JP2022553830A - Ｎ末端ｓｃＦｖ多重特異性結合分子 - Google Patents

Abstract

Ｎ末端ｓｃＦｖ、第１のＦａｂ、および第２のＦａｂを含む多重特異性結合分子（ＭＢＭ）、ＭＢＭおよび細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤を含むＭＢＭコンジュゲート、ＭＢＭおよびＭＢＭコンジュゲートを含む薬学的組成物、がんを治療するためにＭＢＭ、ＭＢＭコンジュゲート、および薬学的組成物を使用する方法、ＭＢＭをコードする核酸、ＭＢＭを発現するように操作された細胞、ならびにＭＢＭを産生する方法。

Description

１．関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月５日に出願された、米国仮特許出願第６２／９３０，９１６号の優先権の利益を主張し、その内容は、その参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

２．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

３．背景技術
ほとんどの自然に発生する抗体分子は、一般に、２つのいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および２つのいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む。重鎖および軽鎖ポリペプチドの各々は、抗原と相互作用することができる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般にポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有する。重鎖および軽鎖ポリペプチドの各々は、定常領域（一般にカルボキシル末端部分）を含む。

細胞または細胞株の単一クローンによって産生される、組換えモノクローナル抗体は、過去２０年間に様々な異なる疾患の治療のための非常に成功したクラスの生物学的薬物として出現した。抗体ベースの治療剤は、がんおよび自己免疫／炎症性障害を含む、様々な疾患を成功裏に治療するために使用されてきた。

いくつかの疾患の生物学的複雑さのため、２つ以上の抗原またはエピトープを標的とする抗体は、特定の状態の治療において、単一の抗体よりも効果的であり得る。例えば、非特許文献１および非特許文献２を参照されたい。これらの抗体は、より良好な治療制御を約束する。例えば、特に抗体ベースの免疫療法の場合、多くの抗体療法に関連するオフターゲット効果を低減させるために、標的特異性を改善する必要性が存在する。加えて、多重特異性抗体は、特に免疫療法の文脈において、複数の細胞受容体の相乗的標的化などの新しい治療戦略を提供する。

Ｌｉｎｄｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７（２８）：１２５５０－１２５６３ Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，２０１１，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３１７（９）：１２５５－６０

４．概要
本開示は、少なくとも３つの抗原結合部位（「ＡＢＳ」）を含有し、そのうちの２つがＦａｂであり、そのうちの３番目がＶＨドメインのＮ末端でＦａｂのうちの１つに付着したｓｃＦｖである、多重特異性結合分子（「ＭＢＭ」）を提供する。本開示のＭＢＭは、互いに会合した２つの重鎖Ｆｃドメインで構成されるＦｃドメインを含有する。Ｆｃドメインおよび任意の会合ポリペプチド鎖を含む各ポリペプチド鎖は、本明細書では「半抗体」と呼ばれる。

本開示の例示的なＭＢＭが図１に示され、変形例が図２および図３に示される。
本開示の典型的なＭＢＭは、それらのＦｃドメインを通して会合した２つの半抗体を含む。図１～３の左側に示される半抗体は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、
・任意のリンカー（２）によって接続された（いずれかの順序の）ＶＨ（１）およびＶＬ（３）で構成されるｓｃＦｖ、
・任意のリンカー（４）、
・以下で構成される第１のＦａｂ（「Ｆａｂ１」）：
○ＶＨ（５）ならびに図１の例では、ＣＨ１ドメインであるが、図２Ａおよび図２Ｃに示されるように、Ｆａｂヘテロダイマー化を促進するＣＬまたはＣＨ３などの異なるタイプの定常ドメインであり得る、定常ドメイン（６）、これらと会合した、
○ＶＬ（１０）ならびに図１の例では、ＣＬであるが、図２Ａおよび図３Ｃに示されるように、ＣＨ１またはＣＨ３などの異なるタイプの定常ドメインであり得る、定常ドメイン（１１）、
・任意のヒンジドメイン（７）、
・図３に示されるように、ヘテロダイマー化を促進する１つ以上の変異（星型変異またはノブインホール変異など）を含有し得る、ＣＨ２ドメイン（８）およびＣＨ３ドメイン（９）で構成されるＦｃドメインを含む。

左半抗体は、２つのポリペプチド鎖で構成され、第１のポリペプチド鎖は、ＶＬ（１０）および定常ドメイン（１１）を含み、第２のポリペプチド鎖は、図１～３に示されるように構成された残りのドメインを含む。

図１の右側に示される半抗体は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、
・以下で構成される第２のＦａｂ（「Ｆａｂ２」）：
○ＶＨ（１２）ならびに図１の例では、ＣＨ１ドメインであるが、図２Ｂおよび図２Ｄに示されるように、Ｆａｂヘテロダイマー化を促進するＣＬまたはＣＨ３などの異なるタイプの定常ドメインであり得る、定常ドメイン（１３）、これらと会合した、
○ＶＬ（１７）ならびに図１の例では、ＣＬであるが、図２Ｂおよび図２Ｄに示されるように、ＣＨ１またはＣＨ３などの異なるタイプの定常ドメインであり得る、定常ドメイン（１８）、
・任意のヒンジドメイン（１４）、
・図３に示されるように、ヘテロダイマーの精製および／またはアセンブリを促進する１つ以上の変異（星型変異またはノブインホール変異など）を含有し得る、ＣＨ２ドメイン（１５）およびＣＨ３ドメイン（１６）で構成されるＦｃドメインを含む。

右半抗体は、２つのポリペプチド鎖で構成され、第１のポリペプチド鎖は、ＶＬ（１７）および定常ドメイン（１８）を含み、第２のポリペプチド鎖は、図１～３に示されるように構成された残りのドメインを含む。

完全なＭＢＭは、Ｆｃ領域を形成する２つのＦｃドメインを通した２つの半抗体の会合によって形成され、第１の抗原結合部位（「ＡＢＳ１」）を有するｓｃＦｖ、第２の抗原結合部位（「ＡＢＳ２」）を有するＦａｂ１、および第３の抗原結合部位（「ＡＢＳ３」）を有するＦａｂ３を有するＭＢＭをもたらす。

図１～３に示される本開示のＭＢＭの変形は、限定することを意図するものではなく、本開示のＭＢＭは、とりわけ、図１～３および以下のセクション６．２に示される修飾の任意の組み合わせを含むことができる。さらに、第１もしくは第２のポリペプチド鎖または左もしくは右半抗体を参照することは、便宜のためのみであり、ポリペプチド鎖または半抗体が任意の特定の順序で産生されるか、または組み立てられることを伝えることを意図するものではない。

本開示の、ＭＢＭのＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３は各々、標的分子、例えば、細胞表面発現抗原に結合する。好ましくは、ＭＢＭのｓｃＦｖ、Ｆａｂ１、およびＦａｂ２は、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３の各々が、そのそれぞれの標的に同時に結合することができるように選択される。いくつかの実施形態では、ＭＢＭのＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３は各々、異なる標的分子に結合することができるか、代替的に、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの２つは、同じ標的分子上の異なる領域に結合することができる。

有利には、少なくとも２つ以上の異なる標的分子に結合するＭＢＭを使用して、例えば、そのような２つ以上の標的分子が発現される特定の組織タイプを優先的に標的とすることができる。

本開示の、ＭＢＭにおいて使用することができるｓｃＦｖは、以下のセクション６．２．１ならびに特定の実施形態１～１２、１９～２０、３１～３５、および５５～６０に記載される。本開示のＭＢＭにおいて使用することができるＦａｂは、以下のセクション６．２．２ならびに特定の実施形態１～１２、１９～２０、２２～２３、２８～３０、および３６～５４に記載される。ｓｃＦｖは、例えば、ペプチドリンカーによって、Ｆａｂ１に接続することができる。ｓｃＦｖをＦａｂ１に接続するために使用することができるリンカーは、以下のセクション６．２．３および特定の実施形態１３～１８に記載される。本開示のＭＢＭにおいて使用することができるＦｃドメインは、以下のセクション６．２．４および特定の実施形態２４～２６に記載される。

本開示はさらに、本開示のＭＢＭを含む薬物コンジュゲート（本明細書では便宜上「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と呼ばれる）を提供する。ＡＤＣの例示的な特徴は、以下のセクション６．３および特定の実施形態６１に記載される。

本開示はさらに、本開示のＭＢＭをコードする核酸を提供する。ＭＢＭをコードする核酸は、単一の核酸（例えば、ＭＢＭのすべてのポリペプチド鎖をコードするベクター）または複数の核酸（例えば、ＭＢＭの異なるポリペプチド鎖をコードする２つ以上のベクター）であり得る。本開示はさらに、本開示の核酸およびＭＢＭを発現するように操作された宿主細胞および細胞株を提供する。本開示はさらに、本開示のＭＢＭを産生する方法を提供する。例示的な核酸、宿主細胞、細胞株、およびＭＢＭを産生する方法は、以下のセクション６．５および特定の実施形態７８～８３に記載される。

本開示はさらに、本開示のＭＢＭおよびＡＤＣを含む薬学的組成物を提供する。例示的な薬学的組成物は、以下のセクション６．６および特定の実施形態６２に記載される。
例えば、がんを治療するために、本開示のＭＢＭ、ＡＤＣ、および薬学的組成物を使用する方法が、本明細書でさらに提供される。例示的な方法は、以下のセクション６．７および特定の実施形態６３～７７に記載される。

５．図面の簡単な説明
本開示の例示的なＭＢＭの概略図。 Ｆａｂが適切なＶＨおよびＶＬ対合を促進する修飾を含有する本開示の例示的なＭＢＭの概略図。追加の戦略は、以下のセクション６．２．２に記載される。 同上。 同上。 同上。 同上。 図３Ａ～３Ｄ：Ｆｃドメインがヘテロダイマー化または適切に対合されたヘテロダイマーの精製を促進する修飾を含有する、本開示の例示的なＭＢＭの概略図。図３Ａおよび図３Ｂは、星型変異を有するＣＨ３（Ｈ４３５Ｒ Ｙ４３６Ｆ修飾を有するＣＨ３）をＣＨ３（^＊）として示し、図３Ｃおよび図３Ｄは、それぞれ、（Ｋ）および（Ｈ）指定を有するノブおよびホール変異を示す。図面の他の場所では、星型変異は、アスタリスク（^＊）で示され、ノブインホール変異は、三角形（例えば、［数１］）で示される。

これらの２つの戦略（例えば、星型変異およびノブインホール変異）は、単一のＭＢＭにおいて組み合わせることができる。追加のヘテロダイマー化戦略は、以下のセクション６．２．４に記載される。
同上。 図４Ａ－１～４Ｂ－２：Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）プロジェクト（図４Ａ－１～図４Ａ－２）およびＨｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（図４Ｂ－１～図４Ｂ－２）による、本開示のＭＢＭによって特異的に結合される例示的な標的分子対：ＫＬＢおよびＦＧＦＲ１ｃの発現プロファイル。重複する表現がある組織は、太字で示される。 同上。 同上。 同上。 ＦＧＦ２１シグナル伝達によって調節される代謝経路。 図６Ａ～６Ｃ：ＦＡＣＳ結合アッセイ結果（実施例１）。図６Ａ：ＨＥＫ２９３／Ｃａｓ９０ｈＦＧＦＲ１／ｈＫＬＢ細胞、図６Ｂ：ＨＥＫ２９３／ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞、図６Ｃ：ＨＥＫ２９３／ｈＦＧＦＲ１ｃ／ｈＫＬＢ細胞。ＭＦＩ：平均蛍光強度、ＡＰＣ：アロフィコシアニン。 同上。 同上。 ＦＧＦＲ２１と比較したＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－ｌｕｃ／ｈＦＧＦＲ１ｃ／ｈＫＬＢ細胞における二重特異性結合分子（ＢＢＭ）ＲＥＧＮ４３６６、ＦＧＦＲ１ｃ ｘ ＫＬＢ二重特異性対照、およびコンパレータＦＧＦＲ１ｃ ｘ ＫＬＢ二重特異性ＲＥＧＮ４３０４による適度な活性化を示すグラフ。 二価ＲＥＧＮ４３６６（ＲＬＵ：相対光単位）と比較した三価Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６によるＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃＨＳ／ｈＫＬＢ細胞における増強されたレポーター活性化（実施例１）。 ｓｃＦｖ６と指定された分子の６つのリンカー長バリアント（（１）位置で２２３９３または３９３と指定されたＫＬＢ結合剤、（２）位置でＡＤＩ－１９８４２または８４２と指定されたＦＧＦＲ１結合剤、および（３）位置でｓｃＦｖフォーマットのＫＬＢ結合剤２２３９３の結合を遮断しない、２２５３２または５３２と指定されたＫＬＢ結合剤を含有する）を評価する研究の結果を示すグラフ。分子は、ＦＧＦＲ１結合ドメインと比較されるＮ末端５３２ｓｃＦｖドメインとの間に７～４５アミノ酸のリンカーを含有した。すべてのリンカー長の三重特異性結合分子は、コンパレータ二重特異性結合分子であるＲＥＧＮ４３０４よりも大きな活性を示す。 図１０Ａ～１０Ｂ：Ｆ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６およびｓｃＦｖ６ ＬＫ７（７アミノ酸リンカーを含有する）と指定される三重特異性結合剤が、ｈＦＧＦＲ１ｃおよびｈＫＬＢを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞においてＦＧＦＲ１ｃシグナル伝達を強力に活性化することを示す図。図１０Ａ：１６時間にわたる血清飢餓、続いて１ｎＭおよび１０ｎＭの濃度での１５分間の薬物処理の結果としてのＥＲＫおよびＰＬＣγリン酸化を通した薬物濃度依存性ＦＧＦＲ１ｃシグナル伝達を示すウエスタンブロット。 １６時間にわたる血清飢餓、続いて１０ｎＭの濃度での１５、３０分、ならびに１、２、４、および６時間のインキュベーション期間にわたる薬物処理の結果としてのＥＲＫおよびＰＬＣγリン酸化を通した時間依存性ＦＧＦＲ１ｃシグナル伝達を示すウエスタンブロット。 図１１Ａ～１１Ｃ：単一特異性（抗ＫＬＢ、ＲＥＧＮ４６６１）および二重特異性結合分子（抗ＫＬＢｘＦＧＦＲ１ｃ、ＲＥＧＮ４３０４）は、三重特異性ｍＡｂ（Ｆ１Ｋ．ｓｃＦｖ６ ＩｇＧ１およびＦ１Ｋ－Ｆａｂ６ ＩｇＧ１）と比較して異なる化学量論を有するＫＬＢ（タンデム黒丸）／ＦＧＦＲ１ｃ（白抜き長方形）に結合する。図１１Ａ：ＲＥＧＮ４６６１：ＫＬＢ複合体（実線）は、多角度光散乱と組み合わされた非対称流場流分画（Ａ４Ｆ－ＭＡＬＳ）によって分析した。ＲＥＧＮ４６６１（破線）およびＫＬＢ（点線）の個々の試料からのフラクトグラムもオーバーレイされる。保持時間の関数としての２１５ｎｍでの相対ＵＶ吸光度が各試料について示され、分解されたピークの測定されたモル質量が示される。 ＲＥＧＮ４３０４：ＫＬＢ複合体（太い実線）およびＲＥＧＮ４３０４：ＫＬＢ：ＦＧＦＲ１ｃ複合体（細い実線）は、多角度光散乱と組み合わされた非対称流場流分画（Ａ４Ｆ－ＭＡＬＳ）によって分析した。ＲＥＧＮ４３０４（破線）、ＫＬＢ（点線）、およびＦＧＦＲ１ｃ（灰色の点線）の個々の試料からのフラクトグラムもオーバーレイされる。保持時間の関数としての２１５ｎｍでの相対ＵＶ吸光度が各試料について示され、分解されたピークの測定されたモル質量が示される。 Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６ ＩｇＧ１：ＫＬＢ複合体（太い実線）およびＦ１Ｋ－ｓｃＦｖ６ ＩｇＧ１：ＫＬＢ：ＦＧＦＲ１ｃ複合体（０．２μＭ：０．２μＭ：０．２μＭ、細い実線）は、多角度光散乱と組み合わされた非対称流場流分画（Ａ４Ｆ－ＭＡＬＳ）によって分析した。保持時間の関数としての２１５ｎｍでの相対ＵＶ吸光度が各試料について示され、分解されたピークの測定されたモル質量が示される。 二重特異性結合分子および単一特異性対照（図１２Ｂ）と比較して、ＦＧＦＲ１ｃ、ＫＬＢ、およびＦＧＦ２１のクラスターが、活性複合体（図１２Ａ）、ならびにＦＧＦＲ１ｃおよびＫＬＢ受容体と、２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ三重特異性結合分子、例えば、Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６との間に形成される潜在的な化学量論的複合体をどのように形成するかの概略図。 同上。 ＦＧＦＲ３ Ｓ２４９Ｃ変異を発現するＵＭＵＣ１４細胞での増殖アッセイ。 ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合変異を発現するＵＭＵＣ１４細胞での増殖アッセイ。 ＵＭＵＣ１４細胞におけるＦＧＦＲ３受容体分解アッセイの結果。

６．発明を実施するための形態
６．１．定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有することを意図している。

抗原結合部位またはＡＢＳ：本明細書で使用される「抗原結合部位」または「ＡＢＳ」という用語は、標的分子への特異的、非共有的、および可逆的結合が可能であるＭＢＭの部分を指す。本開示のＭＢＭは、ｓｃＦｖの一部である第１のＡＢＳ（「ＡＢＳ１」）、Ｆａｂの一部である第２のＡＢＳ（「ＡＢＳ２」）、およびＦａｂの一部である第３のＡＢＳ（「ＡＢＳ３」）を含む。

会合：ＭＢＭの文脈における「会合」という用語は、２つ以上のポリペプチド鎖間の機能的関係を指す。特に、「会合」という用語は、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３がそれらのそれぞれの標的に結合することができる機能的ＭＢＭを産生するために、例えば、分子相互作用を通して非共有結合的に、または１つ以上のジスルフィド架橋もしくは化学的架橋を通して共有結合的に、２つ以上のポリペプチドが互いに会合していることを意味する。本開示のＭＢＭに存在し得る会合の例には、Ｆｃ領域におけるホモダイマーまたはヘテロダイマーＦｃドメイン間の会合、ＦａｂまたはｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬ領域間の会合、ＦａｂにおけるＣＨ１とＣＬとの間の会合、ならびにドメイン置換ＦａｂにおけるＣＨ３とＣＨ３との間の会合が含まれる（がこれらに限定されない）。

相補性決定領域またはＣＤＲ：本明細書で使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＨＣＤＲ－Ｈ３）があり、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）がある。ＣＤＲの境界を特定するために使用することができる例示的な規則には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡＢＳ定義、およびＩＭＧＴ定義が含まれる。例えば、Ｋａｂａｔ，１９９１，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（ＡＢＳ番号付けスキーム）、およびＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を特定するために公開データベースも利用可能である。

由来：本明細書で使用される場合、「由来」という用語は、第１の分子と第２の分子との間の関係を示す。それは一般に、第１の分子と第２の分子との間の構造的類似性を指し、第２の分子に由来する第１の分子に対するプロセスもしくは供給源の制限を示さないか、または含まない。

ＥＣ５０：「ＥＣ５０」という用語は、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間で応答を誘導する、抗体またはＭＢＭの半最大有効濃度を指す。ＥＣ５０は本質的に、その最大効果の５０％が観察される抗体またはＭＢＭの濃度を表す。特定の実施形態では、ＥＣ５０値は、例えば、ＦＡＣＳ結合アッセイによって決定されるように、抗体またはＭＢＭによって特異的に結合され得る標的分子を発現する細胞への半最大結合を与える抗体またはＭＢＭの濃度に等しい。したがって、低減したまたは弱い結合は、増加したＥＣ５０、または半最大有効濃度値で観察される。本開示のＭＢＭのＥＣ５０値は、いくつかの実施形態では、約１０^－５Ｍ以下（例えば、１０^－５Ｍ未満、１０^－６Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、または１０^－９Ｍ未満）のＥＣ５０値によって特徴付けることができる。

エピトープ：エピトープ、または抗原決定基は、本明細書に記載される抗体または他の抗原結合部分によって認識される抗原（例えば、標的分子）の一部分である。エピトープは、線形または立体配座であり得る。

Ｆａｂ：本開示のＭＢＭの文脈における「Ｆａｂ」という用語は、ポリペプチド鎖の対を指し、第１は、第１の定常ドメインのＮ末端にある抗体の可変重（ＶＨ）ドメイン（本明細書ではＣ１と呼ばれる）を含み、第２は、第１の定常ドメインと対形成することができる第２の定常ドメインのＮ末端にある抗体の可変軽（ＶＬ）ドメイン（本明細書ではＣ２と呼ばれる）を含む。天然抗体では、ＶＨは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）のＮ末端であり、ＶＬは、軽鎖（ＣＬ）の定常ドメインのＮ末端である。本開示のＦａｂは、特に本開示のＭＢＭが非同一のＦａｂを含む場合、天然配向に従って配置され得るか、または正しいＶＨおよびＶＬ対合を促進するドメイン置換もしくは交換を含み得る。例えば、ＦａｂにおけるＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの対をＣＨ３ドメインの対で置き換えて、ヘテロダイマーＭＢＭにおける正しい修飾Ｆａｂ鎖対合を促進することができる。ＣＨ１およびＣＬを逆にして、ＣＨ１をＶＬに付着させ、ＣＬをＶＨに付着させることも可能であり、構成は、一般にＣｒｏｓｓｍａｂとして知られる。代替的に、または加えて、置換または交換された定常ドメインの使用、正しい鎖対合は、本開示のヘテロダイマーＭＢＭの両方の可変領域と対合することができる普遍的な軽鎖の使用によって達成することができる。

ＦｃドメインおよびＦｃ領域：「Ｆｃドメイン」という用語は、別の重鎖の対応する部分と対合する重鎖の部分を指す。「Ｆｃ領域」という用語は、２つの重鎖Ｆｃドメインの会合によって形成される抗体ベースの結合分子の領域を指す。Ｆｃ領域内の２つのＦｃドメインは、互いに同じであるか、または異なり得る。天然抗体では、Ｆｃドメインは、典型的には、同一であるが、本開示のＭＢＭを産生する目的で、一方または両方のＦｃドメインは、ヘテロダイマー化を可能にするように有利に修飾され得る。

半抗体：「半抗体」という用語は、少なくとも１つのＡＢＳまたはＡＢＳ鎖（例えば、Ｆａｂの１つの鎖）を含み、例えば、ジスルフィド架橋または分子相互作用（例えば、Ｆｃヘテロダイマー間のノブインホール相互作用）を通して、ＡＢＳまたはＡＢＳ鎖を含む別の分子と会合することができる分子を指す。半抗体は、１つのポリペプチド鎖または２つ以上のポリペプチド鎖（例えば、Ｆａｂの２つのポリペプチド鎖）からなり得る。好ましい実施形態では、半抗体は、Ｆｃドメインを含む。

宿主細胞：本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸が導入された細胞を指す。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。そのような用語は、特定の対象細胞、およびそのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指すことが理解される。特定の修飾が、変異または環境の影響のいずれかによって次世代で発生し得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。典型的な宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞などの、真核生物宿主細胞である。例示的な真核生物宿主細胞には、酵母および哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、サル、またはヒト細胞株などの脊椎動物細胞、例えば、ＨＫＢ１１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＥＫ細胞、またはＣＨＯ細胞が含まれる。

多重特異性結合分子またはＭＢＭ：本明細書で使用される「多重特異性結合分子」または「ＭＢＭ」という用語は、２つの半抗体を含み、少なくとも２つの異なるエピトープ（およびいくつかの場合、３つ以上の異なるエピトープ）に特異的に結合し、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３を含む分子（例えば、複数のポリペプチド鎖のアセンブリ）を指す。

作動可能に連結：「作動可能に連結」という用語は、機能的ポリペプチドを産生するように２つ以上の領域が連結されるポリペプチド鎖の２つ以上の領域間の機能的関係を指す。

親抗体：「親抗体」という用語は、本開示のＭＢＭが由来する抗体（その用語は本明細書で定義される）、例えば、本開示のＭＢＭに存在するＮ末端ｓｃＦｖドメインを欠く親単一特異性または二重特異性抗体を意味する。本開示のＭＢＭは、例えば、そのＡＢＳのうちの１つ以上では、「親」抗体と、結合配列、例えば、ＣＤＲ、ＶＨ、および／またはＶＬ配列を共有し得るが、親抗体またはそのコード配列を修飾することによって調製される必要はない。

単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ：本明細書で使用される「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含むポリペプチド鎖を指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。

特異的に（または選択的に）結合：本明細書で使用される「特異的に（または選択的に）結合」という用語は、ＭＢＭまたはその抗原結合部位（「ＡＢＳ」）が、生理学的条件下で比較的安定な標的分子と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、約５ｘ１０^－２Ｍ以下（例えば、５ｘ１０^－２Ｍ未満、１０^－２Ｍ未満、５ｘ１０^－３Ｍ未満、１０^－３Ｍ未満、５ｘ１０^－４Ｍ未満、１０^－４Ｍ未満、５ｘ１０^－５Ｍ未満、１０^－５Ｍ未満、５ｘ１０^－６Ｍ未満、１０^－６Ｍ未満、５ｘ１０^－７Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、５ｘ１０^－８Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、５ｘ１０^－９Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、または１０^－１０Ｍ未満）のＫＤによって特徴付けることができる。抗体または抗体フラグメント、例えば、ＭＢＭまたはＡＢＳの標的分子への結合親和性を決定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）結合アッセイなどを含む。１つの種からの標的分子に特異的に結合するＭＢＭまたはそのＡＢＳは、しかしながら、１つ以上の他の種からの標的分子に対して交差反応性を有し得る。

標的分子：本明細書で使用される「標的分子」という用語は、ＭＢＭの抗原結合部位によって特異的に結合することができる任意の生体分子（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、またはそれらの組み合わせ）を指す。

組織：本明細書で使用される「組織」という用語は、特定の種類の細胞の集合体または凝集体を指す。組織は、中胚葉（例えば、骨、筋肉、結合組織、腎臓、および関連構造）、内胚葉（例えば、肺、他の呼吸器構造、および消化器官）、または外胚葉（例えば、神経系、感覚器官、皮膚、および関連構造）に由来し得る。本開示のＭＢＭによる標的化に有用な組織の例には、これらに限定されないが、結合組織（線維結合組織、骨格結合組織、および流体結合組織、血液、骨、腱、靭帯、脂肪、および疎性組織などを含む）、筋肉組織（内臓筋または平滑筋、骨格筋、および心筋などを含む）、神経（ｎｅｒｖｏｕｓまたはｎｅｕｒａｌ）組織（中枢神経系（脳、脊髄など）からのものを含む）、末梢神経系（脳神経、脊髄神経、運動ニューロンなど）、上皮組織（皮膚、気道、生殖管、消化管、単層扁平上皮、重層扁平上皮、単層立方体上皮、移行上皮、偽重層円柱上皮、円柱上皮、腺上皮、線毛円柱上皮などを含む）、内皮組織（血管、リンパ管など）、および任意の細胞またはその任意の成分（例えば、細胞外マトリックス）が含まれる。本開示のＭＢＭによって標的化される組織は、（ａ）固体組織もしくは液体組織（例えば、血液もしくは個々の血球タイプ）、（ｂ）正常組織もしくは疾患組織（例えば、がん細胞）であり得、および／あるいは（ｃ）同じ器官（例えば、腎臓もしくは肝臓）もしくは他の身体構造（例えば、腫瘍）に存在するか、または異なる器官もしくは他の身体構造に存在し得る。

組織発現プロファイル：標的分子に関して本明細書で使用される「組織発現プロファイル」という用語は、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ＨＰＡ）および／またはＧｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）プロジェクトによって定義される、人体における標的分子の発現パターンを指す。組織発現プロファイルは、タンパク質発現プロファイルおよび／またはｍＲＮＡ発現プロファイルであり得る。

二価：本明細書で使用される「二価」という用語は、３つの抗原結合部位を有するＭＢＭを指す。いくつかの実施形態では、抗原結合部位のうちの２つは、同じ標的の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、抗原結合部位のうちの２つは、同じ標的分子の異なるエピトープに特異的に結合する。

ユニバーサル軽鎖：ＭＢＭの文脈で本明細書で使用される「ユニバーサル軽鎖」という用語は、Ｆａｂ１の重鎖領域と対合してＦａｂ１を形成することができ、Ｆａｂ２の重鎖領域と対合してＦａｂ２を形成することができる軽鎖ポリペプチドを指す。ユニバーサル軽鎖は、「共通の軽鎖」としても知られている。

ＶＨ：「ＶＨ」という用語は、ｓｃＦｖまたはＦａｂの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。
ＶＬ：「ＶＬ」という用語は、ｓｃＦｖまたはＦａｂの軽鎖を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。

６．２．多重特異性結合分子（ＭＢＭ）
本開示のＭＢＭは、２つの半抗体を含み、そのうちの一方は、少なくとも１つの抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ）を含み、そのうちの他方は、少なくとも２つの抗原結合部位（例えば、そのＶＨのＮ末端に作動可能に連結されたｓｃＦｖを有するＦａｂ）を含む。

本開示のＭＢＭは、少なくとも２つの異なるエピトープ（および場合によっては３つ以上の異なるエピトープ）に特異的に結合する。少なくとも２つの異なるエピトープは、同じ標的分子または異なる標的分子上にあり得る。一般に、本開示のＭＢＭは、２つ以上の異なる標的分子（本明細書では「抗原」と呼ばれることがある）に特異的に結合する。

６．２．１．ｓｃＦｖ
単鎖Ｆｖまたは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、単一のポリペプチド鎖に抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、単鎖ポリペプチドとして発現することができ、それらが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが標的結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦＶのＶＨ鎖およびＶＬ鎖を接続するのに適したリンカーの例は、セクション６．２．３において特定されるリンカーである。

特に明記されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、ＶＬおよびＶＨ可変領域をいずれかの順序で有し得、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得るか、またはＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。

ｓｃＦｖは、マウス、ヒト、またはヒト化ＶＨおよびＶＬ配列などの、任意の好適な種からのＶＨおよびＶＬ配列を含むことができる。
ｓｃＦｖコード核酸を作製するために、ＶＨおよびＶＬコードＤＮＡフラグメントは、リンカーをコードする、例えば、セクション６．２．３に記載されるリンカー（典型的にはアミノ酸グリシンおよびセリン、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４～Ｓｅｒ）_３（配列番号１）を含有する配列のリピート）のいずれかをコードする別のフラグメントに作動可能に連結され、ＶＨおよびＶＬ配列は、連続した単鎖タンパク質として発現され得、ＶＬおよびＶＨ領域は、可撓性リンカーによって接合される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。

６．２．２．Ｆａｂ１およびＦａｂ２
本開示のＭＢＭは、各半抗体に少なくとも１つのＦａｂドメインを含む。Ｆａｂドメインは、従来、パパインなどの酵素を使用した免疫グロブリン分子のタンパク質分解による切断によって産生された。本開示のＭＢＭでは、Ｆａｂドメインは、より大きな分子の一部として組換え的に発現される。

Ｆａｂドメインは、任意の好適な種からの定常ドメインおよび可変領域配列を含むことができ、したがって、マウス、キメラ、ヒト、またはヒト化であり得る。
Ｆａｂドメインは、典型的には、ＶＬドメインに付着したＣＬドメインと対合するＶＨドメインに付着したＣＨ１ドメインを含む。野生型免疫グロブリンでは、ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対合されてＦｖ領域を構成し、ＣＨ１ドメインは、ＣＬドメインと対合されて結合モジュールをさらに安定化する。２つの定常ドメイン間のジスルフィド結合は、Ｆａｂドメインをさらに安定化させることができる。

本開示のＭＢＭについて、特に軽鎖が共通のまたは普遍的な軽鎖ではない場合、Ｆａｂヘテロダイマー化戦略を使用して、同じＡＢＳに属するＦａｂドメインの正しい会合を可能にし、別のＡＢＳに属するＦａｂドメインの異常な対合を最小限に抑えることが有利である。例えば、以下の表１に示されるＦａｂヘテロダイマー化戦略を使用することができる：

したがって、特定の実施形態では、Ｆａｂの２つのポリペプチド間の正しい会合は、例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号に記載されるように、ＦａｂのＶＬおよびＶＨドメインを互いに交換するか、またはＣＨ１およびＣＬドメインを互いに交換することによって促進される。

正しいＦａｂ対合はまた、ＣＨ１ドメインにおける１つ以上のアミノ酸修飾およびＦａｂのＣＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸修飾、ならびに／またはＶＨドメインにおける１つ以上のアミノ酸修飾およびＶＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸修飾を導入することによって促進され得る。修飾されるアミノ酸は、典型的には、Ｆａｂ成分が、他のＦａｂの成分ではなく、互いに優先的に対合するように、ＶＨ：ＶＬおよびＣＨ１：ＣＬ界面の一部である。

一実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、残基のＫａｂａｔ番号付けによって示される可変（ＶＨ、ＶＬ）および定常（ＣＨ１、ＣＬ）ドメインの保存されたフレームワーク残基に限定される。Ａｌｍａｇｒｏ，２００８，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：１６１９－１６３３は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ番号付けスキームに基づいたフレームワーク残基の定義を提供する。

一実施形態では、ＶＨおよびＣＨ１ならびに／またはＶＬおよびＣＬドメインに導入された修飾は、互いに相補的である。重鎖および軽鎖の界面での相補性は、立体的および疎水性接触、静電／電荷相互作用、または様々な相互作用の組み合わせに基づいて達成することができる。タンパク質表面間の相補性は、ロックアンドキーフィット、ノブイントゥホール、突起および空洞、ドナーおよびアクセプターなどの観点で文献に広く記載されており、すべて２つの相互作用する表面間の構造的および化学的一致の性質を意味する。

一実施形態では、１つ以上の導入された修飾は、Ｆａｂ成分の界面にかけて新しい水素結合を導入する。一実施形態では、１つ以上の導入された修飾は、Ｆａｂ成分の界面にかけて新しい塩橋を導入する。例示的な置換は、国際公開第２０１４／１５０９７３号および国際公開第２０１４／０８２１７９号に記載されており、それらの内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、Ｆａｂドメインは、ＣＨ１ドメインにおける１９２Ｅ置換、ならびにＣＬドメインにおける１１４Ａおよび１３７Ｋ置換を含み、これは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に塩橋を導入する（例えば、Ｇｏｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：３１９９－２１１を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、Ｆａｂドメインは、ＣＨ１ドメインにおける１４３Ｑおよび１８８Ｖ置換、ならびにＣＬドメインにおける１１３Ｔおよび１７６Ｖ置換を含み、これは、ＣＨ１とＣＬドメインとの間の接触の疎水性および極性領域を交換するのに役立つ（例えば、Ｇｏｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：３１９９－２１１を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、Ｆａｂドメインは、Ｆａｂドメインの正しいアセンブリを促進する直交Ｆａｂ界面を導入するために、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、ＣＬドメインのいくつかまたはすべてにおける修飾を含むことができる（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：１９１－１９８）。一実施形態では、３９Ｋ、６２Ｅ修飾は、ＶＨドメインに導入され、Ｈ１７２Ａ、Ｆ１７４Ｇ修飾は、ＣＨ１ドメインに導入され、１Ｒ、３８Ｄ、（３６Ｆ）修飾は、ＶＬドメインに導入され、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１７６Ｗ修飾は、ＣＬドメインに導入される。別の実施形態では、３９Ｙ修飾は、ＶＨドメインに導入され、３８Ｒ修飾は、ＶＬドメインに導入される。

Ｆａｂドメインはまた、天然ＣＨ１：ＣＬジスルフィド結合を操作されたジスルフィド結合で置き換えるように修飾することができ、それによってＦａｂ成分対合の効率を向上させる。例えば、操作されたジスルフィド結合は、ＣＨ１ドメインに１２６Ｃ、ＣＬドメインに１２１Ｃを導入することによって、導入することができる（例えば、Ｍａｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＭＡｂｓ ７：３７７－８９を参照されたい）。

Ｆａｂドメインはまた、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを、正しいアセンブリを促進する代替ドメインで置き換えることによって、修飾することができる。例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＭＡｂｓ ７：３６４－７６は、ＣＨ１ドメインをＴ細胞受容体の定常ドメインで置換し、ＣＬドメインをＴ細胞受容体のｂドメインで置換し、これらのドメイン置換を、ＶＬドメインに３８Ｄ修飾を導入し、ＶＨドメインに３９Ｋ修飾を導入することによるＶＬドメインとＶＨドメインとの間の追加の電荷－電荷相互作用で対合することを記載する。

正しいＶＨ－ＶＬ対合を促進するためのＦａｂヘテロダイマー化戦略の使用の代わりに、またはそれに加えて、共通の軽鎖（普遍的な軽鎖とも呼ばれる）のＶＬは、本開示のＭＢＭの各Ｆａｂ ＶＬ領域に使用することができる。様々な実施形態では、本明細書に記載されるように共通の軽鎖を使用することは、元の同族ＶＬを使用することと比較して、ＭＢＭの不適切な種の数を低減させる。様々な実施形態では、ＭＢＭのＶＬドメインは、共通の軽鎖を含む単一特異性抗体から特定される。様々な実施形態では、ＭＢＭのＶＨ領域は、限定されたヒト軽鎖レパートリーを発現するように予め操作されたマウスＢ細胞内にインビボで再配置されるヒト重鎖可変遺伝子セグメント、またはヒト重鎖と同族の単一ヒト軽鎖を含み、目的の抗原での曝露に応答して、１つの、または２つの可能なヒトＶＬのうちの１つと同族である複数のヒトＶＨを含有する抗体レパートリーを生成し、抗体レパートリーは、目的の抗原に特異的である。共通の軽鎖は、再配置されたヒトＶκ１－３９Ｊκ５配列または再配置されたヒトＶκ３－２０Ｊκ１配列に由来するものであり、体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを含む。例えば、米国特許第１０，４１２，９４０号を参照されたい。

６．２．３．リンカー
ある特定の態様では、本開示は、ＡＢＳの２つ以上の成分（例えば、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ）、２つ以上のＡＢＳ（例えば、半抗体のｓｃＦｖおよびＦａｂ）、またはＡＢＳおよび非ＡＢＳ成分（例えば、Ｆｃ領域）は、ペプチドリンカーによって互いに接続される、ＭＢＭを提供する。そのようなリンカーは、例えば、セクション６．４に記載されるＭＢＭに薬物を付着させるために使用されるＡＤＣリンカーとは対照的に、本明細書では「ＡＢＳリンカー」と呼ばれる。

ペプチドリンカーは、２アミノ酸～６０アミノ酸以上の範囲であり得、ある特定の態様では、ペプチドリンカーは、３アミノ酸～５０アミノ酸、４～３０アミノ酸、５～２５アミノ酸、１０～２５アミノ酸、１０アミノ酸～６０アミノ酸、１２アミノ酸～２０アミノ酸、２０アミノ酸～５０アミノ酸、または２５アミノ酸～３５アミノ酸の長さの範囲である。

特定の態様では、ペプチドリンカー、例えば、ｓｃＦｖドメインと、ＡＢＳ１のｓｃＦｖドメインおよびＡＢＳ２の重鎖可変領域などの重鎖とを分離するペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、または少なくとも７アミノ酸の長さであり、任意に、最大３０アミノ酸、最大４０アミノ酸、最大５０アミノ酸、または最大６０アミノ酸の長さである。

前述のいくつかの実施形態では、リンカーは、５アミノ酸～５０アミノ酸の長さの範囲であり、例えば、５～５０、５～４５、５～４０、５～３５、５～３０、５～２５、または５～２０アミノ酸の長さの範囲である。前述の他の実施形態では、リンカーは、６アミノ酸～５０アミノ酸の長さの範囲であり、例えば、６～５０、６～４５、６～４０、６～３５、６～３０、６～２５、または６～２０アミノ酸の長さの範囲である。前述のさらに他の実施形態では、リンカーは、７アミノ酸～５０アミノ酸の長さの範囲であり、例えば、７～５０、７～４５、７～４０、７～３５、７～３０、７～２５、または７～２０アミノ酸の長さの範囲である。

荷電（例えば、荷電親水性リンカー）および／または可撓性リンカーが特に好ましい。
本開示のＭＢＭに使用することができる可撓性ＡＢＳリンカーの例には、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９およびＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２７（１０）：３２５－３３０に開示されるものが含まれる。特に有用な可撓性リンカーは、グリシンおよびセリンの繰り返し、例えば、Ｇ_ｎＳ（配列番号２）もしくはＳＧ_ｎ（配列番号３）のモノマーもしくはマルチマーであるか、またはこれらを含み、ｎは、１～１０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一実施形態では、リンカーは、Ｇ_４Ｓ（配列番号４）、例えば、（ＧＧＧＧＳ）_ｎの繰り返しのモノマーもしくはマルチマーであるか、またはこれを含む。

ポリグリシンリンカーは、本開示のＭＢＭにおいて好適に使用することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカー、例えば、ｓｃＦｖドメインとＡＢＳ１のｓｃＦｖドメインおよびＡＢＳ２の重鎖可変領域などの重鎖とを分離するペプチドリンカーは、２つの連続するグリシン（２Ｇｌｙ）、３つの連続するグリシン（３Ｇｌｙ）、４つの連続するグリシン（４Ｇｌｙ（配列番号５））、５つの連続するグリシン（５Ｇｌｙ（配列番号６））、６つの連続するグリシン（６Ｇｌｙ（配列番号７））、７つの連続するグリシン（７Ｇｌｙ（配列番号８））、８つの連続するグリシン（８Ｇｌｙ（配列番号９））、または９つの連続するグリシン（９Ｇｌｙ（配列番号１０））を含む。

特定の実施形態では、ＡＢＳリンカー、例えば、ｓｃＦｖドメインと、ＡＢＳ１のｓｃＦｖドメインおよびＡＢＳ２の重鎖可変領域などの重鎖とを分離するペプチドリンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号４）またはそのマルチマーおよび１つ以上の追加のグリシン、例えば、２Ｇｌｙ、３Ｇｌｙ、または４Ｇｌｙ（配列番号５）の両方で構成される。そのようなリンカーの例には、Ｇ_４Ｓ ＧＧ（配列番号６３）、４ｘＧ_４Ｓ ＧＧ（配列番号６４）、および７ｘＧ_４Ｓ ＧＧ（配列番号６５）が含まれる。

６．２．４．ヒンジ領域
本開示のＭＢＭはまた、例えば、ＡＢＳモジュールをＦｃ領域に接続する、ヒンジ領域を含むことができる。ヒンジ領域は、天然または修飾ヒンジ領域であり得る。ヒンジ領域は、典型的には、Ｆｃ領域のＮ末端に見られる。

天然ヒンジ領域は、自然に発生する抗体におけるＦａｂドメインとＦｃドメインとの間に通常見られるヒンジ領域である。修飾ヒンジ領域は、天然ヒンジ領域とは長さおよび／または組成が異なる任意のヒンジである。そのようなヒンジは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サメ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、またはヤギヒンジ領域などの、他の種からのヒンジ領域を含むことができる。他の修飾ヒンジ領域は、重鎖Ｆｃ領域のものとは異なるクラスまたはサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含み得る。代替的に、修飾ヒンジ領域は、天然ヒンジまたはリピーティング単位の一部を含み得、リピート中の各単位は、天然ヒンジ領域に由来する。さらなる代替では、天然ヒンジ領域は、１つ以上のシステインもしくは他の残基を、セリンもしくはアラニンなどの中性残基に変換することによって、または好適に配置された残基をシステイン残基に変換することによって改変され得る。そのような手段によって、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、増加または減少され得る。他の修飾ヒンジ領域は、完全に合成であり得、長さ、システイン組成、および可撓性などの所望の特性を有するように設計され得る。

いくつかの修飾ヒンジ領域は、例えば、米国特許第５，６７７，４２５号、国際公開第９９１５５４９号、国際公開第２００５／００３１７０号、国際公開第２００５／００３１６９号、国際公開第２００５／００３１７０号、国際公開第９８２５９７１号、および国際公開第２００５／００３１７１号にすでに記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、本開示の一方または両方の半抗体のＦｃ領域は、そのＮ末端に、無傷のヒンジ領域、例えば、ヒンジドメインを有する。いくつかの実施形態では、「ヒンジドメイン」は、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６または約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０までの配列（Ｂｕｒｔｏｎ，１９８５ Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６）、または別の抗体クラスもしくはアイソタイプの対応する配列を指す。

様々な実施形態では、ヒンジドメイン内の２３３～２３６位は、Ｇ、Ｇ、Ｇ、および未占有；Ｇ、Ｇ、未占有、および未占有；Ｇ、未占有、未占有、未占有、および未占有；またはすべて未占有であり得、位置は、ＥＵ番号付けによって番号付けされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＭＢＭは、同じアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４）の野生型ヒンジドメインと比較して、Ｆｃγ受容体についての結合親和性を低減させる修飾ヒンジドメインを含む。

一実施形態では、本開示のＭＢＭの一方または両方の鎖のＦｃ領域は、そのＮ末端に無傷のヒンジドメインを有する。
一実施形態では、本開示のＭＢＭのＦｃ領域およびヒンジ領域の両方は、ｌｇＧ４に由来し、ヒンジ領域は、修飾された配列ＣＰＰＣ（配列番号１１）を含む。ヒトｌｇＧ４のコアヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣ（配列番号１１）を含有するｌｇＧ１と比較して、配列ＣＰＳＣ（配列番号１２）を含有する。ｌｇＧ４配列に存在するセリン残基は、この領域における増加した可撓性をもたらし、したがって分子の一部分は、ＩｇＧ分子における他の重鎖に架橋して鎖間ジスルフィドを形成するのではなく、同じタンパク質鎖（鎖内ジスルフィド）内でジスルフィド結合を形成する（Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０（１）：１０５－１０８）。セリン残基をプロリンに変更して、ｌｇＧ１と同じコア配列を与えることは、ｌｇＧ４ヒンジ領域における鎖間ジスルフィドの完全な形成を可能にし、したがって精製産物における不均一性を低減する。この改変されたアイソタイプは、ｌｇＧ４Ｐと呼ばれる。

６．２．４．１．キメラヒンジ配列
ヒンジ領域は、キメラヒンジ領域であり得る。
例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を含むことができる。

特定の実施形態では、キメラヒンジ領域は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号１３）（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１２１０８７号の配列番号８として以前に開示された）またはＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号１４）（国際公開第２０１４／１２１０８７号の配列番号９として以前に開示された）を含む。そのようなキメラヒンジ配列は、ＩｇＧ４ ＣＨ２領域に好適に連結することができる（例えば、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、例えば、ヒトまたはマウスＦｃドメインに組み込むことによって、これは例えば、セクション６．２．５．１に記載されるように、エフェクター機能を低減するようにＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインにおいてさらに修飾することができる）。

６．２．４．２．低減したエフェクター機能を有するヒンジ配列
さらなる実施形態では、ヒンジ領域は、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／１６１０１０（Ａ２）号に記載されるように、修飾してエフェクター機能を低減することができる。様々な実施形態では、修飾ヒンジ領域の２３３～２３６位は、Ｇ、Ｇ、Ｇ、および未占有；Ｇ、Ｇ、未占有、および未占有；Ｇ、未占有、未占有、未占有、および未占有；またはすべて未占有であり、位置は、ＥＵ番号付けによって番号付けされる（国際公開第２０１６／１６１０１０（Ａ２）号の図１に示される）。これらのセグメントは、ＧＧＧ－、ＧＧ－、Ｇ－－－、または－－－－として表すことができ、「－」は、未占有の位置を表す。

２３６位は、標準的なヒトＩｇＧ２では未占有であるが、他の標準的なヒトＩｇＧアイソタイプでは占有されている。２３３～２３５位は、４つすべてのヒトアイソタイプでは（国際公開第２０１６／１６１０１０（Ａ２）号の図１に示されるように）Ｇ以外の残基によって占有されている。

２３３～２３６位内のヒンジ修飾は、２２８位がＰによって占有されることと組み合わせることができる。２２８位は、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２ではＰによって自然に占有されるが、ヒトＩｇＧ４ではＳ、ヒトＩｇＧ３ではＲによって占有される。ＩｇＧ４抗体におけるＳ２２８Ｐ変異は、ＩｇＧ４抗体を安定化し、外因性抗体と内因性抗体との間の重鎖軽鎖対の交換を低減するのに有利である。好ましくは、２２６～２２９位は、それぞれ、Ｃ、Ｐ、ＰおよびＣによって占有される。

例示的なヒンジ領域は、残基２２６－２３６を有し、ＧＧＧ－（２３３－２３６）、ＧＧ－－（２３３－２３６）、Ｇ－－－（２３３－２３６）、およびＧなし（２３３－２３６）と呼ばれる修飾ヒンジ配列によって占有される、中間（またはコア）および下部ヒンジと呼ばれることがある。任意に、ヒンジドメインアミノ酸配列は、ＣＰＰＣＰＡＰＧＧＧ－ＧＰＳＶＦ（配列番号１５）（国際公開第２０１６／１６１０１０（Ａ２）号の配列番号１として以前に開示された）、ＣＰＰＣＰＡＰＧＧ－－ＧＰＳＶＦ（配列番号１６）（国際公開第２０１６／１６１０１０（Ａ２）号の配列番号２として以前に開示された）、ＣＰＰＣＰＡＰＧ－－－ＧＰＳＶＦ（配列番号１７）（国際公開第２０１６／１６１０１０（Ａ２）号の配列番号３として以前に開示された）、またはＣＰＰＣＰＡＰ－－－－ＧＰＳＶＦ（配列番号１８）（国際公開第２０１６／１６１０１０（Ａ２）号の配列番号４として以前に開示された）を含む。

上記の修飾ヒンジ領域は、典型的には、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、指定された領域に隣接する追加のヒンジセグメント（例えば、上部ヒンジ）を有し得る、重鎖定常領域に組み込むことができる。存在するそのような追加の定常領域セグメントは、典型的には、同じアイソタイプ、好ましくはヒトアイソタイプであるが、異なるアイソタイプのハイブリッドであり得る。そのような追加のヒト定常領域セグメントのアイソタイプは、好ましくはヒトＩｇＧ４であるが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ３、またはドメインが異なるアイソタイプであるそれらのハイブリッドでもあり得る。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４の例示的な配列は、国際公開第２０１６／１６１０１０（Ａ２）号の図２～４に示される。

具体的な実施形態では、修飾ヒンジ配列は、ＩｇＧ４ ＣＨ２領域に連結することができる（例えば、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、例えば、ヒトまたはマウスＦｃドメインに組み込むことによって、これは例えば、セクション６．２．５．１に記載されるように、エフェクター機能を低減するようにＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインにおいてさらに修飾することができる）。

６．２．５．Ｆｃドメイン
本開示のＭＢＭは、任意の適切な種に由来するＦｃ領域を含むことができる。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃドメインに由来する。

Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスｌｇＡ１およびｌｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、およびｌｇＧ４を含む）、およびＩｇＭを含む、任意の適切なクラスの抗体に由来することができる。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、またはｌｇＧ４に由来する。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ｌｇＧ１に由来する。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ｌｇＧ４に由来する。

Ｆｃ領域内の２つのＦｃドメインは、互いに同じであるか、または異なり得る。天然抗体では、Ｆｃドメインは、典型的には、同一であるが、多重特異性結合分子、例えば、本開示のＭＢＭを産生する目的で、Ｆｃドメインは、以下のセクション６．２．５．２に記載されるように、有利に異なり、ヘテロダイマー化を可能にし得る。

天然抗体では、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの重鎖Ｆｃドメインは、２つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）で構成され、ＩｇＥおよびＩｇＭの重鎖Ｆｃドメインは、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）で構成される。これらはダイマー化してＦｃ領域を作製する。

本開示のＭＢＭにおいて、Ｆｃ領域、および／またはその内のＦｃドメインは、１つ以上の異なるクラスの抗体、例えば、１つ、２つ、または３つの異なるクラスからの重鎖定常ドメインを含むことができる。

一実施形態では、Ｆｃ領域は、ｌｇＧ１に由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、ｌｇＧ２に由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。

一実施形態では、Ｆｃ領域は、ｌｇＧ３に由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、ｌｇＧ４に由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。

一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＭからのＣＨ４ドメインを含む。ＩｇＭ ＣＨ４ドメインは、典型的には、ＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧに由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびにＩｇＭに由来するＣＨ４ドメインを含む。

本開示のＭＢＭのためのＦｃ領域の産生における使用のための重鎖定常ドメインは、上記の自然に発生する定常ドメインのバリアントを含み得ることが理解されるであろう。そのようなバリアントは、野生型定常ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸バリエーションを含み得る。一例では、本開示のＦｃ領域は、野生型定常ドメインから配列が異なる少なくとも１つの定常ドメインを含む。バリアント定常ドメインは、野生型定常ドメインよりも長くても短くてもよいことが理解されるであろう。好ましくは、バリアント定常ドメインは、野生型定常ドメインと少なくとも６０％同一または類似である。別の例では、バリアント定数ドメインは、少なくとも７０％同一または類似である。別の例では、バリアント定数ドメインは、少なくとも８０％同一または類似である。別の例では、バリアント定数ドメインは、少なくとも９０％同一または類似である。別の例では、バリアント定数ドメインは、少なくとも９５％同一または類似である。

ＩｇＭおよびＩｇＡは、共通のＨ２Ｌ２抗体ユニットの共有結合マルチマーとしてヒトにおいて自然に発生する。ＩｇＭは、Ｊ鎖が組み込まれた場合はペンタマーとして、Ｊ鎖を欠く場合はヘキサマーとして発生する。ＩｇＡは、モノマーおよびダイマー形態として発生する。ＩｇＭおよびＩｇＡの重鎖は、テールピースとして知られる、Ｃ末端定常ドメインへの１８アミノ酸伸長を有する。テールピースは、ポリマーにおいて重鎖間にジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含み、重合において重要な役割を果たすと考えられる。テールピースは、グリコシル化部位も含有する。特定の実施形態では、本開示のＭＢＭは、テールピースを含まない。

本開示のＭＢＭに組み込まれるＦｃドメインは、タンパク質の機能的特性を改変する１つ以上の修飾、例えば、ＦｃＲｎもしくは白血球受容体などのＦｃ受容体への結合、補体への結合、修飾されたジスルフィド結合構造、または改変されたグリコシル化パターンを含み得る。エフェクター機能を改変する例示的なＦｃ修飾は、セクション６．２．５．１に記載される。

Ｆｃドメインはまた、例えば、同一のＦｃドメインに対する非同一のＦｃドメインの優先的な対合である、ヘテロダイマー化を可能にすることによって、非対称ＭＢＭの製造可能性を改善する修飾を含むように改変することができる。ヘテロダイマー化は、配列が異なるＦｃドメインを含有するＦｃ領域によって異なるＡＢＳが互いに接続されるＭＢＭの産生を可能にする。ヘテロダイマー化戦略の例をセクション６．２．５．２に例示する。

上記の修飾のいずれかを任意の好適な方法で組み合わせて所望の機能的特性を達成するか、かつ／または他の修飾と組み合わせてＭＢＭの特性を改変することができることが理解されるであろう。

６．２．５．１．改変されたエフェクター機能を有するＦｃドメイン
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体および／またはエフェクター機能への結合を低減する１つ以上のアミノ酸置換を含む。

特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、またはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクター機能は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、およびサイトカイン分泌の群から選択される１つ以上である。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。

一実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１、およびＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。そのような一実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｉｇｄ Ｆｃ領域、特にヒトＩｇｄ Ｆｃ領域である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｐ３２９位にアミノ酸置換、ならびにＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、およびＰ３３１（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓである。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｐ３２９、Ｌ２３４、およびＬ２３５（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、Ｆｃ領域は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」、または「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。

典型的には、同じ１つ以上のアミノ酸置換は、Ｆｃ領域の２つのＦｃドメインの各々に存在する。したがって、特定の実施形態では、Ｆｃ領域の各Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）、すなわち、Ｆｃ領域における第１および第２のＦｃドメインの各々において、２３４位のロイシン残基は、アラニン残基（Ｌ２３４Ａ）で置き換えられ、２３５位のロイシン残基は、アラニン残基（Ｌ２３５Ａ）で置き換えられ、３２９位のプロリン残基は、グリシン残基（Ｐ３２９Ｇ）によって置き換えられる（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
典型的には、同じ１つ以上のアミノ酸置換は、Ｆｃ領域の２つのＦｃドメインの各々に存在する。したがって、特定の実施形態では、Ｆｃ領域の各Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）、すなわち、Ｆｃ領域における第１および第２のＦｃドメインの各々において、２３４位のロイシン残基は、アラニン残基（Ｌ２３４Ａ）で置き換えられ、２３５位のロイシン残基は、アラニン残基（Ｌ２３５Ａ）で置き換えられ、３２９位のプロリン残基は、グリシン残基（Ｐ３２９Ｇ）によって置き換えられる（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、エフェクター機能を低減するＤ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ変異（ＥＵ番号付け）を含むバリアントＩｇＧ１である。

別の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への低減した結合を有するＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。Ｆｃ受容体への低減した結合を有する例示的なＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、以下の表Ａから選択されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、以下に示される配列の太字部分のみを含む：

特定の実施形態では、低減したエフェクター機能を有するＩｇＧ４は、本明細書ではＩｇＧ４またはｈＩｇＧ４と呼ばれることがある、国際公開第２０１４／１２１０８７号の配列番号３１のアミノ酸配列の太字部分を含む。

ヘテロダイマーＭＢＭについて、上記に記載されるバリアントＩｇＧ４ Ｆｃ配列の組み合わせ、例えば、国際公開第２０１４／１２１０８７号の配列番号３０（またはその太字部分）および国際公開第２０１４／１２１０８７号の配列番号３７（またはその太字部分）の組み合わせを含むＦｃ領域、または国際公開第２０１４／１２１０８７号の配列番号３１（またはその太字部分）および国際公開第２０１４／１２１０８７号の配列番号３８（またはその太字部分）の組み合わせを含むＦｃ領域を組み込むことが可能である。

６．２．５．２．Ｆｃヘテロダイマー化バリアント
多くの多重特異性分子フォーマットは、天然免疫グロブリンとは異なり、非同一の抗原結合ドメイン（またはその一部分、例えば、ＦａｂのＶＨまたはＶＨ－ＣＨ１）に作動可能に連結された、２つのＦｃドメイン間のダイマー化を伴う。Ｆｃドメインを形成する２つのＦｃ領域の不適切なヘテロダイマー化は、所望の多重特異性分子の収率を増加させるための障害であり得、精製の課題を表す。例えば、欧州特許出願公開第１８７０４５９（Ａ１）号、米国特許第５，５８２，９９６号、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第５，９１０，５７３号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号、米国特許第７，１８３，０７６号、米国特許出願公開第２００６／２０４４９３（Ａ１）号、およびＰＣＴ公開第２００９／０８９００４（Ａ１）号に記載されるように、本開示のＭＢＭに存在し得るＦｃドメインのダイマー化の増強において、当該技術分野で利用可能な様々なアプローチを使用することができる。

本開示は、Ｆｃヘテロダイマーを含むＭＢＭ、すなわち、異種、非同一のＦｃドメインを含むＦｃ領域を提供する。ヘテロダイマー化戦略は、異なるＡＢＳ（またはその一部分、例えば、ＦａｂのＶＨまたはＶＨ－ＣＨ１）に作動可能に連結されたＦｃ領域のダイマー化を増強し、同一のＡＢＳに作動可能に連結されたＦｃドメインのダイマー化を低減するために使用される。典型的には、Ｆｃヘテロダイマーにおける各Ｆｃドメインは、抗体のＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインは、前のセクションに記載されるように、任意のアイソタイプ、クラス、またはサブクラス、好ましくはＩｇＧ（ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、およびｌｇＧ４）クラスの抗体の定常領域に由来する。

ＣＨ３ドメインでの２つの異なる重鎖のヘテロダイマー化は、所望のＭＢＭを生じさせるが、同一の重鎖のホモダイマー化は、所望のＭＢＭの収率を低減させるであろう。したがって、好ましい実施形態では、本開示のＭＢＭを形成するために会合する２つの半抗体は、未修飾鎖と比較してヘテロダイマー会合に有利な修飾を有するＣＨ３ドメインを含有するであろう。

具体的な実施形態では、Ｆｃヘテロダイマーの形成を促進する当該修飾は、Ｆｃドメインの１つにおける「ノブ」修飾および他のＦｃドメインにおける「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブイントゥホール」または「ノブインホール」修飾である。ノブイントゥホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９：６１７－６２１、およびＣａｒｔｅｒ，２００１，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８：７－１５に記載される。一般に、方法は、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）、第２のポリペプチドの界面に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、ヘテロダイマー形成を促進し、ホモダイマー形成を妨げるために、突起を空洞内に配置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同一または類似のサイズの代償性空洞は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作製される。

したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、これは第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能であり、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する。好ましくは、より大きな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。好ましくは、より小さな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、およびバリン（Ｖ）からなる群から選択される。突起および空洞は、例えば、部位特異的変異誘発によって、またはペプチド合成によって、ポリペプチドをコードする核酸を変更することによって作製することができる。例示的な置換は、Ｙ４７０Ｔである。

特定のそのような実施形態では、第１のＦｃドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基は、トリプトファン残基（Ｔ３６６Ｗ）で置き換えられ、Ｆｃドメインにおいて、４０７位のチロシン残基は、バリン残基（Ｙ４０７Ｖ）で置き換えられ、任意に、３６６位のスレオニン残基は、セリン残基（Ｔ３６６Ｓ）で置き換えられ、３６８位のロイシン残基は、アラニン残基（Ｌ３６８Ａ）で置き換えられる（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施形態では、第１のＦｃドメインにおいて、追加的に、３５４位のセリン残基は、システイン残基（Ｓ３５４Ｃ）で置き換えられるか、または３５６位のグルタミン酸残基は、システイン残基（Ｅ３５６Ｃ）で置き換えられ（特に、３５４位のセリン残基はシステイン残基で置き換えられ）、第２のＦｃドメインにおいて、追加的に、３４９位のチロシン残基は、システイン残基（Ｙ３４９Ｃ）によって置き換えられる（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施形態では、第１のＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、第２のＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

いくつかの実施形態では、静電ステアリング（例えば、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５（２５）：１９６３７－４６に記載される）を使用して、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの会合を促進することができる。

ヘテロダイマー化を促進するために修飾されたＦｃドメインの使用の代替として、またはそれに加えて、Ｆｃドメインを修飾して、Ｆｃヘテロダイマーの選択を可能にする精製戦略を可能にすることができる。そのような一実施形態では、１つの半抗体は、プロテインＡへのその結合を無効にする修飾Ｆｃドメインを含み、ひいては、ヘテロダイマータンパク質をもたらす精製方法を可能にする。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照されたい。そのようなものとして、ＭＢＭは、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインを含み、第１および第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸ほど互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違を欠失する対応するＭＢＭと比較して、プロテインＡへＭＢＭの結合を低減させる。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または消失する変異／修飾を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。したがって、修飾のクラスは、本明細書では「星型」変異と呼ばれる。

６．３．標的分子
本開示のＭＢＭのＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３は各々、標的分子、例えば、タンパク質、炭水化物、または脂質などの細胞表面発現抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３によって結合される標的分子は、タンパク質分子である。例示的な標的分子には、ヒトクロトーベータ（「ＫＬＢ」）、ヒト線維芽細胞成長因子受容体１ｃアイソフォーム（「ＦＧＦＲ１ｃ」）、ヒト線維芽細胞成長因子受容体３（「ＦＧＦＲ３」）、ヒトＣＤ６３、およびヒトアミロイド前駆体様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）が含まれる。

好ましくは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ１、およびＦａｂ２は、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３の各々が、そのそれぞれの標的に同時に特異的に結合することができるように選択される。いくつかの実施形態では、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３は各々、異なる標的分子に特異的に結合する。他の実施形態では、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの２つは、同じ標的分子上の異なるエピトープに結合することができる。

ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの２つが同じ標的分子上の異なるエピトープに結合する場合、標的分子への結合は、好ましくは非競合性であり、すなわち、ＡＢＳは、標的分子への結合（例えば、エピトープが重複していた場合、発生し得る）について競合しない。抗体と抗体フラグメントとの間の結合競合を測定するためのアッセイは、当該技術分野で知られており、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイ、および表面プラズモン共鳴アッセイを含む。

標的分子への結合についての競合は、例えば、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）でのリアルタイム、ラベルフリーバイオレイヤー干渉アッセイを使用して決定することができる。アッセイの具体的な実施形態では、アッセイ全体は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳ－ＥＢＴ緩衝液）中で２５℃で、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪しながら行われる。２つの抗体またはその抗原結合フラグメントが、それらの特定の標的抗原上のそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合することができるかを評価するために、ペンタ－Ｈｉｓタグ付き標的抗原（配列番号２５として開示される「ペンタ－Ｈｉｓ」）は、まず抗ペンタ－Ｈｉｓ抗体（配列番号２５として開示される「ペンタ－Ｈｉｓ」）でコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ、＃１８－５１２２）上に、バイオセンサーチップをペンタ－Ｈｉｓタグ付き標的抗原（配列番号２５として開示される「ペンタ－Ｈｉｓ」）を含有するウェルに浸漬することによって捕捉される。抗原捕捉バイオセンサーチップは、次いで、Ａｂ－１の溶液（例えば、５０μｇ／ｍＬ溶液）を含有するウェルに浸漬することによって、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（その後Ａｂ－１と呼ばれる）で飽和させる。バイオセンサーチップは、次いでその後、第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（その後Ａｂ－２と呼ばれる）の溶液（例えば、５０μｇ／ｍＬ溶液）を含有するウェルに浸漬される。バイオセンサーチップは、アッセイのすべてのステップ間にＨＢＳ－ＥＢＴ緩衝液で洗浄される。リアルタイム結合応答はアッセイの経過全体の間モニタリングされ得、すべてのステップの終了時の結合応答が記録され得る。Ａｂ－１と予め複合体形成された標的抗原へのＡｂ－２結合の応答を比較することができ、同じ標的抗原に対する異なる抗体／抗原結合フラグメントの競合性／非競合性挙動を決定することができる。

少なくとも２つ以上の異なる標的分子に結合するＭＢＭを使用して、例えば、結合が望ましくない他の組織タイプへの結合を最小限に抑えながら、２つ以上の標的分子が発現される特定の組織タイプを優先的に標的とすることができる。例えば、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの１つまたは２つが、第１の組織発現プロファイルを有する第１の標的分子に結合し、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの少なくとも１つが、第１の組織発現プロファイルと重複するが同一ではない、第２の発現プロファイルを有する第２の異なる標的分子に結合する場合、ＭＢＭは、第１および第２の発現プロファイルの共通組織を標的とすることができる。

同じ標的分子（同じエピトープ上または異なるエピトープ上にかかわらず）に結合する２つ以上のＡＢＳを有するＭＢＭは、細胞表面受容体のクラスター化および活性化に有用であり得る。

発現プロファイルは、経験的に決定することができるか、またはＧｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）プロジェクトおよびＨｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓなどの公開データベースから取得することができる。標的選択は、タンパク質発現プロファイル、ｍＲＮＡ発現プロファイル、または両方に基づくことができる。望ましくない組織部位でのＭＢＭ活性を最小限に抑えるために、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの任意の２つまたは３つすべての間の組織発現の重複は、好ましくは１０組織、例えば、９組織、８組織、７組織、６組織、５組織、４組織、３組織、２組織、または１組織未満である。本開示のＭＢＭによって結合される例示的な標的対、ＫＬＢおよびＦＧＦＲ１ｃについての例示的な組織プロファイル分析は、図４Ａ（ＧＴＥｘデータベースに基づく）および４Ｂ（ＨＰＡデータベースに基づく）に示される。

様々な実施形態では、
・ＡＢＳ１およびＡＢＳ２は、同じ標的分子上の同じまたは異なるエピトープに結合し、ＡＢＳ３は、異なる標的分子に結合するか、
・ＡＢＳ１およびＡＢＳ３は、同じ標的分子上の同じまたは異なるエピトープに結合し、ＡＢＳ２は、異なる標的分子に結合するか、
・ＡＢＳ２およびＡＢＳ３は、同じ標的分子上の同じまたは異なるエピトープに結合し、ＡＢＳ１は、異なる標的分子に結合するか、
・ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３は、異なる標的分子に結合するか、または
・ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３は、同じ標的分子上の同じまたは異なるエピトープに結合する。

ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの２つ以上が標的分子上の同じエピトープに結合する場合、そのようなＡＢＳは、同じまたは異なるＶＨ配列および／またはＶＬ配列を有し得る。

理論によって拘束されることなく、本開示のＭＢＭは、すべての３つのＡＢＳを欠く親単一特異性抗体または二重特異性抗体よりも大きな親和性で標的分子（または標的分子を発現する細胞）に結合する利点を有すると考えられる。したがって、本開示のＭＢＭは、いくつかの実施形態では、１つ以上の標的分子および／またはすべての３つのＡＢＳを欠く親単一特異性抗体もしくは二重特異性抗体、例えば、ＡＢＳ１のｓｃＦｖが欠く二重特異性抗体よりも大きな親和性で１つ以上の標的分子を発現する細胞に結合することができる。例えば、ＭＢＭは、いくつかの実施形態では、細胞ベースの結合アッセイにおいて対応する親単一特異性抗体または二重特異性抗体よりも（例えば、セクション７に記載されるように）標的分子への結合についてより低いＫＤを有し、かつ／またはより強力なＥＣ５０値を有し得る。

所与の抗体またはＭＢＭのアゴニストまたはアンタゴニスト活性は、標的選択、エピトープカバレージ、およびフォーマットの選択に依存する。アゴニストおよびアンタゴニスト抗体の特定は、例えば、機能に基づくスクリーニングを通して、達成することができる。本開示のＮ末端ｓｃＦｖ ＭＢＭは、典型的には、ｓｃＦｖ融合前の親抗体または親二重特異性抗体がそれぞれアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する場合、アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する。理論によって拘束されることなく、本開示のＭＢＭは、従来の二重特異性分子（例えば、２つのＦａｂを含有するがＮ末端ｓｃＦｖドメインを欠く親二重特異性分子）と比較して、例えば、追加のＮ末端ｓｃＦｖドメインによって付与された新規結合化学量論により、増強された活性（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト活性）によって特徴付けられると考えられる。

６．３．１．ＫＬＢ－ＦＧＦＲ１ｃ結合剤
本開示のＭＢＭは、いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＢに結合する１つ以上のＡＢＳ、およびヒトＦＧＦＲ１ｃに（例えば、ループＤ２またはＤ３に）結合する１つ以上のＡＢＳを含有することができる。ＫＬＢおよびＦＧＦＲ１ｃの両方を発現するヒト組織には、脂肪組織、乳腺組織、肝臓、肺、膵臓、胃、および精巣が含まれる（図４Ａ－４Ｂを参照されたい）。したがって、ヒトＫＬＢに結合する１つ以上のＡＢＳおよびヒトＦＧＦＲ１ｃに結合する１つ以上のＡＢＳを有する本開示のＭＢＭは、これらの組織タイプを優先的に標的とすることができる。ＦＧＦファミリーのメンバーであるＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃおよびＫＬＢで構成される受容体複合体を通してシグナル伝達するため、内分泌ホルモンとして機能する。この標的対の１つの例示的な構成において、ＡＢＳ１およびＡＢＳ３は、ＫＬＢの異なるエピトープに結合し、ＡＢＳ２は、ＦＧＦＲ１ｃに結合する。理論によって拘束されることなく、この構成を有するＭＢＭの結合は、受容体複合体を悩ませ、図５に示される代謝の利益をもたらすと考えられる。

例示的な抗ＫＬＢ抗体は、表２Ａに提供され、本開示のＭＢＭにおいて使用することができる例示的な抗ＫＬＢ抗体のＶＨおよびＶＬ配列は、表２Ｂに提供される。本開示のＭＢＭは、例えば、表２Ａまたは表２Ｂに提供される抗ＫＬＢ抗体のうちのいずれかのＣＤＲまたはＶＨおよび／もしくはＶＬ配列を含むことができる。例示的な抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体は、表３Ａに提供され、本開示のＭＢＭにおいて使用することができる例示的な抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体のＶＨおよびＶＬ配列は、表３Ｂに提供される。本開示のＭＢＭは、例えば、表３Ａまたは表３Ｂに提供される抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体のうちのいずれかのＣＤＲまたはＶＨおよび／もしくはＶＬ配列を含むことができる。

６．３．２．ＦＧＦＲ３－ＡＰＬＰ２結合剤
本開示のＭＢＭは、いくつかの実施形態では、ヒトＦＧＦＲ３に結合する１つ以上のＡＢＳ、およびヒトＡＰＬＰ２に結合する１つ以上のＡＢＳを含有することができる。ＦＧＦＲ３は、膀胱がんにおける臨床的に検証された腫瘍ドライバーである。ＡＰＬＰ２は、急速な内在化および分解を受け得る細胞表面受容体として同定されている。ＦＧＦＲ３遮断およびＡＰＬＰ２を介したＦＧＦＲ３の増強された下方調節の両方を誘導するために、本開示のＭＢＭは、ヒトＦＧＦＲ３に結合する１つ以上のＡＢＳおよびヒトＡＰＬＰ２に結合する１つ以上のＡＢＳを有し得る。この標的対の１つの例示的な構成において、ＡＢＳ２およびＡＢＳ３は、ＦＧＦＲ３の同じエピトープに結合し、ＡＢＳ１は、ＡＰＬＰ２に結合する。理論によって拘束されることなく、この構成を有するＭＢＭの結合は、ＦＧＦＲ３受容体複合体の遮断および／または分解をもたらすと考えられる。

例示的な抗ＦＧＦＲ３抗体配列は、表４に提供される。本開示のＭＢＭは、例えば、表４に提供される抗ＦＧＦＲ３抗体のうちのいずれかのＣＤＲまたはＶＨおよび／もしくはＶＬ配列を含むことができる。例示的な抗ＡＰＬＰ２抗体は、表５に提供される。本開示のＭＢＭは、例えば、表５に提供される抗ＡＰＬＰ２抗体のうちのいずれかのＣＤＲまたはＶＨおよび／もしくはＶＬ配列を含むことができる。

６．３．３．ＦＧＦＲ３－ＣＤ６３結合剤
本開示のＭＢＭは、いくつかの実施形態では、ヒトＦＧＦＲ３に結合する１つ以上のＡＢＳ、およびヒトＣＤ６３に結合する１つ以上のＡＢＳを含有することができる。ＦＧＦＲ３は、膀胱がんにおける臨床的に検証された腫瘍ドライバーである。ＣＤ６３は、関連パートナーの輸送を調節することができる遍在的に発現する細胞表面テトラスパニンである。ＦＧＦＲ３遮断およびＣＤ６３を介したＦＧＦＲ３の増強された下方調節または表面保持の両方を誘導するために、本開示のＭＢＭは、ヒトＦＧＦＲ３に結合する１つ以上のＡＢＳおよびヒトＣＤ６３に結合する１つ以上のＡＢＳを有し得る。この標的対の１つの例示的な構成において、ＡＢＳ２およびＡＢＳ３は、ＦＧＦＲ３の同じエピトープに結合し、ＡＢＳ１は、ＣＤ６３に結合する。理論によって拘束されることなく、この構成を有するＭＢＭの結合は、ＦＧＦＲ３受容体複合体の遮断および／または分解をもたらすと考えられる。

例示的な抗ＦＧＦＲ３抗体配列は、上記の表４に提供される。本開示のＭＢＭは、例えば、表４に提供される抗ＦＧＦＲ３抗体のうちのいずれかのＣＤＲまたはＶＨおよび／もしくはＶＬ配列を含むことができる。本開示のＭＢＭにおいて使用することができる例示的な抗ＣＤ６３抗体のＶＨおよびＶＬ配列は、表６に提供される。本開示のＭＢＭは、例えば、表６に提供される抗ＣＤ３抗体のうちのいずれかのＣＤＲまたはＶＨおよび／もしくはＶＬ配列を含むことができる。

６．４．抗体薬物コンジュゲート
本開示のＭＢＭは、特に、ＭＢＭががん治療剤としての使用を意図した場合、例えば、リンカーを介して、薬物部分にコンジュゲートすることができる。そのようなコンジュゲートは、便宜上、本明細書では抗体－薬物コンジュゲート（または「ＡＤＣ」）と呼ばれる。

ある特定の態様では、薬物部分は、細胞毒性または細胞増殖抑制活性を発揮する。一実施形態では、薬物部分は、メイタンシノイド、キネシン様タンパク質ＫＩＦ１１阻害剤、Ｖ－ＡＴＰアーゼ（液胞型Ｈ＋－ＡＴＰアーゼ）阻害剤、アポトーシス促進剤、Ｂｃｌ２（Ｂ細胞リンパ腫２）阻害剤、ＭＣＬ１（骨髄細胞白血病１）阻害剤、ＨＳＰ９０（熱ショックタンパク質９０）阻害剤、ＩＡＰ（アポトーシスの阻害剤）阻害剤、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの機械的標的）阻害剤、微小管安定剤、微小管不安定剤、オーリスタチン、ドラスタチン、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、ＣＲＭ１（染色体維持１）阻害剤、ＤＰＰＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２（サイクリン依存性キナーゼ２）阻害剤、ＣＤＫ９（サイクリン依存性キナーゼ９）阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）阻害剤から選択される。

いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、以下の構造を有するメイタンシノイドである。

いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、以下の構造を有するメイタンシノイドである。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、本開示のＭＢＭを含み、

は、ＭＢＭへの結合である。
いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、本開示のＭＢＭを含み、

は、ＭＢＭへの結合である。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、本開示のＭＢＭを含み、

または
それらの混合物を含み、

は、本開示のＭＢＭへの結合である。
いくつかの実施形態では、結合は、システイン残基の硫黄成分を介してＭＢＭに連結される。

いくつかの実施形態では、結合は、リジン残基の窒素成分を介してＭＢＭに連結される。
本開示のＡＤＣでは、細胞毒性剤および／または細胞増殖抑制剤は、ＡＤＣリンカーによってＭＢＭに連結される。細胞毒性剤および／または細胞増殖抑制剤をＡＤＣのＭＢＭに連結するＡＤＣリンカーは、短、長、疎水性、親水性、可撓性、もしくは剛性であり得るか、またはリンカーが異なる特性を有するセグメントを含み得るように、各々独立して上記の特性のうちの１つ以上を有するセグメントで構成され得る。リンカーは、２つ以上の薬剤をＭＢＭ上の単一の部位に共有的に連結するように多価であり得るか、または共有的にそれらが単一の薬剤をＭＢＭ上の単一の部位に連結するように一価であり得る。

ある特定の態様では、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、プロ荷電リンカー、またはジカルボン酸ベースのリンカーから選択される。
当業者によって理解されるように、ＡＤＣリンカーは、１つ場所で細胞毒性剤および／または細胞増殖抑制剤への共有連結、ならびに別の場所でＭＢＭへの共有連結を形成することによって、細胞毒性剤および／または細胞増殖抑制剤をＭＢＭに連結する。共有連結は、ＡＤＣリンカー上の官能基と薬剤およびＭＢＭ上の官能基との間の反応によって形成される。

ＡＤＣリンカーは、好ましくは、細胞外で条件に対して化学的に安定であるが、そうである必要はなく、細胞内で切断、破壊、および／または他の方法で特異的に分解するように設計され得る。代替的に、細胞内で特異的に切断または分解するように設計されないＡＤＣリンカーが使用され得る。安定対不安定ＡＤＣリンカーの選択は、細胞毒性剤および／または細胞増殖抑制剤の毒性に依存し得る。正常細胞に毒性である薬剤について、安定リンカーが好ましい。選択的であるか、または標的化され、正常細胞に対してより低い毒性を有する薬剤が利用され得、細胞外環境に対するＡＤＣリンカーの化学的安定性はあまり重要ではない。ＡＤＣの文脈で薬物をＭＢＭに連結するために有用な多種多様なＡＤＣリンカーは、当該技術分野で知られている。これらのＡＤＣリンカー、および他のＡＤＣリンカーのいずれかは、細胞毒性剤および／または細胞増殖抑制剤を本開示のＡＤＣのＭＢＭに連結するために使用され得る。

多くの細胞毒性剤および／または細胞増殖抑制剤を単一のＭＢＭ分子に連結するために使用され得る例示的な多価ＡＤＣリンカーは、例えば、国際公開第２００９／０７３４４５号、国際公開第２０１０／０６８７９５号、国際公開第２０１０／１３８７１９号、国際公開第２０１１／１２００５３号、国際公開第２０１１／１７１０２０号、国際公開第２０１３／０９６９０１号、国際公開第２０１４／００８３７５号、国際公開第２０１４／０９３３７９号、国際公開第２０１４／０９３３９４号、国際公開第２０１４／０９３６４０号に記載され、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、Ｍｅｒｓａｎａらによって開発されたＦｌｅｘｉｍｅｒリンカー技術は、良好な物理化学的特性を有する高ＤＡＲ ＡＤＣを可能にする潜在性を有する。Ｍｅｒｓａｎａ技術は、一連のエステル結合を介して、薬物分子を可溶化ポリアセタール骨格に組み込むことに基づく。方法論は、良好な物理化学的特性を維持しながら、高負荷ＡＤＣ（最大２０のＤＡＲ）を与える。

使用され得る例示的な一価ＡＤＣリンカーは、例えば、Ｎｏｌｔｉｎｇ，２０１３，Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０４５：７１－１００、Ｄｕｃｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２１：５－１３、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５４：３６０６－３６２３、米国特許第７，２２３，８３７号、米国特許第８，５６８，７２８号、米国特許第８，５３５，６７８号、および国際公開第２００４／０１０９５７号に記載され、これらの各々は、参照によって本明細書に組み込まれる。

限定ではなく例として、本開示のＡＤＣに含まれ得るいくつかの切断可能および切断不可能なＡＤＣリンカーを以下に記載する。
特定の実施形態では、選択されたＡＤＣリンカーは、インビボで切断可能である。切断可能なＡＤＣリンカーは、化学的または酵素的に不安定なまたは分解可能な連結を含み得る。切断可能なＡＤＣリンカーは、一般に、細胞質における還元、リソソームにおける酸性条件への曝露、細胞内の特定のプロテアーゼまたは他の酵素による切断などの、薬物を遊離させる細胞内部のプロセスに依存する。切断可能なＡＤＣリンカーは、一般に、化学的または酵素的のいずれかで切断可能な１つ以上の化学結合を組み込むが、ＡＤＣリンカーの残部は切断不可能である。特定の実施形態では、ＡＤＣリンカーは、ヒドラゾンおよび／またはジスルフィド基などの化学的に不安定な基を含む。化学的に不安定な基を含むリンカーは、血漿といくつかの細胞質コンパートメントとの間の異なる特性を利用する。ヒドラゾン含有ＡＤＣリンカーの薬物放出を促進する細胞内条件は、エンドソームおよびリソソームの酸性環境であるが、ジスルフィド含有ＡＤＣリンカーは、高チオール濃度、例えば、グルタチオンを含有する、サイトゾルにおいて還元される。特定の実施形態では、化学的に不安定な基を含むＡＤＣリンカーの形質安定性は、化学的に不安定な基の近くの置換基を使用して立体障害を導入することによって増加され得る。

切断可能なＡＤＣリンカーは、切断不可能な部分もしくはセグメントを含み得、かつ／または切断可能なセグメントもしくは部分は、そうでなければ切断不可能なＡＤＣリンカーに含まれ、それを切断可能にし得る。ほんの一例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および関連ポリマーは、ポリマー骨格に切断可能な基を含み得る。例えば、ポリエチレングリコールまたはポリマーＡＤＣリンカーは、ジスルフィド、ヒドラゾン、またはジペプチドなどの１つ以上の切断可能な基を含み得る。

ＡＤＣリンカーに含まれ得る他の分解可能な連結は、ＰＥＧカルボン酸または活性化ＰＥＧカルボン酸の、生物学的活性剤上のアルコール基との反応によって形成されるエステル連結を含み、そのようなエステル基は、一般に、生理学的条件下で加水分解して、生物学的活性剤を放出する。加水分解的に分解可能な連結は、これらに限定されないが、炭酸塩連結；アミンおよびアルデヒドの反応から生じるイミン連結；アルコールをリン酸塩基と反応させることによって形成されるリン酸エステル連結；アルデヒドおよびアルコールの反応産物であるアセタール連結；ギ酸塩およびアルコールの反応産物であるオルトエステル連結；ならびにポリマーの末端、およびオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基を含むが、これらに限定されない、ホスホラミダイト基によって形成されるオリゴヌクレオチド連結を含む。

特定の実施形態では、ＡＤＣリンカーは、酵素的に切断可能なペプチド部分、例えば、トリペプチドまたはジペプチドを含む。特定の実施形態では、ジペプチドは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｃｉｔ－Ｖａｌ、Ａｌａ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｃｉｔ、Ｃｉｔ－Ａｌａ、Ａｓｎ－Ｃｉｔ、Ｃｉｔ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｇｌｕ、Ｇｌｕ－Ｖａｌ、Ｓｅｒ－Ｃｉｔ、Ｃｉｔ－Ｓｅｒ、Ｌｙｓ－Ｃｉｔ、Ｃｉｔ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｃｉｔ、Ｃｉｔ－Ａｓｐ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、ｌｌｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、およびＴｒｐ－Ｃｉｔから選択される。特定の実施形態では、ジペプチドは、Ｃｉｔ－Ｖａｌ、およびＡｌａ－Ｖａｌから選択される。

上記または本明細書で論じられるＡＤＣの様々な実施形態のいずれにおいても、ＡＤＣは、１～２０、より典型的には２～１０の範囲の薬物：抗体比（または、この場合、薬物：ＭＢＭ比）を有し得る。

６．５．核酸および宿主細胞
別の態様では、本開示は、本開示のＭＢＭをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＢＭは、単一の核酸によってコードされる。他の実施形態では、ＭＢＭは、複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の）核酸によってコードされる。

単一の核酸は、単一のポリペプチド鎖を含むＭＢＭ、２つ以上のポリペプチド鎖を含むＭＢＭ、または３つ以上のポリペプチド鎖を含むＭＢＭの一部分をコードすることができる（例えば、単一の核酸は、３つ、４つ以上のポリペプチド鎖を含むＭＢＭの２つのポリペプチド鎖、または４つ以上のポリペプチド鎖を含むＭＢＭの３つのポリペプチド鎖をコードすることができる）。別個の発現の制御のために、２つ以上のポリペプチド鎖をコードするオープンリーディングフレームを、別個の転写調節要素（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）の制御下に置くことができる。２つ以上のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームはまた、同じ転写調節要素によって制御され、かつ内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって分離され、別個のポリペプチドへの翻訳を可能にし得る。

いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチド鎖を含むＭＢＭは、２つ以上の核酸によってコードされる。ＭＢＭをコードする核酸の数は、ＭＢＭ中のポリペプチド鎖の数以下（例えば、２つ以上のポリペプチド鎖が単一の核酸によってコードされる場合）であり得る。

本開示の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。
別の態様では、本開示は、本開示の核酸を含有する宿主細胞およびベクターを提供する。核酸は、本明細書に以下でより詳細に記載されるように、単一のベクターまたは同じ宿主細胞もしくは別個の宿主細胞に存在する別個のベクターに存在し得る。

６．５．１．ベクター
本開示は、本明細書に記載されるＭＢＭまたはＭＢＭ成分をコードするヌクレオチド配列、例えば、半抗体のポリペプチド鎖のうちの１つまたは２つを含むベクターを提供する。ベクターには、これらに限定されないが、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージ、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。

多数のベクターシステムを使用することができる。例えば、１つのクラスのベクターは、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。別のクラスのベクターは、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、およびフラビウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡ要素を利用する。

追加的に、ＤＮＡをそれらの染色体に安定して組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、例えば、栄養要求性宿主への原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性などを提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結するか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入することができる。ｍＲＮＡの最適な合成には、追加の要素が必要な場合もある。これらの要素は、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。

構築物を含有する発現ベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために調製されると、発現ベクターは、トランスフェクトするか、または適切な宿主細胞に導入することができる。これを達成するために、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、遺伝子銃、脂質ベースのトランスフェクション、または他の従来の技法などの、様々な技法が使用され得る。得られるトランスフェクトされた細胞を培養し、発現されたポリペプチドを回収するための方法および条件は、当業者に知られており、本記載に基づいて、使用される特定の発現ベクターおよび哺乳動物宿主細胞に応じて変更または最適化され得る。

６．５．２．細胞
本開示はまた、本開示の核酸を含む宿主細胞を提供する。
一実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される１つ以上の核酸を含むように遺伝子操作される。

一実施形態では、宿主細胞は、発現カセットを使用することによって遺伝子操作される。「発現カセット」という句は、そのような配列と適合性の宿主における遺伝子の発現に影響を与えることができる、ヌクレオチド配列を指す。そのようなカセットは、プロモーター、イントロンを伴うまたは伴わないオープンリーディングフレーム、および終結シグナルを含み得る。例えば、誘導性プロモーターなどの、発現をもたらすのに必要または有用な追加の因子も使用され得る。

本開示はまた、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
細胞は、これらに限定されないが、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞であり得る。好適な真核細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、およびＭＤＣＫＩＩ細胞が含まれるが、これらに限定されない。好適な昆虫細胞には、Ｓｆ９細胞が含まれるが、これに限定されない。

６．６．薬学的組成物
本開示のＭＢＭおよび／またはＡＤＣは、ＭＢＭおよび／またはＡＤＣならびに１つ以上の担体、賦形剤、および／または希釈剤を含む組成物の形態であり得る。組成物は、獣医学的使用またはヒトにおける薬学的使用などの、特定の使用のために製剤化され得る。組成物の形態（例えば、乾燥粉末、液体製剤など）、ならびに使用される賦形剤、希釈剤、および／または担体は、ＭＢＭおよび／またはＡＤＣの意図される使用、ならびに治療上の使用について、投与様式に依存する。

治療使用について、組成物は、薬学的に許容される担体を含む無菌薬学的組成物の一部として供給され得る。この組成物は、（それを患者に投与する所望の方法に応じて）任意の好適な形態であり得る。薬学的組成物は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、髄腔内、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、または局所（ｌｏｃａｌｌｙ）などの様々な経路によって患者に投与することができる。任意の所与の場合における投与に最も適した経路は、特定の抗体および／またはＡＤＣ、対象、ならびに疾患の性質および重症度ならびに対象の体調に依存するであろう。典型的には、薬学的組成物は、静脈内または皮下に投与されるであろう。

薬学的組成物は、用量当たりの本開示の所定量のおよびＭＢＭ／またはＡＤＣを含有する単位剤形で便利に提示することができる。単位用量に含まれるＭＢＭおよび／またはＡＤＣの量は、治療される疾患、および当該技術分野で周知の他の因子に依存するであろう。そのような単位投与量は、単回投与に適した量のＭＢＭおよび／もしくはＡＤＣを含有する凍結乾燥された乾燥粉末の形態、または液体の形態であり得る。乾燥粉末単位剤形は、シリンジ、好適な量の希釈剤、および／または投与に有用な他の成分を備えたキットに包装され得る。液体形態の単位投与量は、単回投与に適した量のＭＢＭおよび／またはＡＤＣが予め充填されたシリンジの形態で便利に供給され得る。

薬学的組成物はまた、複数回の投与に適した量のＡＤＣを含有することから大量に供給され得る。
薬学的組成物は、所望の純度を有するＭＢＭおよび／またはＡＤＣを、当該技術分野で典型的に使用される任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（これらのすべては本明細書で「担体」として参照される）、すなわち、緩衝剤、安定剤、防腐剤、等張剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤、および他の種々の添加剤と混合することによって、凍結乾燥された製剤または水溶液としての保存のために調製され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｓｏｌ，ｅｄ．１９８０）を参照されたい。そのような添加剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに無毒であるべきである。

緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲のｐＨを維持するのに役立つ。それらは、多種多様な濃度で存在し得るが、典型的には、約２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲の濃度で存在するであろう。本開示での使用に適した緩衝剤には、有機および無機酸の両方、ならびにそれらの塩、例えば、クエン酸塩緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム－クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸塩緩衝液（例えば、コハク酸－コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸－水酸化ナトリウム混合物、コハク酸－コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸塩緩衝液（例えば、酒石酸－酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸－酒石酸カリウム混合物、酒石酸酸－水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝液（例えば、フマル酸－フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸－フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム－フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸塩緩衝液（例えば、グルコン酸－グリコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸－水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸－グリコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸塩緩衝液（例えば、シュウ酸－シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸－水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸－シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸塩緩衝液（例えば、乳酸－乳酸ナトリウム混合物、乳酸－水酸化ナトリウム混合物、乳酸－乳酸カリウム混合物など）、および酢酸塩緩衝液（例えば、酢酸－酢酸ナトリウム混合物、酢酸－水酸化ナトリウム混合物など）が含まれる。追加的に、リン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびトリスなどのトリメチルアミン塩を使用することができる。

防腐剤は、微生物成長を遅らせるために添加され得、約０．２％～１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加することができる。本開示での使用に適した防腐剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、およびアルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、ならびに３－ペンタノールが含まれる。「安定剤」として知られる等張化剤は、本開示の液体組成物の等張性を確保するために添加することができ、多価糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールなどの三価または高級糖アルコールを含む。安定剤とは、増量剤から、治療剤を可溶化するか、または変性もしくは容器壁への接着を防止するのを助ける添加剤まで、機能の範囲がおよび得る幅広いカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上記に列挙される）；アミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなど（シクリトール、例えば、イノシトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）；タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン単糖類、例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類、例えば、ラクトース、マルトース、スクロース、およびトレハロース；ならびに三糖類、例えば、ラフィノース；ならびに多糖類、例えば、デキストランであり得る。安定剤は、ＡＤＣの重量当たり０．５～１０重量％の範囲の量で存在し得る。

非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られる）は、糖タンパク質を可溶化するのを助け、糖タンパク質を撹拌によって誘導される凝集に対して保護するために添加され得、これはまた、製剤が、タンパク質の変性を引き起こすことなく応力を印加されたせん断表面に曝露されることを可能にする。好適な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、およびプルロニック（登録商標）ポリオールが含まれる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．０７ｍｇ／ｍＬ～約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在し得る。

追加の種々の賦形剤には、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が含まれる。

６．７．治療適応症
本開示のＭＢＭ、ＡＤＣ、および薬学的組成物は、がん、例えば、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３が結合する標的分子の発現に関連するがんを治療するために使用することができる。

したがって、一態様では、本開示は、がんを治療する方法であって、がんに罹患している対象に、有効量の本開示のＭＢＭ、コンジュゲート、または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、ＦＧＦＲ３に結合し、任意にＣＤ６３に結合するか、またはＡＰＬＰ２に結合する本開示のＭＢＭを使用して、膀胱がん、膠芽腫、および扁平上皮肺がんを治療することができる。

本開示のＭＢＭ、ＡＤＣ、および薬学的組成物は、非がん適応症、例えば、非アルコール性脂肪肝炎（「ＮＡＳＨ」）の治療、代謝性疾患の治療、循環ＨＤＬコレステロールの低減、循環ＬＤＬコレステロールの増加、血中トリグリセリドの低減、血中グルコースの低減、肥満症の治療、および糖尿病の治療にも使用することができる。そのような非がん適応症について、いくつかの実施形態では、ＭＢＭは、ＫＬＢおよび／またはＦＧＦＲ１ｃを標的とする。

したがって、一態様では、本開示は、循環ＨＤＬコレステロールを低減させる方法であって、上昇したＨＤＬレベルを抱えている対象に、有効量の本開示のＭＢＭ、コンジュゲート、または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、循環ＬＤＬコレステロールを増加させる方法であって、低いＬＤＬレベルを抱えている対象に、有効量の本開示のＭＢＭ、コンジュゲート、または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、血中トリグリセリドを低減させる方法であって、上昇したトリグリセリドレベルを抱えている対象に、有効量の本開示のＭＢＭ、コンジュゲート、または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、血中グルコースを低減させる方法であって、上昇したグルコースレベルを抱えている対象に、有効量の本開示のＭＢＭ、コンジュゲート、または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、肥満症を治療する方法であって、肥満症に罹患している対象に、有効量の本開示のＭＢＭ、コンジュゲート、または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、糖尿病を治療する方法であって、糖尿病に罹患している対象に、有効量の本開示のＭＢＭ、コンジュゲート、または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。

７．実施例
７．１．実施例１：ＦＧＦＲ１ｃ ｘ ＫＬＢ ｘ ＫＬＢ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭ
７．１．１．材料および方法
７．１．１．１．ＭＢＭの生成
ＫＬＢエピトープ１（ｅｐ１）またはエピトープ２（ｅｐ２）に結合する様々なＫＬＢ ｓｃＦｖを、ＦＧＦＲ１ｃおよびＫＬＢの両方を標的とする既存のＩｇＧ様二重特異性分子、ＲＥＧＮ４３６６からのＦＧＦＲ１ｃ ＶＨドメインのＮ末端に融合させた（図１および表７）。

（ｉ）ＶＬ（１００Ｃ変異、Ｋａｂａｔ番号付けを有する）、リンカー（４ｘＧ_４Ｓ（配列番号５７））、およびＶＨ（４４Ｃ変異、Ｋａｂａｔ番号付けを有する）、続いてｓｃＦｖをＦＧＦＲ１ｃ結合Ｆａｂに接続するための様々な長さのリンカーの配向の様々なＫＬＢ ｓｃＦｖ、（ｉｉ）ＦＧＦＲ１ｃ結合Ｆａｂ、ならびに（ｉｉｉ）ノブ形成変異（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、ＥＵ番号付け）、ホール形成変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、ＥＵ番号付け）、および星型変異（Ｈ４３５Ｒ、Ｙ４３６Ｆ、ＥＵ番号付け）を有するＩｇＧ１ ＦｃドメインをコードするＤＮＡフラグメントを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって合成した。

個々の重鎖の哺乳動物発現ベクターは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）または制限消化、続いてＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．によって提供される標準的な分子クローニングプロトコルに従ったライゲーションのいずれかによって作製した。ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ／ＫＬＢ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭｓ （Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ１－９）の発現のために、重鎖（「Ｈｃ１－ノブ」および「Ｈｃ２－ホール^＊」）およびユニバーサル軽鎖ＤＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にコトランスフェクトした。５０ｍｌの細胞培養培地を回収し、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介した精製のために処理した。機能確認のために、選択されたＭＢＭを２００ｍｌまでスケールアップし、最終ステップとしてサイズ排除クロマトグラフィーを含む一連の精製手順に供した。ＫＬＢに結合するＦａｂおよびＦＧＦＲ１ｃに結合するＦａｂを有する、ＲＥＧＮ４３６６を作製および精製して、ＩｇＧ様二重特異性対照分子として機能させた。

７．１．１．２．ＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃＨＳ／ｈＫＬＢレポーターベースのアッセイ
ＭＢＭは、血清応答要素（ＳＲＥ）を含有するプロモーターの制御下で、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびＫＬＢ、ならびにルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現したＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃＨＳ／ｈＫＬＢ細胞を使用してそれらのアゴニスト活性について試験した。６ｘＨｉｓタグ（配列番号５８）を有する組換えヒトＦＧＦ２１を陽性対照として使用し、ＦＧＦ２１から得られた最大レポーター活性を１００％活性として定義した。細胞を、各ＭＢＭまたは６ｘＨｉｓ－ＦＧＦ２１で６時間処理し、次いでルシフェラーゼアッセイに供した。個々のＭＢＭによって誘導された活性パーセントを、ＦＧＦ２１による最大活性に対して正規化した。ＥＣ５０を決定するために用量－応答アッセイを実施した。

７．１．１．３．ｈＦＧＦＲ１ｃおよびｈＫＬＢ結合についてのＢｉａｃｏｒｅ分析
Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６についての結合の親和性および作用機序は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって決定した。ＫＬＢについてのＦ１Ｋ－ｓｃＦｖ６の見かけの親和性を、親ＫＬＢ ｍＡｂの一価の親和性と比較するために、抗体捕捉フォーマットを使用した。簡潔には、ＦＧＦＲ１ｃ親ｍＡｂ １９８４２、ＫＬＢ親ｍＡｂ ２２５３２Ｐ２および２２３９３Ｐ２、ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ親二重特異性抗体ＲＥＧＮ４３６６およびＦ１Ｋ－ｓｃＦｖ６を、抗ヒトＦｃ抗体（ＲＥＧＮ２５６７）とＣＭ５チップ上に固定化した。異なる濃度のｈＦＧＦＲ１ｃ＿Ｖ５＿６ｘＨｉｓ（８００－１２．５ｎＭ、４倍希釈）またはｈＫＬＢ．ＨＡ．６ｘＨｉｓ（１００－１．５６ｎＭ、４倍希釈）を５０μＬ／分で２分間注入し、アッセイを２５℃で行った。結合速度パラメータを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃを使用した１：１結合モデルを使用してリアルタイムデータをあてはめることによって測定した。

７．１．１．４．フローサイトメトリーによる細胞ベースの結合
ＨＥＫ２９３／Ｃａｓ９－ｈＦＧＦＲ１／ｈＫＬＢ（ＫＬＢ^＋）、ＨＥＫ２９３／ｈＦＧＦＲ１ｃ（ｈＦＧＦＲ１ｃ^＋）、およびＨＥＫ２９３／ｈＦＧＦＲ１ｃ／ｈＫＬＢ（ｈＦＧＦＲ１ｃ^＋／ｈＫＬＢ^＋）細胞を、完全ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｘペンストレプ－グルタミン）に１×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁し、染色を１×１０^５細胞で行った。ＭＢＭを添加し、細胞を３０分間２～８℃で染色した。細胞を、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（１％ＦＢＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で２回洗浄し、１８００ＲＰＭで４分間４℃で遠心分離した。アロフィコシアニン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０９－１３６－０９８，１：４００）を添加し、細胞と３０分間２～８℃でインキュベートした。細胞を、前と同じように洗浄し、１００μＬの２％パラホルムアルデヒドに再懸濁した。細胞を２～８℃で３０分間インキュベートし、２回洗浄した。染色された細胞を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）ＦＡＣＳ装置を用いて分析した。

７．１．２．結果
７．１．２．１．ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ／ＫＬＢ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭの生成
表７に示される特徴を有する９つのＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ／ＫＬＢ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭを発現し、精製した。

７．１．２．２．ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ／ＫＬＢ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ三重特異性分子のエピトープ依存性活性
精製されたＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ／ＫＬＢ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭのアゴニスト活性を分析するためにＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃＨＳ／ｈＫＬＢを使用した細胞ベースのレポーターアッセイの結果を表８に示す。Ｆ１Ｋ＿ｓｃＦｖ３、Ｆ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６、およびＦ１Ｋ＿ｓｃＦｖ９は、活性％に基づいて上位の活性剤であることがわかった。それらはすべて、ＫＬＢ ｅｐ２領域に結合する同じＫＬＢ標的化ｓｃＦｖを共有し、元のＫＬＢ Ｆａｂと同じＫＬＢ ｅｐ１領域を標的化するｓｃＦｖを有するＭＢＭよりもアッセイにおいて有意に活性であった。特に、長さ３０アミノ酸のｓｃＦｖ－Ｆａｂリンカーを有するＦ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６は、５４．１％で最高の活性および最高の効力（ＥＣ５０＝９．８０Ｅ－１０Ｍ）を有することが観察された。

７．１．２．３．２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ三重特異性Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６は、同じＫＬＢ上の２つの異なるエピトープに同時に結合することができる。
Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６上のＢｉａｃｏｒｅ分析の結果を表９Ａ～９Ｂに示す。Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６は、ｈＫＬＢについて１．４７Ｅ－１１ＭのＫ_Ｄを有することがわかり、それぞれ、親ＫＬＢｍＡｂ ２２５３２Ｐ２および２２３９３Ｐ２と比較して５５倍および１，３３３倍の親和性の増加を表した。Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６がＲＥＧＮ４３６６（ｈＫＬＢの場合は２２３９３Ｐ２アーム）と比較された場合にも、ｈＫＬＢについての増強された親和性が観察された。この観察は、ＫＬＢの異なるエピトープ標的化アームを有する、Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６が、同じｈＫＬＢ分子上の両方の結合部位に同時に関与することができるという結論を強く支持する。ｈＦＧＦＲ１ｃ結合について、Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６は、その親ＦＧＦＲ１ｃ ｍＡｂ １９８４２または親二重特異性抗体ＲＥＧＮ４３６６（ｈＦＧＦＲ１ｃの場合は１９８４２アーム）と比較して、ｈＦＧＦＲ１ｃについての親和性のわずかな減少（４倍）を有する。

７．１．２．４．２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ三重特異性Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６は、ｈＫＬＢおよびｈＦＧＦＲ１ｃ／ｈＫＬＢを過剰発現する細胞により密接に結合する。
細胞ベースの設定におけるｈＫＬＢについてのＦ１Ｋ－ｓｃＦｖ６の増強された親和性の関連性をさらに確認するために、ＦＡＣＳ結合アッセイを使用して、三重特異性Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６（ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ／ＫＬＢ）の結合を二重特異性抗体ＲＥＧＮ４３６６（ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ ２２３９３アーム）およびＲＥＧＮ６７９９（ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ ２２５３２アーム）、親抗体２２３９３ ＩｇＧ（ＫＬＢ）、２２５３２ ＩｇＧ（ＫＬＢ）、および１９８４２ ＩｇＧ（ＦＧＦＲ１ｃ）と比較した。ＨＥＫ２９３／Ｃａｓ９－ｈＦＧＦＲ１／ｈＫＬＢ（ｈＦＧＦＲ１ノックアウトおよびｈＫＬＢ過剰発現）およびＨＥＫ２９３／ｈＦＧＦＲ１ｃ／ｈＫＬＢ（ｈＦＧＦＲ１ｃおよびｈＫＬＢ過剰発現）細胞の両方において、Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６は、すべての他の対照よりも結合におけるより強力なＥＣ５０を一貫して示した（図６Ａおよび６Ｃ）。ＨＥＫ２９３／ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞では、ｈＦＧＦＲ１ｃの二価性によって、１９８４２ ＩｇＧが最も強い結合を有することが観察され、ＲＥＧＮ４３６６およびＦ１Ｋ－ｓｃＦｖ６が続いた（図６Ｂ）。ＦＡＣＳ結合データは、Ｂｉａｃｏｒｅ分析とよく一致している。理論によって拘束されることなく、この実施例のデータは、２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ三重特異性設計を介したｈＫＬＢの二重エピトープ関与が、抗体媒介性ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ受容体複合体相互作用および潜在的な細胞表面クラスター化を改善することを示すと考えられる。

７．１．２．５．２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭ Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６は二重特異性ＲＥＧＮ４３６６よりも優れたアゴニスト活性を示す
Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６の増強された親和性が、二重特異性ＲＥＧＮ４３６６よりも改善された有効性につながり得るかを評価するために、ＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃＨＳ／ｈＫＬＢを使用したインビトロレポーターベースの細胞アッセイを実施した。Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６およびＲＥＧＮ４３６６の両方を、データの解釈を混乱させ得る任意の凝集を除去するために、親和性精製後の最終ステップとしてサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製した。可溶性ＦＧＦ２１に対して正規化される場合１９％のみの活性化を有する、親二重特異性抗体ＲＥＧＮ４３６６と比較して、Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６は、ルシフェラーゼ遺伝子発現の効力（ＥＣ５０）を４～５倍増強しただけでなく、活性化の％も７７％まで顕著に上昇させた（図８）。

同じ２２５３２Ｐ２ ｓｃＦｖを使用するが、２＋１ Ｃ－ｓｃＦｖと呼ばれる、ＦｃのＣ末端に融合した同様の三価分子も作製し、評価した。この対応する三重特異性分子は、Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６よりも劣った機能的活性ではるかに低い発現および精製収率を有した（結果は示されない）。

７．２．実施例２：三重特異性活性に関するリンカー長の評価
７．２．１．材料および方法
ＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃ．ｈＫＬＢ安定細胞株を、ＨＥＫ２９３細胞をＳＲＥ－ルシフェラーゼレポーター、完全長ヒトＦＧＦＲ１ｃ、および完全長ヒトＫＬＢプラスミドで順次トランスフェクトすることによって生成した。

対照二重特異性分子と同様に、ｓｃＦｖ６と呼ばれる三重特異性分子のリンカー長バリアントを生成し、ルシフェラーゼレポーターアッセイで試験した。リンカーバリアントは、ｓｃＦｖ６ ＬＫ７：Ｇ_４Ｓ ＧＧ（配列番号６３）、ｓｃＦｖ６ ＬＫ１５：３ｘＧ_４Ｓ（配列番号１）、ｓｃＦｖ６ ＬＫ２２：４ｘＧ_４Ｓ ＧＧ（配列番号６４）、ｓｃＦｖ６：６ｘＧ_４Ｓ（配列番号５９）、ｓｃＦｖ６ ＬＫ３７：７ｘＧ_４Ｓ ＧＧ（配列番号６５）、およびｓｃＦｖ６ ＬＫ４５：９ｘＧ_４Ｓ（配列番号６０）と呼ばれる。

細胞を３８４ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する完全培地で一晩培養した。培養培地を、０．１％ＦＢＳで補足されたＯｐｔｉ－ＭＥＭ還元血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）に変更した。約２４時間後、細胞を、段階希釈したリガンドで６時間処理し、次いでＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して、製造元の指示に従ってルシフェラーゼアッセイに供した。

７．２．２．結果
１つの研究では、ＲＥＧＮ４３０４およびＲＥＧＮ４３６６と呼ばれる二重特異性結合分子（ＢＢＭ）のアゴニスト活性をｈＦＧＦ２１のアゴニスト活性と比較した。このアッセイでは、ＢＢＭは、約３０％のｈＦＧＦ２１のアゴニスト活性を示した（図７）。

別の研究では、リンカー長バリアントの（図９において２および３と指定されたドメイン間のペプチドリンカーの）アゴニスト活性を、ＦＧＦ２１およびＲＥＧＮ４３０４と呼ばれるＢＢＭのアゴニスト活性と比較した。結果を以下の図９および表１０に示す。

すべてのリンカー長バリアントは、対照二重特異性結合分子の少なくとも約２倍の活性を示し、最短のリンカー長（７または１５アミノ酸）を有するバリアントは、最大のアゴニスト活性を示した。

７．３．実施例３：ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＧＦＲ１ｃシグナル伝達の活性化
７．３．１．材料および方法
ＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃ．ｈＫＬＢ安定細胞株を、実施例３に記載されるように生成した。ウエスタンブロット分析のために、ＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃ．ｈＫＬＢ細胞を、６ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する完全培地で一晩培養した。培養培地を、０．１％ＦＢＳで補足されたＯｐｔｉ－ＭＥＭ還元血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）に変更した。約２４時間後、希釈したリガンドを細胞に最終的な１ｎＭまたは１０ｎＭの濃度まで添加した。１５分の処理後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、および０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）に溶解した。総細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分解し、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ウエスタンブロット分析のために、以下の一次抗体を使用した：総ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９１０２）、ホスホ－ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９１０１）、ＰＬＣ－ガンマ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、５６９０）、リン光体－ＰＬＣガンマ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２８２１）。

７．３．２．結果
二重特異性および三重特異性結合分子のアゴニスト活性を、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびヒトＫＬＢを安定して発現するＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃ．ｈＫＬＢ細胞において、陰性対照としての無関係な抗体ＲＥＧＮ１９４５および陽性対照としてのＦＧＦ２１（ＲＥＧＮ１４３８）とともに試験した。処理後、活性化されたＦＧＦＲ１ｃによって誘導される、ＥＲＫおよびＰＬＣ－ガンマリン酸化を、ルシフェラーゼ活性と同様に測定した。

Ｆ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６ＬＫ７およびＦ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６Ｌ１の両方は、１ｎＭおよび１０ｎＭの両方の濃度でＥＲＫおよびＰＬＣ－ガンマリン酸化を強く誘導した。特に、Ｆ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６またはＦ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６ＬＫ７処理細胞におけるホスホ－ＥＲＫおよびホスホ－ＰＬＣ－ガンマレベルは、対応する濃度の親二重特異性抗体（ＲＥＧＮ４３６６）、ＦＧＦＲ１／ＫＬＢアゴニスト二重特異性抗体（ＲＥＧＮ４３０４）、または組換えヒトＦＧＦ２１（ＲＥＧＮ１４３８）で処理された細胞におけるものよりも著しく高かった（図１０Ａ）。

ＦＧＦＲ１ｃ活性化の時間経過を評価するために、ＨＥＫ２９３．ＳＲＥｌｕｃ．ｈＦＧＦＲ１ｃ．ｈＫＬＢ細胞を、変動する時間にわたってリガンドで処理し、ウエスタンブロット分析のために回収した。結果を図１０Ｂに示す。ホスホ－ＥＲＫレベルによって測定されたＥＲＫ活性化は、ＲＥＧＮ１４３８、ＲＥＧＮ４３０４、またはＦ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６での処理後早くも１５分で観察され、これは最大６時間持続した。Ｆ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６は、処理の時間経過を通してＲＥＧＮ１４３８またはＲＥＧＮ４３０４と比較してより高いホスホ－ＥＲＫレベルを示した。Ｆ１Ｋ＿ｓｃＦｖ６は、１５分時点でホスホ－ＰＬＣガンマを強く誘導し、これは次いで時間とともに徐々に減少した。

７．４．実施例４：多角度レーザー光散乱と組み合わされた非対称流場流分画（Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ）によるＫＬＢ、ＦＧＦＲ１ｃ、および結合分子間で形成されるインビトロ複合体のサイズ分析
７．４．１．概要
原則として、本開示の三重特異性結合分子は、ＦＧＦＲ１ｃおよびＫＬＢと異なるタイプの複合体を形成することができる。形成された複合体のタイプを決定するために、２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖおよび２＋１ Ｎ－Ｆａｂ三重特異性結合分子間で形成されたインビトロ複合体のサイズ分析を、多角度光散乱と組み合わされた非対称流場流分画（Ａ４Ｆ－ＭＡＬＳ）を使用して行った。Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳはまた、対照二重特異性結合分子（ＲＥＧＮ４３０４）および単一特異性ＫＬＢ結合分子（ＲＥＧＮ４６６１）によって形成される複合体を分析するために使用した。

７．４．２．材料および方法
７．４．２．１．Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ移動相緩衝液
移動相緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）を、１．４ｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、１０．７ｇのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、および５００ｍＬの５Ｍ塩化ナトリウムを組み合わせることによって調製し、次いで、溶液をＨＰＬＣグレード水で５．０Ｌの体積にした。緩衝液の最終的な測定されたｐＨは、７．０であった。移動相緩衝液を、使用前に濾過（０．２μｍ）した。

７．４．２．２．Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳシステムは、紫外線（ＵＶ）ダイオードアレイ検出器、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｗｎ ＨＥＬＥＯＳ（登録商標）ＩＩレーザー光散乱装置（ＬＳ）、およびＯｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ示差屈折計（ＲＩ）検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステムと組み合わされたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）３＋Ａ４Ｆ分離システムで構成した。検出器は、次の順序：ＵＶ－ＬＳ－ＲＩで直列に接続した。ＬＳおよびＲＩ検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供される指示に従って較正した。

定義された量の抗ＫＬＢおよび抗ＦＧＦＲ１ｃ多重特異性結合分子候補を、各々ＲＥＧＮ６４２４（組換えＫＬＢ）およびＲＥＧＮ６１５２（組換えＦＧＦＲ１ｃ）と組み合わせ、１Ｘ ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４で希釈して、等モル比：０．２μＭ多重特異性結合分子：０．２μＭ ＲＥＧＮ ＲＥＧＮ６４２４または０．２μＭ多重特異性結合分子：０．２μＭ ＲＥＧＮ ＲＥＧＮ６４２４：０．２μＭ ＲＥＧＮ ＲＥＧＮ６１５２を得た。すべての試料を、周囲温度で２時間インキュベートし、４℃で濾過せずに維持した後、Ｗ３５０スペーサーホイル（スペーサーの厚さ３５０μｍ、スペーサーの幅２．２ｃｍ）を備えたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）短チャネルに、１０ｋＤａのＭＷＣＯ再生セルロース膜を使用して注入した。各試料の注入前に、チャネルを、移動相緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）で予め平衡化した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、２ｍｇ／ｍＬ、１０μｇ試料負荷）を別個に注入し、システム好適性対照として含めた。

分画方法は、４つのステップ：注入、集束、溶出、およびチャネル「ウォッシュアウト」ステップで構成された。Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ移動相緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）を、分画方法全体を通して使用した。各試料（７μｇ）を、０．２ｍＬ／分の流量で１分間注入し、その後１．０ｍＬ／分の集束流量で３分間集束した。試料を、１．０ｍＬ／分のチャネル流量、一定のクロスフロー３．０ｍＬ／分で１５分間溶出し、続いて３．０ｍＬ／分から０ｍＬ／分まで線形勾配クロスフローを５分かけて行った。最後に、クロスフローを０ｍＬ／分でさらに５分間保持して、チャネルをウォッシュアウトした。ＢＳＡを、同じパラメータ設定を使用して分画した。

７．４．２．３．ＭＡＬＬＳデータ分析
ＡＳＴＲＡ Ｖソフトウェア（バージョン５．３．４．１４、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してデータを分析した。データを、過剰散乱光を溶質濃度および重量平均モル質量、Ｍｗに関連付ける方程式にあてはめた（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９９（２）：１３６－４６、Ｗｙａｔｔ，１９９３，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ２７２（１）：１－４０）：

（式中、ｃは、溶質濃度であり、Ｒ（θ、ｃ）は、散乱角および濃度の関数としての溶質からの過剰ラレー比であり、Ｍｗは、モル質量であり、Ｐ（θ）は、散乱光の角度依存性を表し（回転半径５０ｎｍ未満を有する粒子について約１）、Ａ２は、浸透圧の膨張における第２のビリアル係数である（測定は希薄溶液で行われるため無視できる））および

式中、ｎ_０は、溶媒屈折率を表し、Ｎ_Ａは、アボガドロの数であり、λ０は、真空での入射光の波長であり、ｄｎ／ｄｃは、溶質の比屈折率増分を表す。
ＢＳＡモノマーのモル質量は、データ収集（システム好適性チェック）中に光散乱および示差屈折率検出器の較正定数を評価するのに役立った。ＵＶおよびＲＩ検出器から決定されたＢＳＡの平均モル質量の相対標準偏差（ＲＳＤ％）は、５．０％以下であった。

光散乱検出器の正規化係数、検出器間遅延量、および広帯域化項は、使用されたＡ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ条件について収集されたＢＳＡクロマトグラムから計算した。これらの値を、これらの観点について補正するために、すべての他の試料について収集されたデータファイルに適用した。

２１５ｎｍでのｄｎ／ｄｃ値および消散係数を、Ａｓｔｒａソフトウェアで提供されるタンパク質コンジュゲート分析を使用して実験的に決定した。補正された消散係数およびｄｎ／ｄｃ値を使用して、すべてのタンパク質－タンパク質複合体試料を分析した。

７．４．３．結果
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳを、組換えＫＬＢ（ＲＥＧＮ６４２４）、組換えＦＧＦＲ１ｃ（ＲＥＧＮ６１５２）、ならびにいくつかの単一特異性（ＲＥＧＮ４６６１）、二重特異性（ＲＥＧＮ４３０４）、および三重特異性（２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ）結合分子間で形成される複合体の相対サイズ分布を評価するために使用した。結果を図１１Ａ（ＲＥＧＮ４６６１の場合）、図１１Ｂ（ＲＥＧＮ４３０４の場合）、および図１１Ｃ（２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖフォーマット）に示す。潜在的な抗体：抗原複合体の理論的モル質量および予測される化学量論は、図１１Ａ～１１Ｃに挿入として提供される。予想通り、単一特異性ＫＬＢ結合分子（ＲＥＧＮ４６６１）は、等モル比で組み合わされる場合、ＫＬＢと標準的な１：１（ピーク１、約２８０ｋＤａ）および１：２（ピーク２、約３５６ｋＤａ）複合体を形成した（図１１Ａ）。同様に、対照二重特異性結合分子（抗ＫＬＢｘＦＧＦＲ１ｃ、ＲＥＧＮ４３０４）が等モル量のＫＬＢと混合された場合、約２８０ｋＤａの計算されたモル質量を有する離散した均一なピーク（ピーク１）が観察された（図１１Ｂ）。個々の成分の計算されたモル質量に基づいて、ピーク１は、おそらく１：１の二重特異性：ＫＬＢ複合体を表す。この混合物へのＦＧＦＲ１ｃのさらなる添加は、約３０５～４４４ｋＤａの計算されたモル質量範囲を有する広いピーク（ピーク２）をもたらし、これは一般に１：１：１の二重特異性：ＫＬＢ：ＦＧＦＲ１ｃ三元複合体と一致する（図１１Ｂ）。ピーク２の後端でのモル質量の上昇傾向は、ＫＬＢ－ＦＧＦＲ１ｃ相互作用を介して弱く会合した、より大きな複合体も溶液中に存在し得るが、分画時に容易に解離することを示す。

対照単一特異性および二重特異性結合分子と比較して、三重特異性結合分子は、独特の高次化学量論でＫＬＢおよびＦＧＦＲ１ｃに結合した。等モル量のＫＬＢと混合される場合、Ｆ１Ｋ－ｓｃＦｖ６ ＩｇＧ１は、約５７９ｋＤａのモル質量を有する、大いに離散した、均一なピーク（ピーク１）を形成し、おそらく２分子のＫＬＢに結合した２分子のＦ１Ｋ－ｓｃＦｖ６ ＩｇＧ１を含有する複合体を表す（２：２複合体、図１１Ｃ）。この混合物への変動する量のＦＧＦＲ１ｃの添加後、わずかに広く、後で溶出するピーク（ピーク２）が約６０７～６４４ｋＤａの計算されたモル質量範囲で観察された。ピーク２はおそらく、２分子のＦ１Ｋ－ｓｃＦｖ６ ＩｇＧ１、２分子のＫＬＢ、および１～２分子のＦＧＦＲ１ｃを含有する三元複合体の混合物を表す（２：２：１および２：２：２複合体、図１１Ｃ）。

図１２Ａは、ＦＧＦＲ１ｃおよびＫＬＢと複合体化したＦＧＦ２１の化学量論を示す。図１２Ｂは、ＦＧＦ２１抗体結合の様々な代替化学量論を示す。本明細書に提示されるデータは、本開示の三重特異性結合分子が、ＫＬＢおよびＦＧＦＲ１ｃに結合して、対照単一特異性および二重特異性結合分子と比較して独特の化学量論を有する三元複合体を形成することができ、これが二重特異性結合分子と比較してそれらの増加したアゴニスト活性に寄与し得ることを明らかにする。

７．５．実施例５：ＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２およびＦＧＦＲ３／ＣＤ６３ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭ
７．５．１．材料および方法
７．５．１．１．ＭＢＭの生成
二価ＦＧＦＲ３ ｍＡｂに融合した一価ｓｃＦｖを有する２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭを構築するために、１６個のＡＰＬＰ２標的化ｓｃＦｖおよび３個のＣＤ６３標的化ｓｃＦｖを、エフェクターサイレンシング置換、ホール（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、ＥＵ番号付け）、および星型（Ｈ４３５Ｒ、Ｙ４３６Ｆ、ＥＵ番号付け）変異を有する修飾ヒトＩｇＧ４ Ｆｃバックボーンを有するＦＧＦＲ３親抗体３０１０８の重鎖のＮ末端に個別に融合させた（表１１）。第２の重鎖は、同一の３０１０８Ｆａｂならびに同じエフェクターサイレンシング置換およびノブ（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、ＥＵ番号付け）変異を有する修飾ＩｇＧ４ Ｆｃを含有する（表１１）。２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭの一般的なフォーマットを図１に示し、ＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２およびＦＧＦＲ３／ＣＤ６３ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭは、エフェクターサイレンシング置換、ノブインホール変異、および星型変異を含有する。ｓｃＦｖ含有鎖にホール変異、およびｓｃＦｖドメインを欠く鎖にノブ変異を有する２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭの一般的なフォーマットを図３Ｃに示す。ｓｃＦｖ含有鎖に星型変異を有する２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭの一般的なフォーマットを図３Ａに示す。

（ｉ）ＶＨ（ＶＨ－４４Ｃ、Ｋａｂａｔ番号付けを有する）、リンカー（４ｘＧ_４Ｓ（配列番号５７））、ＶＬ（ＶＬ－１００Ｃ変異、Ｋａｂａｔ番号付けを有する）、ｓｃＦｖをＦａｂと接続するためのリンカー（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号１）の配向の、様々なＡＰＬＰ２またはＣＤ６３ ｓｃＦｖ、（ｉｉ）３０１０８のＦａｂ領域、および（ｉｉｉ）修飾ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（表１０）をコードするＤＮＡフラグメントは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって合成した。個々の重鎖の哺乳動物発現ベクターを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）によって組み立てた。ＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２またはＣＤ６３ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ分子の発現のために、重鎖１－ホール^＊、重鎖２－ノブ、およびＵＬＣ ３－２０ ＤＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にコトランスフェクトした。５０ｍｌの細胞培養培地を回収し、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介した精製のために処理した。機能確認のために、３ＡＳＢ－５および３ＣＳＢ－２を２００ｍｌまでスケールアップし、最終ステップとしてサイズ排除クロマトグラフィーを含む一連の精製手順に供した。以前に作製および精製されたＦＧＦＲ３を標的とする３０１０８ ＩｇＧを対照として使用した。

７．５．１．２．標的結合に関するＢｉａｃｏｒｅ分析
個々の標的に対する２つのＭＢＭ、３ＡＳＢ－５および３ＣＳＢ－２の結合親和性を評価するためにＢｉａｃｏｒｅ動態分析を実施した。

７．５．１．３．増殖アッセイ
膀胱がん細胞増殖に対する２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖの効果を、Ｓ２４９Ｃ変異を発現するＵＭＵＣ１４細胞およびＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合変異を発現するＲＴ４細胞で試験した。

７．５．２．結果
７．５．２．１．ＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２およびＦＧＦＲ３／ＣＤ６３ ２＋１Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭの生成
発現および精製された代表的なＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２およびＦＧＦＲ３／ＣＤ６３ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ＭＢＭの設計概要を表１１に示す。

７．５．２．２．ＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２またはＣＤ６３ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖは、ＦＧＦＲ３、ＡＰＬＰ２、およびＣＤ６３に結合することができる。
個々の標的に対する３ＡＳＢ－５および３ＣＳＢ－２についてのＢｉａｃｏｒｅ動態分析の結果を表１２Ａ～１２Ｃに示す。両方の２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖは、Ｋ_Ｄ＝８ｎＭを有する親３０１０８ＩｇＧ対照と同様に、共通の標的ＦＧＦＲ３に結合することがわかった。３ＡＳＢ－５について、ＡＰＬＰ２の結合は、Ｋ_Ｄ＝８．０４Ｅ－１０Ｍでサブナノモル範囲であることがわかった。３ＣＳＢ－２について、ＣＤ６３のＫ_Ｄは、親Ｈ４Ｈ１２４５０Ｎ ＩｇＧの一価結合親和性よりも４倍弱い、５．８８Ｅ－１０Ｍであることがわかった。要約すると、３ＡＳＢ－５および３ＣＳＢ－２の両方は、それらの標的、ＦＧＦＲ３、ＡＰＬＰ２、およびＣＤ６３に対して期待される結合能力を有する。

７．５．２．３．ＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ３ＡＳＢ－５およびＦＧＦＲ３／ＣＤ６３ ２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ３ＣＳＢ－２は、異なるメカニズムを介してＵＭＵＣ１４（Ｓ２４９Ｃ）およびＲＴ４（ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３）細胞の両方で強力な増殖遮断を提供することができる。

膀胱がん細胞増殖に対する２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖの効果を、Ｓ２４９Ｃ変異を発現するＵＭＵＣ１４細胞およびＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合変異を発現するＲＴ４細胞で試験した。親抗体Ｈ４Ｈ３０１０８Ｐ２は、ＲＴ４細胞では強力な成長阻害を示したが、ＵＭＵＣ１４細胞では最適ではない成長阻害活性を示した。３ＣＳＢ－２および３ＡＳＢ－５は、ＵＭＵＣ１４細胞で有意に増強された活性を示し、試験された最高用量（１００ｎＭ）で成長阻害が約２５％増加した（図１３Ａ）。加えて、２＋１ Ｎ－ｓｃＦｖ ３ＣＳＢ－２および３ＡＳＢ－５の活性は、ＲＴ４細胞では高レベルに維持され、親抗体Ｈ４Ｈ３０１０８Ｐ２に相当した（図１３Ｂ）。親ＦＧＦＲ３抗体とは異なり、３ＣＳＢ－２および３ＡＳＢ－５は、異なる変異によって駆動される膀胱がん細胞の増殖を遮断することができることが見出された（図１３Ａおよび１３Ｂ）。

ＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２またはＦＧＦＲ３／ＣＤ６３ ＭＢＭの根本的なメカニズムをさらに調査するために、抗体誘導性受容体分解の効果をＵＭＵＣ１４細胞で試験した。興味深いことに、ＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２対ＦＧＦＲ３／ＣＤ６３ ＭＢＭでは異なるメカニズムが観察された。ＦＧＦＲ３／ＡＰＬＰ２ ＭＢＭでの処理は、処理なしの細胞、またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）もしくは親抗体Ｈ４Ｈ３０１０８Ｐ２で処理された細胞と比較して、抗体誘導性受容体分解の増強されたレベルを示した（図１４）。反対に、ＦＧＦＲ３／ＣＤ６３ ＭＢＭでの処理は、ＦＧＦＲ３受容体レベルに影響を及ぼさず、二重特異性３ＣＳＢ－２ ＭＢＭの増強された成長阻害活性が異なるメカニズムに起因したことを示す（図１４）。

８．具体的な実施形態
本開示は、以下の具体的な実施形態によって例示される。
１．多重特異性結合分子（ＭＢＭ）であって、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端の配向で、（ｉｉｉ）Ｆｃドメインに作動可能に連結された、（ｉｉ）第１のＦａｂ（「Ｆａｂ１」）の第１の重鎖領域に作動可能に連結された、（ｉ）第１の抗原結合部位（「ＡＢＳ１」）を含むｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチド鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端の配向で、（ｉｉ）Ｆｃドメインに作動可能に連結された、（ｉ）第２のＦａｂ（「Ｆａｂ２」）の第２の重鎖領域を含む、第２のポリペプチド鎖と、
（ｃ）第１の重鎖領域と対合してＦａｂ１を形成する第１の軽鎖を含む第３のポリペプチド鎖であって、Ｆａｂ１が、第２の抗原結合部位（「ＡＢＳ２」）を含む、第３のポリペプチド鎖と、
（ｄ）第２の重鎖領域と対合してＦａｂ２を形成する第２の軽鎖を含む第４のポリペプチド鎖であって、Ｆａｂ２が、第３の抗原結合部位（「ＡＢＳ３」）を含む、第４のポリペプチド鎖と、を含む、ＭＢＭ。

２．各抗原結合部位（「ＡＢＳ」）が、異なるエピトープに結合する、実施形態１に記載のＭＢＭ。
３．ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの２つが、同じ標的分子の異なるエピトープに特異的に結合する、実施形態１または実施形態２に記載のＭＢＭ。

４．ｓｃＦｖ、Ｆａｂ１、およびＦａｂ２が、それらのそれぞれの標的に同時に特異的に結合することができる、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
５．ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの少なくとも１つが、第１の組織発現プロファイルを有する標的分子に特異的に結合し、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの少なくとも１つが、第１の組織発現プロファイルと、重複しているが、同一ではない、第２の組織発現プロファイルを有する標的分子に特異的に結合する、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

６．第１の組織発現プロファイルおよび第２の組織発現プロファイルが、１０個以下の組織によって重複する、実施形態５に記載のＭＢＭ。
７．第１の組織発現プロファイルおよび第２の組織発現プロファイルが、５個以下の組織によって重複する、実施形態６に記載のＭＢＭ。

８．第１の組織発現プロファイルおよび第２の組織発現プロファイルが、３個以下の組織によって重複する、実施形態７に記載のＭＢＭ。
９．第１および第２の組織発現プロファイルが、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ＨＰＡ）によっておよび／またはＧｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）プロジェクトによって定義される、実施形態６～８のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

１０．第１および第２の組織発現プロファイルが、タンパク質発現プロファイルである、実施形態６～９のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
１１．第１および第２の組織発現プロファイルが、ｍＲＮＡ発現プロファイルである、実施形態６～９のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

１２．Ｆａｂ１の標的分子に対するＭＢＭの親和性が、ＭＢＭのｓｃＦｖを欠くが、それ以外はアミノ酸配列においてＭＢＭと同一である、Ｆａｂ１の標的分子に対する第２のＭＢＭの親和性よりも低い、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

１３．ｓｃＦｖが、リンカーを介して第１の重鎖領域に連結される、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
１４．リンカーが、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、または少なくとも７アミノ酸の長さであり、任意に最大３０アミノ酸、最大４０アミノ酸、最大５０アミノ酸、または最大６０アミノ酸の長さであり、いくつかの特定の実施形態では、リンカーが、
（ａ）５アミノ酸～５０アミノ酸の長さ、
（ｂ）５アミノ酸～４５アミノ酸の長さ、
（ｃ）５アミノ酸～４０アミノ酸の長さ、
（ｄ）５アミノ酸～３５アミノ酸の長さ、
（ｅ）５アミノ酸～３０アミノ酸の長さ、
（ｆ）５アミノ酸～２５アミノ酸の長さ、
（ｇ）５アミノ酸～２０アミノ酸の長さ、
（ｈ）６アミノ酸～５０アミノ酸の長さ、
（ｉ）６アミノ酸～４５アミノ酸の長さ、
（ｊ）６アミノ酸～４０アミノ酸の長さ、
（ｋ）６アミノ酸～３５アミノ酸の長さ、
（ｌ）６アミノ酸～３０アミノ酸の長さ、
（ｍ）６アミノ酸～２５アミノ酸の長さ、
（ｎ）６アミノ酸～２０アミノ酸の長さ、
（ｏ）７アミノ酸～４０アミノ酸の長さ、
（ｐ）７アミノ酸～３５アミノ酸の長さ、
（ｑ）７アミノ酸～３０アミノ酸の長さ、
（ｒ）７アミノ酸～２５アミノ酸の長さ、
（ｓ）７アミノ酸～２０アミノ酸の長さ、または
（ｔ）１０アミノ酸～６０アミノ酸の長さである、実施形態１３に記載のＭＢＭ。

１５．リンカーが、２０アミノ酸～５０アミノ酸の長さであり、任意にリンカーが、２５～３５アミノ酸の長さである、実施形態１４または１４（ｍ）に記載のＭＢＭ。
１６．リンカーが、Ｇ_ｎＳ（配列番号６１）またはＳＧ_ｎ（配列番号６２）のマルチマーであるか、またはこれを含み、ｎが、１～７の整数であり、任意にリンカーが、Ｇ_４Ｓ（配列番号４）のマルチマーであるか、またはこれを含む、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

１７．リンカーが、２つの連続するグリシン（２Ｇｌｙ）、３つの連続するグリシン（３Ｇｌｙ）、４つの連続するグリシン（４Ｇｌｙ（配列番号５））、５つの連続するグリシン（５Ｇｌｙ（配列番号６））、６つの連続するグリシン（６Ｇｌｙ（配列番号７））、７つの連続するグリシン（７Ｇｌｙ（配列番号８））、８つの連続するグリシン（８Ｇｌｙ（配列番号９））、もしくは９つの連続するグリシン（９Ｇｌｙ（配列番号１０））であるか、またはこれを含む、実施形態１３～１６のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

１８．
（ａ）Ｇ_ｎＳ（配列番号６１）またはＳＧ_ｎ（配列番号６２）のマルチマー（例えば、Ｇ_４Ｓ（配列番号４）のマルチマーであって、ｎが、１～７の整数であり、例えば、Ｇ_４Ｓ（配列番号４）のマルチマーを含む、マルチマー、および
（ｂ）１つ以上の追加のグリシン、例えば、２つの連続するグリシン（２Ｇｌｙ）、３つの連続するグリシン（３Ｇｌｙ）、４つの連続するグリシン（４Ｇｌｙ（配列番号５））、５つの連続するグリシン（５Ｇｌｙ（配列番号６））、６つの連続するグリシン（６Ｇｌｙ（配列番号７））、７つの連続するグリシン（７Ｇｌｙ（配列番号８））、８つの連続するグリシン（８Ｇｌｙ（配列番号９））、または９つの連続するグリシン（９Ｇｌｙ（配列番号１０））を含む、実施形態１３～１７のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

１９．ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの少なくとも１つが、膜結合抗原に特異的に結合する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
２０．ＡＢＳ１およびＡＢＳ３が、同じ細胞上の膜結合抗原に特異的に結合する、実施形態１～１９のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

２１．三重特異性結合分子（「ＴＢＭ」）である、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
２２．第１の軽鎖および第２の軽鎖が、ユニバーサル軽鎖である、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

２３．第１のＦａｂまたは第２のＦａｂの軽鎖定常領域および第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、Ｃｒｏｓｓｍａｂ配置にある、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

２４．Ｆｃヘテロダイマーを含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
２５．ＦｃヘテロダイマーにおけるＦｃドメインが、野生型Ｆｃドメインと比較してノブインホール変異を含む、実施形態２４に記載のＭＢＭ。

２６．Ｆｃヘテロダイマーにおける少なくとも１つのＦｃドメインが、野生型Ｆｃドメインと比較して星型変異を含む、実施形態２４または実施形態２５に記載のＭＢＭ。
２７．三価ＭＢＭである、実施形態１～２６のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

２８．ＡＢＳ３が、ヒトクロトーベータ（「ＫＬＢ」）に特異的に結合する、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
２９．ＡＢＳ３が、抗ＫＬＢ抗体のＣＤＲ配列、例えば、表２Ａ～２Ｂに示されるＫＬＢ結合剤のいずれか１つのＣＤＲ配列を含む、実施形態２８に記載のＭＢＭ。

３０．ＡＢＳ３が、抗ＫＬＢ抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列、例えば、表２Ａ～２Ｂに示されるＫＬＢ結合剤のいずれか１つのＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、実施形態２９に記載のＭＢＭ。

３１．ＡＢＳ１が、ヒトＫＬＢに特異的に結合する、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
３２．ＡＢＳ１が、抗ＫＬＢ抗体のＣＤＲ配列、例えば、表２Ａ～２Ｂに示されるＫＬＢ結合剤のいずれか１つのＣＤＲ配列を含む、実施形態３１に記載のＭＢＭ。

３３．ＡＢＳ１が、抗ＫＬＢ抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列、例えば、表２Ａ～２Ｂに示されるＫＬＢ結合剤のいずれか１つのＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、実施形態３２に記載のＭＢＭ。

３４．ＡＢＳ１およびＡＢＳ３が、ヒトＫＬＢ上の異なるエピトープに特異的に結合する、実施形態１～３３のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
３５．ＡＢＳ１およびＡＢＳ３が、ヒトＫＬＢ上のそれらのそれぞれのエピトープに同時に特異的に結合することができる、実施形態３４に記載のＭＢＭ。

３６．ＡＢＳ２が、ヒト線維芽細胞成長因子受容体１ｃアイソフォーム（「ＦＧＦＲ１ｃ」）に特異的に結合する、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
３７．ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体のＣＤＲ配列、例えば、表３Ａ～３Ｂに示されるＦＧＦＲ１ｃ結合剤のいずれか１つのＣＤＲ配列を含む、実施形態３６に記載のＭＢＭ。

３８．ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列、例えば、表３Ａ～３Ｂに示されるＦＧＦＲ１ｃ結合剤のいずれか１つのＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、実施形態３７に記載のＭＢＭ。

３９．ＡＢＳ２が、ＦＧＦＲ１ｃのループＤ３に結合する、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
４０．ＡＢＳ２が、ＦＧＦＲ１ｃのループＤ２に結合する、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

４１．ＡＢＳ２が、ヒト線維芽細胞成長因子受容体３（「ＦＧＦＲ３」）に特異的に結合する、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
４２．ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＣＤＲ配列、例えば、表４に示されるＦＧＦＲ３結合剤のいずれか１つのＣＤＲ配列を含む、実施形態４１に記載のＭＢＭ。

４３．ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列、例えば、表４に示されるＦＧＦＲ３結合剤のいずれか１つのＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、実施形態４２に記載のＭＢＭ。

４４．ＡＢＳ３が、ヒトＦＧＦＲ３に特異的に結合する、実施形態１～２７または４１～４３のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
４５．ＡＢＳ３が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＣＤＲ配列、例えば、表４に示されるＦＧＦＲ３結合剤のいずれか１つのＣＤＲ配列を含む、実施形態４４に記載のＭＢＭ。

４６．ＡＢＳ３が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列、例えば、表４に示されるＦＧＦＲ３結合剤のいずれか１つのＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、実施形態４５に記載のＭＢＭ。

４７．ＡＢＳ２およびＡＢＳ３が、ヒトＦＧＦＲ３に特異的に結合する、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
４８．ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＣＤＲ配列、例えば、表４に示されるＦＧＦＲ３結合剤のいずれか１つのＣＤＲ配列を含む、実施形態４７に記載のＭＢＭ。

４９．ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列、例えば、表４に示されるＦＧＦＲ３結合剤のいずれか１つのＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、実施形態４８に記載のＭＢＭ。

５０．ＡＢＳ３が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＣＤＲ配列、例えば、表４に示されるＦＧＦＲ３結合剤のいずれか１つのＣＤＲ配列を含む、実施形態４７～４９のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

５１．ＡＢＳ３が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列、例えば、表４に示されるＦＧＦＲ３結合剤のいずれか１つのＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、実施形態５０に記載のＭＢＭ。

５２．ＡＢＳ２およびＡＢＳ３が、ＦＧＦＲ３上の同じエピトープに特異的に結合する、実施形態４７～５１のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
５３．ＡＢＳ２およびＡＢＳ３が、同じＣＤＲ配列を含む、実施形態５２に記載のＭＢＭ。

５４．ＡＢＳ２およびＡＢＳ３が、同じＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を含む、実施形態５３に記載のＭＢＭ。
５５．ＡＢＳ１が、ヒトＣＤ６３に特異的に結合する、実施形態４１～５４のいずれか１つに記載のＭＢＭ。

５６．ＡＢＳ１が、抗ＣＤ６３抗体のＣＤＲ配列、例えば、表６に示されるＣＤ６３結合剤のいずれか１つのＣＤＲ配列を含む、実施形態５５に記載のＭＢＭ。
５７．ＡＢＳ１が、抗ＣＤ６３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列、例えば、表６に示されるＣＤ６３結合剤のいずれか１つのＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、実施形態５６に記載のＭＢＭ。

５８．ＡＢＳ１が、ヒトアミロイド前駆体様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）に特異的に結合する、実施形態４１～５４のいずれか１つに記載のＭＢＭ。
５９．ＡＢＳ１が、抗ＡＰＬＰ２抗体のＣＤＲ配列、例えば、表５に示されるＡＰＬＰ２結合剤のいずれか１つのＣＤＲ配列を含む、実施形態５８に記載のＭＢＭ。

６０．ＡＢＳ１が、抗ＡＰＬＰ２抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列、例えば、表５に示されるＡＰＬＰ２結合剤のいずれか１つのＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、実施形態５９に記載のＭＢＭ。

６１．実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭおよび細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤を含む、コンジュゲート。
６２．実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭまたは実施形態６１に記載のコンジュゲートおよび賦形剤を含む、薬学的組成物。

６３．がんを治療する方法であって、がんに罹患している対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ、実施形態６１に記載のコンジュゲート、または実施形態６２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

６４．がんが、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、および／またはＡＢＳ３が特異的に結合する標的分子の発現に関連する、実施形態６３に記載の方法。
６５．ＭＢＭが、実施形態４１～６０のいずれか１つに記載のＭＢＭであるか、コンジュゲートが、実施形態４１～６０のいずれか１つに記載のＭＢＭを含むか、または薬学的組成物が、実施形態４１～６０のいずれか１つに記載のＭＢＭもしくは実施形態４１～６０のいずれか１つに記載のＭＢＭを含むコンジュゲートを含む、実施形態６３または実施形態６４に記載の方法。

６６．がんが、膀胱がんである、実施形態６３～６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．がんが、膠芽腫である、実施形態６３～６５のいずれか１つに記載の方法。
６８．がんが、扁平上皮細胞肺がんである、実施形態６３～６５のいずれか１つに記載の方法。

６９．非アルコール性脂肪肝炎（「ＮＡＳＨ」）を治療する方法であって、ＮＡＳＨに罹患している対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ、実施形態６１に記載のコンジュゲート、または実施形態６２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

７０．代謝性疾患を治療する方法であって、代謝性疾患に罹患している対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ、実施形態６１に記載のコンジュゲート、または実施形態６２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

７１．循環ＨＤＬコレステロールを低減させる方法であって、上昇したＨＤＬレベルを抱えている対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ、実施形態６１に記載のコンジュゲート、または実施形態６２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

７２．循環ＬＤＬコレステロールを増加させる方法であって、低いＬＤＬレベルを抱えている対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ、実施形態６１に記載のコンジュゲート、または実施形態６２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

７３．血中トリグリセリドを低減させる方法であって、上昇したトリグリセリドレベルを抱えている対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ、実施形態６１に記載のコンジュゲート、または実施形態６２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

７４．血中グルコースを低減させる方法であって、上昇したグルコースレベルを抱えている対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ、実施形態６１に記載のコンジュゲート、または実施形態６２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

７５．肥満症を治療する方法であって、肥満症に罹患している対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ、実施形態６１に記載のコンジュゲート、または実施形態６２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

７６．糖尿病を治療する方法であって、糖尿病に罹患している対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＢＭ、実施形態６１に記載のコンジュゲート、または実施形態６２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

７７．ＭＢＭが、実施形態２８～４０のいずれか１つに記載のＭＢＭであるか、コンジュゲートが、実施形態２８～４０のいずれか１つに記載のＭＢＭを含むか、または薬学的組成物が、実施形態２８～４０のいずれか１つに記載のＭＢＭもしくは実施形態２８～４０のいずれか１つに記載のＭＢＭを含むコンジュゲートを含む、実施形態６９～７６のいずれか１つに記載の方法。

７８．実施形態１～６０のいずれか１つに記載の実施形態のいずれか１つに記載のＭＢＭをコードする、核酸または複数の核酸。
７９．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＭＢＭを発現するように操作された、細胞。

８０．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＭＢＭを１つ以上のプロモーターの制御下でコードする１つ以上の核酸配列を含む１つ以上の発現ベクターでトランスフェクトされた、細胞。

８１．ＭＢＭを産生する方法であって、
（ａ）ＭＢＭが発現される条件下で実施形態７９または８０に記載の細胞を培養することと、
（ｂ）細胞培養物からＭＢＭを回収することと、を含む、方法。

８２．ＭＢＭを濃縮することをさらに含む、実施形態８１に記載の方法。
８３．ＭＢＭを精製することをさらに含む、実施形態８１または実施形態８２に記載の方法。

９．参考文献の引用
本出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書がすべての目的のために参照によって組み込まれることが個別に示された場合と同程度に、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書および本開示に組み込まれる参考文献のうちの１つ以上の教示間に矛盾がある場合、本明細書の教示が意図される。

Claims (89)

1. 多重特異性結合分子（ＭＢＭ）であって、
   （ａ）Ｎ末端からＣ末端の配向で、（ｉｉｉ）Ｆｃドメインに作動可能に連結された、（ｉｉ）第１のＦａｂ（「Ｆａｂ１」）の第１の重鎖領域に作動可能に連結された、（ｉ）第１の抗原結合部位（「ＡＢＳ１」）を含むｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチド鎖と、
   （ｂ）Ｎ末端からＣ末端の配向で、（ｉｉ）Ｆｃドメインに作動可能に連結された、（ｉ）第２のＦａｂ（「Ｆａｂ２」）の第２の重鎖領域を含む、第２のポリペプチド鎖と、
   （ｃ）第１の重鎖領域と対合してＦａｂ１を形成する第１の軽鎖を含む第３のポリペプチド鎖であって、Ｆａｂ１が、第２の抗原結合部位（「ＡＢＳ２」）を含む、第３のポリペプチド鎖と、
   （ｄ）第２の重鎖領域と対合してＦａｂ２を形成する第２の軽鎖を含む第４のポリペプチド鎖であって、Ｆａｂ２が、第３の抗原結合部位（「ＡＢＳ３」）を含む、第４のポリペプチド鎖と、を含む、ＭＢＭ。
2. 各抗原結合部位（「ＡＢＳ」）が、異なるエピトープに結合する、請求項１に記載のＭＢＭ。
3. ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの２つが、同じ標的分子の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項１または請求項２に記載のＭＢＭ。
4. 前記ｓｃＦｖ、Ｆａｂ１、およびＦａｂ２が、それらのそれぞれの標的に同時に特異的に結合することができる、請求項１～３のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
5. ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの少なくとも１つが、第１の組織発現プロファイルを有する標的分子に特異的に結合し、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの少なくとも１つが、前記第１の組織発現プロファイルと、重複しているが、同一ではない、第２の組織発現プロファイルを有する標的分子に特異的に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
6. 前記第１の組織発現プロファイルおよび前記第２の組織発現プロファイルが、１０個以下の組織によって重複する、請求項５に記載のＭＢＭ。
7. 前記第１の組織発現プロファイルおよび前記第２の組織発現プロファイルが、５個以下の組織によって重複する、請求項６に記載のＭＢＭ。
8. 前記第１の組織発現プロファイルおよび前記第２の組織発現プロファイルが、３個以下の組織によって重複する、請求項７に記載のＭＢＭ。
9. 前記第１および第２の組織発現プロファイルが、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ＨＰＡ）によっておよび／またはＧｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）プロジェクトによって定義される、請求項６～８のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
10. 前記第１および第２の組織発現プロファイルが、タンパク質発現プロファイルである、請求項６～９のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
11. 前記第１および第２の組織発現プロファイルが、ｍＲＮＡ発現プロファイルである、請求項６～９のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
12. Ｆａｂ１の標的分子に対する前記ＭＢＭの親和性が、前記ＭＢＭのｓｃＦｖを欠くが、それ以外はアミノ酸配列において前記ＭＢＭと同一である、前記Ｆａｂ１の標的分子に対する第２のＭＢＭの親和性よりも低い、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
13. 前記ｓｃＦｖが、リンカーを介して前記第１の重鎖領域に連結される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
14. 前記リンカーが、
    （ａ）少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、または少なくとも７アミノ酸の長さであり、任意に
    （ｂ）最大３０アミノ酸、最大４０アミノ酸、最大５０アミノ酸、または最大６０アミノ酸の長さである、請求項１３に記載のＭＢＭ。
15. 前記リンカーが、
    （ａ）５アミノ酸～５０アミノ酸の長さ、
    （ｂ）５アミノ酸～４５アミノ酸の長さ、
    （ｃ）５アミノ酸～４０アミノ酸の長さ、
    （ｄ）５アミノ酸～３５アミノ酸の長さ、
    （ｅ）５アミノ酸～３０アミノ酸の長さ、
    （ｆ）５アミノ酸～２５アミノ酸の長さ、または
    （ｇ）５アミノ酸～２０アミノ酸の長さである、請求項１４に記載のＭＢＭ。
16. 前記リンカーが、
    （ａ）６アミノ酸～５０アミノ酸の長さ、
    （ｂ）６アミノ酸～４５アミノ酸の長さ、
    （ｃ）６アミノ酸～４０アミノ酸の長さ、
    （ｄ）６アミノ酸～３５アミノ酸の長さ、
    （ｅ）６アミノ酸～３０アミノ酸の長さ、
    （ｆ）６アミノ酸～２５アミノ酸の長さ、または
    （ｇ）６アミノ酸～２０アミノ酸の長さである、請求項１４に記載のＭＢＭ。
17. 前記リンカーが、
    （ａ）７アミノ酸～４０アミノ酸の長さ、
    （ｂ）７アミノ酸～３５アミノ酸の長さ、
    （ｃ）７アミノ酸～３０アミノ酸の長さ、
    （ｄ）７アミノ酸～２５アミノ酸の長さ、
    （ｅ）７アミノ酸～２０アミノ酸の長さである、請求項１４に記載のＭＢＭ。
18. 前記リンカーが、５アミノ酸～２５アミノ酸の長さである、請求項１４に記載のＭＢＭ。
19. 前記リンカーが、１０アミノ酸～６０アミノ酸の長さである、請求項１４に記載のＭＢＭ。
20. 前記リンカーが、２０アミノ酸～５０アミノ酸の長さである、請求項１９に記載のＭＢＭ。
21. 前記リンカーが、２５～３５アミノ酸の長さである、請求項２０に記載のＭＢＭ。
22. 前記リンカーが、Ｇ_ｎＳ（配列番号６１）もしくはＳＧ_ｎ（配列番号６２）のマルチマーであるか、またはこれを含み、ｎが、１～７の整数である、請求項１３～２１のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
23. 前記リンカーが、Ｇ_４Ｓ（配列番号４）のマルチマーであるか、またはこれを含む、請求項２２に記載のＭＢＭ。
24. 前記リンカーが、２つの連続するグリシン（２Ｇｌｙ）、３つの連続するグリシン（３Ｇｌｙ）、４つの連続するグリシン（４Ｇｌｙ（配列番号５））、５つの連続するグリシン（５Ｇｌｙ（配列番号６））、６つの連続するグリシン（６Ｇｌｙ（配列番号７））、７つの連続するグリシン（７Ｇｌｙ（配列番号８））、８つの連続するグリシン（８Ｇｌｙ（配列番号９））、もしくは９つの連続するグリシン（９Ｇｌｙ（配列番号１０））であるか、またはこれを含む、請求項１３～２３のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
25. ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、およびＡＢＳ３のうちの少なくとも１つが、膜結合抗原に特異的に結合する、実施形態１～２４のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
26. ＡＢＳ１およびＡＢＳ３が、同じ細胞上の膜結合抗原に特異的に結合する、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
27. 三重特異性結合分子（「ＴＢＭ」）である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
28. 前記第１の軽鎖および前記第２の軽鎖が、ユニバーサル軽鎖である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
29. 前記第１のＦａｂまたは前記第２のＦａｂの前記軽鎖定常領域および前記第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、Ｃｒｏｓｓｍａｂ配置にある、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
30. Ｆｃヘテロダイマーを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
31. 前記ＦｃヘテロダイマーにおけるＦｃドメインが、野生型Ｆｃドメインと比較してノブインホール変異を含む、請求項３０に記載のＭＢＭ。
32. 前記Ｆｃヘテロダイマーにおける少なくとも１つのＦｃドメインが、野生型Ｆｃドメインと比較して星型変異を含む、請求項３０または請求項３１に記載のＭＢＭ。
33. 三価ＭＢＭである、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
34. ＡＢＳ３が、ヒトクロトーベータ（「ＫＬＢ」）に特異的に結合する、実施形態１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
35. ＡＢＳ３が、抗ＫＬＢ抗体のＣＤＲ配列を含む、請求項３４に記載のＭＢＭ。
36. ＡＢＳ３が、抗ＫＬＢ抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、請求項３５に記載のＭＢＭ。
37. ＡＢＳ１が、ヒトＫＬＢに特異的に結合する、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
38. ＡＢＳ１が、抗ＫＬＢ抗体のＣＤＲ配列を含む、請求項３７に記載のＭＢＭ。
39. ＡＢＳ１が、抗ＫＬＢ抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、請求項３８に記載のＭＢＭ。
40. ＡＢＳ１およびＡＢＳ３が、ヒトＫＬＢ上の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
41. ＡＢＳ１およびＡＢＳ３が、ヒトＫＬＢ上のそれらのそれぞれのエピトープに同時に特異的に結合することができる、請求項４０に記載のＭＢＭ。
42. ＡＢＳ２が、ヒト線維芽細胞成長因子受容体１ｃアイソフォーム（「ＦＧＦＲ１ｃ」）に特異的に結合する、請求項１～４１のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
43. ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体のＣＤＲ配列を含む、請求項４２に記載のＭＢＭ。
44. ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、請求項４３に記載のＭＢＭ。
45. ＡＢＳ２が、ＦＧＦＲ１ｃのループＤ３に結合する、請求項４２～４４のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
46. ＡＢＳ２が、ＦＧＦＲ１ｃのループＤ２に結合する、請求項４２～４４のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
47. ＡＢＳ２が、ヒト線維芽細胞成長因子受容体３（「ＦＧＦＲ３」）に特異的に結合する、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
48. ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＣＤＲ配列を含む、請求項４７に記載のＭＢＭ。
49. ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、請求項４８に記載のＭＢＭ。
50. ＡＢＳ３が、ヒトＦＧＦＲ３に特異的に結合する、請求項１～３３または４７～４９のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
51. ＡＢＳ３が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＣＤＲ配列を含む、請求項５０に記載のＭＢＭ。
52. ＡＢＳ３が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、請求項５１に記載のＭＢＭ。
53. ＡＢＳ２およびＡＢＳ３が、ヒトＦＧＦＲ３に特異的に結合する、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
54. ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＣＤＲ配列を含む、請求項５３に記載のＭＢＭ。
55. ＡＢＳ２が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、請求項５４に記載のＭＢＭ。
56. ＡＢＳ３が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＣＤＲ配列を含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
57. ＡＢＳ３が、抗ＦＧＦＲ３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、請求項５６に記載のＭＢＭ。
58. ＡＢＳ２およびＡＢＳ３が、ＦＧＦＲ３上の同じエピトープに特異的に結合する、請求項５３～５７のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
59. ＡＢＳ２およびＡＢＳ３が、同じＣＤＲ配列を含む、請求項５８に記載のＭＢＭ。
60. ＡＢＳ２およびＡＢＳ３が、同じＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を含む、請求項５９に記載のＭＢＭ。
61. ＡＢＳ１が、ヒトＣＤ６３に特異的に結合する、請求項４７～６０のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
62. ＡＢＳ１が、抗ＣＤ６３抗体のＣＤＲ配列を含む、請求項６１に記載のＭＢＭ。
63. ＡＢＳ１が、抗ＣＤ６３抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、請求項６２に記載のＭＢＭ。
64. ＡＢＳ１が、ヒトアミロイド前駆体様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）に特異的に結合する、請求項４７～６０のいずれか一項に記載のＭＢＭ。
65. ＡＢＳ１が、抗ＡＰＬＰ２抗体のＣＤＲ配列を含む、請求項６４に記載のＭＢＭ。
66. ＡＢＳ１が、抗ＡＰＬＰ２抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む、請求項６５に記載のＭＢＭ。
67. 請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭおよび細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤を含む、コンジュゲート。
68. 請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭまたは請求項６７に記載のコンジュゲートおよび賦形剤を含む、薬学的組成物。
69. がんを治療する方法であって、がんに罹患している対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ、請求項６７に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
70. 前記がんが、ＡＢＳ１、ＡＢＳ２、および／またはＡＢＳ３が特異的に結合する標的分子の発現に関連する、請求項６９に記載の方法。
71. 前記ＭＢＭが、請求項４７～６６のいずれか一項に記載のＭＢＭであるか、前記コンジュゲートが、請求項４７～６６のいずれか一項に記載のＭＢＭを含むか、または前記薬学的組成物が、請求項４７～６６のいずれか一項に記載のＭＢＭもしくは請求項４７～６６のいずれか一項に記載のＭＢＭを含むコンジュゲートを含む、請求項６９または請求項７０に記載の方法。
72. 前記がんが、膀胱がんである、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の方法。
73. 前記がんが、膠芽腫である、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記がんが、扁平上皮細胞肺がんである、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の方法。
75. 非アルコール性脂肪肝炎（「ＮＡＳＨ」）を治療する方法であって、ＮＡＳＨに罹患している対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ、請求項６７に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
76. 代謝性疾患を治療する方法であって、代謝性疾患に罹患している対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ、請求項６７に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
77. 循環ＨＤＬコレステロールを低減させる方法であって、上昇したＨＤＬレベルを抱えている対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ、請求項６７に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
78. 循環ＬＤＬコレステロールを増加させる方法であって、低いＬＤＬレベルを抱えている対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ、請求項６７に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
79. 血中トリグリセリドを低減させる方法であって、上昇したトリグリセリドレベルを抱えている対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ、請求項６７に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
80. 血中グルコースを低減させる方法であって、上昇したグルコースレベルを抱えている対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ、請求項６７に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
81. 肥満症を治療する方法であって、肥満症に罹患している対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ、請求項６７に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
82. 糖尿病を治療する方法であって、糖尿病に罹患している対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＭＢＭ、請求項６７に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
83. 前記ＭＢＭが、請求項３４～４６のいずれか一項に記載のＭＢＭであるか、前記コンジュゲートが、請求項３４～４６のいずれか一項に記載のＭＢＭを含むか、または前記薬学的組成物が、請求項３４～４６のいずれか一項に記載のＭＢＭもしくは請求項３４～４６のいずれか一項に記載のＭＢＭを含むコンジュゲートを含む、請求項７５～８２のいずれか一項に記載の方法。
84. 請求項１～６６のいずれか一項のいずれか一項に記載のＭＢＭをコードする、核酸または複数の核酸。
85. 請求項１～６６のいずれか一項に記載のＭＢＭを発現するように操作された、細胞。
86. 請求項１～６６のいずれか一項に記載のＭＢＭを１つ以上のプロモーターの制御下でコードする１つ以上の核酸配列を含む、１つ以上の発現ベクターでトランスフェクトされた、細胞。
87. ＭＢＭを産生する方法であって、
    （ａ）前記ＭＢＭが発現される条件下で請求項８５または８６に記載の細胞を培養することと、
    （ｂ）前記細胞培養物から前記ＭＢＭを回収することと、を含む、方法。
88. 前記ＭＢＭを濃縮することをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
89. 前記ＭＢＭを精製することをさらに含む、請求項８７または請求項８８に記載の方法。

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