TW202342548A - 抗獨特型(anti-idiotype)抗體分子及其用途 - Google Patents

抗獨特型(anti-idiotype)抗體分子及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明揭示特異性結合至抗APRIL抗體之抗體分子。該等抗體分子可用於偵測抗APRIL抗體之分析法中。

Description

抗獨特型(ANTI-IDIOTYPE)抗體分子及其用途
IgA腎病變為全世界最盛行之慢性腎小球疾病之一。保守性流行病學估計引用的全球發病率為大致5至50例個案/百萬(兒童)及10至40例個案/百萬(成人)。此疾病發生率呈現區域性偏向，其中在亞洲及美國具有較高盛行率，在日本及中國地區具有尤其較高之疾病負荷。在日本，經切片檢查確認的IgA腎病變個案預計為大致350,000。在美國，此預計為大致100,000--因此，其為成人中最常診斷之1°腎小球疾病。儘管為相對惰性疾病，但IgA腎病變仍引起末期腎病(ESRD)，亦即在20至30年跨度內，20%至50%患者出現腎衰竭。鑒於需要藉由腎臟切片檢查(一種在各種臨床背景中可變地實施的方案)確認該疾病，因此此等數字可能被大大低估。該疾病的致病機制複雜，其具有導致疾病病因學、病理學及惡化之遺傳、流行病學及潛在環境因素。其同樣具有無症狀至末期腎衰竭(ESRD)範圍內之可變臨床呈現。IgA腎病變係由IgA (通常呈免疫複合體形式)在腎臟之腎小球膜中沈積引起。
正開發抗體藥物產品用於治療IgA腎病變。需要開發新的藥劑及分析法以針對臨床前及臨床樣品評估抗體藥物產品。
本發明至少部分地提供抗體分子，其結合至抗APRIL抗體(例如，西貝侖利單抗(sibeprenlimab))且包含一或多種本文中所揭示之功能及結構特性。在一實施例中，抗體分子為抗獨特型(抗ID)抗體分子。在一實施例中，抗體分子結合至抗APRIL抗體及/或降低(例如抑制、阻斷或中和)抗APRIL抗體之一或多種生物活性。在一實施例中，抗體分子包含本文所描述之重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)。在一實施例中，抗體分子包含本文所描述之VH之一或多個重鏈CDR (HCDR)及/或VL之一或多個輕鏈CDR (LCDR)。亦提供編碼抗體分子之核酸分子、載體、細胞、組合物、套組及用於製備及使用抗體分子之方法。本文中所揭示之抗體分子適用於偵測及量測樣品及個體中之抗APRIL抗體(例如，西貝侖利單抗)。
因此，在一態樣中，本發明提供一種抗體分子(例如抗獨特型抗體分子)，例如本文中所描述之抗體分子，其具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或所有)： a) 以高親和力結合至抗APRIL抗體(例如西貝侖利單抗)，例如其中半數最大有效濃度(EC 50)藉由例如本文中所描述之方法所測定為約1 µg/mL或更低，例如約900 ng/ml或更低、800 ng /ml或更低、700 ng/ml或更低、600 ng/ml或更低、500 ng/mL或更低、400 ng/mL或更低、300 ng/mL或更低、200 ng/mL或更低、100 ng/ mL或更低、90 ng/mL或更低、80 ng/mL或更低、70 ng/mL或更低、60 ng/mL或更低、50 ng/mL或更低、40 ng/mL或更低、30 ng/mL或更低、20 ng/mL或更低、10 ng/mL或更低、5 ng/mL或更低、2 ng/mL或更低、1 ng/mL或更低，例如在1 ng/mL與1 µg /mL之間，例如在1 ng/mL與1 µg/mL之間、在1 ng/mL與500 ng/mL之間、在1 ng/mL與200 ng/mL之間、在1 ng/mL與100 ng/mL之間、在1 ng/mL與50 ng/mL之間、在1 ng/mL與20 ng/mL之間、在1 ng/mL與10 ng/mL之間、在1 ng/mL與5 ng/mL之間、在2 ng/mL與1 µg/mL之間、在5 ng/mL與1 µg/mL之間、在10 ng/mL與1 µg/mL之間、在20 ng/mL與1 µg/mL之間、在50 ng/mL與1 µg/mL之間、在100 ng/mL與1 µg/mL之間、在200 ng/mL與1 µg/mL之間、在500 ng/mL與1 µg/mL之間、在2 ng/mL與500 ng/mL之間、在5 ng/mL與200 ng/mL之間、在10 ng/mL與100 ng/mL之間、在15 ng/mL與50 ng/mL之間、在20 ng/mL與30 ng/mL之間、在20 ng/mL與25 ng/mL之間，例如約1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、60 ng/mL、70 ng/mL、80 ng/mL、90 ng/mL、100 ng/mL、110 ng/mL、120 ng/mL、130 ng/mL、140 ng/mL或150 ng/mL； b) 特異性結合至抗APRIL抗體(例如，西貝侖利單抗)上之獨特型，例如與由本文中所描述之單株抗體(例如，mAb 1H4)識別之抗原決定基相同、類似或重疊之抗原決定基； c) 活體外、離體或活體內降低(例如抑制、阻斷或中和)抗APRIL抗體(例如，西貝侖利單抗)之一或多種生物活性； d) 展示與本文中所描述之單株抗體(例如，mAb 1H4)相同或類似之結合親和力或特異性或兩者； e) 展示與抗體分子相同或類似之結合親和力或特異性或兩者，該抗體分子包含本文中所描述之重鏈可變區及/或輕鏈可變區，例如本文中所描述之單株抗體(例如，mAb 1H4)之重鏈可變區及/或輕鏈可變區； f)  展示與抗體分子相同或類似之結合親和力或特異性或兩者，該抗體分子包含本文中所描述之一或多個(例如兩個或三個)重鏈CDR及/或一或多個(例如兩個或三個)輕鏈CDR，例如本文中所描述之單株抗體(例如，mAb 1H4)之一或多個(例如兩個或三個)重鏈CDR及/或一或多個(兩個或三個)輕鏈CDR； g) 展示與包含本文中所描述之胺基酸序列的抗體分子相同或類似之結合親和力或特異性或兩者； h) 展示與包含由本文中所描述之核苷酸序列編碼之胺基酸序列的抗體分子相同或類似之結合親和力或特異性或兩者； i)  抑制(例如競爭性地抑制)第二抗體分子與抗APRIL抗體(例如，西貝侖利單抗)之結合，其中第二抗體分子為本文中所描述之單株抗體(例如，mAb 1H4)； j)  與第二抗體分子競爭結合至抗APRIL抗體(例如，西貝侖利單抗)，其中第二抗體分子為本文中所描述之單株抗體(例如，mAb 1H4)； k) 具有本文中所描述之單株抗體(例如，mAb 1H4)之一或多種生物特性； l)  具有本文中所描述之單株抗體(例如，mAb 1H4)之一或多種結構特性；或 m)        具有本文中所描述之單株抗體(例如，mAb 1H4)之一或多種藥物動力學特性。
在一態樣中，本發明提供一種能夠結合至抗APRIL抗體(例如，西貝侖利單抗)之經分離之抗體分子，其包含：包含SEQ ID NO: 1之HCDR1胺基酸序列、HCDR2胺基酸序列及HCDR3胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；以及包含SEQ ID NO: 2之LCDR1胺基酸序列、LCDR2胺基酸序列及LCDR3胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。在一實施例中，HCDR1胺基酸序列包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。在一實施例中，HCDR2胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。在一實施例中，HCDR3胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。在一實施例中，LCDR1胺基酸序列包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。在一實施例中，LCDR2胺基酸序列包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。在一實施例中，LCDR3胺基酸序列包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。
在一實施例中，VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基之胺基酸序列。在一實施例中，VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
在一實施例中，VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基之胺基酸序列。在一實施例中，VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
在一實施例中，VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基之胺基酸序列；且VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基之胺基酸序列。在一實施例中，VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
在一實施例中，抗體分子包含兩個VH及兩個VL，例如本文中所描述之兩個VH及兩個VL。
在一實施例中，抗體分子包含抗原結合片段。在一實施例中，抗原結合片段包含Fab、F(ab')2、Fv、scFv或sc(Fv)2。
在一實施例中，抗體分子包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之重鏈恆定區。在一實施例中，抗體分子包含κ或λ輕鏈之輕鏈恆定區。在一實施例中，抗體分子包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之重鏈恆定區；及κ或λ輕鏈之輕鏈恆定區。在一實施例中，抗體分子包含IgG1之重鏈恆定區(例如，本文中所描述之IgG1重鏈恆定區)及κ輕鏈之輕鏈恆定區(例如，本文中所描述之κ輕鏈恆定區)。在一實施例中，抗體分子包含IgG2之重鏈恆定區(例如，本文中所描述之IgG2重鏈恆定區)及κ輕鏈之輕鏈恆定區(例如，本文中所描述之κ輕鏈恆定區)。
在一實施例中，抗體分子包含Fc區。
在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 3之胺基酸18至458的重鏈。在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸18至464的重鏈。在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 5之胺基酸18至235的輕鏈。
在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 3之胺基酸18至458的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸18至235的輕鏈。在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸18至464的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸18至235的輕鏈。
在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的重鏈。在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈。在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的輕鏈。
在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的輕鏈。在一實施例中，抗體分子包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的輕鏈。
在一個實施例中，抗體分子為mAb 1H4、1A5或6A3。在一個實施例中，抗體分子為mAb 1H4。
在一實施例中，抗體分子為小鼠抗體分子。在一實施例中，抗體分子為人源化抗體分子。在一實施例中，抗體分子為單株抗體分子。在一實施例中，抗體分子為合成抗體分子。在一實施例中，抗體分子為純化抗體分子，其例如純化自融合瘤上清液、短暫轉染之細胞(例如，Expi293細胞)或穩定表現之細胞株(例如，CHO細胞)。在一實施例中，抗體分子係以0.2 mg/mL至5 mg/mL，例如0.5 mg/mL至1.5 mg/mL之濃度產生自例如融合瘤。在一實施例中，抗體分子為釕化抗體分子。
在一實施例中，抗體分子為抗獨特型(抗ID)抗體分子。在一實施例中，抗體分子結合至抗APRIL抗體之一或多個(例如2、3、4、5或6個) CDR。在一實施例中，抗體分子結合至抗APRIL抗體之VH、VL或兩者。在一實施例中，抗體分子不結合、實質上不結合至抗APRIL抗體之Fc區。
在一個實施例中，抗體分子在例如本文所描述之結合ELISA分析法中結合抗APRIL抗體。在一實施例中，抗體分子在例如本文所描述之橋接ELISA分析法中結合抗APRIL抗體。在一實施例中，抗體分子係以例如藉由ELISA所測定之低於500 ng/mL，例如低於400 ng/mL、300 ng/mL、200 ng/mL、150 ng/mL、120 ng/mL、100 ng/mL、90 ng/mL、80 ng/mL、70 ng/mL、60 ng/mL、50 ng/mL、40 ng/mL、35 ng/mL、30 ng/mL、25 ng/mL、20 ng/mL、15 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL或0.1 ng/mL，例如1 ng/mL至150 ng/mL、2 ng/mL至100 ng/mL、5 ng/mL至50 ng/mL或10 ng/mL至25 ng/mL之EC50結合至抗APRIL抗體。
在一實施例中，抗體分子降低(例如中和、抑制或阻斷)抗APRIL抗體與APRIL之結合。在一實施例中，抗體分子結合至未與APRIL結合之抗APRIL抗體。在一實施例中，抗體分子未結合或實質上未結合至與APRIL結合之抗APRIL抗體。在一實施例中，抗體分子結合至未與APRIL結合之抗APRIL抗體，且未結合或實質上未結合至與APRIL結合之抗APRIL抗體。在一實施例中，抗體分子結合至未與APRIL結合之抗APRIL抗體及與APRIL結合之抗APRIL抗體。
在一個實施例中，抗體分子橋接兩個抗APRIL抗體，例如同時結合至兩個抗APRIL抗體。在一個實施例中，抗體分子與抗APRIL抗體分子競爭結合至APRIL。
在一實施例中，抗APRIL抗體結合至人類APRIL。在一實施例中，抗APRIL抗體包含西貝侖利單抗之一或多個(例如2、3、4、5或6個) CDR。在一實施例中，抗APRIL抗體包含西貝侖利單抗之VH、VL或兩者。在一實施例中，抗APRIL抗體分子為西貝侖利單抗。
在一態樣中，本發明提供一種偵測抗APRIL抗體之方法，其包含使本文中所描述之抗體分子與樣品接觸；及測定抗體分子與樣品之間(例如，抗體分子與樣品中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成，由此偵測抗APRIL抗體。
在一實施例中，方法進一步包含使抗體分子與參考樣品接觸及測定抗體分子與參考樣品之間的複合體形成。
在一個實施例中，在ELISA分析法(例如藥物動力學ELISA)中偵測抗APRIL抗體。在一實施例中，ELISA為例如本文所描述之結合ELISA。在一實施例中，ELISA為例如本文所描述之橋接ELISA。在一實施例中，在抗藥物分析法中偵測抗APRIL抗體。在一實施例中，在毒理學分析中偵測抗APRIL抗體。在一實施例中，在GxP分析法中偵測抗APRIL抗體。
在一態樣中，本發明提供一種評估樣品之方法，其包含使本文中所描述之抗體分子與樣品接觸；及測定抗體分子與樣品之間(例如，抗體分子與樣品中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成，由此評估樣品。
在一實施例中，方法進一步包含使抗體分子與參考樣品接觸及測定抗體分子與參考樣品之間的複合體形成。
在一實施例中，在ELISA分析法(例如，藥物動力學ELISA)中評估樣品。在一實施例中，ELISA為例如本文所描述之結合ELISA。在一實施例中，ELISA為例如本文所描述之橋接ELISA。在一實施例中，在抗藥物分析法中評估樣品。在一實施例中，在毒理學分析法中評估樣品。在一實施例中，在GxP分析法中偵測抗APRIL抗體。
在一態樣中，本發明提供一種偵測抗APRIL抗體之方法，其包含使本文中所描述之抗體分子與個體接觸(例如，向個體投與本文中所描述之抗體分子)；及測定抗體分子與個體之間(例如，抗體分子與個體中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成，由此偵測抗APRIL抗體。
在一態樣中，本發明提供一種評估個體之方法，其包含使本文中所描述之抗體分子與個體接觸(例如，向個體投與本文中所描述之抗體分子)，測定抗體分子與個體之間(例如，抗體分子與個體中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成，由此評估個體。
在一態樣中，本發明提供一種抗體分子，其結合至與由本文所描述之抗體分子所識別之抗原決定基相同或重疊之抗原決定基。
在一態樣中，本發明提供一種組合物(例如，醫藥組合物)，其包含本文中所描述之抗體分子及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一實施例中，組合物適合於活體外、離體或活體內偵測抗APRIL抗體。
在一態樣中，本發明提供一種套組，其包含本文中所描述之抗體分子及抗體分子之使用說明。
在一態樣中，本發明提供一種核酸(例如，經分離之核酸)，其編碼本文中所描述之抗體分子之一或多個(例如2、3、4、5或6個) CDR或VH、VL或兩者。
在一實施例中，核酸經人源化。在一實施例中，核酸經密碼子最佳化。
在一實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 8之核苷酸52至1374，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸之核苷酸序列。
在一實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 9之核苷酸52至1392，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸之核苷酸序列。
在一實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 10之核苷酸52至705，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸之核苷酸序列。
在一實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。在一實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列。在一實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
在一態樣中，本發明提供一種載體(例如表現載體)，其包含本文所描述之核酸。在一實施例中，表現載體包含可操作地連接至核酸之啟動子。
在一態樣中，本發明提供一種細胞(例如宿主細胞)，其包含本文所描述之核酸或本文所描述之載體。
在一態樣中，本發明提供一種產生抗體分子之方法，其包含在適合於基因表現之條件下培養本文所描述之宿主細胞。在一實施例中，方法進一步包含分離或純化抗體分子。
本發明涵蓋前述態樣及/或實施例中之任一或多者的所有組合，以及與實施方式中所闡述之實施例及實例中之任一或多者的組合。
本文組合物及方法之其他特徵、目標及優點自實施方式及附圖及自申請專利範圍將顯而易見。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2022年2月7日申請之美國臨時申請案第63/307,538號之權利。前述申請案之內容係以全文引用之方式併入本文中。
本文揭示以高親和力及特異性結合至抗APRIL分子(例如西貝侖利單抗)之抗體分子。特異性識別治療性單株抗體(mAb)藥物(例如西貝侖利單抗)之抗獨特型抗體(抗ID)試劑的產生對於產生高度敏感性抗體藥物開發分析法以查詢臨床前及臨床樣品(例如，藥物動力學ELISA、抗藥物分析法及毒理學)至關重要。使用小鼠免疫接種方法及融合瘤技術，結合對細胞株之廣泛篩選來產生本文中所描述之試劑，該細胞株產生對西貝侖利單抗之可變區具有特異性之mAb。抗ID mAb之適當特徵可包括例如對藥物(西貝侖利單抗)可變區/CDR而非Fc區具有特異性、與其他人類或動物免疫球蛋白之交叉反應性可忽略、在兩個西貝侖利單抗分子之間產生『橋』以用於抗藥物分析法開發，且易於及可再現地產生。抗ID mAb可純化自例如：1)融合瘤上清液，2) Expi293細胞之短暫轉染，或3)穩定表現之CHO細胞株，以提供最大可再現性及高產量之試劑批次為準。
定義如本文中所使用，冠詞「一(a)」及「一(an)」係指該冠詞之文法對象為一個或多於一個(例如，至少一個)。
除非上下文以其他方式明確指示，否則術語「或」在本文中用於意謂術語「及/或」且可與其互換地使用。
「約」及「大致」一般應意謂鑒於量測值之性質或精確度，所量測之量之可接受誤差程度。例示性誤差程度在給定值或值範圍之百分之20 (%)以內，通常在10%以內，且更通常在5%以內(例如在4%、3%、2%或1%以內)。
本文揭示之組合物及方法涵蓋具有指定序列或與其實質上一致或類似之序列，例如與指定序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高一致性之序列的多肽及核酸。
在胺基酸序列之上下文中，術語「實質上一致」在本文中用於指第一胺基酸含有足夠或最小數目之胺基酸殘基，該等胺基酸殘基：a)與第二胺基酸序列中之所比對胺基酸殘基一致或b)為第二胺基酸序列中之所比對胺基酸殘基之保守性取代，從而使第一及第二胺基酸序列可具有共同結構域及/或共同功能活性。舉例而言，胺基酸序列含有與參考序列(例如本文中所提供之序列)具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之共同結構域。
在核苷酸序列之上下文中，術語「實質上一致」在本文中用於指第一核酸序列含有足夠或最小數目之核苷酸，該等核苷酸與第二核酸序列中之所比對核苷酸一致，從而使第一核苷酸序列及第二核苷酸序列編碼具有共同功能活性之多肽，或編碼共同結構多肽域或共同功能多肽活性。舉例而言，與參考序列(例如本文所提供之序列)具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。
術語「功能變異體」係指具有與天然存在之序列實質上一致之胺基酸序列的多肽，或係由實質上一致之核苷酸序列編碼，且能夠具有天然存在之序列的一或多種活性。
如下計算序列之間的同源性或序列一致性(該等術語在本文中可互換地使用)。
為了測定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比，出於最佳比較目的來比對序列(例如，可將空位引入第一及第二胺基酸或核酸序列中之一或兩者中以用於最佳比對且出於比較目的可忽略非同源序列)。在一典型實施例中，出於比較目的而比對之參考序列之長度為參考序列之長度的至少30%，例如至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。接著比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。若第一序列中之位置被與第二序列中之相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據，則分子在該位置處為一致的。
兩個序列之間的一致性百分比係該等序列所共有的一致位置數目之函數，同時考慮兩個序列之最佳比對所需引入之空位的數目及各空位長度。
可使用數學演算法來實現序列比較及兩個序列之間的一致性百分比測定。在一實施例中，使用Clustal Omega (Sievers等人 Mol Syst Biol. 2011; 7:539)測定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比。在一實施例中，使用Kalign2 (Lassmann等人 Nucleic Acids Res. 2009; 37(3):858-65；Lassmann及Sonnhammer BMC Bioinformatics. 2005; 6:298)測定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比。在一實施例中，使用MAFFT (Katoh及Standley Mol Biol Evol. 2013; 30(4):772-80)測定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比。在一實施例中，使用MUSCLE (Edgar Nucleic Acids Res. 2004; 32(5):1792-7；Edgar BMC Bioinformatics. 2004; 5:113)測定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比。在一實施例中，使用MView (Brown等人 Bioinformatics. 1998; 14(4): 380-1)測定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比。用於測定兩個序列之間的一致性百分比之其他方法亦描述於例如Li等人 Nucleic Acids Res. 2015; 43(W1):W580-4；McWilliam等人 Nucleic Acids Res. 2013; 41(Web Server issue):W597-600中。
在一實施例中，使用已併入GCG套裝軟體(可獲自www.gcg.com)中之GAP程式中的Needleman及Wunsch ( J Mol Biol. 1970; 48(3):443-53)演算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4之空位權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。在一實施例中，使用NWSgapdna. CMP矩陣以及40、50、60、70或80之空位權數及1、2、3、4、5或6之長度權數，使用GCG套裝軟體(可獲自www.gcg.com)中之GAP程式測定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。一種適合之參數集(及應使用者，除非另外說明)為Blossum 62計分矩陣，其中空位罰分為12、空位擴展罰分為4及讀框轉移空位罰分為5。
可使用已併入ALIGN程式(2.0版)中之Meyers及Miller ( Comput Appl Biosci. 1988; 4(1):11-7)之演算法，使用PAM120權數殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4測定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比。
本文中所描述之核酸及蛋白質序列可用作「查詢序列」以對照公用資料庫進行搜尋，例如以鑑別其他家族成員或相關序列。可使用Altschul,等人1990; J . Mol . Biol. 215:403-10之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)進行此類搜尋。可用NBLAST程式(評分=100，字長=12)進行BLAST核苷酸搜尋以獲得與本文所描述之核酸同源的核苷酸序列。可用XBLAST程式(評分=50，字長=3)進行BLAST蛋白質搜尋以獲得與本文中所描述之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為使空位式比對達成比較目的，可如Altschul等人, Nucleic Acids Res. 1997; 25:3389-3402中所描述使用空位式BLAST。當使用BLAST及空位式BLAST程式時，可使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。
如本文中所使用，術語「在低嚴格度、中嚴格度、高嚴格度或極高嚴格度條件下雜交」描述雜交及洗滌條件。用於進行雜交反應之指南可見於 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6中，其以引用之方式併入本文中。該參考文獻中描述水性及非水性方法且可使用任一種。本文中所提及之特定雜交條件如下：1)低嚴格度雜交條件為在約45℃使用6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，隨後至少在50℃ (對於低嚴格度條件而言，洗滌溫度可升高至55℃)用0.2X SSC、0.1% SDS洗滌兩次；2)中嚴格度雜交條件為在約45℃使用6X SSC，隨後在60℃用0.2X SSC、0.1% SDS洗滌一或多次；3)高嚴格度雜交條件為在約45℃使用6X SSC，隨後在65℃用0.2X SSC、0.1% SDS洗滌一或多次；及較佳地，4)極高嚴格度雜交條件為在65℃使用0.5 M磷酸鈉、7% SDS，隨後在65℃用0.2X SSC、1% SDS洗滌一或多次。除非另外說明，否則極高嚴格度條件4)為適合之條件及應使用之條件。
應理解，本文中所描述之分子可具有對其功能無實質性影響的額外保守性或非必需胺基酸取代。
術語「胺基酸」意欲涵蓋所有分子，無論天然或合成的，其包括胺基官能基與酸官能基兩者且能夠包括於天然存在之胺基酸之聚合物中。例示性胺基酸包括天然存在之胺基酸；其類似物、衍生物及同類物；具有變異型側鏈之胺基酸類似物；以及前述任一者的所有立體異構物。如本文中所使用，術語「胺基酸」包括D-光學異構物或L-光學異構物及肽模擬物兩者。
「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」(若為單鏈)在本文中可互換地使用以指任何長度之胺基酸聚合物。聚合物可為線性或分支化的，其可包含經修飾之胺基酸且其可間雜有非胺基酸。術語亦涵蓋已經修飾(例如二硫鍵形成、醣基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作(諸如與標記組分結合))之胺基酸聚合物。多肽可自天然來源中分離，可藉由重組技術自真核或原核宿主產生，或可為合成程序之產物。
術語「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」或「聚核苷酸序列」及「聚核苷酸」可互換地使用。其指任何長度之核苷酸(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)之聚合形式，或其類似物。聚核苷酸可為單股或雙股，且若為單股，則可為編碼股或非編碼(反義)股。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。可在聚合之後諸如藉由與標記組分結合進一步修飾聚核苷酸。核酸可為重組聚核苷酸，或基因體、cDNA、半合成或合成來源之聚核苷酸，其不存在於自然界中或以非天然排列形式連接至另一聚核苷酸。
如本文中所使用，術語「分離」係指自原始或原生環境(例如，若其天然存在，則為天然環境)移除物質。舉例而言，存在於活動物中之天然存在之聚核苷酸或多肽未經分離，但藉由人類干預而與天然系統中之一些或所有共存物質分離的相同聚核苷酸或多肽經分離。此類聚核苷酸可為載體之一部分及/或此類聚核苷酸或多肽可為組合物之部分，且仍經分離以使得此類載體或組合物不為自然界中發現其之環境之部分。
如本文中所使用，術語「治療(treat)」病症(例如APRIL相關病症)意謂在一實施例中，患有病症(例如APRIL相關病症)及/或經歷病症(例如APRIL相關病症)之症狀的個體(例如人類)在抗體分子投與時比從未投與抗體分子時罹患的症狀嚴重度輕及/或更快恢復。在一實施例中，當治療APRIL相關病症時，與類似之未經治療個體相比，APRIL在經治療個體中之含量可能更低。舉例而言，在投與本文中所描述之抗體分子以用於有效治療發炎病症後，將使用免疫螢光法或電子顯微術進行之診斷分析法偵測個體之生物樣品中之APRIL。在治療個體中之病症後，其他分析法(例如尿檢、血檢、超音波、X射線或膀胱鏡檢)亦可用於監測患者中之治療，或偵測病症(例如APRIL相關病症)之症狀的存在，例如減少之存在(或不存在)。治療可例如部分或完全減輕、改善、緩解、抑制或降低病症(例如APRIL相關病症)之嚴重程度，及/或降低其發生率，且視情況延遲其發作、其影響或症狀、特徵及/或病因之一或多種臨床表現。在一實施例中，治療係針對未展現病症(例如APRIL相關病症)之某些病徵的個體，及/或僅展現病症(例如APRIL相關病症)之早期病徵的個體。在一實施例中，治療係針對展現病症(例如APRIL相關病症)之一或多種確定病徵的個體。在一實施例中，治療係針對診斷為罹患病症(例如APRIL相關病症)之個體。在一實施例中，病症為本文中所描述之APRIL相關病症。
如本文中所使用，術語「預防」病症(例如APRIL相關病症)意謂若個體(例如人類)接受抗體分子，則該個體不太可能患有該病症(例如APRIL相關病症)。在一實施例中，個體係處於罹患病症(例如APRIL相關病症)之風險中。在一實施例中，病症為本文中所描述之APRIL相關病症。
本文中之組合物及方法之各種態樣進一步詳細描述於下文中。其他定義闡述於通篇本說明書中。
抗體分子在一態樣中，本發明提供結合至抗APRIL抗體之抗體分子(例如，抗獨特型抗體分子)。
如本文中所使用，術語「抗體分子」係指包含至少一個免疫球蛋白可變域序列之蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段。術語「抗體分子」包括例如全長抗體及抗體之抗原結合片段。
舉例而言，抗體分子可包括重(H)鏈可變域序列(本文中縮寫為VH)及輕(L)鏈可變域序列(本文中縮寫為VL)。在另一實例中，抗體分子包括兩個重(H)鏈可變域序列及兩個輕(L)鏈可變域序列，由此形成兩個抗原結合位點，諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fd、Fd'、Fv、單鏈抗體(例如scFv或sc(Fv)2)、單可變域抗體、雙功能抗體(Dab) (二價及雙特異性)及嵌合(例如人源化)抗體，其可藉由修飾完全抗體或使用重組DNA技術重新合成之抗體來產生。此等功能性抗體片段保留與其各別抗原或受體選擇性結合之能力。抗體及抗體片段可來自任何類別之抗體，其包括(但不限於) IgG、IgA、IgM、IgD及IgE，以及來自任何子類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)之抗體。抗體分子可為單株或多株的。在一實施例中，抗體分子為全IgG抗體。抗體分子亦可為人類、人源化、CDR移植或活體外產生之抗體。抗體分子可具有選自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或兩種或更多種同型之嵌合體的重鏈恆定區。抗體分子亦可具有選自例如κ或λ之輕鏈。在本文中，術語「免疫球蛋白」(Ig)可與術語「抗體」互換地使用。在一實施例中，抗體分子為多特異性抗體分子(例如，雙特異性抗體分子)。
抗原結合片段之實例包括：(i) Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，其為包含兩個在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段；(iii) Fd片段，其係由VH及CH1域組成；(iv) Fv片段，其係由抗體之單臂之VL及VH域組成；(v)雙功能抗體(dAb)片段，其係由VH域組成；(vi)駱駝或駱駝化可變域；(vii)單鏈Fv (scFv)，參見例如Bird等人(1988) Science242:423-426；及Huston等人(1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA85:5879-5883)；(viii)單域抗體。可使用任何適合之方法(包括熟習此項技術者已知的若干習知技術)獲得此等抗體片段，且可以與完整抗體相同之方式針對效用來篩選此等片段。
術語「抗體」包括完整分子以及其功能片段。抗體之恆定區可改變(例如，突變)以修飾抗體之特性(例如，以增加或減小以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體醣基化、半胱胺酸殘基之數目、效應細胞功能或補體功能)。
在一實施例中，抗體分子為單鏈抗體。單鏈抗體(scFv)可經工程改造(參見例如，Colcher, D.等人(1999) Ann N Y Acad Sci880:263-80；及Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res2:245-52)。單鏈抗體可經二聚化或多聚化以產生對相同靶蛋白之不同抗原決定基具有特異性的多價抗體。
在一實施例中，抗體分子為單域抗體。單域抗體可包括互補決定區為單域多肽之部分的抗體。實例包括(但不限於)重鏈抗體、天然不含輕鏈之抗體、衍生自習知4鏈抗體之單域抗體、經工程改造之抗體及除衍生自抗體之骨架以外的單域骨架。單域抗體可為此項技術中之任一種單域抗體，或任何未來單域抗體。單域抗體可衍生自任何物種，其包括(但不限於)小鼠、人類、駱駝、駱馬、魚、鯊魚、山羊、兔及牛。在一實施例中，單域抗體為天然存在之單域抗體，其稱為不含輕鏈之重鏈抗體。此類單域抗體揭示於例如WO 94/04678中。為了清楚起見，此衍生自天然不含輕鏈之重鏈抗體的可變域在本文中稱為VHH或奈米抗體，以與四鏈免疫球蛋白之習知VH區分。此類VHH分子可衍生自駱駝科( Camelidae)物種(例如駱駝、駱馬、單峰駝、羊駝及栗色駱馬)中產生之抗體。除駱駝科以外的其他物種可產生天然不含輕鏈之重鏈抗體；此類VHH亦屬於本發明之範疇內。
VH及VL區可細分成高變區，稱為「互補決定區」(CDR)，其間穿插有保守性更高之區域，稱為「構架區」(FR或FW)。如本文中所使用，術語「互補決定區」及「CDR」係指在抗體可變區內之胺基酸序列，其賦予抗原特異性及結合親和力。一般而言，各重鏈可變區中存在三種CDR (HCDR1、HCDR2、HCDR3)且各輕鏈可變區中存在三種CDR (LCDR1、LCDR2、LCDR3)。如本文中所使用，術語「構架」、「FW」及「FR」可互換地使用。
構架區及CDR之範圍已由多種方法(參見Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest第五版，美國健康及人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services)，NIH公告第91-3242號(「Kabat」編號方案)；Chothia, C.等人(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 (「Chothia」編號方案))；及Oxford Molecular的AbM抗體模型化軟體使用之AbM定義來精確定義。通常參見例如，Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.載於: Antibody Engineering Lab Manual (編: Duebel, S.及Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)。如本文中所使用，根據「Chothia」編號方案定義之CDR有時亦稱為「高變環」。根據所有定義，各VH及VL通常包括三個CDR及四個FR，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
舉例而言，根據Kabat，重鏈可變域(VH)中之CDR胺基酸殘基可編號為31至35 (HCDR1)、50至65 (HCDR2)及95至102 (HCDR3)；且輕鏈可變域(VL)中之CDR胺基酸殘基編號為24至34 (LCDR1)、50至56 (LCDR2)及89至97 (LCDR3)。根據Chothia，VH中之CDR胺基酸可編號為26至32 (HCDR1)、52至56 (HCDR2)及95至102 (HCDR3)；且VL中之胺基酸殘基可編號為26至32 (LCDR1)、50至52 (LCDR2)及91至96 (LCDR3)。藉由組合Kabat及Chothia兩者之CDR定義，CDR可由人類VH中之胺基酸殘基26至35 (HCDR1)、50至65 (HCDR2)及95至102 (HCDR3)以及人類VL中之胺基酸殘基24至34 (LCDR1)、50至56 (LCDR2)及89至97 (LCDR3)組成。
一般而言，除非特別指示，否則本文中所描述之抗體分子可包括一或多個本文所描述之Kabat CDR及/或Chothia高變環的任何組合。
如本文中所使用，「免疫球蛋白可變域序列」係指可形成免疫球蛋白可變域之結構之胺基酸序列。舉例而言，序列可包括天然存在之可變域之胺基酸序列的全部或部分。舉例而言，序列可或可不包括一個、兩個或更多個N端或C端胺基酸，或可包括與蛋白質結構形成相容的其他改變。
術語「抗原結合區」係指抗體分子中包含決定子之部分，該等決定子形成結合至抗原或其抗原決定基之界面。就蛋白質(或蛋白質模擬物)而言，抗原結合區通常包括(至少例如四個胺基酸或胺基酸模擬物之)一或多個環，其形成結合至抗原之界面。通常，抗體分子之抗原結合區包括至少一個或兩個CDR及/或高變環，或更通常至少三個、四個、五個或六個CDR及/或高變環。
術語「競爭」或「交叉競爭」在本文中可互換地使用以指第一抗體分子干擾第二抗體分子與標靶結合之能力。干擾結合可為直接或間接的(例如，經由抗體分子或標靶之異位調節)。可使用競爭結合分析法(例如FACS分析法、ELISA或BIACORE分析法)測定抗體分子能夠干擾另一抗體分子與標靶結合之程度，且由此確定其是否可被稱為競爭。在一實施例中，競爭結合分析法為定量競爭分析法。在一實施例中，當在競爭結合分析法(例如本文中所描述之競爭分析法)中，第一抗體分子與標靶之結合降低10%或更多，例如20%或更多、30%或更多、40%或更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、98%或更多、99%或更多時，稱第一抗體分子與第二抗體分子競爭結合至標靶。
如本文中所使用，術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指單一分子組成之抗體分子之製劑。單株抗體組合物展示針對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。可藉由融合瘤技術或藉由不使用融合瘤技術之方法(例如重組方法)製備單株抗體。
「有效人類」蛋白為不引起中和抗體反應(例如人類抗鼠類抗體(HAMA)反應)之蛋白質。HAMA可能在許多情形下存在問題，例如若重複投與抗體分子，例如在慢性或復發性疾病病況之治療中。由於抗體自血清之清除增強及潛在過敏反應，因此HAMA反應可使得重複投與抗體變得潛在無效(參見例如，Saleh等人, Cancer Immunol. Immunother., 32:180-190 (1990)；LoBuglio等人, Hybridoma, 5:5117-5123 (1986))。
抗體分子可為多株或單株抗體。在一實施例中，抗體可以重組方式產生，例如藉由任何適合之噬菌體呈現或組合方法產生。
用於產生抗體之各種噬菌體呈現及組合方法為此項技術中已知的(例如Ladner等人美國專利第5,223,409號；Kang等人國際公開案第WO 92/18619號；Dower等人國際公開案第WO 91/17271號；Winter等人國際公開案WO 92/20791；Markland等人國際公開案第WO 92/15679號；Breitling等人國際公開案WO 93/01288；McCafferty等人國際公開案第WO 92/01047號；Garrard等人國際公開案第WO 92/09690號；Ladner等人國際公開案第WO 90/02809號；Fuchs等人(1991) Bio / Technology9:1370-1372；Hay等人(1992) Hum Antibod Hybridomas3:81-85；Huse等人(1989) Science246:1275-1281；Griffths等人(1993) EMBO J12:725-734；Hawkins等人(1992) J Mol Biol226:889-896；Clackson等人(1991) Nature352:624-628；Gram等人(1992) PNAS89:3576-3580；Garrad等人(1991) Bio / Technology9:1373-1377；Hoogenboom等人(1991) Nuc Acid Res19:4133-4137；及Barbas等人(1991) PNAS88:7978-7982中所描述，所有該等文獻之內容均以引用之方式併入本文中)。
在一個實施例中，抗體分子為完全人類抗體(例如在已經基因工程改造以產生人類免疫球蛋白序列之抗體的小鼠中產生的抗體)，或非人類抗體，例如嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)、山羊、靈長類動物(例如猴)、駱駝抗體。在一個實施例中，非人類抗體為嚙齒動物(例如小鼠或大鼠抗體)。產生嚙齒動物抗體之方法為此項技術中已知的。
可使用攜有人類免疫球蛋白基因而非小鼠系統之轉殖基因小鼠產生人類單株抗體。使用經所關注抗原免疫接種之此等轉殖基因小鼠的脾細胞來產生融合瘤，該等融合瘤分泌對人類蛋白質之抗原決定基具有特異親和力的人類mAb (參見例如Wood等人國際申請案WO 91/00906，Kucherlapati等人PCT公開案WO 91/10741；Lonberg等人國際申請案WO 92/03918；Kay等人國際申請案92/03917；Lonberg, N.等人1994 Nature368:856-859；Green, L.L.等人1994 Nature Genet. 7:13-21；Morrison, S.L.等人1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855；Bruggeman等人1993 Year Immunol7:33-40；Tuaillon等人1993 PNAS90:3720-3724；Bruggeman等人1991 Eur J Immunol21:1323-1326)。
抗體可為其中可變區或其部分(例如CDR)在非人類生物體(例如大鼠或小鼠)中產生之抗體。嵌合抗體、CDR移植抗體及人源化抗體均屬於本發明內。在非人類生物體(例如大鼠或小鼠)中產生且接著修飾(例如在可變構架或恆定區中)以降低在人體中之抗原性的抗體屬於本發明內。
可藉由任何適合之重組DNA技術產生嵌合抗體。若干技術為此項技術中已知的(參見Robinson等人，國際專利申請公開案第WO1987/002671號；Akira等人，歐洲專利申請公開案第184,187號；Taniguchi, M., 歐洲專利申請公開案第171,496號；Morrison等人，歐洲專利申請公開案第173,494號；Neuberger等人，國際專利申請公開案第WO 86/01533號；Cabilly等人美國專利第4,816,567號；Cabilly等人，歐洲專利申請公開案第125,023號；Better等人(1988 Science240:1041-1043)；Liu等人(1987) PNAS84:3439-3443；Liu等人, 1987, J . Immunol. 139:3521-3526；Sun等人(1987) PNAS84:214-218；Nishimura等人, 1987, Canc . Res. 47:999-1005；Wood等人(1985) Nature314:446-449；及Shaw等人, 1988, J . Natl Cancer Inst. 80:1553-1559)。
人源化或CDR移植抗體將有(重鏈及/或輕鏈免疫球蛋白鏈之)至少一個或兩個，但通常全部三個接受體CDR經供體CDR置換。抗體可經非人類CDR之至少一部分置換，或僅一些CDR可經非人類CDR置換。僅需要置換人源化抗體結合至脂多醣所需數目的CDR。在一個實施例中，供體將為嚙齒動物抗體，例如大鼠或小鼠抗體，且接受體將為人類構架或人類共同構架。通常，將提供CDR之免疫球蛋白稱為「供體」且將提供構架之免疫球蛋白稱為「接受體」。在一個實施例中，供體免疫球蛋白為非人類(例如嚙齒動物)。接受體架構通常為天然存在之(例如人類)構架或共同構架，或與其約85%或更高(例如90%、95%、99%或更高)一致之序列。
如本文中所使用，術語「共同序列」係指由相關序列家族中最頻繁存在之胺基酸(或核苷酸)形成的序列(參見例如，Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)。在蛋白質家族中，共同序列中之各位置係由該家族中最頻繁出現於該位置處之胺基酸佔據。若兩個胺基酸同等頻繁地出現，則共同序列中可包括任一個。「共同構架」係指共同免疫球蛋白序列中之構架區。
抗體可藉由任何適合之方法及此項技術中已知的若干種此類方法人源化(參見例如，Morrison, S. L., 1985, Science229:1202-1207，Oi等人, 1986, BioTechniques4:214，以及Queen等人US 5,585,089、US 5,693,761及US 5,693,762，所有該等文獻之內容均以引用之方式併入本文中)。
可藉由CDR移植或CDR取代來產生人源化抗體或CDR移植抗體，其中免疫球蛋白鏈中之一個、兩個或全部CDR可經置換。參見例如，美國專利5,225,539；Jones等人1986 Nature321:552-525；Verhoeyan等人1988 Science239:1534；Beidler等人1988 J . Immunol. 141:4053-4060；Winter US 5,225,539，所有該等文獻之內容以引用之方式明確併入本文中。Winter描述可用於製備人源化抗體之CDR移植方法(英國專利申請案GB 2188638A，其申請於1987年3月26日；Winter US 5,225,539)，該文獻之內容以引用之方式明確地併入本文中。
亦提供其中特定胺基酸已經取代、缺失或添加之人源化抗體。用於自供體選擇胺基酸之標準描述於例如US 5,585,089中，例如US 5,585,089之第12至16行，該文獻之內容以引用之方式併入本文中。其他用於使抗體人源化之技術描述於Padlan等人EP 519596 A1 (1992年12月23日出版)中。
在一實施例中，抗體分子具有重鏈恆定區，其選自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE之重鏈恆定區；尤其選自例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之(例如人類)重鏈恆定區。在另一實施例中，抗體分子具有輕鏈恆定區，其選自例如κ或λ之(例如人類)輕鏈恆定區。恆定區可經改變(例如經突變)以修飾抗體分子之特性(例如以增加或減少以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體醣基化、半胱胺酸殘基之數目、效應細胞功能及/或補體功能)。在一實施例中，抗體分子具有效應功能且可固定補體。在另一實施例中，抗體分子未募集效應細胞或固定補體。在一實施例中，抗體分子結合Fc受體之能力降低或無結合Fc受體之能力。舉例而言，其可為同型或亞型、片段或其他突變體，其不支持結合至Fc受體，例如其具有突變或缺失之Fc受體結合區。
在一實施例中，改變抗體分子之恆定區。用於改變抗體恆定區之方法為此項技術中已知的。可藉由用不同殘基置換抗體之恆定部分中之至少一個胺基酸殘基來產生具有改變之功能(例如對效應子配位體(諸如細胞上之FcR或補體之C1組分)的親和力改變)的抗體分子(參見例如，EP 388,151 A1、美國專利第5,624,821號及美國專利第5,648,260號，所有該等文獻之內容以引用之方式併入本文中)。亦考慮了人類IgG4中使抗體結構穩定之胺基酸突變，諸如S228P (EU命名法，在Kabat命名法中為S241P)。可描述若應用於鼠類或其他物種免疫球蛋白則會降低或消除此等功能的類似變化類型。
在一實施例中，抗體分子中僅有的胺基酸為典型胺基酸。在一實施例中，抗體分子包含天然存在之胺基酸；其類似物、衍生物及同類物；具有變異型側鏈之胺基酸類似物；及/或前述中之任一者的所有立體異構物。抗體分子可包含胺基酸及肽模擬物之D-光學異構物或L-光學異構物。
在一實施例中，抗體分子包含單株抗體(例如，具有免疫球蛋白Fc區之全長抗體)。在一實施例中，抗體分子包含全長抗體或全長免疫球蛋白鏈。在一實施例中，抗體分子包含全長抗體或全長免疫球蛋白鏈之抗原結合片段或功能片段。
在一實施例中，抗體分子為單特異性抗體分子，例如其結合單一抗原決定基。舉例而言，單特異性抗體分子可具有複數個免疫球蛋白可變區序列，其各自結合相同抗原決定基。
在一實施例中，抗體分子為多特異性抗體分子，例如其包含複數個免疫球蛋白可變區序列，其中複數個免疫球蛋白可變區序列中之第一免疫球蛋白可變區序列對第一抗原決定基具有結合特異性且複數個免疫球蛋白可變區序列中之第二免疫球蛋白可變區序列對第二抗原決定基具有結合特異性。在一實施例中，第一及第二抗原決定基位於同一抗原上，例如同一蛋白質(或多聚蛋白之亞單元)上。在一實施例中，第一及第二抗原決定基重疊。在一實施例中，第一及第二抗原決定基不重疊。在一實施例中，第一及第二抗原決定基位於不同抗原上，例如不同蛋白質(或多聚蛋白之不同亞單元)上。在一實施例中，多特異性抗體分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可變域。在一實施例中，多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子、三特異性抗體分子或四特異性抗體分子。
在一實施例中，多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對不超過兩種抗原具有特異性。雙特異性抗體分子之特徵通常在於對第一抗原決定基具有結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列及對第二抗原決定基具有結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列。在一實施例中，第一及第二抗原決定基位於同一抗原上，例如同一蛋白質(或多聚蛋白之亞單元)上。在一實施例中，第一及第二抗原決定基重疊。在一實施例中，第一及第二抗原決定基不重疊。在一實施例中，第一及第二抗原決定基位於不同抗原上，例如不同蛋白質(或多聚蛋白之不同亞單元)上。在一實施例中，雙特異性抗體分子包含對第一抗原決定基具有結合特異性之重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列，以及對第二抗原決定基具有結合特異性之重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列。在一實施例中，雙特異性抗體分子包含對第一抗原決定基具有結合特異性之半抗體及對第二抗原決定基具有結合特異性之半抗體。在一實施例中，雙特異性抗體分子包含對第一抗原決定基具有結合特異性之半抗體或其片段以及對第二抗原決定基具有結合特異性之半抗體或其片段。在一實施例中，雙特異性抗體分子包含對第一抗原決定基具有結合特異性之scFv或其片段以及對第二抗原決定基具有結合特異性之scFv或其片段。
用於產生雙特異性或異二聚抗體分子之方案為此項技術中已知的；包括(但不限於)例如「臼包杵(knob in a hole)」方法，例如US5731168中所描述；靜電導向Fc配對，例如WO 09/089004、WO 06/106905及WO 2010/129304中所描述；股交換工程改造域(Strand Exchange Engineered Domain；SEED)異二聚體形成，例如WO 07/110205中所描述；Fab臂交換，例如WO 08/119353、WO 2011/131746及WO 2013/060867中所描述；雙重抗體結合物，例如藉由使用具有胺反應性基團及硫氫基反應性基團之異型雙官能試劑使抗體交聯以產生雙特異性結構，例如US4433059中所描述；經由兩條重鏈之間二硫鍵之還原及氧化循環將來自不同抗體之半抗體(重鏈-輕鏈對或Fab)重組而產生的雙特異性抗體決定子，例如US 4444878中所描述；三官能抗體，例如經由硫氫基反應性基團交聯之三個Fab'片段，例如US5273743中所描述；生物合成結合蛋白，例如經由C端尾交聯、較佳地經由二硫鍵或胺反應性化學交聯之scFv對，例如US5534254中所描述；雙官能抗體，例如經由已置換恆定域之白胺酸拉鏈(例如c-fos及c-jun)二聚化之具有不同結合特異性的Fab片段，例如US5582996中所描述；雙特異性及寡特異性單價及寡價受體，例如經由一個抗體之CH1區與通常具有相關輕鏈之另一抗體之VH區之間的多肽間隔基連接的兩個抗體(兩個Fab片段)之VH-CH1區，例如US5591828中所描述；雙特異性DNA-抗體結合物，例如經由DNA之雙股段使抗體或Fab片段交聯，例如US5635602中所描述；雙特異性融合蛋白，例如含有其間具有親水性螺旋肽連接子之兩個scFv及完全恆定區的表現構築體，例如US5637481中所描述；多價及多特異性結合蛋白，例如具有含Ig重鏈可變區之結合區的第一域及含Ig輕鏈可變區之結合區的第二域的多肽之二聚體，一般稱為雙功能抗體(亦揭示產生雙特異性、三特異性或四特異性分子的更高階結構)，例如US5837242中所描述；微型抗體構築體，其中所連接的VL及VH鏈藉由肽間隔基進一步連接至抗體鉸鏈區及CH3區，該等微型抗體構築體可二聚化以形成雙特異性/多價分子，例如US5837821中所描述；藉由短肽連接子(例如5或10個胺基酸)連接或在任一定向上均完全無連接子的VH及VL域，其可形成二聚體以形成雙特異性雙功能抗體；三聚體及四聚體，例如US5844094中所描述；經肽鍵聯連接之VH域(或家族成員中之VL域)串，該等VH域經由C端的可交聯基團進一步與VL域結合以形成一系列FV (或scFv)，例如US5864019中所描述；以及其中VH與VL域經由肽連接子連接的單鏈結合多肽經由非共價或化學交聯而組合成多價結構以形成例如同二價、異二價、三價及四價結構，該等結構使用scFv或雙功能抗體型型式，例如US5869620中所描述。上文提及之申請案的內容以全文引用之方式併入本文中。
製備多特異性或雙特異性抗體分子之其他方法可見於例如，US5910573、US5932448、US5959083、US5989830、US6005079、US6239259、US6294353、US6333396、US6476198、US6511663、US6670453、US6743896、US6809185、US6833441、US7129330、US7183076、US7521056、US7527787、US7534866、US7612181、US2002/004587、US2002/076406、US2002/103345、US2003/207346、US2003/211078、US2004/219643、US2004/220388、US2004/242847、US2005/003403、US2005/004352、US2005/069552、US2005/079170、US2005/100543、US2005/136049、US2005/136051、US2005/163782、US2005/266425、US2006/083747、US2006/120960、US2006/204493、US2006/263367、US2007/004909、US2007/087381、US2007/128150、US2007/141049、US2007/154901、US2007/274985、US2008/050370、US2008/069820、US2008/152645、US2008/171855、US2008/241884、US2008/254512、US2008/260738、US2009/130106、US2009/148905、US2009/155275、US2009/162359、US2009/162360、US2009/175851、US2009/175867、US2009/232811、US2009/234105、US2009/263392、US2009/274649、EP346087、WO00/06605、WO02/072635、WO04/081051、WO06/020258、WO2007/044887、WO2007/095338A2、WO2007/137760A2、WO2008/119353、WO2009/021754、WO2009/068630、WO91/03493、WO93/23537、WO94/09131、WO94/12625、WO95/09917、WO96/37621、WO99/64460中。上文提及之申請案的內容以全文引用之方式併入本文中。
本文中所描述之抗體分子之多肽可為線性或分支的，其可包含經修飾之胺基酸且其可雜有非胺基酸。抗體分子亦可經修飾；例如藉由二硫鍵形成、醣基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作(諸如與標記組分結合)來修飾。多肽可自天然來源中分離，可藉由重組技術自真核或原核宿主產生，或可為合成程序之產物。
本文中所描述之抗體分子可以未結合形式單獨使用，或可與物質(例如毒素或部分(例如治療藥物；化合物發射放射；植物、真菌或細菌來源之分子；或生物蛋白(例如蛋白質毒素)或粒子(例如重組病毒粒子，例如經由病毒外殼蛋白))結合。舉例而言，抗體分子可與放射性同位素(諸如α-、β-或γ-發射體，或β-及γ-發射體)偶合。
抗體分子可經衍生化或連接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白質)。如本文中所使用，「衍生化」抗體分子為已經修飾之抗體分子。衍生化方法包括(但不限於)添加螢光部分、放射性核苷酸、毒素、酶或親和力配位體，諸如生物素。因此，抗體分子意欲包括本文中所描述之抗體的衍生化及以其他方式修飾之形式，包括免疫黏附分子。舉例而言，抗體分子可(藉由化學偶合、基因融合、非共價結合或以其他方式)在功能上連接至一或多種其他分子實體，諸如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙功能抗體)、可偵測試劑、毒素、醫藥劑及/或可介導抗體或抗體部分與另一分子(諸如鏈黴抗生物素蛋白核心區或聚組胺酸標籤)之結合的蛋白質或肽。
一些類型之衍生化抗體分子係由兩種或更多種抗體(相同類型或不同類型之抗體，例如以產生雙特異性抗體)交聯而產生。適合之交聯劑包括異型雙官能(具有兩個由適當間隔基(例如，間-順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯)分隔之不同反應性基團)或同型雙官能(例如，辛二酸二丁二醯亞胺酯)交聯劑。此類連接子可購自Pierce Chemical Company, Rockford, Ill。
抗登革熱(anti-dengue)抗體分子可衍生化(或標記)之適用可偵測試劑包括螢光化合物、各種酶、輔基、發光物質、生物發光物質、螢光發射金屬原子(例如銪(europium；Eu)及其他鑭系元素)以及放射性物質(描述於下文中)。例示性螢光可偵測劑包括螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素(phycoerythrin)及其類似物。抗體亦可用可偵測酶衍化，諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、乙醯膽鹼酯酶、葡萄糖氧化酶及其類似酶。當抗體用可偵測酶衍生化時，其係藉由添加被酶利用以產生可偵測反應產物之其他試劑來偵測。舉例而言，當可偵測試劑辣根過氧化酶存在時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺產生可偵測之著色反應產物。抗體分子亦可用輔基(例如，鏈黴抗生物素蛋白/生物素及抗生素蛋白/生物素)衍生化。舉例而言，抗體可用生物素衍生化且經由間接量測抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白結合來偵測。適合之螢光物質之實例包括傘形酮(umbelliferone)、螢光素(fluorescein)、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三𠯤基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質之實例包括流明諾(luminol)；且生物發光物質之實例包括螢光素酶、螢光素(luciferin)及水母發光蛋白(aequorin)。
可例如在多種情形下以診斷方式及/或以實驗方式使用經標記之抗體分子，包括(i)藉由標準技術(諸如親和力層析或免疫沈澱)分離預定抗原；(ii)偵測(例如，在細胞溶解物或細胞上清液中之)預定抗原以便評估蛋白質之豐度及表現模式；(iii)作為臨床測試程序之部分，監測組織中之蛋白質含量，例如測定給定治療方案之功效。
本文中所描述之抗體分子可與另一分子實體結合，通常為標記物或治療性(例如抗微生物(例如抗菌或殺菌)、免疫調節、免疫刺激性、細胞毒性或細胞生長抑制性)試劑或部分。放射性同位素可用於診斷性或治療性應用中。可與抗體分子偶合之放射性同位素包括(但不限於) α-、β-或γ-發射體，或β-及γ-發射體。此類放射性同位素包括(但不限於)碘( 131I或 125I)、釔( 90Y)、鎦( 177Lu)、錒( 225Ac)、鐠、砈( 211At)、錸( 186Re)、鉍( 212Bi或 213Bi)、銦( 111In)、鎝( 99mTc)、磷( 32P)、銠( 188Rh)、硫( 35S)、碳( 14C)、氚(3H)、鉻( 51Cr)、氯( 36Cl)、鈷( 57Co或 58Co)、鐵( 59Fe)、硒( 75Se)或鎵( 67Ga)。適用作治療劑之放射性同位素包括釔( 90Y)、鎦( 177Lu)、錒( 225Ac)、鐠、砈( 211At)、錸( 186Re)、鉍( 212Bi或 213Bi)及銠( 188Rh)。適用作標記(例如用於診斷)之放射性同位素包括碘( 131I或 125I)、銦( 111In)、鎝( 99mTc)、磷( 32P)、碳( 14C)及氚( 3H)，或以上列舉之治療性同位素中之一或多者。
本發明提供放射性標記之抗體分子及其標記方法。在一實施例中，揭示一種標記抗體分子之方法。方法包括使抗體分子與螯合劑接觸，由此產生結合之抗體。結合之抗體經放射性同位素(例如， 111銦、 90釔及 177鎦)放射性標記，由此產生標記之抗體分子。
在一實施例中，抗體分子與治療劑結合。本文中揭示治療活性放射性同位素。其他治療劑之實例包括(但不限於)紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、短桿菌素D (gramicidin D)、溴化乙錠、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、類美登素(maytansinoid) (例如美登醇(maytansinol) (參見例如美國專利第5,208,020號))、CC-1065 (參見例如美國專利第5,475,092號、第5,585,499號、第5,846,545號)及其類似物或同源物。治療劑包括(但不限於)抗代謝物(例如甲胺喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine)、烷基化劑(例如甲氮芥(mechlorethamine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、CC-1065、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BSNU)及洛莫司汀(lomustine) (CCNU)、環硫磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順-二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、蒽環黴素(anthracyclinies) (例如道諾黴素(先前為柔紅黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如放線菌素D (先前為放射菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素及安麴黴素(anthramycin；AMC))，以及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼、長春鹼、紫杉醇及類美登素)。
在一實施例中，抗體分子(例如單特異性、雙特異性或多特異性抗體分子)共價連接(例如融合)至另一搭配物(例如蛋白質)，例如以融合分子(例如融合蛋白)形式。
如本文中所使用，「融合蛋白」及「融合多肽」係指具有至少兩個共價連接在一起之部分的多肽，其中各部分為多肽。在一實施例中，各部分為具有不同特性之多肽。特性可為生物特性，諸如活體外或活體內活性。特性亦可為簡單化學或物理特性，諸如結合至靶分子、催化反應等。兩個部分可藉由單一肽鍵直接連接或經由連接子(例如肽連接子)連接，但彼此在閱讀框架中。
在一個態樣中，本發明的特徵為一種提供特異性結合至靶蛋白之抗體分子之方法。方法可包括：提供包含靶蛋白之至少一部分的蛋白質，該部分與靶蛋白之對應部分同源(例如至少70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%一致)，但相差至少一個胺基酸(例如至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個胺基酸)；獲得特異性結合至靶蛋白之抗體分子；以及評估抗體分子在調節靶蛋白活性中之功效。方法可進一步包括使抗體分子或衍生物與(例如來自個體之)樣品接觸。方法可進一步包括向個體(例如人類)投與抗體分子或衍生物。
在另一態樣中，本發明提供製備本文中所揭示之抗體分子之方法。方法可包括：提供抗原或其片段；獲得特異性結合至抗原之抗體分子；評估抗體分子在調節抗原及/或表現抗原之生物體的活性中之功效。方法可進一步包括使抗體分子或衍生物與(例如來自個體之)樣品接觸。方法可進一步包括向個體(例如人類)投與抗體分子或衍生物。
本發明提供編碼本文中所描述之抗體分子之核酸，以及包括核酸之載體及宿主細胞。核酸包括(但不限於) RNA、基因體DNA及cDNA。
例示性抗體分子之胺基酸及核苷酸序列描述於下文中。
1H4_VH之胺基酸序列(CDR序列帶下劃線)
1H4_VH 之CDR 序列 胺基酸序列 SEQ ID NO:
HCDR1 GIDFSRYW 11
HCDR2 INPDSSTI 12
HCDR3 AIYYDYAMDF 13
1H4_Vk之胺基酸序列(CDR序列帶下劃線)
1H4_Vk 之CDR 序列 胺基酸序列 SEQ ID NO:
LCDR1 ESVDNYGISF 14
LCDR2 AAS 15
LCDR3 QQNKEVPYT 16
1H4_VH_IgG1之胺基酸序列(Osteo前導序列：帶下劃線；1H4_VH：常規；連接子：帶下劃線及斜體；小鼠IgG1恆定區：斜體；CDR序列：粗體及帶下劃線)
1H4_VH_IgG2之胺基酸序列(Osteo前導序列：帶下劃線；1H4_VH：常規；連接子：帶下劃線及斜體；小鼠IgG2恆定區：斜體；CDR序列：粗體及帶下劃線)
1H4_Vk之胺基酸序列(Osteo前導序列：帶下劃線；1H4_VH：常規；κ恆定區：斜體；CDR序列：粗體及帶下劃線)
1H4_VH之核苷酸序列(編碼CDR之序列為粗體及帶下劃線)
編碼 1H4_VH 之 CDR 的序列 核酸序列 SEQ ID NO:
HCDR1 GGCATTGATTTCTCTCGCTACTGG 17
HCDR2 ATAAACCCGGATTCTTCTACCATT 18
HCDR3 GCAATTTATTACGATTACGCTATGGACTTC 19
1H4_Vk之核苷酸序列(編碼CDR之序列為粗體及帶下劃線)
編碼 1H4_Vk 之 CDR 的序列 核酸序列 SEQ ID NO:
LCDR1 GAATCAGTAGACAATTACGGTATCTCATTC 20
LCDR2 GCAGCATCA 21
LCDR3 CAGCAAAACAAGGAGGTTCCCTATACG 22
1H4_VH_IgG1之核苷酸序列(Osteo前導序列：帶下劃線；1H4_VH：常規；連接子：帶下劃線及斜體；小鼠IgG1恆定區：斜體；編碼CDR之序列：粗體及帶下劃線)
1H4_VH_IgG2之核苷酸序列(Osteo前導序列：帶下劃線；1H4_VH：常規；連接子：帶下劃線及斜體；小鼠IgG2恆定區：斜體；編碼CDR之序列：粗體及帶下劃線)
1H4_Vk之核苷酸序列(Osteo前導序列：帶下劃線；1H4_VH：常規；κ恆定區：斜體；編碼CDR之序列：粗體及帶下劃線)
在一實施例中，使用Kabat或Chothia之CDR定義，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)之VH區的一個、兩個或三個CDR。在一實施例中，使用Kabat或Chothia之CDR定義，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)之VL區的一個、兩個或三個CDR。在一實施例中，使用Kabat或Chothia之CDR定義，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)的VH區之一或多個(例如兩個或三個) CDR及/或VL區之一或多個(例如兩個或三個) CDR。
在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之一個、兩個或三個VH CDR。在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之一個、兩個或三個VL CDR。在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之一或多個(例如兩個或三個) VH CDR及/或一或多個(例如兩個或三個) VL CDR。
在一實施例中，抗體分子包含一個、兩個或三個VH CDR，其包含SEQ ID NO: 11、12及/或13之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。在一實施例中，抗體分子包含三個VH CDR之集合，其包含SEQ ID NO: 11、12及13之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。在一實施例中，抗體分子包含一個、兩個或三個VH CDR，其包含SEQ ID NO: 11、12及/或13之胺基酸序列。在一實施例中，抗體分子包含三個VH CDR之集合，其包含SEQ ID NO: 11、12及13之胺基酸序列。
在一實施例中，抗體分子包含一個、兩個或三個VL CDR，其包含SEQ ID NO: 14、15及/或16之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。在一實施例中，抗體分子包含三個VL CDR之集合，其包含SEQ ID NO: 14、15及/或16之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。在一實施例中，抗體分子包含一個、兩個或三個VL CDR，其包含SEQ ID NO: 14、15及/或16之胺基酸序列。在一實施例中，抗體分子包含三個VL CDR之集合，其包含SEQ ID NO: 14、15及16之胺基酸序列。
在一實施例中，抗體分子包含一個、兩個或三個VH CDR，其包含由SEQ ID NO: 17、18及/或19編碼之胺基酸序列或與其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異之核酸序列。在一實施例中，抗體分子包含三個VH CDR之集合，其包含由SEQ ID NO: 17、18及19編碼之胺基酸序列或與其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異之核酸序列。在一實施例中，抗體分子包含一個、兩個或三個VH CDR，其包含由SEQ ID NO: 17、18及/或19編碼之胺基酸序列。在一實施例中，抗體分子包含三個VH CDR之集合，其包含由SEQ ID NO: 17、18及19編碼之CDR序列。
在一實施例中，抗體分子包含一個、兩個或三個VL CDR，其包含由SEQ ID NO: 20、21及/或22編碼之胺基酸序列或與其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異之核酸序列。在一實施例中，抗體分子包含三個VL CDR之集合，其包含由SEQ ID NO: 20、21及22編碼之CDR序列或與其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異之核酸序列。在一實施例中，抗體分子包含一個、兩個或三個VL CDR，其包含由SEQ ID NO: 20、21及/或22編碼之胺基酸序列。在一實施例中，抗體分子包含三個VL CDR之集合，其包含由SEQ ID NO: 20、21及22編碼之CDR序列。
在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)之VH區的一個、兩個、三個或四個構架。在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)之VL區的一個、兩個、三個或四個構架。在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)的VH區之一或多個(例如兩個、三個或四個)構架及/或VL區之一或多個(例如兩個、三個或四個)構架。
在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)的重鏈可變區。在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)的輕鏈可變區。在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)的重鏈可變區及輕鏈可變區。
在一實施例中，抗體分子包含具有本文中所描述之胺基酸序列或與其實質上一致之胺基酸序列的重鏈可變區。在一實施例中，抗體分子包含具有本文中所描述之胺基酸序列或與其實質上一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一實施例中，抗體分子包含具有本文中所描述之胺基酸序列(或與其實質上一致之胺基酸序列)的重鏈可變區及具有本文中所描述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一實施例中，抗體分子包含具有本文中所描述之胺基酸序列或與其實質上一致之胺基酸序列的重鏈。在一實施例中，抗體分子包含具有本文中所描述之胺基酸序列或與其實質上一致之胺基酸序列的輕鏈。在一實施例中，抗體分子包含具有本文中所描述之胺基酸序列(或與其實質上一致之胺基酸序列)的重鏈及具有本文中所描述之胺基酸序列的輕鏈。
在一實施例中，抗體分子包含由本文中所描述之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列編碼的重鏈可變區。在一實施例中，抗體分子包含由本文中所描述之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列編碼的輕鏈可變區。在一實施例中，抗體分子包含由本文中所描述之核苷酸序列(或與其實質上一致之核苷酸序列)編碼的重鏈可變區及由本文中所描述之核苷酸序列(或與其實質上一致之核苷酸序列)編碼的輕鏈可變區。
在一實施例中，抗體分子進一步包含重鏈恆定區。在一實施例中，重鏈恆定區為IgG1恆定區或其功能部分。在另一實施例中，重鏈恆定區為IgG2恆定區或其功能部分。在一實施例中，抗體分子進一步包含輕鏈恆定區。在一實施例中，抗體分子進一步包含重鏈恆定區。在一實施例中，重鏈恆定區為IgG3恆定區或其功能部分。在一實施例中，抗體分子進一步包含重鏈恆定區。在一實施例中，重鏈恆定區為IgG4恆定區或其功能部分。在一實施例中，抗體分子進一步包含重鏈恆定區及輕鏈恆定區。在一實施例中，抗體分子包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)的重鏈恆定區、輕鏈恆定區以及重鏈及輕鏈可變區。在一實施例中，抗體分子包含重鏈恆定區、輕鏈恆定區及可變區，該等可變區包含本文中所描述之單株抗體(例如單株抗體1H4、1A5、6A3、1B8、1E5、6C1、3F4、6C12、2F5或6H5中之任一者)之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR。
在一實施例中，抗體分子進一步包含連接子，例如本文中所描述之連接子。在一實施例中，抗體分子進一步包含前導序列，例如本文中所描述之前導序列。
APRIL增殖誘導性配位體(A PRoliferation Inducing Ligand；APRIL)，亦稱為CD256、TNF-及APOL-相關白血球表現之配位體2 (TALL-2)或TNF相關死亡配位體1 (TRDL-1)，係由腫瘤壞死因子配位體超家族成員13 ( TNFSF13)基因(亦稱為 APRIL、 TALL2或 ZTNF2)編碼之TNF家族細胞介素。APRIL在諸如信號轉導、細胞增殖調節及IgA類別轉換之多種生物過程中起作用(Hahne等人 ( 1998 ) J . Exp . Med .188:1185-1190 (1998)；Castigli等人 Proc . Natl . Acad . Sci . U . S . A. 101:3903-3908 (2004))。
APRIL在功能及結構上均與B細胞活化因子F13B (B Cell Activating Factor F13B；BAFF，亦稱為B淋巴球刺激因子(BLyS))有關。兩種細胞介素均涉及先天性及後天性免疫功能之關鍵調節方面。APRIL及BAFF兩者均結合淋巴球受體跨膜活化因子及CAML相互作用因子(transmembrane activator and CAML interactor；TACI)及B細胞成熟抗原(B cell maturation antigen；BCMA)。APRIL及BAFF似乎經由蛋白質-蛋白質相互作用彼此以異源方式相互作用。儘管APRIL及BAFF兩者共用生物化學(受體結合)、免疫學及甚至一些結構重疊(例如，當其涉及其各別受體結合域之三維拓朴結構時)，但兩種細胞介素在結構及功能上仍不同。APRIL結合至生物相關硫酸乙醯肝素(以硫酸乙醯肝素蛋白多醣形式存在於胞外基質中)；但BAFF不結合。此相互作用就協同性地促進APRIL之寡聚狀態及其與TACI之局部相互作用而言發揮重要生物功能，此同樣需要HSPGS以達成完全活性。不同於充當B細胞之強效活化因子的BAFF (包括增殖及分化兩者)，APRIL似乎在B細胞表現型之調節方面發揮更特定的作用，例如當其涉及IgA產生及IgA陽性漿細胞之分化/存活時。因此，與靶向BAFF (例如貝利單抗(belimumab))之其他免疫相關治療劑或主要靶向前B細胞及早期B細胞之抗CD20療法(例如利妥昔單抗(rituximab))相比，預期APRIL受體信號傳導之靶向破壞對於B細胞穩態及整體免疫功能的擾動影響更小。亦顯示APRIL在其他骨髓相關細胞及淋巴組織以及血液學癌症(例如骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia；CLL))及實體腫瘤(例如大腸癌、甲狀腺癌及乳癌)上高量表現。
人類APRIL之例示性胺基酸及核苷酸序列描述於例如Hahne等人 J . Exp . Med. 188:1185-1190 (1998)；Shu等人 J . Leukoc . Biol. 65:680-683 (1999)；Kelly等人 Cancer Res. 60:1021-1027(2000)；及Pradet-Balade等人 EMBO J. 21:5711-5720 (2002)中。人類APRIL之其他變異體及替代性序列描述於例如The MGC Project Team, Genome Res. 14:2121-2127 (2004)；Ota等人 Nat . Genet. 36:40-45 (2004)；及Kelly等人 Cancer Res. 60:1021-1027 (2000)中。人類及小鼠APRIL之例示性胺基酸及核苷酸序列亦描述於例如國際申請公開案第WO2017/091683號中，其內容以全文引用之方式併入本文中。
動物模型可例如使用各種動物模型活體內評估本文中所描述之抗體分子。舉例而言，動物模型可用於測試本文中所描述之抗體分子的藥物動力學及/或藥效學特性。
可用於評估本文中所描述之抗體分子之IgA腎病變的例示性動物模型包括(但不限於)自發性IgA腎炎之ddY小鼠模型(Imai等人 Kidney Int. 1985; 27(5):756-761)；利用惰性蛋白質或常見病毒病原體作為刺激抗原之小鼠模型(Emancipator等人 Curr . Protoc. Immunol .2001年5月;第15章:第15.11單元)；利用非感染性蛋白質抗原之大鼠模型(Emancipator等人 Curr . Protoc . Immunol .2001年5月;第15章:第15.11單元)；IgA免疫複合體相關腎病變之慢性小鼠模型(Montinaro等人 Nephrol . Dial . Transplant. 1995; 10(11): 2035-2042)；人類腎小球病變之Gne M712T小鼠模型(Kakani等人 Am . J. Pathol. 2012; 180(4):1431-1440)；利用MBP-20-肽融合蛋白之小鼠IgA腎病變模型(Zhang等人 Anat . Rec . ( Hoboken ). 2010; 293(10): 1729-1737)；以及IgA免疫複合體腎炎之小鼠模型(Rifai等人 J Exp Med. 1979; 150(5):1161-1173)。IgA腎病變之其他動物模型描述於例如Tomino等人 J . Nephrol .2008; 21(4):463-467；Endo Ren . Fail. 1997; 19(3):347-371；及Rifai Kidney Int. 1987; 31(1):1-7中。
本文中所描述之其他病症之例示性動物模型亦為此項技術中已知的。可用於評估本文中所描述之抗體分子的例示性動物類型包括(但不限於)小鼠、大鼠、兔、天竺鼠及猴。
組合物本文中所描述之抗體分子可包括於組合物中。在一實施例中，組合物為醫藥組合物，例如包含醫藥學上可接受之載劑。本文中所描述之組合物可用於評估樣品或個體中之抗APRIL抗體分子之分析法中。
如本文中所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、等張劑及吸收延遲劑及其類似載劑。載劑可適用於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、直腸、脊椎或表皮投藥(例如藉由注射或輸注)。在一實施例中，醫藥組合物中之小於約5%，例如小於約4%、3%、2%或1%之抗體分子係以聚集體形式存在。在其他實施例中，醫藥組合物中之至少約95%，例如至少約96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.8%或更多之抗體分子係以單體形式存在。在一實施例中，藉由層析，例如高效尺寸排阻層析(HP-SEC)來測定聚集體或單體之含量。
本文中所闡述之組合物可呈各種形式。此等形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、脂質體及栓劑。適合之形式視所欲投藥模式及治療應用而定。典型適合之組合物係呈可注射或可輸注溶液形式。一種適合之投藥模式為非經腸(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌內)。在一實施例中，藉由靜脈內輸注或注射來投與抗體分子。在一實施例中，藉由肌內或皮下注射來投與抗體。
如本文中所使用之片語「非經腸投與(parenteral administration)」及「非經腸投與(administered parenterally)」意謂除經腸及外用投藥以外，通常藉由注射進行之投藥模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
治療性組合物在製造及儲存條件下通常應為無菌及穩定的。組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適用於高抗體濃度之其他有序結構。可藉由將所需量之活性化合物(亦即，抗體或抗體部分)與上文所列舉之成分之一或組合併入適當溶劑中，隨後視需要過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。通常，藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及來自上文所列舉之成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其自先前無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何額外所需成分之粉末。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鹽及明膠來達成可注射組合物之延長吸收。
可藉由各種方法投與本文中所描述之抗體分子。若干種方法為此項技術中已知的，且在許多治療性、預防性或診斷性應用中，適當之投藥途徑/模式為靜脈內注射或輸注。舉例而言，可以小於10 mg/min，較佳小於或等於5 mg/min之速率藉由靜脈內輸注來投與抗體分子，以達到約1至100 mg/m 2，較佳約5至50 mg/m 2、約7至25 mg/m 2且更佳約10 mg/m 2之劑量。如熟習此項技術者將瞭解，投藥途徑及/或模式將視所需結果而變化。在一實施例中，可用將保護化合物以免快速釋放之載劑(諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封遞送系統)來製備活性化合物。可使用可生物降解之生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之許多方法已獲得專利或一般為熟習此項技術者已知的。參見例如， Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
在一實施例中，抗體分子可例如與惰性稀釋劑或可吸收之可食用載劑一起經口投與。抗體分子(及視需要之其他成分)亦可封閉於硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓製成錠劑或直接併入個體之膳食中。對於經口治療性投與，可將抗體分子與賦形劑合併且以可攝取之錠劑、口頰錠、糖衣錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片及其類似形式使用。為藉由除非經腸投藥以外之形式投與抗體分子，可能需要用防止化合物不活化之物質包覆化合物或將化合物與防止其不活化之物質共投與。亦可用醫學裝置投與治療性、預防性或診斷性組合物，且此項技術中已知若干種此類醫學裝置。
調整給藥方案以產生所需反應(例如治療性、預防性或診斷性反應)。舉例而言，可單次推注投藥，可隨時間推移投與若干分次劑量，或可如治療情況之緊急狀態所指示而按比例減少或增加劑量。為了投藥之簡便性及劑量之均勻性，以單位劑型來調配非經腸組合物為尤其有利的。如本文中所使用之單位劑型係指適合作為用於所治療個體之單位劑量的實體不連續單元；各單元含有經計算以與所需醫藥載劑結合產生所需治療作用的預定量之活性化合物。單位劑型之規格係由以下決定且直接取決於：(a)抗體分子之獨特特徵及所欲達成之特定治療性、預防性或診斷性作用，及(b)此類抗體分子之混配技術中固有的關於個體治療敏感度之侷限性。
抗體分子之治療、預防或診斷有效量之一個例示性、非限制性範圍為每kg個體體重約0.1至50 mg，例如約0.1至30 mg/kg，例如約1至30、1至15、1至10、1至5、5至10，或1至3 mg/kg，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50 mg/kg。可以小於10 mg/min，例如小於或等於5 mg/min之速率靜脈內輸注來投與抗體分子，以達到約1至100 mg/m 2，例如約5至50 mg/m 2、約7至25 mg/m 2，例如約10 mg/m 2之劑量。應注意，劑量值可隨所欲緩解之病況的類型及嚴重程度而變化。此外應理解，對於任何特定個體，特定給藥方案應根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與之人員的專業判斷而隨時間調整，且本文中所闡述之劑量範圍僅為例示性且並不意欲限制所主張組合物之範疇或實務。
本文中之醫藥組合物可包括「治療有效量」、「預防有效量」或「診斷有效量」之本文中所描述之抗體分子。
「治療有效量」係指在所需劑量且在所需時段內有效達成所需治療結果之量。抗體分子之治療有效量可視以下因素而變化：諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及抗體或抗體部分引發個體所需反應之能力。治療有效量亦為抗體分子之治療有益作用重於任何毒性或有害作用之量。相對於未經治療之個體，「治療有效劑量」通常抑制可量測參數至少約20%，例如至少約40%、至少約60%或至少約80%。可量測參數可為例如血尿、有色尿、泡沫尿、疼痛、手及腳腫脹(水腫)，或高血壓。可在預測治療或預防病症之功效的動物模型系統中評估抗體分子抑制可量測參數之能力。或者，可藉由在活體外或離體分析法中檢查抗體分子抑制可量測參數之能力來評估組合物之此特性。
「預防有效量」係指在所需劑量且在所需時段內有效達成所需預防結果之量。通常，由於預防劑量係在疾病之前或在疾病較早期用於個體，因此預防有效量將小於治療有效量。
「診斷有效量」係指在所需劑量且在所需時段內有效達成所需診斷結果之量。通常，診斷有效量為可在活體外、離體或活體內診斷病症之量。
套組本文中所描述之抗體分子可包括於套組中。
套組可包括一或多個其他元件，包括：使用說明書；其他試劑，例如標記、治療劑，或適用於使抗體分子與標記或治療劑螯合或以其他方式偶合之試劑，或放射防護組合物；用於製備用以投與之抗體分子之裝置或其他物質；醫藥學上可接受之載劑；以及用於向個體投藥之裝置或其他物質。
核酸本發明提供核酸，其包含編碼本文中所描述之抗體分子或其功能片段(例如VH、VL或兩者)之核苷酸序列(例如本文中所描述之核苷酸序列)。
舉例而言，本發明之特徵在於分別編碼本文中所描述之抗體分子或本文中所描述之抗體分子之一部分之重鏈及輕鏈可變區的第一及第二核酸。核酸可包含編碼本文中所描述之胺基酸序列的核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列(例如與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致，或與其相差不超過3、6、15、30或45個核苷酸之核苷酸序列)。
在一實施例中，核酸包含編碼來自重鏈可變區之至少一個、兩個或三個CDR (例如，包含SEQ ID NO: 11、12及/或13之胺基酸序列之CDR)的核苷酸序列，該重鏈可變區具有本文中所描述之胺基酸序列，或與其實質上一致之胺基酸序列(例如，與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致，及/或具有一或多個取代(例如保守性取代)之胺基酸序列)。在一實施例中，核酸包含編碼來自輕鏈可變區之至少一個、兩個或三個CDR (例如，包含SEQ ID NO: 14、15及/或16之胺基酸序列之CDR)的核苷酸序列，該輕鏈可變區具有本文中所描述之胺基酸序列，或與其實質上一致之胺基酸序列(例如，與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致，及/或具有一或多個取代(例如保守性取代)之序列)。在一實施例中，核酸包含編碼來自重鏈可變區之至少一個、兩個或三個CDR (例如，包含SEQ ID NO: 11、12及/或13之胺基酸序列之CDR)的核苷酸序列，該重鏈可變區具有本文中所描述之胺基酸序列，或與其實質上一致之胺基酸序列(例如，與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致，及/或具有一或多個取代(例如保守性取代)之胺基酸序列)；以及編碼來自輕鏈可變區之至少一個、兩個或三個CDR (例如，包含SEQ ID NO: 14、15及/或16之胺基酸序列之CDR)的核苷酸序列，該輕鏈可變區具有本文中所描述之胺基酸序列，或與其實質上一致之胺基酸序列(例如，與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致，及/或具有一或多個取代(例如保守性取代)之序列)。
在一實施例中，核酸包含本文中所描述之核苷酸序列或與其實質上同源之核苷酸序列(例如與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致，及/或能夠在本文中所描述之嚴格條件下雜交之核苷酸序列)。在一實施例中，核酸包含本文中所描述之核苷酸序列之一部分(例如功能部分)或與其實質上同源之序列(例如與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致，及/或能夠在本文中所描述之嚴格度條件下雜交之核苷酸序列)。該部分可編碼例如可變區(例如VH或VL)；一個、兩個或三個或更多個CDR；或一個、兩個、三個或四個或更多個構架區。
本文中所描述之核酸包括去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。聚核苷酸可為單股或雙股，且若為單股，則可為編碼股或非編碼(反義)股。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。可在聚合之後諸如藉由與標記組分結合進一步修飾聚核苷酸。核酸可為重組聚核苷酸，或基因體、cDNA、半合成或合成來源之聚核苷酸，其不存在於自然界中或以非天然排列形式連接至另一聚核苷酸。
本文中所描述之核酸可包括於載體及宿主細胞中。核酸可存在於單一載體或各別載體中，存在於相同宿主細胞或各別宿主細胞中，如下文更詳細地描述。
載體本發明提供包含本文中所描述之核酸的載體(例如，選殖載體及表現載體)。
在一實施例中，載體包含有包含編碼本文中所描述之抗體分子之核苷酸序列的核酸。在另一實施例中，載體包含有包含本文中所描述之核苷酸序列的核酸。載體包括(但不限於)病毒、質體、黏質體、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。
可使用多種載體系統。舉例而言，一種類別之載體利用衍生自動物病毒(諸如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、逆轉錄病毒(勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、MMTV或MOMLV)或SV40病毒)之DNA元件。另一種類別之載體利用衍生自RNA病毒(諸如塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、東部馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalitis virus)及黃病毒(Flavivirus))之RNA元件。
另外，可藉由引入一或多個標記物以允許選擇經轉染之宿主細胞來選擇將DNA穩定整合至其染色體中之細胞。標記物可例如向營養缺乏型宿主提供原始營養型、殺生物劑抗性(例如抗生素)或對重金屬(諸如銅)之抗性或其類似者。可選之標記物基因可直接連接至待表現之DNA序列或藉由共轉型而引入同一細胞中。mRNA之最佳合成亦可能需要額外元件。此等元件可包括剪接信號，以及轉錄啟動子、強化子及終止信號。
用於表現的載體一經製成，則可將載體轉染或引入至適當宿主細胞中。為此，可使用各種技術，諸如原生質體融合、磷酸鈣沈澱、電穿孔、逆轉錄病毒轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質之轉染或其他習知技術。就原生質體融合而言，細胞在培養基中生長且針對適當活性進行篩選。
用於培養所得轉染細胞及用於回收所產生之抗體分子的方法及條件為熟習此項技術者已知的，且可基於本說明書根據所使用之特定表現載體及哺乳動物宿主細胞而改變或最佳化。
細胞本發明提供包含本文中所描述之核酸或本文中所描述之載體的細胞(例如宿主細胞)。
在一實施例中，細胞經基因工程改造以包含本文中所描述之核酸或本文中所描述之載體。在一實施例中，使用表現卡匣對細胞進行基因工程改造。片語「表現卡匣」係指核苷酸序列，其能夠影響與此類序列相容之宿主中的基因表現。此類卡匣可包括啟動子、具有或不具有內含子之開放閱讀框架及終止信號。亦可使用在實現表現中所需或有幫助之額外因子，例如可誘導之啟動子。
細胞可為(但不限於)真核細胞、細菌細胞、昆蟲細胞或人類細胞。適合之真核細胞包括(但不限於) Vero細胞、希拉細胞(HeLa cell)、COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞、BHK細胞及MDCKII細胞。適合之昆蟲細胞包括(但不限於) Sf9細胞。在一實施例中，細胞(例如，宿主細胞)為經分離之細胞。
抗體分子之用途本文中所揭示之抗體分子以及本文中所揭示之組合物具有活體外、離體及活體內效用。
在一實施例中，抗體分子降低(例如抑制、阻斷或中和)抗APRIL抗體(例如西貝侖利單抗)之一或多種生物活性。舉例而言，此等抗體分子可活體外或離體投與培養中之細胞，或投與個體(例如人類個體)，例如活體內，以降低(例如抑制、阻斷或中和)抗APRIL抗體之一或多種生物活性。在一實施例中，抗體分子與抗APRIL抗體競爭結合至APRIL。在一實施例中，抗體分子抑制或實質上抑制抗APRIL抗體與APRIL之結合。因此，在一態樣中，本發明提供一種評估已用抗APRIL抗體治療之個體或來自個體之樣品的方法，其包含使樣品或個體與本文中所描述之抗體分子接觸，從而評估樣品或個體。
如本文中所使用，術語「個體」意欲包括人類及非人類動物。在一實施例中，個體為人類個體，例如患有APRIL相關病症或處於APRIL相關病症之風險中的人類患者。在一實施例中，APRIL相關病症為IgA腎病變。術語「非人類動物」包括哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物。在一實施例中，個體為人類。本文中所描述之抗體分子適用於測定個體中之抗APRIL抗體含量或活性。患有APRIL相關病症之個體包括例如已罹患APRIL相關病症但(至少暫時)無症狀之個體、已展現APRIL相關病症之症狀的個體或患有與APRIL相關病症有關之病症的個體。
診斷方法本發明提供用於活體外(例如在樣品中，諸如血液樣品或切片)或活體內(例如個體中之活體內成像)偵測抗APRIL抗體之存在的診斷方法。方法包括：(i)使樣品與本文中所描述之抗體分子接觸，或向個體投與本文中所描述之抗體分子；(視情況地) (ii)使參考樣品(例如對照樣品)與抗體分子接觸，或向參考個體(例如對照個體)投與抗體分子；及(iii)偵測抗體分子與樣品或個體、或參考樣品或個體中之抗APRIL抗體之間的複合體形成，其中相對於參考樣品或個體，樣品或個體中之複合體形成之變化(例如，統計學顯著變化)指示樣品或個體中存在抗APRIL抗體。抗體分子可直接或間接地用可偵測物質標記以便於偵測結合或未結合之抗體分子。適合之可偵測物質包括上文所描述及下文更詳細地描述之各種酶、輔基、螢光物質、發光物質及放射性物質。
術語「樣品」係指用於偵測多肽或編碼多肽之核酸的樣品，且包括(但不限於)體液(例如血液、血清或尿液)、細胞、細胞溶解物、蛋白質或細胞之膜提取物或組織樣品(例如切片)。
可藉由量測或目測結合至抗APRIL抗體之抗體分子或未結合之抗體分子來偵測抗體分子與抗APRIL抗體之間的複合體形成。可使用任何適合之偵測分析法，且習知偵測分析法包括酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)或組織免疫組織化學。替代標記抗體分子，可藉由使用以可偵測物質標記之標準物及未標記之抗體分子的競爭免疫分析法在樣品中分析抗APRIL抗體之存在。在此分析法中，將樣品、經標記之標準物及抗體分子組合且測定結合至未標記之結合分子的經標記之標準物的量。樣品中之抗APRIL抗體之量與結合至抗體分子的經標記之標準物的量成反比。
本文中所描述之抗體分子可用於診斷可藉由抗APRIL抗體治療或預防之病症。本文中所描述之偵測或診斷方法可與本文中所描述之其他方法組合使用以治療或預防本文中所描述之病症。
列舉之實施例1.      一種能夠結合至抗APRIL抗體之抗體分子，其包含：包含SEQ ID NO: 1之HCDR1胺基酸序列、HCDR2胺基酸序列及HCDR3胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；以及包含SEQ ID NO: 2之LCDR1胺基酸序列、LCDR2胺基酸序列及LCDR3胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 2.      一種能夠結合至抗APRIL抗體之抗體分子，其包含： (a) 包含以下中之1、2或3者的重鏈可變區(VH)： (i)  HCDR1，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列， (ii)  HCDR2，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列，及/或 (iii)  HCDR3，其包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列；及/或 (b) 包含以下中之1、2或3者的輕鏈可變區(VL)： (iv) LCDR1，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列， (v) LCDR2，包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列，及/或 (vi) LCDR3，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸差異之胺基酸序列。 3.      如實施例1或2之抗體分子，其中VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之胺基酸序列。 4.      如實施例1至3中任一項之抗體分子，其中VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。 5.      如實施例1至4中任一項之抗體分子，其中VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之胺基酸序列。 6.      如實施例1至5中任一項之抗體分子，其中VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。 7.      如實施例1至6中任一項之抗體分子，其包含抗原結合片段。 8.      如實施例7之抗體分子，其中抗原結合片段包含Fab、F(ab')2、Fv、scFv或sc(Fv)2。 9.      如實施例1至8中任一項之抗體分子，其包含重鏈恆定區。 10.    如實施例9之抗體分子，其中重鏈恆定區包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之重鏈恆定區。 11.    如實施例1至10中任一項之抗體分子，其包含輕鏈恆定區。 12.    如實施例11之抗體分子，其中輕鏈恆定區包含κ或λ輕鏈之輕鏈恆定區。 13.    如實施例1至12中任一項之抗體分子，其包含Fc區。 14.    如實施例1至13中任一項之抗體分子，其包含有包含SEQ ID NO: 3之胺基酸18至458或SEQ ID NO: 4之胺基酸18至464的重鏈。 15.    如實施例1至14中任一項之抗體分子，其包含有包含SEQ ID NO: 5之胺基酸18至235的輕鏈。 16.    如實施例1至15中任一項之抗體分子，其包含： (a)     包含SEQ ID NO: 3之胺基酸18至458的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸18至235的輕鏈；或 (b)    包含SEQ ID NO: 4之胺基酸18至464的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸18至235的輕鏈。 17.    如實施例1至16中任一項之抗體分子，其包含有包含SEQ ID NO: 3或4之胺基酸序列的重鏈。 18.    如實施例1至17中任一項之抗體分子，其包含有包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的輕鏈。 19.    如實施例1至18中任一項之抗體分子，其包含： (a)     包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的輕鏈；或 (b)    包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的輕鏈。 20.    如實施例1至19中任一項之抗體分子，其為mAb 1H4。 21.    如實施例1至20中任一項之抗體分子，其為小鼠抗體分子。 22.    如實施例1至21中任一項之抗體分子，其為經分離之抗體分子。 23.    如實施例1至22中任一項之抗體分子，其為單株抗體分子。 24.    如實施例1至23中任一項之抗體分子，其為抗獨特型抗體分子。 25.    如實施例1至24中任一項之抗體分子，其結合至抗APRIL抗體之VH、VL或兩者。 26.    如實施例1至25中任一項之抗體分子，其結合至抗APRIL抗體之一或多個(例如2、3、4、5或6個) CDR。 27.    如實施例1至26中任一項之抗體分子，其未結合或實質上未結合至抗APRIL抗體之Fc區。 28.    如實施例1至27中任一項之抗體分子，其係以低於500 ng/mL，例如低於400 ng/mL、300 ng/mL、200 ng/mL、150 ng/mL、120 ng/mL、100 ng/mL、90 ng/mL、80 ng/mL、70 ng/mL、60 ng/mL、50 ng/mL、40 ng/mL、35 ng/mL、30 ng/mL、25 ng/mL、20 ng/mL、15 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL或0.1 ng/mL，例如1 ng/mL至150 ng/mL、2 ng/mL至100 ng/mL、5 ng/mL至50 ng/mL或10 ng/mL至25 ng/mL之EC50結合至抗APRIL抗體，例如藉由ELISA所測定。 29.    如實施例1至28中任一項之抗體分子，其降低(例如中和、抑制或阻斷)抗APRIL抗體與APRIL之結合。 30.    如實施例1至29中任一項之抗體分子，其結合至未與APRIL結合之抗APRIL抗體。 31.    如實施例1至30中任一項之抗體分子，其未結合或實質上未結合至與APRIL結合之抗APRIL抗體。 32.    如實施例1至30中任一項之抗體分子，其結合至未與APRIL結合之抗APRIL抗體，且未結合或實質上未結合至與APRIL結合之抗APRIL抗體。 33.    如實施例1至32中任一項之抗體分子，其結合至未與APRIL結合之抗APRIL抗體，且未結合或實質上未結合至與APRIL結合之抗APRIL抗體。 34.    如實施例1至33中任一項之抗體分子，其橋接兩種抗APRIL抗體，例如同時結合至兩種抗APRIL抗體，例如藉由橋接ELISA分析法所測定。 35.    如實施例1至34中任一項之抗體分子，其與抗APRIL抗體競爭結合至APRIL。 36.    如實施例1至35中任一項之抗體分子，其中抗APRIL抗體結合至人類APRIL。 37.    如實施例1至36中任一項之抗體分子，其中抗APRIL抗體為西貝侖利單抗。 38.    一種抗體分子，其與如實施例1至37中任一項之抗體分子競爭結合至抗APRIL抗體。 39.    一種抗體分子，其結合至與由如實施例1至37中任一項之抗體分子所識別之抗原決定基相同或重疊之抗原決定基。 40.    一種偵測抗APRIL抗體之方法，其包含： (a)     使如實施例1至39中任一項之抗體分子與樣品接觸；及 (b)    測定抗體分子與樣品之間(例如抗體分子與樣品中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成， 由此偵測抗APRIL抗體。 41.    一種評估樣品之方法，其包含： (a)     使如實施例1至39中任一項之抗體分子與樣品接觸；及 (b)    測定抗體分子與樣品之間(例如抗體分子與樣品中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成， 由此評估樣品。 42.    如實施例40或41之方法，其進一步包含： (c)     使抗體分子與參考樣品接觸；及 (d)    測定抗體分子與參考樣品之間(例如抗體分子與參考樣品中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成。 43.    如實施例40至42中任一項之方法，其進一步包含在抗體分子與樣品或參考樣品接觸之前提供樣品或參考樣品。 44.    如實施例40至43中任一項之方法，其為ELISA分析法。 45.    如實施例40至44中任一項之方法，其為抗藥物分析法、毒理學分析法或GxP分析法。 46.    一種偵測抗APRIL抗體之方法，其包含： (a)     向個體投與如實施例1至39中任一項之抗體分子；及 (b)    測定抗體分子與個體之間(例如抗體分子與個體中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成， 由此偵測抗APRIL抗體。 47.    一種評估個體之方法，其包含： (a)     向個體投與如實施例1至39中任一項之抗體分子；及 (b)    測定抗體分子與個體之間(例如抗體分子與個體中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成， 由此評估個體。 48.    一種組合物(例如醫藥組合物)，其包含如實施例1至39中任一項之抗體分子，視情況其中組合物包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。 49.    一種核酸(例如經分離之核酸)，其編碼如實施例1至39中任一項之抗體分子的VH、VL或兩者。 50.    如實施例49之核酸，其包含SEQ ID NO: 8之核苷酸52至1374，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸之核苷酸序列。 51.    如實施例49或50之核酸，其包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。 52.    如實施例49之核酸，其包含SEQ ID NO: 9之核苷酸52至1392，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸之核苷酸序列。 53.    如實施例49或52之核酸，其包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列。 54.    如實施例49至53中任一項之核酸，其包含SEQ ID NO: 10之核苷酸52至705，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其相差不超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸之核苷酸序列。 55.    如實施例49至54中任一項之核酸，其包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。 56.    一種載體(例如表現載體)，其包含如實施例49至55中任一項之核酸。 57.    如實施例56之載體，其中載體包含可操作地連接至核酸之啟動子。 58.    一種細胞(例如宿主細胞)，其包含如實施例49至55中任一項之核酸或如實施例56或57之載體。 59.    一種產生抗體分子之方法，其包含在適用於基因表現之條件下培養如實施例58之細胞。 60.    如實施例59之方法，其進一步包含分離或純化抗體分子。 61.    如實施例59或60之方法，其中抗體分子係以0.2 mg/mL至5 mg/mL，例如0.5 mg/mL至1.5 mg/mL之濃度產生。
實例 實例 1 ： 抗獨特型抗體之產生向小鼠免疫接種西貝侖利單抗。為了評估次選殖前之篩選中之特異性，將西貝侖利單抗用作反向篩選試劑。
第一輪免疫接種成功地引發針對西貝侖利單抗的強血清反應，正如效價測試中所示且收穫所有三隻小鼠用於融合。對於效價測試，將西貝侖利單抗塗佈於ELISA盤上且在正常小鼠血清對照存在下，將來自三隻小鼠中之各者的抗血清滴定至盤中。與正常小鼠血清相比，所有三隻小鼠對西貝侖利單抗均展現免疫敏感性且推薦用於產生融合瘤。
自三隻小鼠收穫之淋巴結在融合之後產生八個96孔盤之融合瘤。基於細胞密度接種融合瘤以最大化單殖株性。八個融合盤之初次篩選係藉由酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)評估西貝侖利單抗結合，且針對與人類IgG2之反應性進行反向篩選。將對西貝侖利單抗呈陽性(且對人類IgG2呈陰性)之殖株進行排序、選擇且轉移至新的單一96孔盤中，該培養盤由75種殖株及20個空白孔及一個含有抗血清陽性對照的孔構成。殖株在新的96孔盤中擴增以用於次選殖前之篩選，且二次篩選中使用上清液結合至西貝侖利單抗、人類IgG2、人類IgG、20%混合人類血清、20%混合石蟹獼猴血清及0.8% BSA。在75種殖株中，68種殖株對西貝侖利單抗展示反應性且對人類IgG2反向篩選、人類IgG、20%混合人類血清、20%混合石蟹獼猴血清及0.8% BSA幾乎不具有反應性。自所有進一步分析中排除7種展示與人類IgG2及/或人類Ig結合之殖株。大部分殖株在450 nM下展示OD值≥1.5的最大信號。冷凍68種親本殖株，且上清液送交三次篩選。
殖株選擇在Octect分析法中，在Octet上用抗小鼠IgG Fv生物感測器尖端滴定所有68種融合瘤殖株，且在1X PBS中相對於1 µg/mL標準化並在4℃下儲存以用於三次篩選分析法。根據對一組mAb的結合來篩選68種候選抗ID融合瘤以檢查抗ID之特異性。將來自該組之mAb塗佈於ELISA盤上，且在4℃下培育隔夜，隨後操作各特異性ELISA。基於特異性篩選之結果，24種融合瘤對西貝侖利單抗、mAb 2419 (嵌合hIgG1)及mAb 2419-043 (IgG2，類似於西貝侖利單抗)展現高反應性；且對對照mAb展現低反應性/無反應性。mAb 2419為人源化西貝侖利單抗之鼠類IgG1版本；CDR環為保守性的，但構架區具有變化，且恆定區不同。與mAb 2419之結合係與靶向西貝侖利單抗之CDR區的抗ID一致。
前24種融合瘤在結合(『PK樣』)及橋接ELISA中進一步表徵( 圖 1A 至圖 1B)。出於橋接ELISA分析法之目的，西貝侖利單抗經生物素標記。在該分析法中，山羊抗人類IgG及鏈黴抗生物素蛋白HRP二級抗體兩者可偵測經生物素標記版本之西貝侖利單抗，然而如所預期，山羊抗人類IgG僅偵測未經生物素標記之西貝侖利單抗。
基於來自結合及橋接ELISA之資料，所有24種所選擇之殖株展示以各種EC50值強結合至西貝侖利單抗。在24種殖株中，有7種經鑑別為不同程度之『橋接子』。進行進一步表徵之殖株清單係基於小鼠mAb在橋接ELISA中形成橋之能力。融合瘤殖株在間接結合ELISA中良好結合西貝侖利單抗，但僅有一亞組在橋接ELISA中表現良好。亦測試所有殖株以測定mAb同型。按比例擴大抗獨特型之產生時，由於在蛋白A管柱上純化簡易及可再現性，因此最初選擇具有IgG2同型及良好結合/橋接概況之殖株用於次選殖。 表 1概述選擇用於次選殖之10種殖株及此組初始實驗之結果的概述。 表 1.次殖株選擇概述
殖株名稱 EC50 融合瘤之表現率(µg/mL)
1B8 106.2 60
1H4 20.10 54.9
6A3 9.567 30.9
1E5 12.71 23.5
6C1 36.99 39
3F4 12.10 33.5
1A5 8.194 49.2
6C12 10.66 22.4
2F5 22.18 23.0
6H5 6.399 60
最終次殖株表徵將十種經次選殖之融合瘤(各2個親本)製備為(1)冷凍融合瘤、(2)融合瘤上清液及(3) 6孔盤中之活細胞。在Octet上用抗小鼠IgG Fv生物感測器尖端滴定次殖株上清液，且在1X PBS中相對於1 µg/mL標準化並在4℃下儲存以用於後續實驗。使用標準融合瘤技術將6孔盤的融合瘤活細胞繼代。在繼代之第一週內冷凍融合瘤細胞。融合瘤維持在65%至85%盤滿度(confluency)或在0.25與1.0×10 6個細胞/毫升之間的濃度。以每48至72小時1:5或1:10之比例進行一般繼代。
使用一組三次篩選分析法表徵融合瘤上清液以便確定進行純化及後續表徵的最終次殖株。表徵20種次殖株之實驗包括西貝侖利單抗結合ELISA、橋接ELISA及快速ELISA mAb分型。在此輪實驗完成後，1 µg/mL的一些次殖株在結合ELISA中對西貝侖利單抗具有降低之親和力且自選擇中排除。基於來自橋接ELISA之結果，20種次殖株中之5種在次選殖之前仍為強『橋接子(bridgers)』；10種所選殖株中之7種在次選殖之前為強『橋接子』。在測試次殖株之同型後，未觀測到IgG2a/b同型(在次選殖之前，10個親本中之3個被鑑別為IgG2)。次殖株特性之變化意謂不存在用於簡單蛋白A純化策略之IgG2a/b融合瘤。因此，著力於(1)使用蛋白G及低IgG FBS純化融合瘤及(2)將主要融合瘤之可變區定序及選殖至小鼠IgG2載體中。 表 2概述所有20種次殖株之表徵。選擇1A5.F4、1H4.F4及6A3.E6對融合瘤進行大規模按比例擴增。 表 2.次殖株定序/選殖選擇概述
次殖株 西貝侖利單抗 橋接能力 同型 * 上清液之表現率(µg/ml)
1A5.F4 +++ ++ IgG1/IgG3 κ 61.6
1A5.F6 +++ ++ IgG1 κ 68.1
1B8.F4 + - IgG1 κ 43.2
1B8.G3 +++ - IgG1/IgG2b κ 51.4
1E5.E4 +++ - 未測定 23.1
1E5.G3 +++ - IgG1 κ 22.6
1H4.F4 +++ +++ IgG1 κ 40.8
1H4.G3 +++ - IgG1/IgG2a κ 47.5
2F5.C11 +++ - IgG1 κ 24.7
2F5.D10 +++ - IgG1 κ 26.1
3F4.B11 +++ - IgG1 κ 48.9
3F4.F4 +++ - IgG1 κ 71.5
6A3.E6 +++ +++ IgG1 κ 75.8
6A3.F8 +++ +++ IgG1 κ 57.5
6C1.C7 ++ - IgG1 κ 64.4
6C1.C8 +++ + IgG1/IgG2b κ 58.1
6C12.F7 +++ + IgG1 κ 45.7
6C12.F12 +++ + IgG1 κ 54.1
6H5.D6 +++ - IgG1 λ 16.9
6H5.D7 +++ + IgG1 κ 55.6
+++    最大信號；OD值為1.5或更高 ++      OD值≥1.0 +        OD值在0.4與0.99之間 -         最小信號；OD值＜0.2 *同型測定並不準確
序列及重組表現選擇1A5.F4、1A5.F6、1H4.F4、6A3.E6、6A3.F8及6C12.F12以在6孔盤中培養且進一步定序且選殖至小鼠IgG2a平台載體中。鑑別四種獨特之生產性HC及LC序列。使用來自所有4次轉染之上清液進行結合及橋接ELISA。1A5及兩種1H4 (HC_VH1及HC_VH4_5_10)轉染均未保留西貝侖利單抗之結合或橋接。保留一些針對6C12之活性。因此，使用蛋白A管柱純化6C12且再測試活性。與6C12融合瘤上清液相比，重組純化6C12具有較低之橋接活性及略微較低之結合活性 - 其對於最終抗獨特型抗體而言並不理想。用最終候選物1H4重新審視以重組方式產生抗獨特型之成果。
基於所建立之實驗組中之活性，選擇三種次殖株1A5.F4、1H4.F4及6A3.E6來進行融合瘤之大規模產生及純化，隨後進行驗證。
在 CeLLine 生物反應器燒瓶中按比例擴增融合瘤1A5.F4、1H4.F4及6A3.E6係在低IgG培養基中按比例擴增至5個T-150燒瓶中。一旦匯合，則各次殖株使用一個T-150燒瓶接種CeLLine 1000生物反應器燒瓶，且在37℃及5% CO 2下培育7天後收穫1次。將其他4個T-150燒瓶在37℃及5% CO 2下培育7天、合併、收穫且在1 mL蛋白G管柱上純化，在1X PBS中滲析，無菌過濾並定量。在 圖 2A 至圖 2C中，藉由結合ELISA ( 圖 2A)、橋接ELISA ( 圖 2B)及特異性ELISA ( 圖 2C)、針對2419表徵小規模純化批次的1A4、1H4及6A3，隨後選擇抗ID自其各別CeLLine 1000生物反應器燒瓶中純化。在CeLLine 1000生物反應器燒瓶中培育/產生期間，小比例純化表徵之此平行工作流程允許更快地大規模產生所選擇之抗ID，因為生物反應器燒瓶中之生產可能佔用4週。
圖 2A 至圖 2C中之結合資料表明所有三種抗ID候選物類似地結合西貝侖利單抗。1H4似乎為最強之『橋接子』，且僅1H4及6A3結合至2419；2419具有與西貝侖利單抗相同之CDR區。在 圖 3A 至圖 3C中，亦在1%人類血清存在下(在分析法中)進行橋接ELISA以確保無交叉反應性。另外，針對1A5、1H4及6A3操作SDS PAGER以確認重鏈及輕鏈中無混合物。使還原性及非還原性樣品在4%至12% Bis-Tris凝膠上跑膠，且用Simple Blue染色劑使各帶可視化。1A5之概況(還原性)與1H4及6A3之概況略微不同。
用於 GXP 分析法之產生基於表徵資料，選擇1H4作為欲產生的抗ID mAb用於GXP分析法。在1 mL蛋白G管柱上純化CeLLine 1000生物反應器燒瓶中產生之IgG1融合瘤。如下證明融合瘤產生之三批1H4適合於GXP分析法：進行1次及3次冷凍/解凍且藉由結合ELISA ( 圖 4A 至圖 4C)、橋接ELISA (在1%及20%人類血清存在下進行以確保無交叉反應性) ( 圖 5A 至圖 5C)、還原性及非還原性SDS-PAGE (4%至12% Bis-Tris凝膠且用Simple Blue染色劑可視化)以及mAb分型ELISA進行評估以確認IgG1 κ同型。
確定此等1H4批次在結合/橋接ELISA中表現類似。在存在1%及20%人類血清以及一次及三次冷凍/解凍之情況下，1H4對SDS-PAGE還原性及非還原性概況以及對結合/橋接ELISA之效能無影響。
使用結合及橋接ELISA方法及SDS-PAGE (還原性及非還原性，4%至12% Bis-Tris凝膠且用Simple Blue染色劑可視化)類似地表徵融合瘤產生之額外批次之1H4，且與先前批次進行比較。額外批次之1H4展現類似於先前批次之結合及橋接活性。另外，SDS-PAGE還原性及非還原性概況類似。
1H4 之序列及重組表現1H4係用於ADA分析法開發。1H4.F4抗獨特型之序列經鑑別用於expi293細胞中之重組表現。
為了比較1H4在IgG1對比IgG2主鏈中之活性，對兩者進行研究。將1H4_VH序列及IgG1恆定區選殖至載體中。亦將1H4_Vk序列選殖至載體中。將核苷酸序列人源化及密碼子最佳化。對群落進行定序且使用標準實驗室方法對質體進行大提(maxiprepped)。用1H4 (IgG1)及1H4 (IgG2)配置兩次200 mL expi293轉染。在1 mL蛋白G管柱上純化IgG1，且在1 mL蛋白A管柱上純化IgG2。值得注意的是，IgG1重組物的表現量低於IgG2重組物。
將融合瘤產生之1H4與在 圖 6A 至圖 6B中以重組方式產生及純化之1H4 (IgG1主鏈及IgG2主鏈)進行比較。三個批次在結合ELISA中看起來類似，然而橋接結果表明1H4融合瘤為最佳之『橋接子』，其中重組物批次之間具有一些可變性。另外，將融合瘤產生之1H4與在SDS-PAGE (4%至12% Bis-Tris凝膠且用Simple Blue染色劑可視化)中以重組方式產生及純化之1H4 (IgG1主鏈及IgG2主鏈)進行比較。融合瘤產生之1H4及以重組方式產生之1H4具有類似之還原性及非還原性SDS-PAGE概況。
結合「游離」相對於「總」西貝侖利單抗為了進一步表徵西貝侖利單抗抗獨特型抗體1H4，評估1H4之結合特異性，無論其識別「游離藥物」(亦即未與APRIL結合之西貝侖利單抗)或「總藥物」(亦即與或未與APRIL結合之西貝侖利單抗)。將12 ng/mL之西貝侖利單抗及所滴定之1H4在4℃下預培育隔夜且添加至預塗佈APRIL之盤(0.5 µg/mL)中。類似地，將12 ng/mL之西貝侖利單抗及所滴定之APRIL在4℃下預培育隔夜且添加至預塗佈1H4之盤(1.0 µg/mL)中。在 圖 7中，發現1H4具中和性(亦即阻斷西貝侖利單抗與APRIL之結合)，且僅識別「游離藥物」而非「總藥物」(亦即在與APRIL結合之情況下的西貝侖利單抗)。
概述產生識別西貝侖利單抗之抗獨特型(抗ID)單株抗體。表徵1A5、1H4及6A3，且確定1H4適用於臨床前及臨床抗體藥物開發分析法。在CeLLine 1000生物反應器燒瓶中使用融合瘤細胞株進行1H4之生產。稍後對1H4進行定序且以重組方式表現，且產生於IgG1與IgG2 VH主鏈兩者中並在一組抗ID表徵分析中評估。
以引用方式之併入本文中提及之所有公開案、專利及登錄號均以全文引用之方式併入本文中，如同各個別公開案或專利特別且個別地指示以引用之方式併入一般。
等效物雖然已論述本發明之特定實施例，但以上說明書具說明性而非限制性。在審閱本說明書及以下申請專利範圍時，本發明之多種變化形式對於熟習此項技術者而言將變得顯而易見。本發明之完整範疇以及其等效物之完整範疇，及說明書，以及此類變化形式，應參照申請專利範圍確定。
本專利或申請案文件含有至少一張彩製圖。在要求及支付必要費用後，專利局將提供具有彩圖之本專利或專利申請公開案複本。 圖 1A 至圖 1B描繪結合( 圖 1A)及橋接( 圖 1B) ELISA表徵。 圖 2A 至圖 2C描繪抗ID候選物之表徵(小規模純化)。展示西貝侖利單抗抗ID結合ELISA ( 圖 2A)、西貝侖利單抗抗ID橋接ELISA ( 圖 2B)及2419嵌合IgG1結合ELISA ( 圖 2C)之結果。 圖 3A 至圖 3C描繪在存在1%人類血清之情況下橋接ELISA之結果(小規模純化)。測試次殖株1A5 ( 圖 3A)、1H4 ( 圖 3B)及6A3 ( 圖 3C)。 圖 4A 至圖 4C描繪藉由結合ELISA對1H4進行之表徵(冷凍/解凍穩定性)。展示1H4結合ELISA批次對比( 圖 4A)、1H4批次#2穩定性結合ELISA ( 圖 4B)及1H4批次#3穩定性結合ELISA ( 圖 4C)之結果。 圖 5A 至圖 5C描繪藉由橋接ELISA對1H4進行的表徵(冷凍/解凍穩定性及在存在1%及20%人類血清之情況下)。展示1H4橋接ELISA批次對比( 圖 5A)、1H4批次#2穩定性橋接ELISA ( 圖 5B)及1H4批次#3穩定性橋接ELISA ( 圖 5C)之結果。 圖 6A 至圖 6B描繪融合瘤1H4相對於重組1H4結合( 圖 6A)及橋接( 圖 6B)結果。 圖 7描繪西貝侖利單抗抗獨特型(1H4)特異性ELISA之結果。
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Claims (61)

  1. 一種能夠結合至抗APRIL抗體之抗體分子，其包含： (a) 包含以下1、2或3者的重鏈可變區(VH)： (i)  HCDR1，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸不同之胺基酸序列， (ii)  HCDR2，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸不同之胺基酸序列，及/或 (iii)  HCDR3，其包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸不同之胺基酸序列；及/或 (b) 包含以下1、2或3者的輕鏈可變區(VL)： (iv)  LCDR1，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸不同之胺基酸序列， (v)  LCDR2，包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸不同之胺基酸序列，及/或 (vi)  LCDR3，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列或與其具有不超過1、2或3個胺基酸不同之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體分子，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之抗體分子，其中該VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其不同不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體分子，其中該VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體分子，其中該VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其不同不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體分子，其中該VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體分子，其包含抗原結合片段。
  8. 如請求項7之抗體分子，其中該抗原結合片段包含Fab、F(ab')2、Fv、scFv或sc(Fv)2。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體分子，其包含重鏈恆定區。
  10. 如請求項9之抗體分子，其中該重鏈恆定區包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之重鏈恆定區。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體分子，其包含輕鏈恆定區。
  12. 如請求項11之抗體分子，其中該輕鏈恆定區包含κ或λ輕鏈之輕鏈恆定區。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗體分子，其包含Fc區。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗體分子，其包含含有SEQ ID NO: 3之胺基酸18至458或SEQ ID NO: 4之胺基酸18至464的重鏈。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體分子，其包含含有SEQ ID NO: 5之胺基酸18至235的輕鏈。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗體分子，其包含： (a) 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸18至458的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸18至235的輕鏈；或 (b) 包含SEQ ID NO: 4之胺基酸18至464的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸18至235的輕鏈。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗體分子，其包含含有SEQ ID NO: 3或4之胺基酸序列的重鏈。
  18. 如請求項1至17中任一項之抗體分子，其包含含有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的輕鏈。
  19. 如請求項1至18中任一項之抗體分子，其包含： (a) 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的輕鏈；或 (b) 包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的輕鏈。
  20. 如請求項1至19中任一項之抗體分子，其為mAb 1H4。
  21. 如請求項1至20中任一項之抗體分子，其為小鼠抗體分子。
  22. 如請求項1至21中任一項之抗體分子，其為經分離之抗體分子。
  23. 如請求項1至22中任一項之抗體分子，其為單株抗體分子。
  24. 如請求項1至23中任一項之抗體分子，其為抗獨特型抗體分子。
  25. 如請求項1至24中任一項之抗體分子，其結合至該抗APRIL抗體之VH、VL或兩者。
  26. 如請求項1至25中任一項之抗體分子，其結合至該抗APRIL抗體之一或多個(例如2、3、4、5或6個) CDR。
  27. 如請求項1至26中任一項之抗體分子，其不結合或實質上不結合至該抗APRIL抗體之Fc區。
  28. 如請求項1至27中任一項之抗體分子，其結合至該抗APRIL抗體係以低於500 ng/mL，例如低於400 ng/mL、300 ng/mL、200 ng/mL、150 ng/mL、120 ng/mL、100 ng/mL、90 ng/mL、80 ng/mL、70 ng/mL、60 ng/mL、50 ng/mL、40 ng/mL、35 ng/mL、30 ng/mL、25 ng/mL、20 ng/mL、15 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL或0.1 ng/mL，例如1 ng/mL至150 ng/mL、2 ng/mL至100 ng/mL、5 ng/mL至50 ng/mL或10 ng/mL至25 ng/mL之EC50，例如藉由ELISA所測定。
  29. 如請求項1至28中任一項之抗體分子，其降低(例如中和、抑制或阻斷)該抗APRIL抗體與APRIL之結合。
  30. 如請求項1至29中任一項之抗體分子，其結合至未與APRIL結合之抗APRIL抗體。
  31. 如請求項1至30中任一項之抗體分子，其不結合或實質上不結合至與APRIL結合之抗APRIL抗體。
  32. 如請求項1至30中任一項之抗體分子，其結合至未與APRIL結合之抗APRIL抗體，且不結合或實質上不結合至與APRIL結合之抗APRIL抗體。
  33. 如請求項1至32中任一項之抗體分子，其結合至未與APRIL結合之抗APRIL抗體，且不結合或實質上不結合至與APRIL結合之抗APRIL抗體。
  34. 如請求項1至33中任一項之抗體分子，其橋接兩種抗APRIL抗體，例如同時結合至兩種抗APRIL抗體，例如藉由橋接ELISA分析法所測定。
  35. 如請求項1至34中任一項之抗體分子，其與該抗APRIL抗體競爭結合至APRIL。
  36. 如請求項1至35中任一項之抗體分子，其中該抗APRIL抗體結合至人類APRIL。
  37. 如請求項1至36中任一項之抗體分子，其中該抗APRIL抗體為西貝侖利單抗(sibeprenlimab)。
  38. 一種抗體分子，其與如請求項1至37中任一項之抗體分子競爭結合至抗APRIL抗體。
  39. 一種抗體分子，其結合至與如請求項1至37中任一項之抗體分子所識別之抗原決定基相同或重疊之抗原決定基。
  40. 一種偵測抗APRIL抗體之方法，其包含： (a) 使如請求項1至39中任一項之抗體分子與樣品接觸；及 (b) 測定該抗體分子與該樣品之間(例如該抗體分子與該樣品中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成， 由此偵測該抗APRIL抗體。
  41. 一種評估樣品之方法，其包含： (a) 使如請求項1至39中任一項之抗體分子與該樣品接觸；及 (b) 測定該抗體分子與該樣品之間(例如該抗體分子與該樣品中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成， 由此評估該樣品。
  42. 如請求項40或41之方法，其進一步包含： (c) 使該抗體分子與參考樣品接觸；及 (d) 測定該抗體分子與該參考樣品之間(例如該抗體分子與該參考樣品中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成。
  43. 如請求項40至42中任一項之方法，其進一步包含在該抗體分子與樣品或參考樣品接觸之前提供該樣品或參考樣品。
  44. 如請求項40至43中任一項之方法，其為ELISA分析法。
  45. 如請求項40至44中任一項之方法，其為抗藥物分析法、毒理學分析法或GxP分析法。
  46. 一種偵測抗APRIL抗體之方法，其包含： (a) 向個體投與如請求項1至39中任一項之抗體分子；及 (b) 測定該抗體分子與該個體之間(例如該抗體分子與該個體中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成， 由此偵測該抗APRIL抗體。
  47. 一種評估個體之方法，其包含： (a) 向該個體投與如請求項1至39中任一項之抗體分子；及 (b) 測定該抗體分子與該個體之間(例如該抗體分子與該個體中之抗APRIL抗體之間)的複合體形成， 由此評估該個體。
  48. 一種組合物(例如醫藥組合物)，其包含如請求項1至39中任一項之抗體分子，視情況其中該組合物包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。
  49. 一種核酸(例如經分離之核酸)，其編碼如請求項1至39中任一項之抗體分子的VH、VL或兩者。
  50. 如請求項49之核酸，其包含SEQ ID NO: 8之核苷酸52至1374，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其不同不超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸之核苷酸序列。
  51. 如請求項49或50之核酸，其包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。
  52. 如請求項49之核酸，其包含SEQ ID NO: 9之核苷酸52至1392，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其不同不超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸之核苷酸序列。
  53. 如請求項49或52之核酸，其包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列。
  54. 如請求項49至53中任一項之核酸，其包含SEQ ID NO: 10之核苷酸52至705，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與其不同不超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸之核苷酸序列。
  55. 如請求項49至54中任一項之核酸，其包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
  56. 一種載體(例如表現載體)，其包含如請求項49至55中任一項之核酸。
  57. 如請求項56之載體，其中該載體包含啟動子可操作地連接至該核酸。
  58. 一種細胞(例如宿主細胞)，其包含如請求項49至55中任一項之核酸或如請求項56或57之載體。
  59. 一種產生抗體分子之方法，其包含如請求項58之細胞在適用於基因表現之條件下培養。
  60. 如請求項59之方法，其進一步包含分離或純化該抗體分子。
  61. 如請求項59或60之方法，其中該抗體分子係以0.2 mg/mL至5 mg/mL，例如0.5 mg/mL至1.5 mg/mL之濃度產生。
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