DE10133071A1

DE10133071A1 - Antigene, Rezeptoren, Liganden oder ihre Regionen kombiniert mit proteolytischer Aktivität

Info

Publication number: DE10133071A1
Application number: DE10133071A
Authority: DE
Inventors: Alexander Cherkasky; Georg Michaelis; Karlheinz Esser; Igor Cherkasky
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-07-07
Filing date: 2001-07-07
Publication date: 2003-03-06

Abstract

Die Erfindung betrifft den Bereich der molekularen Medizin und der Biotechnologie. DOLLAR A Es gibt eine große Zahl von Erkrankungen, die durch krankheitserregende Proteine hervorgerufen werden. Das Ziel dieser Erfindung ist, die krankheitserregenden Proteine zielgerichtet und selektiv zu erkennen und zu spalten und somit zu eliminieren. DOLLAR A Die zu beschreibende Erfindung betrifft eine Verbindung, die aus einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und einem Antigen, Autoantigen, Antikörperbinderegion, Ligand, Ligandbinderegion, Rezeptor, Rezeptorbinderegion oder aus einem anderen Epitop besteht. DOLLAR A Als ein Anwendungsbeispiel ist die Verbindung herausgegriffen, die aus einer Protease und einem Autoantigen besteht. Autoantigen ist in diesem Beispiel eine Erkennungs- bzw. Bindedomäne, die mit einem Automatikkörper interagiert, welcher bei der Autoimmunerkrankung für die Pathogenese verantwortlich ist. DOLLAR A Nach dieser Erkennung bzw. Bindung wird ein Fab Fragment oder eine Region des Autoantikörpers durch die Proteasedomäne der Verbindung abgespalten. DOLLAR A Dies erlaubt eine selektive Proteolyse von Autoantikörpern und ihre Elimination und die Wirkung könnte die effektive Behandlung bzw. Heilung oder Linderung einer Autoimmunerkrankung sein.

Description

Die Erfindung betrifft den Bereich der Molekularen Medizin und Biotechnologie.
Zum Stand der Technik werden zwei Anmeldungen (DE 198 22 406 A1 und EP 0 590 530 A2) beschrieben.
Der erste Patentanspruch (DE 198 22 406 A1) betrifft eine Kopplung von einem immunogenischen Peptid mit einer Protease. Nach "Immunology " (5th edition, I. Roitt, J. Brostoff, D. Male) lautet die Definition des Wortes "immunogenisch" (immunogenic): "having the ability to evoke B- and/or T-cell medialed immune reaction". (s. 407).
Die Erfindung beschränkt sich auf die Bindungs- bzw. Erkennungs-Domänen, die bei B- und/oder T-Zell-Immunreaktionen beteiligt sind.
Es gibt keine Beispiele bzw. Konkretisierungen für diese immunogenischen Peptide und es fehlt ein Experiment, welches die Umsetzung der in der Anmeldung - DE-198 22 406 A beschriebenen Fusion in der Praxis bestätigt.
Die europäische Patentanmeldung EP 0590 530 A2 beschreibt auch eine Fusion bzw. eine Verbindung, die nach dem Anspruch 1 aus einer Antigenbinderegion und mindestens einem Prodrug-aktivierenden Enzym besteht.
Das Ziel der Erfindung ist die Prodrug-Aktivierung. Die Erkennungsdomäne ist eine Antigenbinderegion.
Die vorliegende Erfindung ist eine Verbindung bzw. Fusion, die aus einem Antigen, z. B. Autoantigen, Rezeptor, Rezeptorbinderegion, Ligandbinderegion, einem Epitop und/oder einer anderen ähnlichen Erkennungs bzw. Bindungs domäne besteht. Die Verbindung stellt also auch eine Protease mit minder oder stark begrenzter oder gelenkter Substratspezifität (engl. protease with ultralimited substrate specificitiy = pulsus) dar. Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist:

1. Autoimmunantikörper selektiv zu binden, zu spalten und so zu eliminieren. Dies würde zur Linderung der Leiden, die mit den Autoimmunerkrankungen verbunden sind, führen.
2. Immunkomplexe selektiv zu binden, zu spalten und so zu eliminieren.
3. Andere krankheitserregende Proteine zielgerichtet zu eliminieren.

Anwendungsbeispiel 1

Als Beispiel für die Anwendung der oben beschriebenen Verbindung wird die Erkrankung Multiple Sklerose (MS) herausgegriffen. MS ist eine Autoimmunerkrankung, bei der T-Zellen Myelin-basische Proteine (MBP) angreifen. Diese Zellen werden als MBP-spezifische T-Zellen bezeichnet.
MBP spezifische T-Zellen und Autoantikörper erkennen nicht das ganze MBP, sondern bestimmte Fragmente bzw. Peptide. Das am meisten erkannte Peptid befindet sich zwischen den Aminosäuren 84 und 102 vom MBP und wird als immunoreaktives MBP (84-102) Peptid bezeichnet.
Die zu beschreibenden Verbindungen bestehen aus einer Protease wie z. B. Subtilisin oder Proteinase K, derer Strukturen einzelkettig sind, und dem immunoreaktiven MBP (84-102) Peptid. Die Sequenzen der beiden Fusionen sind in den Abb. 2a und 2b dargestellt.
Durch diese Verbindungen wird folgende Wirkung erreicht: eine MBP-spezifische T-Zelle oder ein MBP-spezifischer Autoantikörper erkennt bzw. bindet die MBP- Domäne der in dem Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Verbindung.
Danach übt die Protease-Domäne eine zytotoxische Wirkung bei der MBP- spezifischen T-Zelle aus oder spaltet die variable Region des Fab Fragments des MBP spezifischen Autoantikörpers.
Diese Wirkung führt zur Eliminierung der MBP-spezifischen T-Zellen bzw. MBP- spezifischen Autoantikörper und könnte eine neue selektive und effektive Behandlungs bzw. Heilungsmethode der MS erlauben.

Anwendungsbeispiel 2

Als zweites Beispiel für die Anwendung der oben beschriebenen Verbindung wird als Erkrankung die rheumatoide Arthritis (RA) herausgegriffen. RA ist ebenfalls eine Autoimmunerkrankung, wobei bestimmte Antigene der Gelenkgewebe vom Immunsystem erkannt und als Autoantigene angegriffen werden. Diese Autoantigene bzw. arthritogene Peptide enthalten kurze konservierte Fragmente, die mit grosser Affinität von den RA-Autoantikörpern erkannt werden. Die zu beschreibende Verbindung(en) besteht aus einer Protease wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und einem arthritogenen Peptid. Die Nukleotid und AS- Sequenzen der beiden Fusionen sind in den Abb. 4a und 4b dargestellt.
Durch diese Verbindungen wird folgende Wirkung erreicht: der RA- Autoantikörper erkennt bzw. bindet die arthritogene Domäne, wonach seine variable Region des Fab-Fragmentes durch die Protease-Domäne gespalten wird. Dies führt zur Eliminierung der RA-Autoantikörper und erlaubt eine neue selektive und effektive Behandlung der RA.

Anwendungsbeispiel 3

Als drittes Beispiel für die Anwendung der oben beschriebenen Verbindung(en) werden Immunkomplex-Erkrankungen (IK) wie z. B. die Glomerulonephritis, die Vasculitis etc. herausgegriffen. Immunkomplexerkrankungen sind auch Autoimmunerkrankungen, wobei Fab Fragmente Fc Fragmente erkennen. IK- Antikörper binden aneinander bzw. aggregieren und bilden Komplexe, die als Immunkomplexe bezeichnet werden. Diese Immunkomplexe rufen Inflammationen hervor, und die Bezeichnung einer IK hängt teilweise davon ab, an welchem Ort des Organismus Immunkomplexe gebildet werden.
Ein Fc Fragment eines Antikörpers wird von einem Makrophagen-Fc- Rezeptor (CD23; Fc e R 45 kDA; C-Typ Lectin) erkannt (Roitt, Brostoff, Male "Immunologie" 5 ed. s. 398).
Die zu beschreibende Verbindung(en) bestehen aus einer Protease wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und der Ligand-bindenden (Exo) Domäne des Makrophagen-Fc-Rezeptors. Durch diese Verbindungen wird folgende Wirkung erreicht: Fc Fragmente der Antikörper werden erkannt und abgespalten, wobei die Bildung von Immunkomplexen verlangsamt bzw. gehemmt wird.
Die weitere in diesem Ausführungsbeispiel zu beschreibenden Verbindungen bestehen aus einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und dem Fc Fragment. Durch diese Verbindungen wird folgende Wirkung erreicht: ein IK- Antikörper erkennt bzw. bindet die Fc Domäne, wonach sein Fab Fragment durch die Protease Domäne abgespalten wird. Dies führt zur Elimination der Immunkomplex bindenden Antikörper und könnte eine selektive und effektive Behandlung bzw. Heilung der Immunkomplex-Erkrankungen erlauben.

Anwendungsbeispiel 4

Als viertes Beispiel für die Anwendung der oben beschriebenen Verbindung(en) wird die männliche Infertilität (MI) heraus gegriffen. MI ist auch eine Autoimmunerkrankung, wobei Spermantigene vom Immunsystem erkannt werden. Die gebildeten MI-Antikörper binden sich an die Spermatozoide, rufen ihre Aggregation bzw. Agglutination hervor, und verhindern ihre Bewegung. (I. Roitt, J. Brostoff, D. Male "Immunology" 5 ed. S. 372).
Die zu beschreibende Verbindung(en) besteht aus einer Protease wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und dem Spermantigen bzw. seinem Fragment, welches mit grosser Affinität von den MI Autoantikörper erkannt wird.
Durch diese Verbindungen wird folgende Wirkung erreicht: ein MI Autoantikörper erkennt bzw. bindet sich an die Spermantigen-Domäne, wonach sein Fab Fragment durch die Protease-Domäne abgespalten wird. Dies führt zur Elimination der MI-Autoantikörper und erlaubt eine selektive und effektive Behandlung bzw. Heilung der MI.

Anwendungsbeispiel 5

Als fünftes Beispiel für die Anwendung der oben beschriebenen Verbindung(en) wird die Erkrankung Myastenia gravis (MG) herausgegriffen. MG ist auch eine Autoimmunerkrankung, wobei Autoimmunantikörper gegen die Acetylcholin- Rezeptoren gerichtet sind. Die zu beschreibende Verbindung(en) besteht aus einer Protease wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und dem Acetylcholin-Rezeptor, bzw. seinem Fragment, welches mit grosser Affinität von den MG- Autoantikörpern erkannt wird.
Durch diese Verbindungen wird folgende Wirkung erreicht: ein MG- Autoantikörper erkennt bzw. bindet die Acetylcholin-Rezeptor-Domäne, wonach seine Fab Fragment durch die Protease-Domäne abgespalten wird. Dies führt zur Elimination der MG-Autoantikörper und erlaubt eine selektive, hocheffektive Behandlung bzw. Heilungsmethode der MG.

Anwendungsbeispiel 6

Als sechstes Beispiel sind die Autoimmunerkrankungen herausgegriffen, die durch DNA-Autoantikörper hervorgerufen werden. Die zu beschreibende Verbindung(en) besteht aus einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und einer Sequenz-spezifischen oder unspezifischen DNA-bindenden Domäne (DBD) die mit einer bestimmten DNA-Sequenz interagiert (siehe Abb. 9).
Durch diese Verbindungen wird folgende Wirkung erreicht: ein DNA- Autoantikörper erkennt bzw. bindet die DNA-Sequenz, die mit der DBD-Region interagiert. Danach wird das Fab Fragment des Autoantikörpers durch die Protease Domäne der zu beschreibenden Verbindung abgespalten. Dies führt zur Elimination der DNA-Autoantikörper und zur Linderung der mit DNA- Autoantikörper assoziierten Krankheiten.

Anwendungsbeispiel 7

Als siebtes Beispiel für die Anwendung der beschriebenen Verbindungen ist das Bronchialasthma herausgegriffen. Bei dieser Erkrankung sind Autoantikörper gegen Insulin-Rezeptoren und Beta-Adrenergen-Rezeptoren gerichtet.
Patienten, die an dieser Krankheit leiden, empfinden oft Atemnot.
Die zu beschreibenden Verbindungen bestehen aus einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K, etc. und einem Insulin-Rezeptor und/oder Beta- Adrenergen-Rezeptor bzw. ihren Fragmenten, die mit hoher Affinität von den Autoantikörpern erkannt werden.
Durch diese Verbindungen wird folgende Wirkung erreicht: ein für Bronchialasthma-spezifischer Antikörper erkennt bzw. bindet die Insulin-Rezeptor bzw. Beta-Adrenergen-Rezeptor-Domäne, wonach das Fab Fragment dieses Autoantikörpers durch die Protease-Domäne der zu beschreibenden Verbindung abgespalten wird. Dies führt zur Elimination der Bronchialasthma-Autoantikörper und zur selektiven und effektiven Behandlung bzw. Heilung von Bronchialasthma.

Anwendungsbeispiel 8

Als achtes Beispiel für die Anwendung der oben beschriebenen Verbindungen ist die Chorea-Huntington herausgegriffen. Das ist eine Krankheit, die durch eine Mutation in Gen für Huntingtin hervorgerufen wird. Huntingtin ist eine Polyglutaminkette. Durch diese Mutation wird ein überlanges Huntingtin-Protein gebildet, welches miteinander aggregiert und Huntingtin-Plaques bildet.
Die z m. Uu beschreibende Verbindung besteht aus einer Protease wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und einer Polyglutamin- bzw. Huntingtin-bindenden Domäne.
Durch diese Verbindung wird folgende Wirkung erreicht: ein Huntingtin wird durch die Huntingtin-bindende Domäne der Verbindung erkannt und gebunden, wonach die Protease-Domäne an einer bestimmten Stelle spaltet und das Huntingtin eliminiert. Dies kann man

1. zur präventiven Behandlung anwenden, weil Huntingtine selektiv blockiert, gespalten bzw. eliminiert werden, und die Bildung von Huntingtin-Ploques verlangsamt oder gehemmt wird!
2. zur selektiven Spaltung von Huntingtin-Plaques anwenden.

Anwendungsbeispiel 9

Als neuntes Anwendungsbeispiel ist die Alzheimer-Krankheit (AK) heraus gegriffen. Bei der AK werden durch eine Mutation im APP Gen und durch falsche Prozessierung sog. Beta-Amyloid-Peptide hergestellt. Sie sind 42 AS lang und bestehen aus 3 Domänen: einer Antichymotrypsin(ACT)-bindenden, einer hydrophilen und einer hydrophoben Domäne. Beta-Amyloid-Peptide interagieren miteinander, aggregieren und bilden Ansammlungen sog. Beta-Amyloid-Plaques im Gehirn.
Einzelne Beta-Amyloide sind neurotoxisch, Beta-Amyloid-Plaques rufen große Schäden der Neuronen, wie z. B. Störung der Lipidmembran, hervor.
Die zu beschreibenden Verbindungen bestehen aus einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und

A) einer Beta-Amyloid-Bindungsdomäne bzw. einem Erkennungsfragment von einem für das Beta-Amyloid spezifischen monoklonalen Antikörper;
B) einer hydrophilen Domäne aus der Region des Beta-Amyloid-Peptids, die die entsprechende Domäne eines anderen Beta-Amyloids erkennt bzw. bindet;
C) einer hydrophoben Domäne aus der Region des Beta-Amyloids, die die entsprechende Domäne eines Beta-Amyloids erkennt bzw. bindet;
D) einer hydrophoben und hydrophilen Domäne oder ihrer Region(en), die die entsprechenden Domänen eines Beta-Amyloids erkennen bzw. binden.

Durch diese Verbindungen werden folgende Wirkungen erreicht: ein Beta- Amyloid wird durch die Beta-Amyloid-Erkennungsdomäne A, B, C oder D der Verbindung erkannt bzw. gebunden, wonach die Protease-Domäne an einer bestimmten Stelle das gebundene Beta-Amyloid spaltet und es eliminiert. Dies kann man

1. zur präventiven Behandlung anwenden, weil Beta-Amyloide selektiv blockiert, gespalten bzw. eliminiert werden und die Bildung von Beta-Amyloid-Plaques gehemmt wird;
2. zur selektiven Spaltung von Beta-Amyloid-Plaques.

Anwendungsbeispiel 10

Als zehntes Anwendungsbeispiel sei die Typ 1 Diabetes mellitus bzw. NOD (engl. non obese Diabetes) genannt. Die Krankheit wird durch auto-aggressive T-Zellen hervorgerufen, die die Insulin-produzierenden pankreatische Beta-Zellen zerstören. Das Autoantigen für Diabetes ist ein Protein namens GAD (engl. glutamic acid decarboxylase) ein (J. W. Yoon et al. "Science" 284, 1183 (1999), Harold von Boehmer et al. "Science" 284, 1135 (1999)).
Es gibt zwei Formen von GAD, GAD 65 und 67, und beide Formen werden in Gehirn-Zellen (wo sie in der Produktion des Neurotransmitters GABA involviert sind) exprimiert. Ihre Funktionen in Beta-(islet) Zellen ist unklar. Diabetes Forscher haben entdeckt, dass bei Patienten GAD-spezifische und auch Insulin- spezifische Autoantikörper vorhanden sind. Sie haben auch GAD-autoantigene Peptide ermittelt, die von GAD-spezifischen Autoantikörper erkannt werden. Autoantigene GAD-Peptide sind also die Schlüsselmoleküle, die fusioniert mit einer Protease-Domäne als Autoantikörper-spezifische, in diesem Fall Anti- Diabetes-Arzneimittel angewendet werden können. Durch die Verbindung, die aus autoantigenem GAD-Peptid und einer Protease z. B. Subtilisin besteht, wird folgende Wirkung erreicht: ein GAD-spezifischer Autoantikörper erkennt bzw. bindet die GAD-Domäne, wonach sein Fab Fragment durch die Protease-Domäne abgespalten wird. Dies führt zur Eliminierung des GAD-spezifischen Antikörpers und erlaubt eine selektive bzw. zielgerichtete, hoch effektive Behandlung bzw. Heilung der Krankheit Typ 1 Diabetes.

Ausführungsbeispiel 1

Der erste Schritt zur Durchführung der experimentellen Arbeiten besteht in der Auswahl der DNA- bzw. Nukleotid-Sequenzen für die gewünschten Fusionsproteine.

A) Die DNA- bzw. Nukleotid-Sequenz für die Protease Subtilisin besteht aus 1473 Basenpaaren. Die Protease Subtilisin besitzt ein Molekulargewicht von 39,5 kDa und wird in Bacillussubtilis expremiert. Sie wird in diesem Organismus durch das Subtilisin NAT(apr N) Gen kodiert.
Bacillussubtilis ist kommerziell erhältlich. Die DNA-Region für Subtilisin wird durch PCR herausamplifiziert.
Andere DNA-Sequenzen des geplanten Konstrukts werden de novo synthetisiert. Die Synthese der DNA-Sequenzen für Primer, Spacer bzw. Gelenk-Domäne wie z. B. vom IgG, für die Erkennungsdomäne MBP (82-104) und für den His-tag wird in Auftrag gegeben.
Für die Herstellung des Konstruktes benötigt man Restriktionsendonukleasen für die Bildung von "klebrigen Enden" und Ligasen für die Ligation der Sequenzen miteinander, sowie für die Inserierung in den Vektor.
Das hergestellte Konstrukt bzw. der Vektor bestehend aus DNA-Sequenzen für MBP (82-104), Spacer bzw. Gelenkdomäne, Subtilisin und His-tag wird zuerst in ein prokoryotischen Klonierungssystem (E. coli) und dann in einem eukaryotischen Klonierungssystem (S. cerevisiae) amplifiziert. Das geklonte Konstrukt wird anschließend in einem pro- oder eukaryotischen Expressions system wie z. B. E. coli, S. cerevisiae, H. polymorpha etc., in einem Ei- Expressionssystem oder in einem RTS 500 (Rapid Translation System) vom Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland expremiert. Das zuletztgenannte System basiert auf der CECF (continious-exchange cell-free) in vitro Transcriptions/Translationstechnologie. (Nature 10 May 2001, s. × 1).
Die Isolierung bzw. Reinigung der expremierten Fusionsproteine erfolgt mit Hilfe der His-tag-Peptide welche sich an Nickel-haltige Matritzen wie z. B. Ni-NTA binden. Es gibt Filter basierte His-tag Reinigungssysteme, die z. B. von der U.S: Firma Novagen (www.novagen.com) angeboten werden.
B) Die DNA Sequenz für die Proteinase K (EC 3.4.21.14) besteht aus 1420 Basenpaaren. Die Proteinase K besitzt ein Molekulargewicht von 40,3 kDa und wird in Tritirachium album expremiert. Tritirachium album ist ebenfalls kommerziell erhältlich. Die DNA-Sequenz bzw. das Gen für Proteinase K wird durch PCR herausamplifiziert. Weitere Schritte sind mit den im Abschnitt A beschriebenen Schritten identisch.

Ausführungsbeispiel 2

Die Ausführungsbeispiele 2A und 2B sind den Ausführungsbeispielen 1A und 1B ähnlich, aber mit dem Unterschied, dass die DNA-Sequenz für die Erkennungsdomäne nicht das MBP Fragment sondern ein arthritogenes Peptid betrifft. Die Konstrukte bzw. Vektoren 1A, 1B und 2B kann man zur Sicherheit sequenzieren lassen.
Die hergestellten gereinigten Fusionsproteine werden in einer Pufferlösung wie z. B. Phosphat- oder Carbonat-Puffer gehalten, so dass der pH Wert konstant bei ca. 8 liegt. Damit werden die natürlichen Bedingungen für die selektive katalytische Aktivität der Fusionsproteine im Blut nachgeahmt. Im folgenden werden die Schritte und die zu erwartenden Beobachtungen bei der experimentellen Prüfung der gewünschten Eigenschaften der hergestellten Proteine 1A, 1B, 2A und 2B in vitro beschrieben.
Für den Nachweis der gewünschten Eigenschaften der Fusionsproteine 1A und 1B sind MBP-spezifische T-Zellen und Anti-MBP Antikörper nötig.
Die Lösung im Reagenzglas L1 enthält ein Puffersystem welches an pH Wert konstant bei dem das Blut-pH-Wertes hält, und MBP-spezifische T-Zellen. Die Lösung im Reagenzglas L2 enthält die selben Komponenten wie L1 und andere Zellen.
Die Lösung im Reagenzglas M1 enthält ein Puffersystem, welches den pH Wert konstant bei dem Blut-pH Wert hält und Anti-MBP-Antikörper bzw. MBP- spezifische Autoantikörper.
Die Lösung im Reagenzglas M2 enthält die selben Komponenten wie M1, und andere Biomoleküle, wie z. B. lumineszentes GFP (green fluorescent protein).
Die Lösung im Reagenzglas N1 enthält ein Pufferssystem, wie in den Lösungen L1, L2, M1 und M2 und RA-spezifischen Auto-Antikörper.
Die Lösung im Reagenzglas N2 enthält die selben Komponenten wie in N1 und andere Biomoleküle, wie z. B. lumineszente GFP. Die Lösungen in den Reagenzgläsern L1, L2, M1, M2, N1 und N2 werden jeweils auf 2 andere Reagenzgläser L1a, L1b, L2a, L2b, M1a, M1b, M2a, M2b, N1a, N1b, N2a, und N2b verteilt.
In die Reagenzgläser L1a, L2a, M1a und M2a wird die Lösung mit dem Fusionsprotein 1A zugegeben.
In die Reagenzgläser L1b, L2b, M1b und M2b wird die Lösung mit dem Fusionsprotein 1B zugegeben.
In die Reagenzgläser N1a und N2a wird die Lösung mit dem Fusionsprotein 2A zugegeben.
In die Reagenzgläser N1b und N2b wird die Lösung mit den Fusionsprotein 2B zugegeben. Die Reagenzgläser werden leicht geschüttelt.
Die Reaktionen bzw. die Prozesse in den Reagenzgläser L1a, L1b, M2a, M2b, N2a und N2b stellen das proteolytische verhalten der hergestellten Fusionsproteine dar. Anhand von Beobachtung kann man sagen ob die Fusionsproteine spalten. Die Lösungen L1a und L1b tropft man auf ein Objektträger eines optischen Mikroskops und betrachtet die MBP spezifischen T-Zellen. Sobald man sieht dass diese sterben, so ist dies der Nachweis dafür, dass die Fusionsproteine 1A und 1B MBP spezifische Zellen vernichten. Die kleinen Mengen in den Reagenzgläsern M1a, M1b, N1a, N1b werden jeweils auf vier Gel-Elektophoresen aufgetragen. Biomoleküle migrieren im Gel, wenn ein elektromagnetisches Feld konstanter Grösse angelegt ist. Zum Zeitpunkt der Stromabschaltung stoppt die Bewegung der Biomoleküle im Gel. Zum Beispiel beträgt die Zeitdauer der Bewegung der Biomoleküle im Gel etwa 10 Minuten. Nach 10 Minuten schaltet man den Strom aus und mißt den Weg S in Zentimeter. Die Geschwindigkeit der Migration der Biomoleküle kann man dann leicht mit der Formel der Mechanik: V = S/t (wobei t = 10 Min) messen.
Die Geschwindigkeit eines (Bio) Moleküls in einem elektromagnetischen Feld konstanter Grösse hängt von der Masse dieses Moleküls ab. Je grösser sie ist, desto langsamer bewegt sich das Molekül.
Die durch die Fusionsproteine 1A, 1B, 2A und 2B gespaltenen Autoantikörper bzw. ihre Fragmente haben (durch Spaltung) jeweils kleinere Massen und sollen sich folglich schneller im Gel bewegen als die ungespaltenen Antikörper. Man vergleicht die Migrationsgeschwindigkeiten der einen Lösungen und der mit 1A, 1B, 2A und 2B gemischten Lösungen. Sobald man feststellt, dass die gemischte Lösungen Proteine enthält, die sich schneller im Gel bewegen, so kann man daraus schliessen, dass die Fusionsproteine die Zielmoleküle spalten.
Um die Selektivität zu prüfen, bzw. zu beweisen, dass die Fusionsproteine 1A und 1B, zielgerichtet wirken, muss man die Lösungen L2a und L2b tropfenweise auf ein Objektträger eines optischen Licht-Mikroskops auftragen. Beim guten Ergebnis beobachtet man, dass nur MBP-spezifische Zellen vernichtet werden, wobei andere Zellen geschont bleiben. Man mischt die Lösungen mit den Fusions proteinen 1A und 1B mit den Lösungen M2a und M2b Sobald man feststellt, dass die Emissions intensität nicht verändert ist, so kann man daraus schliessen, dass die GFP Moleküle nicht gespalten also geschont werden. In diesem Fall besitzen die Fusionsproteine Selektivität.
Um die Selektivität von 2A und 2B zu prüfen, mischt man sie mit den Lösungen N2a und N2b. Sobald man feststellt, dass die Emissionsintensität sich nicht verändert kann daraus geschlossen werden, dass die Fusionsproteine 2A und 2B selektiv bzw. zielgerichtet wirken.
In der Abb. 1A ist die Verbindung, bestehend aus einer Erkennungsdomäne wie z. B. Antigen, Autoantigen, Antikörperbinderegion, Rezeptor, Rezeptorbinderegion, Ligand, Ligandbinderegion oder einem Epitop (1), einer Protease-Domäne (2), einem His tag 8 und einer Spacer- oder Gelenk-Sequenz (3), dargestellt, wobei die Erkennungsdomäne sich an einem terminalen Ende befindet.
In der Abb. 1b ist die Verbindung bestehend aus den selben Domänen wie z. B. der Abb. 1A, dargestellt, wobei die Erkennungsdomäne sich zwischen zwei Protease- Domänen befindet.
In der Abb. 1c ist die Verbindung bestehend aus den selben Domänen wie in der Abb. 1A dargestellt, wobei die Protease-Domäne sich zwischen zwei Erkennungsdomänen befindet.
In der Abb. 2a ist die Aminosäure (AS)-Sequenz der Verbindung, die aus Subtilisin und dem MBP (84-102) Peptid besteht, dargestellt.
In der Abb. 2b ist die Nukleotid Sequenz der Verbindung in der Abb. 2a dargestellt.
In der Abb. 3a ist die AS-Sequenz der Verbindung bestehend aus der Proteinase K und dem MBP (82-104) Peptid, dargestellt.
In der Abb. 3b ist die Nukleotid Sequenz der Verbindung von Abb. 3a dargestellt.
In der Abb. 4a ist die AS-Sequenz der Verbindung bestehend aus Subtilisin und arthritogenem Peptid dargestellt.
In der Abb. 4b ist die Nukleotidsequenz der Verbindung von Abb. 4a dargestellt.
In der Abb. 5a ist die AS-Sequenz der Verbindung bestehend aus Proteinase K und arthritogenem Peptid dargestellt.
In der Abb 5b ist die Nukleotid Sequenz der Verbindung von Abb. 5a dargestellt.
In der Abb. 6a ist die AS Verbindung, bestehend aus Subtilisin und Polyglutamin dargestellt.
In der Abb. 6b ist die Nukleotid Sequenz der Verbindung von Abb. 6a dargestellt.
In der Abb. 7a ist die AS-Sequenz der Verbindung, bestehend aus Proteinase K und Polyglutamin, dargestellt.
In der Abb. 7b ist die Nukleotid Sequenz der Verbindung von Abb. 7a dargestellt.
In der Abb. 8 ist die Verbindung bestehend aus einer Protease, einer Mikrotubuli- Bindedomäne. oder einem zytotoxischen (6) oder immunoreaktiven-MBP (7), schematisch dargestellt.
In der Abb. 9 ist die Verbindung, bestehend aus einer Protease (2) und einer Sequenz-spezifischen oder unspezifischen DNA-Bindedomäne (wie z. B. Polylysin) (4), die mit einer DNA-Sequenz (5) interagiert, schematisch dargestellt.
In der Abb. 10a ist die AS-Sequenz der Verbindung bestehend aus Subtilisin und Hsp 61 (3-13) dargestellt.
In der Abb. 10a ist die Nukleotid Sequenz der Verbindung von Abb. 10a dargestellt.
In der Abb. 11a ist die AS-Sequenz der Verbindung bestehend aus Proteinase K und Hsp 61 (3-13) dargestellt.
In der Abb. 11b ist die Nukleotidsequenz der Verbindung von Abb. 11b dargestellt. Liste und Erläuterung der Zahlen 1 ein Antigen, sein Fragment, eine Autoantikörperbinderegion, Rezeptor, sein Fragment, eine Rezeptorbinderegion, Ligand, sein Fragment, eine Ligandbinderegion oder ein Epitop.
2 eine Protease
3 ein Gelenkdomäne
4 eine Sequenz-spezifische oder unspezifische DNA-Bindedomäne
5 eine DNA-Sequenz
6 eine Toxin oder Mikrotubuli-Bindedomäne
7 MBP oder ein immunoreaktives MBP Peptid
8 His tag

Claims

1. Eine Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus mindestens einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und mindestens einem Antigen, seinem Fragment oder Fragmenten, Autoantigen, Antikörperbinderegion, Ligand, seinem Fragment oder Fragmenten, Ligandbinderegion, Rezeptor, seinem Fragment oder Fragmenten, Rezeptorbinderegion Fab, seinem Fragment oder Fragmenten, einem Epitop oder einer anderen Erkennungsdomäne besteht.

2. Verbindung nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Protease mit minder oder stark begrenzter bzw. gelenkter Substratspezifität (engl. irotease with ultralimited substrate specificity Pulsus) darstellt.

3. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und MBP oder einem der drei immunoreaktiven MBP Pepteden, wie z. B. dem MBP (84-102) Peptid besteht.

4. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K, etc. und einem arthritogenen Peptid besteht.

5. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease, einer Mikrotubuli bindenden oder einer anderen Domäne und MBP oder einem der drei immunoreaktiven MBP Peptiden, wie z. B. dem (84-102) Peptid besteht.

6. Verbindung, nach dem Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrotubuli-bindende Domäne z. B. Gephyrin, humanes Mikrotubuli bindendes Protein MIP-1, Lungsin etc. ist.

7. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K etc. und einer sequenzspezifischen oder unspezifischen DNA-Bindedomäne (DBD), die mit einer DNA-Sequenz interagiert, besteht. (Anwendungsbeispiel 6)

8. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease, wie z. B. Subtilisin, Proteinase K, etc. und dem Fc Fragment eines Antikörpers besteht.

9. Verbindung, nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease wie z. B. Subtilisin, Proteinase K, etc. und einem Fc Rezeptor wie z. B. dem Makrophagen Fc Rezeptor (CD 23; Fc RII) oder seiner Ligandbindenden (Exo) Domäne besteht.

10. Verbindung, nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease und einer Huntingtin-, Huntingtin-Bindedomäne oder einer Polyglutamin-Domäne besteht.

11. Verbindung, nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease und der Beta-Amyloidbindenden Domäne, einer hydrophilen Domäne des Beta-Amyloids, einer hydrophothen Domäne des Beta-Amyloids oder einer gemischten hydrophilen-hydrophoben Domäne des Beta-Amyloids besteht.

12. Verbindung, nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichet, dass sie aus einer Protease und einer Prion-Erkennungs bzw. Bingedomäne besteht.

13. Verbindung, nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease und einem Spermantigen oder seinem Fragment besteht.

14. Verbindung, nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease und dem Insulin-Rezeptor, und/oder dem Beta-Adrenergen Rezeptor oder einer Teilregion besteht.

15. Verbindung, nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease und einem Hsp Protein z. B. Hsp 61, Hsp 60 usw. besteht.

16. Verbindung, nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen reversiblen oder ireversiblen Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten darstellt.

17. Verbindung, nach den Ansprüchen 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease und einem Acetylcholin-Rezeptor oder einer Teilregion besteht.

18. DNA bzw. Nukleotid-Sequenzen bzw. Vektoren für alle möglichen Verbindungen nach den Ansprüchen 1-31

19. Klonierungs- und Expressionssysteme für alle möglichen Verbindungen nach den Ansprüchen 1-31.

20. Verbindung, nach den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwischen der Protease und spezifischen Erkennungsdomänen eine Gelenk- (Hinge, Spacer)Domäne enthält.

21. Verbindung, nach den Ansprüchen 1-18, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen His-tag oder eine andere Domäne zur Reinigung enthält.

22. Verbindung, nach dem Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease-Domäne und einer GAD-Domäne bzw. autoantigenem GAD Peptid besteht.

23. Verbindung, nach dem Anspruch 1, die aus einem Antigen, Autoantigen, einem Epitop, einer Antikörper bindenden Domäne, einer Autoantkörper bindenden Domäne, einer Fab Fragment bindenden, oder Fc Fragment bindenden Domäne und eine Protease besteht und dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als Anti- bzw. Autoantikörper spezifisches Arzneimittel verwendet werden kann.

24. Verbindung, nach den Ansprüchen 1-18, dadurch gekennzeichnet, dass sie noch eine oder mehrere Domäne(n), wie z. B. das Tyrosin-Peptid für die Phosphorylierung und Erhöhung des energetischen Niveaus, enthalten kann.

25. Verbindung, nach den Ansprüchen 1-24, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Erkennungsfragment bzw. die Erkennungsregionen sich an den terminalen Enden und/oder in der Nähe des aktiven Zentrums befinden.

26. Verbindung, nach den Ansprüchen 1-27, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid-Sequenz oder Sequenzen für spezifische Erkennungsdomänen in spezifische Vektoren z. B. durch Ligation, Insertion etc. integriert werden können.

27. Verbindung, nach den Ansprüchen 1-26, dadurch gekennzeichnet, dass sie noch weitere Domänen wie z. B. Gelenkdomäne, His tag Phosphopeptid etc. in der Nähe des aktiven Zentrums und/oder an den terminalen Enden enthält.

28. Verbindung, nach den Ansprüchen 1-29, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Erkennungsdomäne zwischen zwei Protease-Domänen befinden kann

29. Verbindung, nach den Ansprüchen 1-28, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Protease-Domäne zwischen zwei Erkennungsdomänen, wie z. B. Antigen, sein Fragment, Rezeptor, sein Fragment, Ligand, sein Fragment, Fab, sein Fragment etc. befinden kann.