KR100832773B1 - 기능성 Ｆｖ 항체 절편 제조 방법 - Google Patents

기능성 Ｆｖ 항체 절편 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 항체에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 항체의 VH와 VL 절편을 류신 지퍼 (leucine zipper)로 연결시킴으로써 기능성 있는 Fv 항체 절편을 보다 안정적이고 용이하게 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 매우 높은 항원 결합력을 가지며, 생물학적 진단 시약 및 단백질체 분석을 위한 다양한 항체의 생산에 유용하게 사용될 수 있을 뿐 아니라 새로운 형태의 기능적인 항체 절편 생산에 이용될 수 있는 재조합 항체 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.
Fv, 류신 지퍼 (leucine zipper), 재조합 항체, 알칼리성 포스파타제, DsbC, 대장균, 세포질

Description

기능성 Ｆｖ 항체 절편 제조 방법 {A METHOD OF PRODUCING FUNCTIONAL Fv ANTIBODY FRAGMENTS}
도 1은 본 발명의 세포질 내 zipFv 발현 벡터를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 세포질 내 zipFv 발현 벡터의 구성을 보다 상세하게 도시한 것이다.
도 3는 Origami (DE3) 균주 (Novagen, USA)의 세포질 내에서 생산된 zipFv-112와 알칼리성 포스파타제 (alkaline phosphatase)와의 융합 단백질의 항원 반응 특이성에 대한 ELISA 결과를 도시한 것이다.
도 4은 항-myc mAb를 사용하여 Origami (DE3)의 세포질 내에서 생산된 zipFv-112와 알칼리성 포스파타제와 융합된 zipFv-112 (zipFvHAP-112 및 zipFvLAP-112)의 항원 결합 반응 강도를 비교한 ELISA 결과를 도시한 것이다.
도 5는 AP 기질 (pNPP)을 사용하여 Origami (DE3)의 세포질 내에서 생산된 zipFv-112와 알칼리성 포스파타제와 융합된 zipFv-112 (zipFvHAP-112 및 zipFvLAP-112)의 항원 결합 반응 강도를 비교한 ELISA 결과를 도시한 것이다.
도 6는 zipFv-112, zipFvHAP-112 또는 zipFvLAP-112의 VH-Fos-myc, VH-Fos-myc-AP, 또는 VL-Jun-S1-AP 절편의 발현을 분석하기 위한 웨스턴 블롯 (Western blot) 결과를 도시한 것이다.
도 7은 zipFv-112를 발현하는 Origami (DE3) 균주의 전체 균주 추출물을 환원 (reducing) 또는 비-환원 (non-reducing) 조건하의 SDS-PAGE 분별 후 분석한 웨스턴 블롯 결과를 도시한 것이다.
도 8은 항-myc-mAb를 사용하여 Origami (DE3) 균주의 세포질 내에서 생산된 zipFvHAdDAP-112와 zipFvLAP-112의 항원 결합 반응을 비교한 ELISA 결과를 도시한 것이다.
도 9a 및 도 9b는 DsbC (periplasmic disulfide-bond isomerase)의 동시 발현이 기능성 있는 zipFvHADLAP-112의 생산에 미치는 영향을 측정한 ELISA 결과를 도시한 것이다.
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기술분야
본 발명은 재조합 항체에 관한 것이다. 상세하게는 본 발명은 항체의 VH와 VL 절편을 류신 지퍼 (leucine zipper)로 연결시킴으로써 기능성 있는 Fv 항체 절편을 보다 안정적이고 용이하게 생산하는 방법에 관한 것이다.
종래기술
Fv, scFv 및 Fab와 같이 항체 중 항원과의 결합에 필수적인 일부 절편만을 사용하여 구성되는 재조합 항체 절편들은 생물학적 연구에서 시약과 치료 그리고 진단에 많이 이용되는 것으로 알려져 있다. 이들은 또한 몇몇의 장점들을 제공하는데, 예를 들면 박테리아에서 기능성 있는 형태로 생산이 가능하며, 형광단백질의 융합 등과 같이 항원과 결합하는 절편에 원하는 특성을 부여할 수 있는 유전적인 조작이 용이하고 [상기 문헌: 1], 류신 지퍼 (leucine zipper)를 통하여 두 가지 항원 결합 특이성을 지닌 이량체 항체 절편을 생산할 수 있다 [상기 문헌: 2]. 적절한 항원과의 결합이 가능한 기능적인 면에서의 항체 최소 단위는 Fv 절편이며, 이것은 중사슬 가변 영역 (VH)과 경사슬 가변 영역 (VL)의 이형이량체 (heterodimer) 형태로 이루어져 있다. 그러나 완전한 형태의 IgG 또는 Fab 분자들과 달리 Fv 절편의 VH 와 VL 결합에 관한 분리 상수 (dissociation constant)는 10-5 ~ 10-8 M 범위이며, 가변 사슬 영역내에 이황결합 (disulfide bond)이 없기 때문에 각각의 결합된 영역을 유지하기에는 충분하지 않다 [상기 문헌: 3, 4 및 5]. 따라서 대장균에서 항원과 결합하는 기능성 있는 Fv 절편의 생산은 일반적으로 비실용 적이라 하겠다.
대안으로 VH 와 VL 영역을 작은 펩타이드 링커 (peptide linker)로 연결함으로써 대장균 안에서 안정한 구조의 Fv 단편들이 단일 펩타이드로 생산될 수 있다. 이렇게 제작된 단일 사슬 가변 절편 (scFv)들은 일반적으로 항원 결합 특이성과 친화도가 본래의 항체와 유사한 정도로 유지되는 것으로 알려져 있다 [상기 문헌: 6, 7, 8 및 9]. 또한 scFv는 단일 폴리펩타이드 구조이기 때문에 Fab 단편 보다 많은 양을 대장균에서 안정하게 생산할 수 있다. 그러나 일부 scFv 절편의 경우 구조적으로 불안정하며 특히 이들이 재조합 면역독소의 제작을 위해 독소에 융합되었을 경우 Fab 또는 완전한 형태의 면역글로불린 보다 항원에 대한 친화도가 훨씬 낮은 것으로 알려져 있다. 이는 아마도 항원 결합 또는 Fv 분자들의 안정화를 위한 펩타이드 링커가 제대로 형성되지 못하기 때문인 것으로 추정되고 있다 [상기 문헌: 10 및 11].
이러한 scFv의 결점을 피하기 위해서 VH 와 VL 영역들의 프레임워크 (framework) 지역 내에 인위적으로 이황결합을 도입하여 이황-안정화시킨 (disulfide-stabilized) Fv (dsFv)라고 명명된 항체가 제작되었으며 [상기 문헌: 12 및 13], 이러한 dsFv 절편의 경우 scFv보다 훨씬 더 구조적으로 안정하고 결합력이 좋다는 것이 밝혀졌으며 따라서 치료와 진단 시약으로 더욱 유용하게 사용될 수 있다 [상기 문헌: 14 및 15]. 그러나 dsFv의 제작은 인위적인 이황결합을 위해 프레임워크 지역 내에 시스테인 (cysteine) 잔기를 삽입할 적절한 위치를 알아내기 위해 분자 모델링 기술 등을 매번 수행해야 하는 등의 번거로움이 수반 된다.
대장균을 이용하여 재조합 dsFv 와 Fab 절편, 또는 scFv를 생산하기 위해서는, 환원된 상태의 대장균의 세포질 내에서는 중사슬과 경사슬 단백질 간의 이황결합이 형성되지 않기 때문에 두 사슬 간의 적절한 결합과 접힘 (folding)을 위해 두 사슬이 대장균의 주변세포질 (periplasm)로 동시에 분비되어야만 한다 [상기 문헌: 16]. 그 결과 항체의 중사슬과 경사슬 단백질이 주변세포질에서 뭉쳐지거나 분해, 세포질 막의 비효율적인 투과 또는 숙주세포의 용해 등에 기인하여 수용성 항체 절편의 산출량이 감소하는 결과가 초래되었다 [상기 문헌: 17]. 따라서 lac 프로모터의 업스트림에서 강력한 전사 억제 기능을 지닌 글루코오스를 이용하여 항체 발현 유도 전에 항체 단편의 발현을 미리 억제하거나 [상기 문헌: 17] lac 프로모터와 다른 아라비노즈 프로모터 P BAD 의 사용이 요구 되었다 [상기 문헌: 18]. 이와 더불어 VH 과 VL 영역의 아미노산 서열의 변이에 따른 항체 절편들 간에 번역, 운반 또는 접힘 (folding) 현상의 차이가 발생하며 이러한 항체 클론간의 차이로 인하여 항체가 대장균에서 동등하게 발현되지 않는다 [상기 문헌: 19].
trxB 돌연변이 유전형질을 지닌 대장균 균주의 경우, 매우 산화적인 세포질 환경을 갖고 있으며 따라서 세포질 내에서 폴리펩타이드의 이황결합의 형성이 허용되므로 상기 대장균의 세포질에서 항체 절편이 발현한다면 비정상적인 폴리펩타이드의 분비에 의한 세포 독성이 경감된다고 사료된다 [상기 문헌: 20]. 이와 관련하여 기능성 있는 항체 절편을 세포질내 발현으로 생산할 수 있다는 것은 항-프로게 스테론 (DE3) scFv 절편이 대장균 균주인 ADA494 (trxB 돌연변이)에서 높은 수율로 생산됨으로써 확인되었으며 [상기 문헌: 21 및 22], 수용성 Fab 항체 절편 또한 대장균 trxB gor 돌연변이 균주의 세포질내에서 성공적으로 생산되었다 [상기 문헌: 23 및 24].
본 연구에서는 기능성 있는 Fv 절편을 좀 더 확실하고 수월하게 생산하기 위한 방법을 개발하기 위해 항체의 VH 와 VL 절편을 류신 지퍼를 통해 연결하였다. 우선 모델시스템으로 1차 담즙 경변 (primary biliary cirrhosis)의 주요한 자가항원인 피루베이트 탈수소효소 복합체 (pyruvate dehydrogenase complex)-E2 (PDC-E2)에 특이적인 사람 Fab 클론인 SP112로부터 획득한 VH 와 VL 영역을 이용하여 zipFv 항체 절편과 이것에 알칼리성 포스파타제 (AP, alkaline phosphatase)를 융합시킨 zipFv-AP를 제작하였고 대장균의 세포질 안에서 기능성 있는 zipFv 와 zipFv-AP 항체 단편의 성공적인 발현을 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기능성 있는 Fv 절편을 보다 안정적이고 용이하게 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 항체의 VH와 VL 절편을 류신 지퍼로 연결시킨 zipFv 및 이것에 AP를 융합시킨 zipFv-AP를 제공하는 것이다.
박테리아를 이용한 항체 절편 (Fv, scFv 또는 Fab)의 생산은 동물 세포 조직 배양에 의한 진단용 모노클로날 항체의 전통적인 생산 방법에 비하여 간단하면서도 비용 면에서 경제적인 대안이 될 수 있으며 이미 수많은 재조합 항체 절편들이 대장균을 이용한 세포질 외 발현을 통하여 성공적으로 생산되고 있다. 특히 scFv 형태는 하나의 폴리펩타이드로 구성되어 있기 때문에 원핵 세포 발현 시 유리하며, Fab 절편 역시 scFv 절편과 비교하여 매우 늦은 언폴딩 속도 (unfolding rate)를 가지고 있기 때문에 가혹한 조건 하에서의 짧은 시간 노출에 대해 비교적 안정하다는 등의 고유한 장점을 가지고 있다 [상기 문헌: 32]. 이는 Fab 형태가 in vitro 상의 진단용에 더 적합하며 따라서 단백질 칩에 사용되는 항체 컨텐츠의 개발에 유용할 수 있음을 시사한다. 한편 dsFv는 scFv와 비교하여 뛰어난 기능적 안정성을 지니고 있기 때문에 치료 및 진단 시약으로서 scFv 보다 더 유용한 것으로 공지되어있다 [상기 문헌: 14]. 그러나 세포질 외 발현을 통한 재조합 항체 절편의 생산에는 어느 정도 기술적 한계점이 존재한다.
대장균을 이용하여 유전자 재조합 단사슬 가변절편 [single-chain variable fragment (scFv)]과 알칼리성 포스파타제 (AP, alkaline phosphatase)와 같은 다른 기능적인 분자들이 융합된 항체 절편의 생산은 기초 생의학 연구와 진단 시약의 개발에 중요하다. 그러나 대장균을 이용한 이러한 분자들의 대량 생산은 꾸준한 연구에도 불구하고 일부 재조합 단사슬 가변절편의 경우 본래의 가변영역 (variable domain) 뿐만 아니라 고정영역 (constant domain)을 지닌 완전한 형태의 항체 (full antibody)에 비해 타겟 항원에 대해 매우 낮은 친화도를 갖는다고 알려져 있다. 그러므로 본 연구에서는 피루베이트 탈수소효소 복합체 (pyruvate dehydrogenase complex)-E2 (PDC-E2)에 특이성을 갖는 SP112 Fab 클론으로부터 항체의 가변영역인 VH 와 VL 절편을 분리한 후 이미 잘 알려져 있는 Jun-Fos 지퍼 (zipper)를 이용하여 기능성 있는 항체 절편 (zipFv라고 명함)과 zipFv에 알칼리성 포스파타제가 연결된 융합 분자 (zipFv-AP라고 명함)를 Origami (DE3) trxB gor 돌연변이 대장균 균주 (Novagen, USA)의 세포질 내에서 발현시킴으로써 생산할 수 있는지 조사하였다. 본 발명에서 제작된 pCzFv, pCzFvHAP, pCzFvLAP 및 pCzFvHADLAP 벡터 등을 이용하여 제작된 zipFv-112 및 zipFv-AP-112 분자는 항원인 PDC-E2에 특이적으로 결합하였으며 특히 zipFv-AP-112 융합 분자의 경우 zipFv-112보다 10배 이상 높은 항원 결합력을 보여 주었다. 또한 가장 우수한 결합력을 지닌 융합 분자는 VH 절편 뒤에 AraC DNA 결합 영역 (AraC DNA binding region), 그리고 VL 절편 뒤에 알칼리성 포스파타제가 결합된 융합단백질이 Jun-Fos 지퍼에 의해 이량체 (dimer)가 형성된 재조합 항체 절편이었다.
본 발명에서 개발된 zipFv는 분자의 크기와 구조적인 면에서 scFv와 Fab의 중간에 해당된다 (이론적으로 scFv는 약 28 kDa : zipFv는 42 kDa: Fab는 56 kDa ). 기능성 있는 zipFv을 제작하기 위해 Fos:Jun 류신 지퍼 (leucine zipper)를 사용하여 VH 와 VL 절편을 연결하였는데, 그 주된 이유는 Fos와 Jun의 경우 열역학적인 안정성으로 말미암아 이형이량체 (heterodimers) (Fos:Jun)가 동형이량체 (homodimers) (Fos:Fos 또는 Jun:Jun) 보다 적어도 1000 배 이상 더 형성되기 때문이다 [상기 문헌: 33]. 또한 이미 동일한 양친매성 헬릭스 류신 지퍼 모티프 (amphiphilic helix leucine zipper motif)와 마우스 IgG3의 플렉시블 힌지 영역 (flexible hinge region)이 이량체이고 이특이적인 (bispecific) scFv 절편의 제작에 성공적으로 사용된 바 있다 [상기 문헌: 2]. 이러한 류신 지퍼 모티프는 역시 성공적으로 VH 와 VL 절편을 상호 이형이량체로 결합시켜 항원 결합 능력이 있는 재조합 항체 절편을 형성하며, 이는 SP112 Fab 클론이 scFv 형태에서는 항원을 인지하지 못했음에도 불구하고 zipFv 형태로 VH 와 VL 절편이 발현되었을 경우 모체인 Fab와 같이 항원 결합 특이성을 유지한다는 것이 본 연구의 결과에서 명확하게 증명된 것이다. 한편 대장균 [상기 문헌: 20]에서 알칼리성 포스파타제를 발현할 경우 효소 활성을 유지하기 위해 이황결합이 필요하며, 본 발명에서는 zipFv 절편에 알칼리성 포스파타제 기능을 부여하기 위하여 pCzFv 벡터에 phoA 유전자를 삽입함으로써 pCzFvHAP 및 pCzFvLAP 벡터를 제작하였다.
zipFv를 디자인한 근본적인 근거 중 하나는 항원 결합 능력을 소유한 zipFv 절편이 돌연변이 대장균의 세포질 내에서 Fab 절편보다 조금 더 효율적으로 형성될 수 있다는 것이며 이는 zipFv의 경우 가변 영역 내에 2쌍의 이황 결합 그리고 Fos와 Jun 지퍼 사이에 또 다른 2쌍의 이황 결합, 따라서 총 4쌍의 이황 결합이 형성하는데 반해 Fab는 CH1 내와 CL 카파 (kappa) 내에 각각 한 쌍의 이황 결합, 그리고 고정 영역 사이에 또 한 쌍의 이황 결합, 총 5쌍의 이황 결합이 형성되어야 하기 때문이다. 그러나 예상과는 달리 타 연구자에 의해 발표된 대장균의 세포질내 발현을 통한 Fab 절편의 생산 양과 비교해 볼 때 세포질 내 발현 Fab의 항원 결합 반응 성이 200 ~ 300배 희석된 시료에서도 잘 나타나는 반면 zipFv와 zipFv-AP 융합 단백질은 매우 약한 항원 결합 강도를 나타내었다 [상기 문헌: 23 및 24]. 그러나 이는 실험 조건의 차이에서 기인한 듯 하며, 본 발명에서는 3 ㎖ 배양액으로부터 1.5 ㎖의 세포질 추출물을 얻어 실험에 사용한 반면 벤츄리 (Venturi) 등 [상기 문헌: 24]은 배양액 2ℓ로부터 얻은 세포질 추출물 10 ㎖를 ELISA에 사용하였으며 따라서 그들의 Fab 시료가 계산적으로는 본 연구의 시료보다 약 100배 정도 더 강한 항원 결합 신호를 나타내야 한다는 것을 의미한다. zipFvHADLAP-112의 경우 1/32 희석비에서도 우수한 항원 결합 시그널을 나타내었으며 따라서 zipFvHADLAP 구조는 Fab 구조에 비해 기능성 있는 세포질 내 항체 절편을 10배 정도 높은 수율로 생산할 수 있다고 추정된다. 또한 세포질내 Fab 발현은 37 ℃ 배양 조건하에서 4 시간 동안 수행된 것에 반해 우리의 zipFv-AP 융합 단백질은 27 ℃ 배양 조건하에서 16 시간 수행된 차이에 기인할 수도 있다.
zipFv와 AP의 융합은 scFv-AP 융합 단백질과 마찬가지로 추가적인 효소와 결합된 이차항체의 사용 없이 간단하게 항체 절편과 항원의 결합을 ELISA 또는 웨스턴 블롯 (Western blot)에서 분석할 수 있다는 장점이 있다 [상기 문헌: 34]. 한편 본 연구 결과에서 보여지는 바와 같이 VL-Jun-S1 또는 VH-Fos-myc 중 어느 C-말단 끝에 phoA 유전자를 추가 삽입하느냐에 따라 기능성 있는 zipFv-AP 융합 단백질의 수율이 변화한다는 결과는 흥미롭다. VH-Fos-myc의 C-말단에 AP를 융합할 경우 VH-Fos-myc-AP 융합 분자의 발현 양이 zipFv-112의 VH-Fos-myc 절편 보다 감소하였으나 VH-Fos-myc-AP와 VL-Jun-S1 간에 정상적으로 이량체를 형성한 zipFvHAP-112의 증가로 인하여 zipFv와 비교할 경우 매우 강한 항원 결합 반응성이 관찰되었다. 본 발명자들의 관찰에 의하면 일반적으로 VH 도메인은 대장균에서 발현될 때 소수성 아미노산의 노출로 인하여 VL 도메인에 비해 상호 응집을 이루는 경향이 더 높게 나타난다. 아마도 상기의 결과는 zipFvAP-112의 경우 VH-Fos-myc의 C-말단에 존재하는 AP에 의해 중사슬 가변 영역에 존재하는 소수성 아미노산들을 어느 정도 은폐하고 이러한 기능이 중사슬 가변 영역간의 상호 응집을 감소시키는 것으로 추정되며 [상기 문헌: 35] 결과적으로 기능성 있는 zipFv-AP 분자의 양을 증가시키는 듯 하다. 반대로 AP를 VL-Jun-S1의 C-말단에 융합할 경우 VL-Jun-S1-AP의 발현 양이 증가되며, 이는 아마도 scFv의 VL 단편 다음에 사람 C 카파 도메인을 융합할 경우 박테리아의 세포질 외로 분비되는 수용성 scFv의 발현에 매우 긍정적인 효과를 보이는 것과 유사한 현상으로 예측된다 [상기 문헌: 35]. 또한 이러한 VH-Fos-myc-AP 와 VL-Jun-S1-AP 절편의 발현 수준에 대한 AP의 차별적인 효과는 유전자의 위치상의 영향, mRNA의 길이 또는 안정성에 따른 차별적인 번역 효율로부터 기인할 가능성도 있다.
항-myc mAb를 사용하거나 AP기질을 직접 사용하는 두 가지 경우 모두에서 최적의 항원 결합 반응성을 보여주는 zipFv 융합 단백질의 구조는 VL-Jun-S1 후반부에 AP 및 VH-Fos-myc 후반부에 AraC(DNA) 도메인을 도입한 zipFvHADLAP 융합 단백질이었 으며, 이는 zipFvHAP-112의 VH-Fos-myc-AP 및 zipFvLAP-112의 VL-jun-S1-AP 절편 대부분이 각각 VL-jun-S1 및 VH-Fos-myc와 적절한 이황 결합을 형성하지 못하고 기능성 있는 zipFv-AP 융합 항체 절편을 형성하며 나머지 부분은 단량체 또는 비-기능적인 다량체로 존재하고, AP 또는 AraC(DNA) 융합 분자가 VH-Fos-myc 절편의 C-말단에 존재함으로서 대장균의 세포질 내에서 VH-Fos-myc 절편 상호간의 응집을 감소시킴을 시사한다.
한편 대장균에 의해 발현되는 scFv 또는 Fab 절편의 적절한 접힘 (folding) 현상을 향상시키고 항체 절편의 생산에 의해 발생하는 숙주 세포에 대한 독성을 감소시키기 위하여 대장균에서 항체 절편들과 함께 샤페론 (chaperone) 단백질의 공동 발현이 시도되었다. 예를 들어 DsbC (periplasmic disulfide-bond isomerase C) 유전자를 한 균주 내에서 공동 발현하였을 경우 대장균의 세포질 내에서 활성 tPA의 수율이 20배 이상 높게 상승된다고 보고되었으며 [상기 문헌: 36], scFv 발현의 독성을 감소시키기 위해 Skp 샤페론 단백질을 대장균에서 항체 절편과 함께 공동 발현시키기도 하였다 [상기 문헌: 37]. 또한 레비 (Levy) 등 [상기 문헌: 23]은 Skp 또는 DsbC 샤페론 단백질의 공동 발현을 통해 기능성 있는 Fab 절편의 세포질 내 생산을 5 ~ 6배 향상시키기도 하였다. 전체 VH-Fos-myc 절편 중 VL-Jun-S1 절편과 함께 이종 이량체를 이루어 기능성 있는 zipFv 또는 zipFv-Ap를 형성하는 양은 단지 < 10%에 불과하며, zipFvHADLAP-112와 DsbC의 공동발현은 기능성 있는 zipFvHADLAP-112의 수율을 약 1.5배 증가시키므로 기능성 있는 zipFv 절편의 생산 증대를 위한 또 하나의 방법이 될 수 있을 것으로 사료된다. 그러나 여전히 VH-Fos-myc과 VL-Jun-S1 절편의 대부분은 여전히 비-기능적인 상태로 남아있고, 따라서 좀 더 효율적인 기능성 있는 zipFv 및 zipFv-AP 절편의 세포질 내 발현을 위해 새로운 접근 방법의 개발이 요구된다.
결론적으로 본 발명의 zipFv 및 zipFv 융합 분자들은 생물학적 연구의 진단 시약 및 단백질체 분석을 위한 다양한 항체의 생산에 유용하게 사용될 수 있는, 새로운 형태의 기능적인 항체 절편 생산에 새로운 대안을 제공한다.
본 발명에서 대장균 trxB gor 돌연변이는 trxB와 gor 유전자 돌연변이를 가진 대장균을 총칭한다. Origami(DE3) 대장균 균주는 상기 대장균 trxB gor 돌연변이의 대표적인 상용 균주로서 본 발명에서는 Novagen으로부터 구입하여 사용하였다. 또한, 본 발명에서 Origami(DE3)와 Origami(DE3) trxB gor 돌연변이 대장균 균주는 동일한 돌연변이 균주를 지칭한다.
이하 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 박테리아 균주와 올리고뉴클레오티드
대장균 균주인 ElectroTen Blue (Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac KanR [F' proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR)]) (Stratagene, USA)를 재조합 벡터의 제작을 위한 DNA 클로닝 숙주로 이용하였고, Origami(DE3) (Δ (ara-leu)7697 Δ lacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 aphC galE galK rpsL F'[lac + lacI q pro] (DE3) gor 522::Tn10 trxB (KanR, StrR, TetR)) (Novagen, USA)를 재조합 항체 절편의 발현에 이용하였다. 본 발명에서 사용된 올리고 뉴클레오티드는 바이오니아 (대한민국)로부터 합성되었다.
실시예 2: DNA 클로닝
모든 DNA 클로닝 절차는 표준 절차 [상기 문헌: 25]에 따라 수행하였고, PCR (polymerase chain reaction)은 EX-Taq 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소 (Takara, Japan)를 사용하여 수행하였다. Fos 및 Jun 유전자 단편들의 업스트림 위치에 각각 VH 및 VL 클로닝 위치가 포함된 pCzFv 벡터, 및 Fos와 Jun 유전자 조각 다음에 PhoA 알칼리성 포스파타제 유전자를 융합한 것을 각각 pCzFvHAP 또는 pCzFvLAP이라 명명하였다 (도 1 참조). 사람 VH 와 VL 사슬 유전자는 약간 변형시킨 사람 Ig-특이적인 VH 와 JH 및 VLκ 와 Jκ의 프라이머를 이용하여 35 싸이클에서 94 ℃ 1 분, 55 ℃ 1 분, 72 ℃ 1 분 후 72 ℃에서 10분의 조건으로 SP112 Fab 클론 [상기 문헌: 26]으로부터 PCR을 이용하여 증폭하였다 [상기 문헌: 27]. (VH 센스 (sense): 5'-GGGGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3' (서열번호: 1), JH 안티센스 (antisense): 5'-GGGGGCCACATTGGCCGATGAGGAGACGGTGACCAKGGTBCCTTGGCCCCA-3' (서열번호: 2), Vκ 센스: VL 정방향: 5'-GGGGTCGACATGGAAATTGAGTTGACGCAGTCTCC-3' (서열번호: 3), Jκ 안티센스: 5'-GGGCCGCGGATACGTTTGATHTCCASYTTGGTCCC-3' (서열번호: 4); Sfi I, SalI and Sac II의 제한효소를 이용하였고 겹침 (degeneracy)을 아래와 같이 표기 하였다: H = A, C 또는 T; S = G 또는 C; Y = C 또는 T; K = G 또는 T; B = G, T 또는 C).
SP112의 VL 유전자 단편을 1.2% 아가로오스 겔 (agarose gel)로부터 분리함으로써 수득하였고, 이를 Sal I과 Sac II로 처리한 후, 2:1 비율로 T4 DNA 라이게이즈 (ligase)를 이용하여 16 ℃ 에서 pCzipFv, pCzFvHAP 및 pCzFvLAP 내로 클로닝 하였다. DNA 라이게이션 (ligation) 반응물을 Gene pulseer (Biorad, USA)를 이용하여 2.5 kV, 25 μF 및 400Ω 조건에서 일렉트로포레이션 (electroporation)에 의해 ElectroTen Blue 컴피턴트 세포 (competent cells) 안으로 삽입시켰다. 상기 세포를 37 ℃ 에서 1시간 동안 SOC 액체 배지에서 배양시켰다. 그 다음 세포 현탁액을 50 ㎍/㎖ 암피실린 (ampicillin)이 포함된 2 x YT 플레이트에 도말하였다. pCzFv, pCzFvHAP 또는 pCzFvLAP 벡터에 VL 유전자가 삽입되어 있는지를 대장균 콜로 니에서 분리한 플라스미드를 Sal I과 Sac II로 처리한 후 1.2% 아가로오스 겔을 통해 확인하였다. 그 후에 SP112로부터 증폭된 VH 유전자를 Sfi I 제한 효소로 처리한 후 VL 유전자가 삽입된 pCzFv, pCzFvHAP, 및 pCzFvLAP 벡터에 클로닝하였다. 이렇게 얻어진 Fv 유전자를 갖는 pCzFv, pCzFvHAP, 그리고 pCzFvLAP 벡터를 pCzFv-112, pCzFvHAP-112 또는 pCzFvLAP-112라고 명명하고 Origami (DE3)세포에 일렉트로포레이션에 의해 삽입시켰다.
AraC (아미노산 잔기 168 - 291) (AraCDNA) [상기 문헌: 28 및 29]의 DNA 결합 도메인의 유전자는 PCR 프라이머 (센스: 5'-GGGACTAGTAACGAGTCGCTCCATCCACCG-3' (서열번호: 5); 안티센스: 5'-GGGGTCGACACTAGTTTATGACAACTTGACGGCTACATCA-3' (서열번호: 6), Spe I 제한효소 인식부위를 밑줄로 표시)를 이용하여 pBAD/gIII 벡터 (Invitrogen, USA)로부터 PCR 증폭을 통해 수득하였다. 수득된 408 bp의 PCR 생산물을 Spe I 제한효소로 절단하였으며, Nhe I 제한효소로 처리된 pCzFvLAP-112에 삽입하였다. 그 후 ElectroTen Blue 세포를 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법으로 형질전환 하였으며, 최종적으로 Origami (DE3)에 일렉트로포레이션 방법으로 형질전환 하였고 그 결과 pCzFvHADLAP-112를 제작하였다. DsbC와의 세포질 내 공동 발현은, 시그널 펩타이드 서열이 제외된 대장균 DsbC 유전자 [(주)아이지세라피 합성] (서열번호: 9)를 PCR 프라이머 (센스: 5'-GGGCATATGGATGACGCGGCAATTCAACAA-3' (서열번호: 7), 안티센스: 5'-GGGGGTACCTTATTTACCGCTGGTCATTTTTTG-3' (서열번호: 8), Nde I 와 Kpn I 제한효소 인식부위를 밑줄로 표시)를 이용하여 PCR 방법으로 BL21 (DE3) 세포 (Novagen, USA)의 게놈 DNA로부터 수득하였다.
결과물인 PCR 생산물을 Nde I / Kpn I으로 효소처리하고, pCDFDuet (Novagen, USA)안에 클로닝함으로써 pCDF-DsbC를 제작하였다. 이 벡터를 이용하여 Origami (DE3) 세포를 형질전환 시켰으며, 50 ㎍/㎖ 의 스펙티노마이신 (spectinomycin) (Sigma Co.)이 포함되어 있는 LB 배지에서 선별하였다.
실시예 3: 항원의 준비
PDC-E2 내부 라이포일 (inner lipoyl) 도메인 cDNA (아미노산 잔기 91-227)가 삽입된 pGEX 벡터를 가지고 있는 대장균을 37 ℃ 에서 50 ㎍/㎖의 암피실린이 포함된 LB 배지 200 ㎖에 OD600 = 0.5 까지 배양시켜 준비하였다 [상기 문헌: 30]. 그 후 최종농도 1 mM의 IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가한 다음 37 ℃ 에서 4시간 동안 대장균을 배양하여 GST (Glutathione S-transferase)에 융합된 사람 PDC-E2 의 재조합 내부 라이포일 도메인의 발현을 유도시켰다. 배양한 균주를 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리 하였고, 결과물인 균주 침전물을 5㎖의 1% Triton X-100 (Sigma Co.)이 첨가된 차가운 PBS (phosphate-buffered saline)로 재현탁 시켰다. 뒤이어 100 ㎍/㎖의 PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가한 후 균주 현탁액을 얼음 안에서 2분간의 간격을 두고 5초간 5회 초음파처리 하였고, 4 ℃ 에서 5분간 원심분리하여 균주 부스러기 (debris)를 제거 하였다. 단백질의 정제는 2 ㎖의 PBS에 있는 글루타티온-아가로오스 비드 (glutathione-agarose bead) (Sigma Co.)를 상등액과 4 ℃ 에서 밤새 혼합하고, 차가운 PBS로 4회 세척한 후 5 mM의 환원된 글루타티온 (reduced glutathione) (Sigma Co.)이 용해되어 있는 50 mM Tris-Cl (pH 8.0)를 사용하여 용출하였다.
대조군 항원은 다음과 같이 준비하였다. MBP (Maltose binding protein)는 제조사의 프로토콜에 따라 아밀로오스-결합 수지 (resin)를 이용하여 pMAL-c2 (New England Biolab, USA)가 들어있는 대장균을 배양하여 준비하였다. 사람 재조합 IL-15 단백질은 pET 발현 시스템을 이용하여 생산하였고 Ni-NTA 수지 [(주)아이지세라피, 공개되지 않음]를 사용하여 정제하였다. BSA (Bovine serum albumin)는 시그마 (Sigma Co.)로부터 구입하였다.
실시예 4: zipFv 와 zipFv-AP 단편의 생산
pCzFv-112, pCzFvHAP-112, pCzFvLAP-112 또는 pCzFvHADLAP-112가 들어있는 Origami (DE3) 균주를 5 ml의 2 x YT/amp 배지에 OD600 = 약 0.5까지 배양하였다. 그 후 IPTG를 최종농도 0.1 mM이 되도록 배양액에 첨가하였으며, zipFv 분자의 발현을 27 ℃ 에서 16시간 유도하였다. 배양된 균주를 4,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 수득한 후 100 ㎍/㎖의 PMSF가 첨가된 2 ml의 차가운 PBS로 재현탁 하였다. 균주 현탁액을 얼음안에서 5회 초음파 분쇄하고 4 ℃ 에서 5분간 원심분리하여 세포질 내 추출물을 수득하였다. 그 결과 수득된 세포질 내 추출물을 ELISA에 사용하였다. DsbC와 zipFv-AP 분자의 공동 발현을 위해 pCDF-DsbC가 삽입되어 있는 Origami (DE3) 균주를 일렉트로컴피턴트 (electrocompetent) 균주 제작에 사용하였 으며, 이 균주에 pCzFvHADLAP-112를 상기 언급한 일렉트로포레이션 방법에 의해 주입하였다. pCDF-DsbC와 pCzFvHADLAP-112 벡터를 모두 가진 균주는 50㎍/㎖의 스펙티노마이신이 첨가된 2 x YT/amp 배지에서 배양하여 선별하였다.
실시예 5: ELISA
코팅완충액 (0.1 M NaHCO3, pH 9.6)중에 10 ㎍/㎖의 PDC-E2, 재조합 사람 IL-15, MBP, 또는 BSA가 용해된 항원 용액을 Maxisorp 96-웰 플레이트 (Nunc, Denmark)에 웰 당 50 ㎕씩 첨가하여 4 ℃ 에서 밤새 코팅하였고, PBS에 분말 우유 3%가 섞인 용액 (MPBS)으로 2 시간 동안 실온에서 블로킹 (blocking)하였다. 이때 단계별로 희석된 50 ㎕의 세포질 내 추출물을 각각의 웰에 첨가하고, 27 ℃ 에서 2시간 동안 반응 시켰다. 플레이트를 0.05% Tween 20이 포함되어 있는 PBS (PBST)로 4회 세척하고, 각각의 웰에 마우스 항-myc 태그 모노클로날 항체 (mAb) [(주)아이지세라피]를 첨가한 다음 다시 PBST 용액으로 4회 세척하고 HRPO (horse radish peroxidase)가 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (goat anti-mouse IgG-HRPO) (Sigma Co.)를 첨가하여 27 ℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. ELISA 양성 반응 신호는 50㎕ 의 3.3', 5.5'-TMB (tetramethyl benzidine) 기질을 첨가하여 시각적으로 보이게 하고, 효소 반응은 동량의 1 N HCl을 각 웰에 첨가하여 정지시켰다. 최종적으로 ELISA 판독기 (Biorad)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 한편 항원과 결합하는 zipFv-AP의 알칼리성 포스파타제 (AP)의 활성을 측정하기 위하여 기질인 pNPP (p-nitrophenyl phosphate) (Sigma Co.) 50㎕ 을 항-myc 태그 mAb 대신에 각 웰에 직접적으로 첨가하였고, 효소 반응은 각 웰에 3N NaOH를 첨가하여 정지시킨 후 ELISA 판독기를 이용하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 6: 웨스턴 블롯
pCzFv-112, pCzFvHAP-112 또는 pCzFvLAP-112가 삽입된 Origami (DE3) 세포를 2 x YT/amp 배지에서 OD600 = 0.5까지 37 ℃ 에서 배양하였고, zipFv 와 zipFv-AP 융합 단백질의 발현을 상기한 바와 같이 유도 하였다. 균주를 배양액으로부터 원심 분리를 통해 수득하였고 β-2-메르캅토에탄올이 첨가되거나 첨가되지 않은 SDS 샘플 완충액에 현탁하였으며, 최종적으로 총 세포 단백질을 12% SDS-PAGE로 분별 하였다 [상기 문헌: 25]. 분별된 단백질을 니트로셀룰로오스 막 (membrane)에 이전 시킨 후 막을 MPBS로 블로킹 (blocking) 시켰다. PBST로 막을 3회 세척한 후 항-myc 태그 모노클로날 항체에 이어 염소 항-마우스 IgG 알칼리성 포스파타제 (AP) (Sigma Co.)를 첨가하거나, NBT/BCIP 기질 (Sigma Co.)을 직접 막에 첨가함으로써 대장균 용해질에서 zipFv 또는 zipFv-AP의 AP 활성을 측정하였다. 블롯 상의 밴드 (band)는 농도계 (densitometer) (Biorad)를 사용하여 분석 하였다
결 과
zipFv 발현 벡터의 작제
SP112 Fab 클론은 일차 담경화증 (PBC) 환자의 면역 레파토리 (repertoire)로부터 수득한 PDC-E2의 구조적 에피토프 (epitope)에 특이적인 사람 재조합 Fab 클론 중 하나이다 [상기 문헌: 26]. 대장균 주변세포질 (periplasm)에서의 SP112 Fab 절편의 과대 발현은 숙주 세포의 용해를 야기 시키고, SP112의 VH 및 VL을 이용하여 작제한 scFv 절편은 항원인 PDC-E2와 적절한 결합을 보여 주지 못하였다 (자료 제시 안함). 따라서 본 발명에서는 Fos [mouse c-Fos (Acc. No.: CAA24105)의 #161-200 아미노산 (40개의 아미노산 잔기) (서열번호: 10)]/Jun [mouse c-Jun (Acc. No.: AAH94032)의 #279-318 아미노산 (40개의 아미노산 잔기) (서열번호: 11)] 류신 지퍼 (leucine zipper)를 통한 VH 및 VL 의 이형이량체화 (heterodimerization)가 항원 결합능력을 유지할 수 있는 지를 시험하기 위해 기본 틀로서 pET22b 발현 벡터 (Novagen, USA)를 사용하고 새로운 Fv 발현 벡터인 pCzFv를 제작하여 이용하였다 (도 1 참조). VH 및 VL 유전자 단편들이 각기 동등하게 전사될 수 있도록 하나의 p7 프로모터 뒤에 VH-Fos-myc, VL-Jun 유전자 절편을 바이시스트로닉 (bicistronic) 하게 배치되도록 디자인 하였다. Fos와 Jun은 VH 와 VL의 이량체 형성에 기여하도록 하였고 두 개의 시스테인을 각각의 Fos와 Jun 부위의 양쪽 지역에 첨가하여 Fos/Jun 이량체의 좌우 두 곳에 이황결합이 이루어 지도록 함으로써 안정된 지퍼 지역이 형성될 수 있도록 하였다 [상기 문헌: 2]. 또한 마우스 IgG3 힌지 (hinge) 절편 [10개의 아미노산 잔기: PKPSTPPGSS (서열번호: 12)]을 VH 와 Fos, 및 VL 과 Jun 사이에 각각 삽입하여 구조적인 유연성을 가질 수 있도록 하였으며, myc 태그 (서열번호: 13)와 S1 태그 (서열번호: 14)를 Fos 와 Jun의 양 끝에 위치시킴으로써 항체 절편의 면역적 검출이 용이하게 하였다. zipFv에 의해 발 현되는 VH-Fos-myc 또는 VL-Jun-S1 절편 중 하나의 C-말단 부위에 알칼리성 포스파타제가 연결된 zipFv-AP 융합 단백질을 생산하기 위해 pCzFv 벡터에 phoA 유전자 (1470 bp의 길이와 46.5 kDa의 크기)를 삽입하여 pCzFvHAP 와 pCzLAP 벡터를 각각 제작하였다.
zipFv 와 zipFv-AP 융합 단백질의 발현 및 특성
SP112 Fab의 VH 와 VL 유전자가 삽입된 pCzFv, pCzFvHAP 및 pCzFvLAP (pCzFv-112, pCzFvHAP-112, pCzFvLAP-112) 벡터들을 Origami (DE3) trxB gor 대장균에 도입한 후 2 x YT/amp 배지에서 배양하였고, 27 ℃ 에서 6 시간 동안 0.1 mM IPTG를 이용하여 재조합 항체 절편들의 발현을 유도하였다. zipFv-112, zipFvHAP112 및 zipFvLAP-112 항체 절편들을 각각 pCzFv-112, pCzFvHAP-112 및 pCzFvLAP-112가 주입된 균주를 사용하여 생산하였고, 항체 절편 생산의 최적 배양 조건을 다양한 IPTG 농도 (0 ~ 1 mM), 온도 (27 ℃ 또는 37 ℃ ) 및 유도 시간 (2 ~ 16 시간)을 사용하여 예비 실험을 통해 검증한 후 37 ℃ 에서 4 시간 동안 발현되는 기능성을 있는 zipFv 와 zipFv-AP 융합 단백질보다 27 ℃ 에서 16 시간 동안 발현되는 단백질의 양이 적어도 1 ~ 3 배 정도 높다는 것을 발견 하였다 (데이터 제시 안함). 또한 세포 배양시 숙주 세포 용해와 같은 현상은 상기 항체 절편들의 세포질내 발현 동안 전혀 발견 되지 않았다 (데이터 제시 안함).
재조합 항체 절편의 IPTG 유도 후 세포를 수거하여 세포질내 추출물을 준비하였고 재조합 PDC-E2, 재조합 사람 IL-15, MBP 및 BSA로 코팅된 마이크로역가 플 레이트를 사용하여 재조합 항체 절편의 항원 결합 특이성을 ELISA 방법으로 분석하였으며, 결합 반응을 검출하기 위해 항-myc 모노클로날 항체를 이용하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 zipFv-112와 이것에 AP가 융합된 단백질 (zipFvHAP-112 및 zipFvLAP-112)은 네가티브 항원들과는 결합하지 않고 오직 PDC-E2에만 특이적으로 반응하였으며, 이는 zipFv 항체 절편들이 SP112의 항원 결합 특이성을 유지하고 있음을 입증한다. zipFv-112가 세 가지의 재조합 항체 단편 중 가장 약한 결합 시그널을 보여 주었기 때문에, 같은 조건에서 준비된 대장균의 세포질 용출액의 희석 샘플을 사용하여 ELISA 방법으로 항원 결합 강도를 비교하였다. 상기 실시예에서 설명한 바와 같이 마우스 항-myc 태그 모노클로날 항체에 이은 염소 항-마우스 IgG-HPRO 이차 항체를 이용하여 PDC-E2와 결합하는 zipFv 와 zipFv-AP 융합의 VH-Fos-myc 또는 VH-Fos-myc-AP를 측정하였다. zipFvHAP-112의 PDC-E2 결합 활성을 ELISA로 분석한 결과 zipFv-112보다 약 10배, zipFvLAP-112 보다 약 4배가 높았으며 (도 4 참조), 이는 VH-Fos-myc C-말단과 AP의 융합이 VH-Fos-myc 절편들의 발현량을 향상시키거나 VL-Jun-S1 절편과의 이량체 결합을 용이하게 함을 시사한다. 대조적으로 결합 활성을 인지하기 위해 AP 기질 (PNPP)을 ELISA에 직접 사용했을 경우에는 zipFvHAP-112가 zipFvLAP-112에 비해 약 1/5정도 약한 결합 활성을 나타내었다 (도 5 참조).
V H 와 V L 융합 단백질의 발현 및 재조합 항체 절편의 형성을 측정하기 위한 웨스턴 블롯 분석
이런 모순된 결과들을 이해하기 위해서, 웨스턴 블롯을 환원상태의 12% SDS-PAGE를 이용하여 Origami (DE3) 세포 용해질을 샘플로 사용하여 수행하였다 (도 6 참조). zipFv-112 또는 zipFvLAP-112의 VH-Fos-myc 절편과 ZipFvHAP-112의 VH-Fos-myc-AP 절편의 발현 양을 항-myc 태그 mAb를 이용하여 측정하였으며, zipFvHAP-112의 VH-Fos-myc-AP 및 zipFvLAP-112의 VL-Jun-S1-AP의 AP 활성을 블롯에 직접 AP 기질인 NBT/BCIP를 첨가하여 측정하였다. 그 결과 ELISA상에서는 zipFv-112가 zipFvHAP-112 및 zipFvLAP-112에 비해 항원 결합 능력이 가장 낮았음에도 불구하고 VH-Fos-myc 절편 (이론적인 분자량 21kDa)의 경우 zipFv-112가 zipFvHAP-112 및 zipFvLAP-112에 비해 3 배 정도 더 강하게 발현됨이 밀도측정법에 의해 측정되었다. 그리고 zipFvHAP-112가 zipFvLAP-112보다 PDC-E2에 대한 결합능력이 훨씬 더 강함에도 불구하고 zipFvHAP-112의 VH-Fos-myc-AP와 zipFvLAP-112의 VH-Fos-myc의 발현 정도는 비슷하였다. 그러므로 VH -Fos-myc의 C 말단에 AP를 융합하는 것은 대체로 대장균 내에서 zipFv-AP의 VH-Fos-myc 절편들의 발현율을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나 여전히 기능적인 ZipFv-AP 분자들의 형성은 개선되었다.
도 7에서 보여지는 바와 같이 zipFv-112가 발현된 세포 추출액을 환원상태와 산화상태의 12% SDS-PAGE에서 분별한 후 수행한 웨스턴 블롯을 농도계를 사용하여 분석한 결과에 따르면 항-myc 모노클로날 항체에 의해 검출된 Origami (DE3) 세포 의 세포질 내의 VH-Fos-myc 절편 중 7% 만이 기능성 있는 zipFv-112 분자들의 형성에 기여하는 것으로 나타났다. 따라서 대부분의 VH-Fos-myc와 VL-Jun-S1 절편들이 Origami (DE3) 세포의 세포질내에서 적절한 이량체를 형성하지 않았다. AP 활성에 있어서는 pCzFvLAP-112 벡터에 의한 VL-Jun-S1-AP의 발현양이 pCzFvHAP-112 벡터에 의한 VH-Fos-myc-AP의 발현양 보다 약 50배정도 높았으나 (도 6 참조), ELISA상에서는 zipFvLAP-112 가 zipFvHAP-112와 비교했을 때 단지 5 배 정도 강한 항원 결합 능력을 보여주었다 (도 5 참조). 따라서 zipFvLAP-112가 보여준 항원 결합력은 세포 내에서 생산된 다량의 VL-Jun-S1-AP 절편 중 적절한 이량체를 형성한 일부의 것으로 보이며 VL-Jun-S1-AP의 상당 부분이 세포 내에서 비-기능적으로 남아 있음을 알 수 있었다. 또한 VH-Fos-myc-AP가 VL-Jun-S1-AP와 비교하여 AP 활성을 적게 나타내는 것은 항-myc 태그 모노클로날 항체의 검출에 의해 관찰된 발현 양으로 판단컨데 VH-Fos-myc-AP의 상대적으로 낮은 발현 양 때문인 것으로 사료된다. 불행히도 항-S1 태그 모노클로날 항체가 블롯 상에서 너무 많은 백그라운드를 나타내기 때문에 웨스턴 블롯 상에서 VL-Jun-S1과 VL-Jun-S1-AP의 발현 양을 비교 분석할 수는 없었다.
기능성 있는 zipFv-AP 융합 단백질의 형성에 있어서 V H -Fos-myc의 c-말단에 융합되는 단백질의 효과
VH-Fos-myc의 C-말단에 존재하는 AP가 기능성 있는 zipFv의 형성에 도움을 주는 것으로 보이며, 또한 VL-Jun-S1의 C-말단에 존재하는 AP는 zipFv-AP 융합 단백질의 AP 활성을 안정화 시켜주는 것으로 판단되었다. 따라서 AraC 조절단백질의 DNA 결합 영역인 AraCDNA 같은 단백질을 VH-Fos-myc의 C-말단에 삽입하는 것이 zipFvLAP-112의 기능성 있는 zipFv 절편 형성에 도움을 주는지 또는 높은 AP 활성을 유지하는데 기여할 수 있는지 조사하였다. AraCDNA를 본 발명에서 선택한 이유는 상기 단백질이 적당한 제한효소 인식 부위를 지니고 있고 본 발명자들이 상기 단백질을 이미 보유하고 있었으며, 이 단백질 영역이 대장균의 세포질 내에서 용해된 형태로 생산될 수 있다고 공지되어 있었기 때문이다 [상기 문헌: 31]. AraCDNA의 유전자 절편을 pCzFvLAP-112 벡터의 myc 태그의 3'-말단에 클로닝하였고 그 결과 pCzFvHADLAP 벡터가 제작되었다 (도 1 참조). Origami (DE3) 세포를 사용하여 zipFvHADLAP-112 절편을 생산하였으며 zipFvHADLAP-112와 zipFvHAP-112의 항원 결합 강도를 항-myc 태그 모노클로날 항체를 이용하여 ELISA 방법으로 비교하였다. 그 결과 VH-Fos-myc C-말단에 AraCDNA가 융합된 zipFvHADLAP-112가 zipFvHAP-112와 동등한 정도의 항원 결합 반응성을 나타내었다 (도 8 참조). 이는 VH-Fos-myc 뒤에 존재하는 융합 단백질이 VH-Fos-myc와 VL-Jun-S1 간의 이량체 형성을 보다 향상된 이황 결합 또는 증가된 VH-Fos-myc 용해도를 통해 기능성 있는 zipFv 항체 절편들의 형성을 향상 시키는 것으로 보인다. AP 활성면에서도 AP 기질을 직접 이용한 ELISA 상에서 zipFvHADLAP-112는 zipFvLAP-112와 같은 정도의 항원 결합 세기가 비슷한 것으로 나타났다 (데이터 제시 안함). 한편 항-myc 태그 모노클로날 항체와 염소 항-마우스 IgG-HRPO를 사용한 ELISA 상의 항원 결합에 따른 검출 신호가 AP기질을 직접 이용했을 때 보다 더 높게 나타났으며 이는 아마도 이차 항체 사용에 따른 검출 신호의 증폭 또는 기질의 민감도 차이에 기인한 것으로 추정된다 (HRPO 대해선 TMB vs AP에 대해선 pNPP).
기능성 있는 zipFv-AP 절편의 발현에 있어서 DsbC 동시 발현의 효과
DsbC 이황화 이량체의 동시발현이 기능성 있는 zipFvHADLAP-112의 생산을 개선시켜주는지 조사하기 위해 시그널 펩타이드 서열이 제거된 DsbC 유전자를 BL21 세포 (Novagen, USA)로부터 PCR로 증폭하였으며 한 숙주 세포 내에서 pET 벡터와의 동시 발현을 위해 pCDFDuet 벡터에 클로닝 하였다. 결과적으로 제작된 pCDF-DsbC를 Origami (DE3) 세포에 삽입하였으며 리더 (leader)가 결실된 형태의 DsbC (217 아미노산, 대략 24 kDa)의 세포질 내 발현을 12 % SDS-PAGE에 의해 확인하였다 (데이터 제시 안함). pCDF-DsbC를 가지고 있는 일렉트로-컴피턴트 (Electro-competent) Origami (DE3) 균주에 pCzFvHADLAP-112를 도입한 후 DsbC가 없는 Origami (DE3) 균주와 있는 균주에서 발현된 zipFvHADLAP-112의 PDC-E2 결합 강도를 ELISA로 각각 비교하였다 (도 9a 및 도 9b 참조). 그 결과 인위적으로 과발현된 DsbC와 동시에 발현되는 zipFvHADLAP-112는 DsbC가 동시 발현되지 않는 zipFvHADLAP-112보다 항원에 대한 결합 강도가 항-myc 태그 모노클로날 항체를 사용하여 측정하였을 경우 약 1.5배 더 높은 것으로 나타났다 (도 9a 참조). 따라서 세포질 내의 DsbC 동시 발현이 VH-Fos-myc-AraC(DNA)와 VL-Jun-S1-AP 사이의 이황화 이량체 형성에 약간의 도움을 주는 것으로 판단되며, 항원에 대한 결합 강도를 AP 기질을 사용하여 직접 측정할 경우 별다른 개선이 나타나지 않는 것으로 보아 VL-Jun-S1-AP의 안정화에는 별다른 효과가 없는 것으로 관찰되었다 (도 9b 참조).
본 발명의 구체예에서 사용된 VH 및 VL 절편 및 기능성 분자들은 단지 본 발명을 예시하고자 하는 것으로서 본 발명을 제한하는 것이 아니며, 연구 목적에 따라 다른 항체로부터 획득한 VH 및 VL 절편 및 항체 절편의 검출을 위한 다른 유용한 기능성 분자가 사용될 수 있음은 자명하다.
본 발명은 기능성 Fv 절편을 보다 안정적이고 용이하게 생산하는 방법을 제공하며, 본 발명의 zipFv 및 zipFV 융합 분자들은 생물학적 연구의 진단 시약 및 단백질체 분석을 위한 다양한 항체의 생산에 유용하게 사용될 수 있는 새로운 형태의 기능적인 항체 절편 생산에 새로운 대안을 제공한다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 프로모터 (promoter) 핵산 서열, VH (Heavy chain variable region), Fos, myc 태그, VL (Light chain variable region), Jun 및 S1 태그를 각각 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 도 1에 기재된 개열지도 중 어느 하나의 구성을 갖는 재조합 항체 절편 발현 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, VH와 Fos 사이 및 VL과 Jun 사이에 마우스 IgG3 힌지 (hinge) 절편을 엔코딩하는 핵산 서열 (서열번호: 12)을 포함함을 특징으로 하는 재조합 항체 절편 발현 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, VH-Fos-myc 다운스트림 또는 VL-Jun-S1 다운스트림에 알칼리성 포스파타제 (alkaline phosphatase), AraC DNA 결합영역 또는 녹색형광단백질 (green fluorescence protein; GFP)을 포함하는 기능성 분자를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 항체 절편 발현 벡터.
  4. 삭제
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체 절편 발현 벡터를 숙주세포 내로 형질전환시켜 숙주세포의 세포질에서 재조합 항체 절편을 발현 및 생산하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 숙주세포가 대장균 trxB gor 돌연변이 균주임을 특징으로 하는 재조합 항체 절편을 발현 및 생산하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 샤페론 단백질 DsbC(periplasmic disulfide-bond isomerase C)를 발현시킬 수 있는 벡터를 숙주세포 내로 형질전환시키는 단계를 추가로 포함하여, DsbC를 동시에 발현시키는 것을 특징으로 하는 재조합 항체 절편을 발현 및 생산하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 대장균 세포질에서 재조합 항체 절편 발현이 25℃ 내지 30℃에서 10 내지 20시간 수행됨을 특징으로 하는, 재조합 항체 절편을 발현 및 생산하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체 절편 발현 벡터에 의하여 발현되고, 항체 중사슬 가변영역 (Heavy chain variable region) 아미노산 서열 및 경사슬 가변영역 (Light chain variable region) 아미노산 서열이 Jun-Fos 류신 지퍼 (leucine zipper)에 의해 결합된 재조합 항체 절편.
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