EA040821B1

EA040821B1 - Антитела, которые специфически связываются с ил-15, и их применение

Info

Publication number: EA040821B1
Application number: EA201991514
Authority: EA
Inventors: Девид Хосе Саймон Лейн; Мэтью Поллард; Энтони Джерард Дойль; Пултон; Дороти Линн; Адам Уильям Кларк
Original assignee: Сефалон, Инк.
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2022-08-01

Description

Ссылка на список последовательностей

Эта заявка включает в себя список последовательностей, озаглавленный 2873.273PC01_SequenceListing_ST25.text, сгенерированный 18 декабря 2017 г., размером 215523 байта. Указанный список последовательностей включен в качестве ссылки.

Область техники

Описание в целом относится к области получения рекомбинантных антител. Более конкретно, описание относится к рекомбинантным антителам, которые специфически связываются с ИЛ-15 человека, независимо от того, находится ли он вне комплекса или в комплексе с рецептором-альфа ИЛ-15.

Уровень техники

Различные ссылки, включая патенты, опубликованные патентные заявки, технические статьи, порядковые номера доступа и другие ссылки, цитируются в данном описании. Каждая такая ссылка включена в данный документ в качестве ссылки во всей полноте для всех целей.

Цитокин интерлейкин 15 (ИЛ-15) является членом суперсемейства ИЛ-2, которое секретируется большим количеством типов клеток и тканей, включая моноциты, макрофаги, дендритные клетки (ДК), кератиноциты, фибробласты и нервные клетки. ИЛ-15 связывается и передает сигналы через комплекс, состоящий из бета-цепи рецептора ИЛ-2 (CD122) и общей гамма-цепи (гамма-C, CD132). In vitro ИЛ-15 разделяет несколько биологических активностей с ИЛ-2. In vivo специфичность в отношении ИЛ-15 по сравнению с ИЛ-2 обеспечивается уникальным индивидуальным рецептором α-цепи (ИЛ-15Pα), который завершает комплекс ИЛ-15Pα/ИЛ-2Pβγ гетеротримерных рецепторов с высокой аффинностью.

ИЛ-15 был выделен из синовиальной ткани у пациентов с ревматоидным артритом и, как сообщается, он индуцирует воспалительные цитокины и хемокины, такие как фактор некроза опухоли-α, ИЛ-10 (Waldman TA (2004) Arthritis Res. Ther. 6:174-177). Блокада активности ИЛ-15 на мышиной модели ксенотрансплантата псориаза человека привела к нормализации псориаза (Villadsen LS et al. (2003) J. Clin. Invest. 112:1571-80). Сообщалось о повышенных уровнях комплекса ИЛ-15 у пациентов с T-клеточным лейкозом из больших гранулярных лимфоцитов, γΔ/Δ T-клеточной лимфомой (Chen J et al. (2012) Blood. 119:137-143).

Используя мышей с дефицитом ИЛ-15, исследователи также показали, что ингибирование сигнального пути ИЛ-15 может обеспечить профилактическое или терапевтическое преимущество при некоторых иммуноопосредованных состояниях, таких как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE; модель рассеянного склероза), колит, воспалительные заболевания кишечника, псориаз и артрит.

В мышиной модели сверхэкспрессия ИЛ-15 в клетках кишечного эпителия запускает чревноподобную энтеропатию. У людей повышенная экспрессия ИЛ-15 является признаком целиакии. ИЛ-15 сверхэкспрессируется как в собственном слое слизистой оболочки, так и в кишечном эпителии пациентов с активной нелеченной целиакией по сравнению со здоровыми контрольными пациентами и пациентами с глютеновой диетой, получавших лечение целиакии, а уровни ИЛ-15 в кишечнике коррелируют со степенью повреждения слизистой оболочки (Abadie V и др. (2014) Immunol. Rev. 260:221-234).

DISC0280 является сильным анти-ИЛ-15-антителом с противоположными механизмами действия in vitro и in vivo. (Finch DK et al. (2011) Br. J. Pharmacol. 162:480-490). К сожалению, было обнаружено, что DISC0280 связывается с сайтом связывания рецептора α ИЛ-15 на ИЛ-15, что обеспечивает транспрезентацию ИЛ-15 с помощью DISC0280 in vivo, подобно транс-презентации растворимого рецептора α ИЛ-15. Таким образом, DISC0280 действует как агонист ИЛ-15 in vivo.

Было описано, что два анти-ИЛ-15 антитела способны нейтрализовать активность ИЛ-15 без конкуренции со связыванием ИЛ-15 с ИЛ-15Pα. Полностью человеческое моноклональное анти-ИЛ-15антитело, AMG 714 (Amgen), показало улучшение активности болезни в исследовании по повышению дозы I-II фазы у пациентов с активным ревматоидным артритом (Baslund B et al. (2005) Arthritis Rheum. 52:2686-2692). Также было описано, что гуманизированное антитело, названное huB-E29, блокирует активность ИЛ-15 in vitro и in vivo на мышиной модели без конкуренции со связыванием ИЛ-15 с ИЛ-15Pα (WO 16/001275).

Клинические испытания, посвященные изучению новых методов лечения целиакии, имеют в качестве измеряемых параметров: a) ослабление вызванного глютеном повреждения слизистой оболочки тонкого кишечника, измеряемого соотношением V/C. V/C - это морфометрическое измерение длины ворсинок тонкого кишечника относительно глубины крипт, взятых из образца кишечной биопсии. (b) Ослабление индуцированного глютеном воспаления слизистой оболочки тонкого кишечника, измеряемое путем подсчета интраэпителиальных лимфоцитов (IEL) в гистологических срезах, (c) ослабление индуцированных глютеном сывороточных антител, таких как антиглиадиновые антитела и аутоантитела против трансглутаминазы. В данное время не показано, что какое-либо терапевтическое средство является эффективным в лечении целиакии, измеряемым вышеупомянутыми измеряемыми параметрами. В этом описании представлены антитела, которые ослабляют индуцированное глютеном повреждение слизистой оболочки тонкого кишечника (улучшенное отношение V/C), ослабляют индуцированное глютеном воспаление слизистой оболочки тонкого кишечника (пониженное количество IEL) и ослабляют индуцированные глютеном сывороточные антитела (уменьшенные анти-глиадиновые антитела), как изме

- 1 040821 рено в модели макаки-резуса при целиакии. Антитела данного описания обеспечивают новое лечение для пациентов с целиакией и другими воспалительными заболеваниями, в которые вовлечен ИЛ-15.

Краткое описание сущности изобретения

В первом аспекте описание относится к антителам, содержащим вариабельную тяжелую цепь и вариабельную легкую цепь, причем эти антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим остаток Gln 108 ИЛ-15 человека (например, где ИЛ-15 образует комплекс с ИЛ-15Ра). В некоторых вариантах осуществления изобретения ИЛ-15 человека содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 511. В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп может дополнительно содержать остатки Ser 7 и Asn 112 ИЛ-15 человека (например, где ИЛ-15 образует комплекс с ИЛ-15Ра). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело предпочтительно имеет сродство к эпитопу, содержащему KD, менее чем около 1,8x10’9 М, как определено поверхностным плазмонным резонансом. В некоторых вариантах осуществления изобретения KD может составлять менее чем около 1,0x10’9 М. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело предпочтительно имеет сродство к эпитопу, содержащему KD менее чем около 2x10’¹⁰ М, как определено поверхностным плазмонным резонансом. В некоторых вариантах осуществления изобретения KD может составлять от около 1,6x10’10 М до около 1,8x10’10 М, как определено поверхностным плазмонным резонансом. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут ингибировать пролиферацию клеток натуральных киллеров (НК), например клеток НК-92, при IC₅₀ менее чем около 900 пМ в анализе пролиферации НК-клеток, включая от около 0,1 до около 900 пМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут ингибировать пролиферацию НК-клеток при IC₅₀ от около 1 до около 60 пМ в анализе пролиферации НКклеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут ингибировать пролиферацию НК-клеток при IC₅₀ от около 5 до около 35 пМ в анализе пролиферации НК-клеток. Антитела могут ингибировать пролиферацию НК-клеток при IC₅₀ от около 5 до около 25 пМ в анализе пролиферации НКклеток. Антитела могут быть способны нейтрализовать ИЛ-15. Антитела могут быть способны уменьшать циркулирующие НК-клетки.

В другом аспекте данное изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с ИЛ-15 человека и которые содержат HCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29. ИЛ-15 человека может быть комплексирован с рецептором альфа ИЛ-15. Антитела являются антагонистами ИЛ-15. Полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, также предоставлены.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17, 20, 25, 28 и 29 соответственно) могут содержать HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 25, 28 и 29 соответственно) могут содержать LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и/или могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 25, 28 и 29 соответственно) могут содержать FR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13. Полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, также предоставлены.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 25, 28 и 29 соответственно) могут содержать LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 25 или 26, 28 и 29 или 31 соответственно) могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455, и/или могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 456. Полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, также предоставлены.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие

- 2 040821

HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 25, 28 и 29 соответственно) могут содержать LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 27, 28 и 30 соответственно) могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457, и/или могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 458. Полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, также предоставлены.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 25, 28 и 29 соответственно) могут содержать LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, где Xaa5 SEQ ID NO: 29 является Phe (например, SEQ ID NO: 519). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 27, 28 и 519 соответственно) могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 459, и/или могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 460. Полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, также предоставлены.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 25, 28 и 29 соответственно, и, необязательно, HFR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13), могут содержать LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления изобретения (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 26, 28 и 30 соответственно) антитела могут содержать HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и FR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 26, 28 и 30 соответственно, и, необязательно, HFR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13) могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, 20, 26, 28 и 30 соответственно, и, необязательно, HFR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13, или антитела, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4) могут содержать вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и/или могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, также предоставлены.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17, 20, 25, 28 и 29 соответственно, и, необязательно, HFR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12) могут содержать HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и FR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела (например, антитела, содержащие HCR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 19, 20, 27, 28 и 31, и HFR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14), могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и/или могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. Полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, также предоставлены.

В другом аспекте данное изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с ИЛ-15 человека (например, ИЛ-15 в комплексе с ИЛ-15Ри) и которые содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах

- 3 040821 осуществления изобретения антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 459. Полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, также предоставлены.

В другом аспекте данное изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с ИЛ-15 человека (например, ИЛ-15 в комплексе с ИЛ-15Ри) и которые содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 505; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 507; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 509; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 510; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 505; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 506; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 507; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 509; или вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 510. Полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, также предоставлены.

Консенсусная последовательность для VH антитела представляет собой SEQ ID NO: 1 и охватывает последовательность VH SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 454. Консенсусная последовательность для VL антитела представляет собой SEQ ID NO: 2 и охватывает последовательность VL SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457 и SEQ ID NO: 459. Консенсусная последовательность для Lцепи антитела представляет собой SEQ ID NO: 3 и охватывает последовательность L-цепи SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458 и SEQ ID NO: 460. Консенсусная последовательность для FR3 VH антитела представляет собой SEQ ID NO: 12 и охватывает последовательность FR3 VH SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14. Консенсусная последовательность для CDR1 VH антитела представляет собой SEQ ID NO: 17 и охватывает последовательность VH SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19. Консенсусная последовательность для CDR1 VL антитела представляет собой SEQ ID NO: 25 и охватывает последовательность VH SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27. Консенсусная последовательность для CDR3 VL антитела представляет собой SEQ ID NO: 29 и охватывает последовательность VH SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 519.

- 4 040821

Любое из антител, которые связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Ρα), как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, может содержать константный домен IgG. В некоторых вариантах осуществления изобретения константный домен IgG может содержать константный домен IgG1. В некоторых вариантах осуществления изобретения константный домен IgG1 может содержать SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления изобретения константный домен IgG может содержать константный домен IgG2. В некоторых вариантах осуществления изобретения константный домен IgG2 может содержать SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления изобретения константный домен IgG может содержать константный домен IgG4. В некоторых вариантах осуществления изобретения константный домен IgG4 может содержать SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51.

Любое из антител, которые связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Pa), как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, может быть составлено в виде композиции с носителем или наполнителем. Носитель может содержать фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения целиакии включает введение антитела, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), нуждающемуся в этом субъекту. Введение антитела к ИЛ-15 может восстановить слизистую оболочку тонкого кишечника у субъекта. Введение антитела к ИЛ-15 может увеличить отношение средней высоты ворсинки к глубине крипты (V/C) у субъекта. Введение антитела к ИЛ-15 может увеличить высоту ворсинок тонкого кишечника у субъекта. Введение антитела к ИЛ-15 может уменьшить количество анти-глиадиновых антител у субъекта. Введение антитела к ИЛ-15 может восстановить вызванное глютеном повреждение слизистой оболочки тонкого кишечника у субъекта.

Любое из антител, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Pa), как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, может быть введено как часть схемы лечения субъекту, нуждающемуся в этом. Таким образом, в другом аспекте изобретение описывает способы лечения субъекта, нуждающегося в этом, антителом к ИЛ-15. Субъект предпочтительно является человеком. Антитела можно вводить как часть схемы лечения для лечения любого аутоиммунного или воспалительного заболевания или состояния, при котором нарушается регуляция ИЛ-15, в частности, когда активируется ИЛ-15.

В некоторых подробных вариантах осуществления изобретения способ может быть предназначен для лечения целиакии и включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ восстановления слизистой оболочки тонкого кишечника у субъекта, имеющего чувствительность к глютену, аллергию на глютен, или целиакию, включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ увеличения отношения средней высоты ворсинки к глубине крипты (V/C) у субъекта, имеющего чувствительность к глютену, аллергию на глютен, или целиакию, включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ увеличения высоты ворсинок тонкого кишечника у субъекта, имеющего чувствительность к глютену, аллергию на глютен, или целиакию, включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ уменьшения антиглиадиновых антител у субъекта, нуждающегося в этом, включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ восстановления, индуцированного глютеном повреждения слизистой оболочки кишечника, включает введение субъекту любого антитела, как описано или приве

- 5 040821 дено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект имеет чувствительность к глютену, аллергию на глютен или целиакию. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот способ может быть предназначен для лечения рефрактерной целиакии и включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот способ может быть предназначен для лечения ревматоидного артрита и включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот способ может быть предназначен для лечения псориаза и включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот способ может быть предназначен для лечения воспалительного заболевания кишечника и включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот способ может быть предназначен для лечения диабета типа 1 и включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот способ может быть предназначен для лечения очаговой алопеции и включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот способ может быть предназначен для лечения T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов и включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с рецептором-альфа ИЛ-15), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот способ может быть предназначен для лечения или ингибирования симптомов воздействия глютена, например воздействия глютена у пациента, который имеет чувствительность к глютену или аллергию, и включает введение субъекту любого антитела, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), которое может находиться в композиции, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Один или более симптомов воздействия глютена могут включать одно или более из мышечных болей, боли в теле, боли в суставах, усталости, вздутия живота, газа, тошноты, судороги, запоров, диареи, кожной сыпи, головной боли, головной боли из-за мигрени, депрессии, беспокойства, затуманенного сознания и/или раздражительности. См. Biesiekierski JR (2015) United European Gastroenterol. J. 3:160-165.

Любое из антител, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Pa), как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, может быть использовано при изготовлении лекарственного средства. Любые такие антитела могут быть использованы для лечения любого аутоиммунного или воспалительного заболевания или состояния, при котором нарушается регуляция ИЛ-15. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут быть использованы для лечения целиакии или в производстве лекарственного средства для лечения целиакии. Антитела могут быть использованы для лечения рефрактерной целиакии или в производстве лекарственного средства для лечения рефрактерной целиакии. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут быть использованы для лечения ревматоидного артрита или в производстве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела можно использовать для лечения псориаза или для произ

- 6 040821 водства лекарственного средства для лечения псориаза. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут быть использованы для лечения воспалительного заболевания кишечника или в производстве лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания кишечника. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут быть использованы для лечения диабета типа 1 или для производства лекарственного средства для лечения диабета типа 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут быть использованы для лечения очаговой алопеции или для производства лекарственного средства для лечения очаговой алопеции. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела можно использовать для лечения T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов или в производстве лекарственного средства для лечения T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов.

Любое из антител, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Pa), как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, может быть использовано в способе in vitro для обнаружения ИЛ-15 (необязательно, в комплексе с ИЛ-15Ри) в образце ткани, выделенном у субъекта, причем способ включает приведение в контакт антитела с образцом ткани, выделенным у субъекта, с образованием комплекса антителоИЛ-15 (необязательно, в дальнейшем, в комплексе с рецептором-альфа ИЛ-15), и обнаружение комплекса в образце ткани. Любое из антител, которое связывается с ИЛ-15, как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов, может быть использовано в способе in vitro для обнаружения комплекса ИЛ-15 с рецептором-альфа ИЛ-15 в образце ткани, выделенном у субъекта, включающем приведение в контакт антитела с образцом ткани, выделенным у субъекта, с образованием комплекса антитело-антиген антитела с ИЛ-15 и комплексом рецептора α ИЛ-15, и обнаружение комплекса антитело-антиген в образце ткани.

В другом аспекте описание дополнительно относится к трансформированным клеткам, которые экспрессируют любое из антител, которые связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, трансформированная клетка может представлять собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка млекопитающего может представлять собой клетку яичника китайского хомяка.

В другом аспекте описание дополнительно относится к полинуклеотидам, которые кодируют любое из антител, которые связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая антитела любого из предыдущих пунктов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи антитела, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 517. В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий вариабельный участок легкой цепи антитела, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 518. Также предусмотрены векторы, содержащие эти полинуклеотиды. Также предусмотрены клетки, содержащие эти полинуклеотиды или векторы. Клетки, содержащие полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует вариабельную тяжелую цепь антитела, которое связывается с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), как описано или приведено в качестве примера в данном документе, включая клетки любого из предыдущих пунктов, и нуклеиновая кислота, которая кодирует вариабельную легкую цепь антитела, также предоставлена. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную тяжелую цепь, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную легкую цепь, могут находиться в одном и том же векторе или в разных векторах.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 продемонстрировано связывание анти-ИЛ-15-антител с комплексом ИЛ-15 человека с рецептором альфа ИЛ-15, или без образования комплекса ИЛ-15Ри. Связывание репрезентативных надосадков гибридомы с некомплексированным рекомбинантным ИЛ-15Ри человека или комплексом рекомбинантного ИЛ-15 с рецептором-альфа ИЛ-15 определяли клеточным ИФА (кИФА) и ИФА. Результаты выражены в относительных единицах флуоресценции.

На фиг. 2A и фиг. 2B продемонстрировано ингибирование в зависимости от дозы реакции ИЛ-15опосредованной пролиферации CTLL-2 анти-ИЛ-15 антителами. На фиг. 2A продемонстрировано ингибирование ИЛ-15-опосредованной пролиферации CTLL-2 репрезентативными анти-ИЛ-15 антителами, разведенными в 2000, 200 и 20 пМ, а на фиг. 2B продемонстрировано ингибирование в ответ на полную дозу в течение 72 ч. Результаты выражены в относительных единицах свечения.

На фиг. 3 продемонстрировано ингибирование ИЛ-15-опосредованной пролиферации НК-92 типичными анти-ИЛ-15-антителами, AMG714 или контролем изотипа (анти-KLH C3 IgG1). Показания снимались через 72 ч и выражались в относительных единицах люминесценции. Результаты выражены как среднее значение ± ошибка 3 повторов.

На фиг. 4-33 продемонстрированы профили BIACORE® для вариантов анти-ИЛ-15, детализирующие уровни захвата антител, измерения сродства в одной точке и изменения последовательности относительно родительского антитела, антитела 4.

- 7 040821

На фиг. 34A, 34B и 34C продемонстрированы варианты анти-ИЛ-15 антител, детализирующие их аминокислотные замены тяжелой и легкой цепей относительно исходного антитела, антитела 4.

На фиг. 35 продемонстрированы варианты антитела 4 с улучшенным ингибированием ИЛ-15опосредованной пролиферации НК-92 относительно родительского антитела, антитела 4 и других антиИЛ-15 антител. Показания были взяты через 72 ч и выражены в относительных единицах свечения.

На фиг. 36 продемонстрирована кинетика связывания вариантов антитела 4 и связывания AMG714 с ИЛ-15 в комплексе с рецептором-альфа ИЛ-15. Кинетику связывания определяли с использованием поверхностного плазмонного резонанса на системе Biacore T200 (GE Healthcare). Варианты антител 4 связывали комплекс ИЛ-15 с более высокой аффинностью, чем AMG714.

На фиг. 37 продемонстрировано сравнение анти-ИЛ-15 антител в анализе на основе клеток НК-92. Ингибирование 25 пМ пролиферации НК-92, опосредованной комплексом ИЛ-15, анти-ИЛ-15 антителами в течение 48 ч выражается в единицах относительной люминесценции. Варианты антитела 70 имеют сходную эффективность друг с другом и имеют более низкое значение IC-50, чем AMG-714.

На фиг. 38 продемонстрировано, что экспонированные на поверхности остатки ИЛ-15 были преобразованы в аланин с помощью сайт-направленного мутагенеза и коэкспрессированы с ИЛ-15Ри человека в F-клетках EXPI293®. Связывание анти-ИЛ-15 антител с очищенными вариантами ИЛ-15 оценивали с использованием поверхностного плазмонного резонанса на системе BICAORE® T200 (GE Healthcare). AMG714 значительно уменьшил или не связался с E98A, Q101A, H105A или Q108A, что характеризуется быстрой диссоциацией или более высокой скоростью диссоциации. Антитело 70a имело низкое связывание с Q108A, что характеризовалось сниженной скоростью ассоциации и быстрой диссоциацией.

На фиг. 39A и 39B продемонстрированы кристаллические структуры комплекса антитела 70a.FAb/ИЛ-15 и четвертичного рецепторного комплекса ИЛ-15. Фиг. 39A- изображение, представляющее вариабельный участок антитела 70a.FAb, связывающего ИЛ-15 человека, вид спереди и сбоку. Фиг. 39B - четвертичная структура функционального комплекса ИЛ-15. Изображение, представляющее ИЛ-15 человека, связанного с ИЛ-15Ри, ИЛ-2Pβ и ИЛ-2Ру (код pdb, 4GS7). Антитело 70a.FAb нарушает связывание ИЛ-15 с ИЛ-2Pβ и ИЛ-2Ру. Антитело 70a FAb связывается с ИЛ-15 дистальнее ИЛ-15Ри и способно связывать комплекс ИЛ-15/ИЛ-15Ри.

На фиг. 39C, 39D и 39E продемонстрированы ключевые остатки связывания ИЛ-15, взаимодействующие с антителом 70a, ИЛ-2Ру и ИЛ-2Pβ. Только остатки ИЛ-15, которые связываются с соответствующими белками-партнерами посредством водородных связей, изображены и пронумерованы. (Фиг. 39C) Остатки, используемые ИЛ-15 для взаимодействия с антителом 70a Fab. (Фиг. 39D) Выбранные остатки ИЛ-15, которые опосредуют водородную связь с ИЛ-2Ру, включая Q108, N112. (Фиг. 39E) Остаток ИЛ-15, S7, образует водородную связь с ИЛ-2Pβ.

На фиг. 39F, 39G и 39H продемонстрирована кристаллическая структура ИЛ-15 человека с антителом 70a. (Фиг. 39F) Изображение, представляющее связывание антитела FAb с ИЛ-15 человека. (Фиг. 39G) Тройной мотив тирозина, содержащий Y52/54/56 в CDRH2, является ключевой детерминантой связывания антитела с ИЛ-15 человека. (Фиг. 39H) Крупный план мотива YYY из антитела 70a, опосредующего взаимодействия с ИЛ-15 человека. Этот мотив скрывает и защищает гидрофобные остатки вокруг спирали 4 ИЛ-15, предотвращая сольватацию. Боковые цепи из ИЛ-15 и CDRH2 остатков, участвующих в этом взаимодействии, указаны белыми и черными палочками соответственно.

На фиг. 40 продемонстрировано связывание вариантов антитела 70 с ИЛ-15 человека. Внеклеточное и внутриклеточное связывание ИЛ-15 с анти-ИЛ-15 мАт оценивали на подгруппах человеческих моноцитов: классических, промежуточных и неклассических моноцитах. Изотипический контроль анти-KLH C3 IgG1 был включен в анализ (заполнено). Показаны данные представителя донора A.

На фиг. 41 продемонстрировано ингибирование активности ИЛ-15 у мышей типичным анти-ИЛ-15 антителом. Представленные результаты представляют собой перечисление циркулирующих НК-клеток в селезенке мышей, которым инъецировали контрольный носитель или комплекс ИЛ-15/ИЛ-15Pα-Fc с последующим примером анти-ИЛ-15 антител или изотипического контроля анти-KLH C3 IgG1. Результаты выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для 8 животных на группу.

На фиг. 42 продемонстрировано ингибирование циркулирующих средних количеств НК-клеток у обезьян Cynomolgus типичными анти-ИЛ-15 антителами. Подсчет циркулирующих средних количеств НК-клеток у обезьян Cynomolgus, которым инъецировали типичные анти-ИЛ-15 антитела, протестированные в дозе 10 мг/кг или 1 мг/кг. Средние количества циркулирующих НК-клеток определяли по экспрессии маркера НК-клеток CD159a (NKG2A) и CD16. Результаты выражены в виде индивидуальных моментов времени для каждой обезьяны, причем сплошная линия указывает средние числа НК-клеток на группу (n=4).

На фиг. 43A, 43B и 43C продемонстрированы различные комбинации HCDR1, HCDR2 и HCDR3.

На фиг. 44A, 44B и 44C продемонстрированы различные комбинации LCDR1, LCDR2 и LCDR2.

На фиг. 45A продемонстрирован дизайн исследования модели целиакии макака-резуса с указанием стадий, измеряемых параметров и лечения анти-ИЛ-15 антителом в двух группах.

На фиг. 45B продемонстрировано ослабление повреждения слизистой оболочки тонкого кишечни

- 8 040821 ка, вызванного глютеном, при лечении анти-ИЛ15, измеренное по соотношению между высотой ворсинок тонкого кишечника и глубиной крипты (V/C). Использовали кишечные биопсии тонкого кишечника, взятые у двух групп макак, в моменты времени, соответствующие 6-месячной диете GD, 35-дневному лечению аИЛ-15 у макак 1-й группы (TD35) и 61-дневному лечению у макак 2-й группы (TD61), чтобы определить отношения V/C.

На фиг. 45C продемонстрировано ослабление вызванного глютеном воспаления слизистой оболочки тонкого кишечника при лечении анти-ИЛ15, измеренное путем подсчета интраэпителиальных лимфоцитов (IEL) в гистологических срезах. Временные точки отражают 6 месяцев диеты GD, 3 месяца диеты GFD, 35 дней после лечения анти-ИЛ15 у макак группы 1 (TD35) и 61 день лечения у макак группы 2 (TD61). Пунктирные синие линии указывают на здоровые контрольные исходные показатели.

На фиг. 45D продемонстрировано ослабление индуцированных глютеном сывороточных антител (анти-глиадиновых антител) при лечении анти-ИЛ15. AGA - анти-глиадиновые антитела; TG2 является анти-трансглутаминазой 2 аутоантителами. Расстояния между временными точками соответствуют двухнедельным интервалам. Отрицательные уровни базовой линии обозначены пунктирными линиями. Начало лечения анти-ИЛ15 указано стрелкой.

Подробное описание сущности изобретения

Различные термины, относящиеся к аспектам описания, используются в описании и формуле изобретения. Такие термины должны иметь свое обычное значение в данной области техники, если не указано иное. Другие специально определенные термины должны толковаться таким образом, чтобы соответствовать определению, приведенному в данном документе.

Используемые в данном документе формы единственного числа включают множественные ссылки, если прямо не указано иное.

Термины субъект и пациент используются взаимозаменяемо и включают любое животное. Млекопитающие являются предпочтительными, включая домашних млекопитающих (например, кошку, собаку), сельскохозяйственных млекопитающих (например, свинью, лошадь, корову), грызунов (например, мышей, кроликов, крыс, морских свинок) и приматов, не являющихся человеком. Люди очень предпочтительны.

Используемый в данном документе термин комплекс ИЛ-15 относится к взаимодействию между ИЛ-15 и рецептором альфа ИЛ-15 (ИЛ-15Ри).

Специфичность в контексте взаимодействий антитело-антиген не обязательно является абсолютным обозначением, но может представлять собой относительный термин, обозначающий степень селективности антитела к антигену. Специфичность антитела к антигену опосредована вариабельными участками антитела и, как правило, определяющими комплементарность участками (CDR) антитела.

Данное изобретение относится к антителам, полученным рекомбинантным путем, которые специфически связываются со свободным (некомплексированным) интерлейкином 15 человека (ИЛ-15), а также с ИЛ-15, который связывается с альфа-рецептором ИЛ-15 (ИЛ-15Ри) - комплекс ИЛ-15. Антитела связываются с их антигеном с высокой аффинностью и значительно уменьшают ИЛ-15-опосредованную пролиферацию иммунных клеток. Антитела антагонизируют ИЛ-15.

В предпочтительных аспектах антитела связываются с эпитопом ИЛ-15 человека (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри), который включает по меньшей мере глутамин в положении 108. Эпитоп может дополнительно включать один или более из серина в положении 7 и аспарагина в положении 112 ИЛ-15 человека (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри).

Эпитоп для данного взаимодействия антитело/антиген может быть установлен с использованием различных экспериментальных способов картирования эпитопов. Экспериментальные способы включают мутагенез (включая аланиновое сканирование), рентгеновскую кристаллографию и различные другие способы, которые хорошо известны в данной области.

Эпитоп для взаимодействия между антигеном и антителом может включать пространственные координаты, определяющие атомные контакты, присутствующие во взаимодействии антиген-антитело. Эпитоп может характеризоваться пространственными координатами, определяющими атомные контакты между антигеном и антителом. Эпитоп может характеризоваться аминокислотными остатками, определенными по специфическому критерию, например, расстоянию между атомами (например, неводородными атомами).

В контексте рентгеновской кристаллической структуры, определяемой пространственными координатами комплекса между антителом, например, фрагментом FAb, и его антигеном, термин эпитоп включает остатки ИЛ-15, характеризующиеся наличием водно-опосредованных водородных связей между атомом пар; водородные связи гетероатомов между 2,5-3,5 :::; или водородная связь, соответствующая донорному/акцепторному атому в ароматическом кольце. Альтернативно, данный аминокислотный остаток ИЛ-15 считается частью эпитопа, если он участвует в гидрофобном взаимодействии или ван-дерваальсовых взаимодействиях между атомами пары.

Эпитоп также может в более общем смысле включать аминокислотные остатки, замена которых другой аминокислотой изменит характеристики взаимодействия между антителом и антигеном (напри

- 9 040821 мер, с использованием сканирования аланином). Эксперименты по мутагенезу с аланиновым сканированием могут проводиться с использованием мутантного ИЛ-15, в котором различные остатки полипептида ИЛ-15 были заменены аланином. Оценивая связывание антитела с мутантным ИЛ-15, можно оценить важность конкретных остатков ИЛ-15 для связывания антитела. Однако, если захоронение неполярной боковой цепи происходит во время связывания антигена и антитела и приводит к упаковке боковой цепи против антигена, то мутация аланина в этом положении может не иметь большого влияния на связывание. Может случиться так, что хотя аланин мутанта приводит к уменьшению связывания антитела, это не означает, что остаток вступает в контакт, скорее, что локальная трехмерная структура ИЛ-15 может быть нарушена введением аланина. Дальнейший структурный анализ комплекса, такой как рентгеновская кристаллография, может потребоваться для оценки остатков контакта между антителом и антигеном.

Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно способны ингибировать, уменьшать или предотвращать пролиферацию иммунных клеток, таких как клетки натуральных киллеров (НК) и CD8+ T-клетки. В некоторых аспектах анти-ИЛ-15 антитела ингибируют пролиферацию при IC₅₀ менее чем около 900 пМ в анализе пролиферации НК. В некоторых аспектах анти-ИЛ-15 антитела ингибируют пролиферацию при IC₅₀ более 0 пМ и менее чем около 900 пМ в анализе пролиферации НК. Анти-ИЛ-15 антитела могут ингибировать пролиферацию при IC₅₀ от около 1 до около 500 пМ в анализе пролиферации НК. Анти-ИЛ15 антитела могут ингибировать пролиферацию при IC₅₀ от около 1 пМ до около 250 пМ в анализе пролиферации НК. Анти-ИЛ-15 антитела могут ингибировать пролиферацию при IC₅₀ от около 1 до около 200 пМ в анализе пролиферации НК. Анти-ИЛ-15 антитела могут ингибировать пролиферацию при IC₅₀от около 1 до около 150 пМ в анализе пролиферации НК. Анти-ИЛ-15 антитела могут ингибировать пролиферацию при IC₅₀ от около 1 до около 100 пМ в анализе пролиферации НК. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно ингибируют пролиферацию при IC₅₀ от около 1 до около 60 пМ в анализе пролиферации НК. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно ингибируют пролиферацию при IC₅₀ от около 5 до около 35 пМ в анализе пролиферации НК. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно ингибируют пролиферацию при IC₅₀ от около 5 до около 30 пМ в анализе пролиферации НК.

В рамках подходящего анализа пролиферации НК клетки, такие как клетки CTLL-2, могут культивироваться и индуцироваться для пролиферации с использованием подходящей концентрации комплекса ИЛ-15 и рецептора альфа ИЛ-15. Таким образом, анализ пролиферации CTLL-2 можно использовать для определения IC₅₀ антител для ингибирования пролиферации. Любое из анти-ИЛ-15 антител, описанных или приведенных в качестве примера в данном документе, добавляют в клеточную культуру, а затем клетки инкубируют в течение подходящего периода времени, включая 48 ч, и оценивают после этого на предмет пролиферации или ингибирования пролиферации вследствие присутствия антител, в том числе путем анализа жизнеспособности клеток.

Как описано или приведено в качестве примера в данном документе, аминокислотные положения, назначенные CDR и FR, могут соответствовать последовательностям белков по Кабат, представляющих иммунологический интерес, Национальным институтам здравоохранения, Bethesda, Md., 1987 и 1991 (также называемым в данном документе системой нумерации по Кабат). Кроме того, аминокислотные положения, назначенные CDR и FR, могут соответствовать расширенной схеме нумерации по Хотиа (www.bioinfo.org.uk/mdex.html).

В соответствии с системой нумерации по Кабат, FR и CDR VH могут быть расположены следующим образом: остатки 1-30 (FR1), 31-35 (CDR1), 36-49 (FR2), 50-65 (CDR2), 66-94 (FR3), 95-102 (CDR3) и 103-113 (FR4), a FR и CDR VL расположены следующим образом: остатки 1-23 (FR1), 24-34 (CDR1), 3549 (FR2), 50-56 (CDR2), 57-88 (FR3), 89-97 (CDR3) и 98-107 (FR4). В некоторых случаях вариабельные участки могут увеличиваться в длине, и в соответствии с системой нумерации по Кабат некоторые аминокислоты могут обозначаться числом, за которым следует буква. Эта спецификация не ограничивается FR и CDR, как определено системой нумерации по Кабат, но включает все системы нумерации, включая каноническую систему нумерации или Хотиа et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-83; и/или Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:927-48; система нумерации Honnegher et al. (2001) J. Mol. Biol., 309:657-70; или система IMGT, обсуждаемая в Giudicelli et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:206-11. В предпочтительных аспектах CDR определяются в соответствии с системой нумерации по Кабат.

В некоторых конкретных аспектах для любого из субдоменов CDR2 тяжелой цепи, описанных в данном документе, в соответствии с системой нумерации по Кабат пять C-концевых аминокислот могут не участвовать непосредственно в связывании антигена, и, соответственно, следует понимать, что любая одна или более из этих пяти C-концевых аминокислот могут быть замещены другой природной аминокислотой без существенного неблагоприятного воздействия на связывание антигена. В некоторых аспектах для любого из субдоменов CDR1 легкой цепи, описанных в данном документе, в соответствии с системой нумерации по Кабат четыре N-концевых аминокислоты могут не участвовать непосредственно в связывании антигена, и, соответственно, следует понимать, что любая одна или более из этих четырех аминокислот могут быть замещены другой природной аминокислотой без существенного неблагоприятного воздействия на связывание антигена. Например, как описано Padlan et al. (1995) FASEB J. 9:133-139, пять C-концевых аминокислот CDR2 тяжелой цепи и/или четыре N-концевых аминокислоты CDR1 лег

- 10 040821 кой цепи могут не участвовать в связывании антигена. В некоторых аспектах как CDR2 тяжелой цепи, так и CDR1 легкой цепи не принимают непосредственного участия в связывании антигена.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри) и содержат CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 и CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и в некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. Антитела могут содержать FR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14. Антитела могут дополнительно содержать вариабельный участок легкой цепи или легкую цепь. Вариабельный участок легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457 или SEQ ID NO: 459. Вариабельный участок легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ iD NO: 507, SEQ ID NO: 509 или SEQ ID NO: 510. Легкая цепь может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458 или SEQ ID NO: 460.

CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 453 или SEQ ID NO: 52 по SEQ ID NO: 135. CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 136 по SEQ ID NO: 226. CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 227 по SEQ ID NO: 272. Подходящие комбинации доменов CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи продемонстрированы на фиг. 43A-43C. Антитела, содержащие такие домены CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, или антитела, содержащие комбинации доменов CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, продемонстрированные на фиг. 43A-43C, могут дополнительно содержать вариабельный участок легкой цепи или легкую цепь. Вариабельный участок легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457 или SEQ ID NO: 459. Вариабельный участок легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509 или SEQ ID NO: 510. Легкая цепь может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458 или SEQ ID NO: 460.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри) и содержат CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, CDR2 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и в некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и в некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. Антитела могут дополнительно содержать вариабельный участок тяжелой цепи. Вариабельный участок тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 454.

CDR1 вариабельного участка легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 273 по SEQ ID NO: 329. CDR2 вариабельного участка легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 330 по SEQ ID NO: 390. CDR3 вариабельного участка легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 391 по SEQ ID NO: 452. Подходящие комбинации доменов CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного участка легкой цепи продемонстрированы на фиг. 44A-44C. Антитела, содержащие такие домены CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельного участка легкой цепи, или антитела, содержащие комбинации доменов CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного участка легкой цепи, продемонстрированные на фиг. 44A-44C, могут дополнительно содержать вариабельный участок тяжелой цепи. Вариабельный участок тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 454.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри) и содержат CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокис

- 11 040821 лотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, CDR2 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29. Антитела могут дополнительно содержать FR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.

В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, CDR2 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. Антитела могут дополнительно содержать FR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри) и содержат CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, CDR2 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. Антитела могут дополнительно содержать FR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри) и содержат CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, CDR2 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. Антитела могут дополнительно содержать FR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри) и содержат CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, CDR2 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. Антитела могут дополнительно содержать FR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри) и содержат CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, CDR2 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. Антитела могут дополнительно содержать FR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри) и содержат CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, со

- 12 040821 держащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, CDR1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, CDR2 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, где Хаа5 SEQ ID NO: 29 представляет собой F (SEQ ID NO: 519). Антитела могут дополнительно содержать FR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ра) и содержат CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельный участок легкой цепи или легкую цепь. Вариабельный участок легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457 или SEQ ID NO: 459. Вариабельный участок легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509 или SEQ ID NO: 510. Легкая цепь может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458 или SEQ ID NO: 460.

Антитела могут специфически связываться с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Ра) и содержать или дополнительно содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий субдомены, содержащие аминокислотную последовательность, показанную в следующей таблице:

	FR1	Hl	FR2	H2	FR3	H3	FR4
SEQ ID NO:	10	16	11	19	14	20	15
SEQ ID NO:	10	16	11	18	14	20	15
SEQ ID NO:	10	16	11	18	13	20	15
SEQ ID NO:	10	16	11	18	13	20	15
SEQ ID NO:	10	16	11	18	13	20	15
SEQ ID NO:	10	16	11	18	13	20	15

Антитела могут специфически связываться с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Рос) и содержать или дополнительно содержать вариабельный участок легкой цепи, содержащий субдомены, содержащие аминокислотную последовательность, показанную в следующей таблице:

	FR1	LI	FR2	L2	FR3	L3	FR4
SEQ ID NO:	21	27	22	28	23	31	24
SEQ ID NO:	21	27	22	28	23	31	24
SEQ ID NO:	21	26	22	28	23	31	24
SEQ ID NO:	21	27	22	28	23	30	24
SEQ ID NO:	21	27	22	28	23	519	24
SEQ ID NO:	21	26	22	28	23	30	24

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ра) и содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454. Антитела могут дополнительно содержать вариабельный участок легкой цепи или легкую цепь. Вариабельный участок легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 457 или SEQ ID NO: 459. Вариабельный участок легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509 или SEQ ID NO: 510. Легкая цепь может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458 или SEQ ID NO: 460.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ра) и содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий

- 13 040821 аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 459. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 505. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 506. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 507. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 509. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 510. Антитела могут дополнительно содержать вариабельный участок тяжелой цепи. Вариабельный участок тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 454.

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри) и содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат легкую цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат легкую цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 456. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 458. В некоторых предпочтительных аспектах антитела содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 460. Антитела могут дополнительно содержать вариабельный участок тяжелой цепи. Вариабельный участок тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 454.

Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 459. Антитела, содержащие такие пары вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи, предпочтительно специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри).

Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 459. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID

- 14 040821

NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 505. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 507. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 509. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 510. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 505. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 506. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 507. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 509. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 510. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Антитела, содержащие такие пары вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи, предпочтительно специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри).

Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 456. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 458. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 460. Антитела, содержащие такие пары вариабельного участка тяжелой цепи и легкой цепи, предпочтительно специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ри).

Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, содержащую аминокислотную по

- 15 040821 следовательность SEQ ID NO: 456. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 458. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 460. Антитела могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. Антитела, содержащие такие пары вариабельного участка тяжелой цепи и легкой цепи, предпочтительно специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Pα).

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15₽а) и содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ

ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ

ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ

ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ

ID NO: 489 или SEQ ID NO: 490, и вариабельный участок легкой цепи или легкую цепь. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Pa) и содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471,

SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO:477,

SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO:483,

SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO:489 или SEQ ID NO: 490, и вариабельный участок легкой цепи или легкую цепь, и вариабельный участок легкой цепи может быть любой из SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498 или SEQ ID NO: 499. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Pa) и содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498 или SEQ ID NO: 499, и вариабельный участок тяжелой цепи. Антитела, содержащие такие пары вариабельного участка тяжелой цепи и легкой цепи, предпочтительно специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Га).

В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Га) и содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 454 и SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи или легкую цепь. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Pα) и содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 454 и SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи или легкую цепь, и вариабельный участок легкой цепи может быть любой из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509 или SEQ ID NO: 510. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Pα) и содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509 или SEQ ID NO: 510 и вариабельный участок тяжелой цепи.

Антитела могут специфически связываться с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Pa) и содержать VH и VL или пару легких цепей, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в следующей таблице: ___________________

	VH	VL	L
SEQ ID NO:	7	8	9
SEQ ID NO:	454	8	9
SEQ ID NO:	4	455	456
SEQ ID NO:	4	457	458
SEQ ID NO:	4	459	460
SEQ ID NO:	4	5	6

Антитела могут специфически связываться с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ15Pa) и содержать VH и VL или пару легких цепей, содержащую аминокислотную последовательность,

- 16 040821 показанную в следующей таблице:

	VH	VL
SEQ ID NO:	4	8
SEQ ID NO:	4	503
SEQ ID NO:	4	505
SEQ ID NO:	4	509
SEQ ID NO:	4	510
SEQ ID NO:	454	455
SEQ ID NO:	454	503
SEQ ID NO:	454	457
SEQ ID NO:	454	505
SEQ ID NO:	454	406
SEQ ID NO:	454	507
SEQ ID NO:	454	5
SEQ ID NO:	454	509
SEQ ID NO:	454	510

Любое из антител, описанных или приведенных в качестве примера в данном документе, связывается с ИЛ-15, которым предпочтительно является ИЛ-15 человека. Антитела могут связываться с некомплексированным ИЛ-15 или ИЛ-15, когда находятся в комплексе с рецептором альфа ИЛ-15 (ИЛ-15Р альфа или ИЛ-15Ра) - комплексом ИЛ-15. В некоторых аспектах ИЛ-15 человека содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 511. В некоторых аспектах, ИЛ-15Р-альфа содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 512, без AVI и His меток. В некоторых аспектах, ИЛ-15Р-альфа содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 520.

Антитела могут иметь сродство к ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ра) с константой диссоциации (KD) менее чем около 1х10^-2 М. В некоторых вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1 х 10^-3 М. В других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1 х 10^-4 М. В некоторых вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1 х 10^-5 М. В еще других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1 х 10^-6 М. В других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1 х 10^-7М. В других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1х 10^-8 М. В других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1х10^-9 М. В других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1 х 10^-10 М. В еще других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1 х 10^-11 М. В некоторых вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1 х10^-12 М. В других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1 х 10^-13 М. В других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1х10^-14 М.

В еще других вариантах осуществления изобретения KD составляет менее чем около 1х10^-15 М. В некоторых аспектах KD составляет менее чем около 1,8х 10^-9 М. В некоторых аспектах KD составляет от около 1,2х10^-10 М до около 2х10^-10 М. В некоторых аспектах KD составляет от около 1,3 х10^-10 М до около 1,9х10^-10 М. В некоторых аспектах KD составляет от около 1,33х10^-10 М до около 1,93х10^-10 М. В некоторых аспектах KD составляет от около 1,6х10^-10 М до около 1,8х 10^-10 М. В некоторых аспектах KD составляет около 1,7х10^-10 М. Значения сродства относятся к значениям, полученным с помощью стандартных методологий, включая поверхностный плазмонный резонанс (SPR), такой как анализы BIACORE® или анализ с использованием OCTET® Red 96 (Forte Bio) системы Dip-and-Read. В предпочтительном варианте осуществления изобретения константа диссоциации определяется с помощью SPR.

В общем анализе BIACORE® SPR антитело иммобилизовано на поверхности сенсорного чипа и подходящие концентрации ИЛ-15 или ИЛ-15 в комплексе с рецептором альфа ИЛ-15 пропускаются через поверхность. Изменения в показателе преломления обнаруживаются, и программное обеспечение используется для генерации сенсограмм для анализа. Взаимодействие между иммобилизованным антителом и ИЛ-15 или комплексом ИЛ-15 может осуществляться в течение любого подходящего промежутка времени, включая от около 1 до около 2 мин. Температура взаимодействия может быть любой подходящей температурой, включая около 25°C.

Антитела, которые связываются с ИЛ-15 (например, ИЛ-15 человека в комплексе с ИЛ-15Ра), могут быть моноклональными антителами. Предпочтительно антитела представляют собой полноразмерные

- 17 040821 антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь. В некоторых аспектах антитела содержат производные или фрагменты или части антител, которые сохраняют антигенсвязывающую специфичность, а также предпочтительно существенно сохраняют аффинность полноразмерной молекулы родительского антитела (например, для ИЛ-15). Например, производные могут содержать один вариабельный участок (вариабельный участок тяжелой цепи или легкой цепи). Другие примеры подходящих производных и фрагментов антител включают, без ограничения, антитела с полиэпитопной специфичностью, диатела, минитела, молекулы FAb, F(Ab')2, Fd, Fabc и Fv, одноцепочечные (Sc) антитела, одноцепочечные антитела Fv (scFv), легкие цепи отдельных антител, тяжелые цепи отдельных антител, слияния между цепями антител и другими молекулами, мономеры или димеры тяжелых цепей, мономеры или димеры легких цепей, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи, и другие мультимеры. Одноцепочечные Fvантитела могут быть мультивалентными. Производные, фрагменты и/или части антител могут быть получены рекомбинантно и экспрессированы с помощью любого типа клеток, прокариотическими или эукариотическими.

В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (сокращенно обозначаемом в данном документе как HCVR или VH) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (сокращенно обозначаемом в данном документе как LCVR или VL) и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена, CL. Участки VH и VL могут быть дополнительно подразделены на участки гипервариабельности, называемые участками определения комплементарности (CDR), чередующиеся с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Как правило, антигенсвязывающие свойства антитела с меньшей вероятностью будут нарушены изменениями последовательностей FR, чем изменениями последовательностей CDR. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно полностью человеческие. Полностью человеческие антитела представляют собой антитела, в которых вся молекула является человеческой или иным образом человеческого происхождения или включает аминокислотную последовательность, идентичную человеческой форме антитела. Полностью человеческие антитела включают антитела, полученные из библиотеки V-генов человека, например, где человеческие гены, кодирующие вариабельные участки антител, экспрессируются рекомбинантно. Полностью человеческие антитела могут экспрессироваться в других организмах (например, мышах и технологии ксеномыши) или в клетках других организмов, трансформированных генами, кодирующими человеческие антитела. Полностью человеческие антитела могут быть экспрессированы в крысиной системе OMNIRAT® (OMT, Inc.) согласно WO 08/151081. Полностью человеческие антитела могут, тем не менее, включать аминокислотные остатки, не кодируемые природными человеческими последовательностями, например мутации, введенные случайным образом, или сайтнаправленные мутации.

В некоторых аспектах анти-ИЛ-15-антитела могут содержать неиммуноглобулин полученные белковые каркасы. Например, можно сослаться на (Ku et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552-6556), в котором описывается четырехспиральный пучок белка цитохрома b562, имеющий две петли, рандомизированные для создания CDR, которые были отобраны для связывания антигена.

Анти-ИЛ-15 антитела могут содержать посттрансляционные модификации или фрагменты, которые могут влиять на активность антитела, период полувыведения или стабильность при хранении/сроке хранения. Например, антитела могут быть метилированными, ацетилированными, гликозилированными, сульфатированными, фосфорилированными, карбоксилированными и/или амидированными или могут содержать другие подходящие фрагменты, которые хорошо известны в данной области. Фрагменты включают любую химическую группу или комбинации групп, которые обычно находятся в молекулах иммуноглобулина в кровотоке или иным образом добавляются к антителам с помощью рекомбинантных систем экспрессии, включая прокариотические и эукариотические системы экспрессии.

Примеры модификаций боковых цепей, рассматриваемых в описании, включают модификации аминогрупп, такие как восстановительное алкилирование путем реакции с альдегидом с последующим восстановлением NaBH₄; амидирование с метилацетимидатом; ацилирование уксусным ангидридом; карбамоилирование аминогрупп цианатом; тринитробензилирование аминогрупп 2,4,6тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS); ацилирование аминогрупп янтарным ангидридом и тетрагидрофталевым ангидридом; и пиридоксилирование лизина пиридоксаль-5-фосфатом с последующим восстановлением NaBH4.

Гуанидиновая группа остатков аргинина может быть модифицирована путем образования продуктов гетероциклической конденсации с такими реагентами, как 2,3-бутандион, фенилглиоксаль и глиоксаль. Карбоксильная группа может быть модифицирована активацией карбодиимида посредством образования O-ацилизомочевины с последующей деривацией, например, до соответствующего амида. Сульфидрильные группы могут быть модифицированы такими способами, как карбоксиметилирование йодо

- 18 040821 уксусной кислотой или йодацетамидом; окисление пермуравьиной кислоты до цистеиновой кислоты; образование смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями; реакция с малеимидом, малеиновым ангидридом или другим замещенным малеимидом; образование производных ртути с использованием 4-хлормеркурибензоата, 4-хлормеркурифенилсульфоновой кислоты, хлорида фенилртути, 2хлормеркури-4-нитрофенола и других ртутных соединений; карбамоилирование цианатом при щелочном pH. Остатки триптофана могут быть модифицированы, например, окислением N-бромсукцинимидом или алкилированием индольного кольца 2-гидрокси-5-нитробензилбромидом или сульфенилгалогенидами. Остатки тирозина, с другой стороны, могут быть изменены нитрованием тетранитрометаном с образованием производного 3-нитротирозина. Модификация имидазольного кольца остатка гистидина может быть осуществлена путем алкилирования производными йодоуксусной кислоты или Nкарбэтоксилирования диэтилпирокарбонатом.

Анти-ИЛ-15 антитела могут включать модификации, которые модулируют период полужизни и биораспределение в сыворотке, включая, без ограничения, модификации, которые модулируют взаимодействие антитела с Fc-рецептором новорожденных (FcRn), рецептором, играющим ключевую роль в защите IgG от катаболизма, и поддержание высокой концентрации сывороточных антител. Модификации периода полужизни в сыворотке могут происходить в участке Fc IgG1, IgG2 или IgG4, включая тройную замену M252Y/S254T/T256E (нумерация в соответствии с системой нумерации EC (Edelman, GM et al. (1969) Proc. Natl. Acad. США 63:78-85)), как описано в пат. США № 7083784. Другие замены могут происходить в положениях 250 и 428, см., например, пат. США 7217797, а также в положениях 307, 380 и 434, см., например, PCT публ. № WO 00/042072. Примеры аминокислотных замен константного домена, которые модулируют связывание с Fc-рецепторами и последующую функцию, опосредованную этими рецепторами, включая связывание FcRn и период полураспада в сыворотке, описаны в US публ. № 2009/0142340, 2009/0068175 и 2009/0092599. Антитела любого класса могут иметь C-концевой лизин тяжелой цепи, пропущенный или удаленный для снижения гетерогенности (AK). Замена S228P (нумерация EC) в IgG4 человека может стабилизировать обмен Fab-плечом антитела in vivo (Labrin et al. (2009) Nature Biotechnol. 27:8; 767-773), и эта замена может присутствовать одновременно с модификациями M252Y/S254T/T256E и/или AK.

Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно содержат человеческие константные домены. Константные домены тяжелой цепи предпочтительно представляют собой константные домены IgG1, IgG2 или IgG4 человека. Константные домены легкой цепи предпочтительно представляют собой константные домены лямбда человека.

Константные участки тяжелой цепи IgG1 человека, которые можно использовать с анти-ИЛ-15 антителами, могут быть выбраны из IgG1 человека (SEQ ID NO: 32), IgG1 (AK) человека (SEQ ID NO: 33), IgG1 человека 252Y/254T/256E (SEQ ID NO: 34), IgG1 человека 252Y/254T/256E (AK) (SEQ ID NO: 35), IgG1 человека L235A/G237A (SEQ ID NO: 36), IgG1 человека L235A/G237A (AK) (SEQ ID NO: 37) IgG1 человека L234A/L235A/G237A (SEQ ID NO: 38) и IgG1 человека L234A/L235A/G237A (AK) (SEQ ID NO: 39). Константные участки тяжелой цепи IgG2 человека, которые можно использовать с анти-ИЛ-15 антителами, могут быть выбраны из IgG2 человека (SEQ ID NO: 40), IgG2 человека (AK) (SEQ ID NO: 41), IgG2 человека A330S/P331S (SEQ ID NO: 42) и IgG человека (ΔΚ) (SEQ ID NO: 43). Константные участки тяжелой цепи IgG4 человека, которые можно использовать с анти-ИЛ-15 антителами, могут быть выбраны из IgG4 человека (SEQ ID NO: 44), IgG4 человека (ΔΚ) (SEQ ID NO: 45), IgG4 человека S228P (SEQ ID NO: 46), IgG4 человека S228P (ΔΚ) (SEQ ID NO: 47), IgG4 человека 228P/252Y/254T/256E (SEQ ID NO: 48), IgG4 человека 228P/252Y/254T/256E (ΔΚ) (SEQ ID NO: 49), IgG4 человека 252Y/254T/256E (SEQ ID NO: 50) и IgG4 человека 252Y/254T/256E (ΔΚ) (SEQ ID NO: 51).

Анти-ИЛ-15 антитела могут быть помечены, связаны или конъюгированы с любыми химическими или биомолекулярными фрагментами. Меченые антитела могут найти применение в терапевтических, диагностических или фундаментальных исследованиях. Такие метки/конъюгаты могут быть обнаружены, такие как флуорохромы, электрохемилюминесцентные зонды, квантовые точки, радиоактивные метки, ферменты, флуоресцентные белки и люминесцентные белки, или могут содержать биотин или ПЭГ.

Антитела могут быть дериватизированы известными защитными/блокирующими группами для предотвращения протеолитического расщепления или повышения активности или стабильности.

Полинуклеотидные последовательности, которые кодируют анти-ИЛ-15 антитела, их домены (например, домены VH и VL) и их субдомены (например, FR и CDR) описаны в описании. Полинуклеотиды включают, но не ограничиваются ими, РНК, ДНК, кДНК, гибриды РНК и ДНК и одно-, двух- или трехцепочечные цепи РНК, ДНК или их гибриды. Последовательности комплементарных нуклеиновых кислот также находятся в объеме описания.

В некоторых аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 7. Полинуклеотид может дополнительно содержать вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 или SEQ

- 19 040821

ID NO: 8. Полинуклеотид может дополнительно содержать вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 9. Полинуклеотид может дополнительно содержать третью последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константный участок тяжелой цепи антитела, такой как любой из константных участков IgG1, IgG2 или IgG4, описанных в данном документе.

В некоторых аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 454. Полинуклеотид может дополнительно содержать вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509 или SEQ ID NO: 510. Полинуклеотид может дополнительно содержать вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458 или SEQ ID NO: 460. Полинуклеотид может дополнительно содержать третью последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константный участок тяжелой цепи антитела, такой как любой из константных участков IgG1, IgG2 или IgG4, описанных в данном документе.

В некоторых аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 8. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 9. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 517. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 518.

В некоторых аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509 или SEQ ID NO: 510. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458 или SEQ ID NO: 460.

Любые такие полинуклеотиды могут содержаться в векторе. Таким образом, векторы, содержащие полинуклеотиды, предоставлены как часть описания. Векторы могут быть векторами экспрессии. Таким образом, обеспечиваются рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую интересующий полипептид. Вектор экспрессии может содержать одну или более дополнительных последовательностей, таких как, но не ограничиваясь ими, регуляторные последовательности, маркер селекции, метка очистки или сигнал полиаденилирования.

Такие регуляторные элементы могут включать промотор транскрипции, энхансеры, сайты связывания мРНК с рибосомами или последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции.

Векторы экспрессии, особенно векторы экспрессии млекопитающих, могут включать один или более нетранскрибированных элементов, таких как источник репликации, подходящий промотор и энхансер, связанный с экспрессируемым геном, другие 5' или 3' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, 5' или 3' нетранслируемые последовательности (такие как необходимые сайты связывания рибосом), сайт полиаденилирования, сайты донора и акцептора сплайсинга или последовательности терминации транскрипции. Источник репликации, который дает возможность репликации у конкретного хозяина, также может быть включен.

Векторы можно использовать для трансформации любой из множества клеток-хозяев, хорошо известных специалистам в данной области, и предпочтительно клеток-хозяев, способных к экспрессии антител. Векторы включают, без ограничения, плазмиды, фагемиды, космиды, бактиды, бактериальные искусственные хромосомы (BAC), дрожжевые искусственные хромосомы (YACs) и бакуловирус, а также другие бактериальные, эукариотические, дрожжевые и вирусные векторы. Подходящие клетки-хозяева включают без ограничения клетки CHO, клетки NS0, клетки HEK293 или любую известную, или полученную стабильную эукариотическую клеточную линию, а также включают клетки бактерий, дрожжей и насекомых.

Антитела могут также продуцироваться клетками гибридомы; способы получения гибридом хорошо известны и известны в данной области.

Описание также обеспечивает композиции, содержащие анти-ИЛ-15 антитела. Композиции могут содержать любое из антител, описанных и/или приведенных в качестве примера в данном документе, и приемлемый носитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие носители включают любые среды, которые не влияют на биологическую активность антитела и предпочтительно не токсичны для хозяина, которому его вводят. Носитель может быть водным раствором. Композиции мо

- 20 040821 гут содержать любое из антител, описанных и/или приведенных в качестве примеров в данном документе, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы для лечения аутоиммунного заболевания, включая аутоиммунное заболевание, при котором ИЛ-15 не регулируется. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы для лечения воспалительного заболевания, включая воспалительное заболевание, при котором ИЛ-15 не регулируется. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы для лечения воспалительного расстройства, включая воспалительное расстройство, при котором ИЛ-15 не регулируется. В некоторых аспектах анти-ИЛ-15-антитела могут быть использованы для лечения целиакии, рефрактерной целиакии, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, диабета 1 типа, очаговой алопеции, а также определенного типа рака, такого как T-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов у субъекта. Таким образом, в описании представлены способы лечения.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении аутоиммунного заболевания, при котором нарушается регуляция ИЛ-15, так что аутоиммунное заболевание лечат у субъекта. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения аутоиммунного заболевания, при котором ИЛ-15 не регулируется у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении воспалительного заболевания, при котором нарушается регуляция ИЛ-15, так что воспалительное заболевание лечится у субъекта. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения воспалительного заболевания, при котором ИЛ-15 не регулируется у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении воспалительного расстройства, при котором нарушается регуляция ИЛ-15, так что воспалительное расстройство лечится у субъекта. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения воспалительного расстройства, при котором ИЛ-15 не регулируется у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении целиакии, так что целиакию лечат у субъекта, и целиакия может быть рефрактерной. Рефрактерная целиакия (RCD) поражает пациентов, которые не смогли вылечиться и демонстрируют постоянные симптомы целиакии, после 6-12 месяцев строгой безглютеновой диеты и когда другие причины симптомов (включая злокачественные новообразования) были исключены. Это может также произойти у пациентов, которые ранее отвечали на долгосрочную безглютеновую диету, но у которых теперь проявляются симптомы целиакии, при этом сохраняется строгая безглютеновая диета (Rishi et al. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology:10 537-546 (2016). Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения целиакии у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

Анти-ИЛ-15 антитела можно использовать для лечения или ингибирования одного или более симптомов воздействия глютена, например, вызванного приемом глютена. Один или более симптомов включают мышечную боль, боль в теле, боль в суставах, усталость, вздутие живота, газы, тошноту, судороги, запор, диарею, кожную сыпь, головную боль, головную боль при мигрени, депрессию, беспокойство, затуманенное сознание и раздражительность. Как правило, способы включают введение анти-ИЛ-15 антитела или его композиции субъекту, обладающему чувствительностью к глютену, который подвергался воздействию глютена, так что один или более симптомов воздействия глютена ингибируются или лечатся у субъекта. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения или ингибирования одного или более симптомов воздействия глютена у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении ревматоидного артрита, так что ревматоидный артрит лечится у субъекта. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения ревматоидного артрита у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении псориаза, так что псориаз лечится у субъекта. Анти-ИЛ-15 анти

- 21 040821 тела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения псориаза у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении воспалительного заболевания кишечника, так что воспалительное заболевание кишечника лечится у субъекта. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения воспалительного заболевания кишечника у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении диабета типа 1, так что диабет типа 1 лечится у субъекта. АнтиИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения диабета 1 типа у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении очаговой алопеции, так что очаговая алопеция лечится у субъекта. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения очаговой алопеции у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

В некоторых аспектах способы лечения включают введение анти-ИЛ-15-антитела или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов, так что T-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов лечится у субъекта. Анти-ИЛ-15 антитела предпочтительно вводят в количестве, которое эффективно для лечения T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов у субъекта. Эффективное количество может варьироваться, например, в соответствии с потребностями или состоянием субъекта. Введение может осуществляться по указанию или под контролем врача.

Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы при производстве лекарственного средства. Например, анти-ИЛ-15-антитела могут быть использованы при изготовлении или приготовлении лекарственного средства для применения при лечении целиакии. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы при изготовлении или приготовлении лекарственного средства для применения при лечении рефрактерной целиакии. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы при изготовлении или приготовлении лекарственного средства для применения при лечении ревматоидного артрита. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы при изготовлении или приготовлении лекарственного средства для применения при лечении псориаза. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы при изготовлении или приготовлении лекарственного средства для применения при лечении воспалительного заболевания кишечника. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы при изготовлении или приготовлении лекарственного средства для применения при лечении диабета 1 типа. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы при изготовлении или приготовлении лекарственного средства для применения при лечении очаговой алопеции. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы при изготовлении или приготовлении лекарственного средства для применения при лечении T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы при производстве или приготовлении лекарственного средства для применения при лечении или ингибировании одного или более симптомов воздействия глютена, например, воздействия глютена у пациента, который имеет чувствительность к глютену или аллергию. Один или более симптомов включают мышечную боль, боль в теле, боль в суставах, усталость, вздутие живота, газы, тошноту, судороги, запор, диарею, кожную сыпь, головную боль, головную боль при мигрени, депрессию, беспокойство, затуманенное сознание и/или раздражительность.

Анти-ИЛ-15-антитела могут быть использованы для лечения целиакии. Анти-ИЛ-15-антитела могут быть использованы для лечения рефрактерной целиакии. Анти-ИЛ-15-антитела могут быть использованы для лечения ревматоидного артрита. Анти-ИЛ-15-антитела могут быть использованы для лечения псориаза. Анти-ИЛ-15-антитела могут быть использованы для лечения воспалительного заболевания кишечника. Анти-ИЛ-15-антитела могут быть использованы для лечения диабета 1 типа. Анти-ИЛ-15антитела могут быть использованы для лечения очаговой алопеции. Анти-ИЛ-15-антитела могут быть использованы для лечения T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов. Анти-ИЛ-15 антитела могут быть использованы для лечения или ингибирования одного или более симптомов воздействия глютена, например воздействия глютена у пациента с чувствительностью к глютену или аллергией. Один или более симптомов включают мышечную боль, боль в теле, боль в суставах, усталость, вздутие живота, газы, тошноту, судороги, запор, диарею, кожную сыпь, головную боль, головную боль при мигрени, депрессию, беспокойство, затуманенное сознание и/или раздражительность.

Описание также включает в себя наборы, содержащие любое из анти-ИЛ-15 антител, и эти наборы могут использоваться, среди прочего, для доставки антител и других агентов для использования в диагностических, базовых исследованиях или терапевтических способах. В некоторых аспектах наборы со- 22 040821 держат любое анти-ИЛ-15 антитело, описанное или приведенное в качестве примера в данном документе, и инструкции по применению антитела в способе лечения целиакии. В некоторых аспектах наборы содержат любое анти-ИЛ-15 антитело, описанное или приведенное в качестве примера в данном документе, и инструкции по применению антитела в способе лечения рефрактерной целиакии. В некоторых аспектах наборы содержат любое анти-ИЛ-15 антитело, описанное или приведенное в качестве примера в данном документе, и инструкции по применению антитела в способе лечения или ингибирования одного или более симптомов воздействия глютена, например, у пациента с чувствительностью к глютену или аллергией. В некоторых аспектах наборы содержат любое анти-ИЛ-15 антитело, описанное или приведенное в качестве примера в данном документе, и инструкции по применению антитела в способе лечения ревматоидного артрита. В некоторых аспектах наборы содержат любое анти-ИЛ-15 антитело, описанное или приведенное в качестве примера в данном документе, и инструкции по применению антитела в способе лечения псориаза. В некоторых аспектах наборы содержат любое анти-ИЛ-15 антитело, описанное или приведенное в качестве примера в данном документе, и инструкции по применению антитела в способе лечения воспалительного заболевания кишечника. В некоторых аспектах наборы содержат любое анти-ИЛ-15 антитело, описанное или приведенное в качестве примера в данном документе, и инструкции по применению антитела в способе лечения диабета 1 типа. В некоторых аспектах наборы содержат любое анти-ИЛ-15 антитело, описанное или приведенное в качестве примера в данном документе, и инструкции по применению антитела в способе лечения очаговой алопеции. В некоторых аспектах наборы содержат любое анти-ИЛ-15 антитело, описанное или приведенное в качестве примера в данном документе, и инструкции по применению антитела в способе лечения T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов.

Также предоставлены способы обнаружения ИЛ-15 в образце ткани, выделенном у субъекта. Как правило, такие способы включают в себя приведение в контакт любого анти-ИЛ-15 антитела, описанного или приведенного в качестве примера в данном документе, с образцом ткани, выделенным у субъекта, с образованием комплекса антитело-ИЛ-15 с рецептором альфа ИЛ-15 и обнаружение комплекса в образце ткани. Способ может дополнительно включать выделение образца ткани у субъекта. Образец ткани может быть из ткани желудочно-кишечного тракта, включая ткань пищевода, ткань желудка, ткань тонкого кишечника, ткань толстого кишечника и другие ткани желудочно-кишечного тракта. Антитело может быть конъюгировано с детектируемой меткой. Антитело может быть обнаружено с помощью вторичного антитела, которое помечено детектируемой меткой. Такие способы могут быть выполнены in vivo, in vitro или in situ.

Также предоставлены способы обнаружения комплекса ИЛ-15 и рецептора-альфа ИЛ-15 в образце ткани, выделенном у субъекта. Как правило, такие способы включают приведение в контакт любого анти-ИЛ-15 антитела, описанного или приведенного в качестве примера в данном документе, с образцом ткани, выделенным у субъекта, с образованием комплекса антитело-антиген анти-ИЛ-15 антитела, связанного с комплексом ИЛ-15 и рецептором альфа ИЛ-15, и обнаружение комплекса антитело-антиген в образце ткани. Способ может дополнительно включать выделение образца ткани у субъекта. Образец ткани может быть из ткани желудочно-кишечного тракта, включая ткань пищевода, ткань желудка, ткань тонкого кишечника, ткань толстого кишечника и другие ткани желудочно-кишечного тракта. Антитело может быть конъюгировано с детектируемой меткой. Антитело может быть обнаружено с помощью вторичного антитела, которое помечено детектируемой меткой. Такие способы могут быть выполнены in vivo, in vitro или in situ.

Следующие примеры предоставлены для более подробного описания. Они предназначены для иллюстрации, а не для ограничения описания. В примерах ссылка на положение остатка является ссылкой на положение в соответствующей последовательности, как изложено в данном документе, если не указано иное.

Пример 1. Получение трансгенных крыс, иммунизация и производство гибридом

1.1 Белок ИЛ-15 и белок ИЛ-15Pα

Человеческий интерлейкин 15 (ИЛ-15) был приобретен (Sigma) или произведен в системе экспрессии HEK293F млекопитающих с использованием плазмид, кодирующих ИЛ-15 человека и растворимого рецептора α ИЛ-15 (ИЛ-15Pα) с HIS на N-конце и меткой AVI (SEQ ID NO: 512) в соотношении 1:1.

1.2 Получение трансгенных крыс

Трансгенных крыс получали, как описано в публикации PCT № WO 08/151081. Вкратце, экспрессирующая конструкция мегануклеазы была интегрирована в геном животного. Экспрессия мегануклеазы в половых клетках приводила к двухцепочечным разрывам в эндогенных генах иммуноглобулина крысы. Спаривание таких трансгенных крыс привело к появлению мутантных/инактивированных эндогенных генов иммуноглобулина крыс.

Трансгенных крыс дополнительно модифицируют для переноса искусственных генов иммуноглобулина человека, так что крысы способны продуцировать антитела с полностью человеческими вариабельными участками.

1.3 Иммунизация

- 23 040821

Для создания полностью человеческих моноклональных антител к комплексу ИЛ-15 с рецепторомальфа ИЛ-15 трансгенных крыс (полученных, как описано выше) иммунизировали ДНК, кодирующей ИЛ-15 человека, и ДНК, кодирующей ИЛ-15Pα человека.

Десять животных были иммунизированы, и иммунный ответ отслеживался в течение всего курса иммунизации с помощью образцов плазмы, полученных при субмандибулярных кровотечениях. Плазму подвергали скринингу на экспрессию антител с помощью ИФА, и животных с достаточными титрами анти-ИЛ-15 антител отбирали для слияния и получения гибридомы. Животных с высоким титром за 5 дней до умерщвления подкожно стимулировали рекомбинантным комплексом ИЛ-15 человека.

1.4 Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к комплексу ИЛ-15

Для создания гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к комплексу ИЛ-15 с рецептором-альфа ИЛ-15, спленоциты и клетки лимфатических узлов от иммунизированных животных выделяли и сливали с иммортализованной клеточной линией. Суспензии отдельных клеток лимфоцитов были слиты с P3X63Ag8.653, не секретирующими клетки миеломы мыши (ATCC, CRL-1580). Клетки высевали при приблизительно 1x105 клеток/мл в планшеты для микротитрования с плоским дном с последующей 2-недельной инкубацией в селективной среде, содержащей помимо обычных реагентов 10% фетальной клоновой сыворотки и 1x HAT (Sigma). Затем отдельные лунки подвергали скринингу с помощью ИФА и BIACORE® на антитела к ИЛ-15 IgG человека с высокой аффинностью.

Пример 2. Скрининг гибридом

2.1 Использование ИФА для отбора антител, которые связываются с комплексом ИЛ-15, но не связываются с некомплексированным рецептором α ИЛ-15

Микротитрационные планшеты покрывали очищенным ИЛ-15 или очищенным ИЛ-15Pα или очищенным комплексом ИЛ-15. Вкратце, планшеты для микротитрования покрывали очищенным белком в ФСБ и затем блокировали нерелевантными белками, такими как бычий сывороточный альбумин (БСА), разведенный в ФСБ. Разведения надосадков гибридомы добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1-2 ч при 37°C. Планшеты промывали ФСБ/TWEEN® 20, а затем инкубировали с Fcспецифическим поликлональным реагентом коза-античеловеческий IgG, конъюгированным с подходящим реагентом обнаружения (например, пероксидазой хрена) щелочной фосфатазы в течение 1 ч при 37°C. После промывания планшеты были обработаны подходящим субстратом (например, 3,3',5,5'тетраметилбензидин TMD) и проанализированы при ОП 405. Гибридомы, которые продуцировали антитела, демонстрирующие положительную реактивность с комплексом ИЛ-15, но не с ИЛ-15Pα, были отобраны для дальнейшей характеристики.

2.2 Использование клеточного ИФА (кИФА) для отбора антител, которые связываются с комплексом ИЛ-15, но не связываются с некомплексированным рецептором α ИЛ-15

Каждую из гибридом, протестированных как указано выше, также тестировали в иммуноферментном анализе на основе клеток (кИФА) для отбора антител, которые связываются с комплексом ИЛ-15, но не связываются с некомплексированным ИЛ-15Pα.

кИФА проводился следующим образом. Клетки HEK трансфицировали с ДНК, кодирующей ИЛ-15 и ИЛ-15Pα, так что они экспрессировали комплекс ИЛ-15. Трансфицированные клетки HEK наносили на планшет для ИФА и на планшет наносили разведения надосадков гибридомы, чтобы они могли связываться с комплексом ИЛ-15, экспрессируемым на поверхности клеток. Анализ повторяли с использованием клеток HEK, трансфицированных с ИЛ-15Pα, так что они экспрессировали некомплексированный ИЛ-15Pα. Преимущество использования кИФА в дополнение к классическому ИФА состоит в том, что для скрининга антител используется нативный белковый комплекс.

В качестве положительного контроля экспрессию комплекса ИЛ-15 или некомплексированного ИЛ15Pa на клеточной поверхности анализировали с использованием античеловеческого ИЛ-15фикоэритрин (PE) антитела (R&D Systems, Кат. № IC2471P). Гибридомы, продуцирующие антитела, которые продемонстрировали положительную реактивность с комплексом ИЛ-15, но не с ИЛ-15Pα, были отобраны для дальнейшей характеристики.

Репрезентативный выбор результатов продемонстрирован на фиг. 1. Антитело 4 связывалось с некомплексированным ИЛ-15 и комплексом ИЛ-15, но не с некомплексированным ИЛ15Pα. Антитело 1A6 не связывалось с некомплексированным ИЛ-15, комплексом ИЛ-15 или ИЛ-15Pα и не было отобрано для дальнейшей характеристики. Антитело 1B3 связывало некомплексированный ИЛ-15, комплекс ИЛ-15 и ИЛ-15Pα. Связывание с некомплексированным ИЛ-15Rα является недостатком, поскольку оно указывает на то, что клоны не являются специфичными к ИЛ-15.

Пример 3. Идентификация антител-кандидатов для дальнейшей разработки

3.1 Анализ на основе клеток CTLL-2

1500 образцов гибридомы, которые связывают комплекс ИЛ-15, но не ИЛ-15а, были протестированы в анализе на мышиной клетке CTLL-2, чтобы определить, какие из них нейтрализуют биологическую активность ИЛ-15. Клеточная линия CTLL-2 происходит от цитотоксической T-клеточной лимфомы (ATCC: TIB-214) и реагирует как на ИЛ-2, так и на ИЛ-15.

- 24 040821

Надосадки гибридомы (неочищенные антитела) тестировали на их способность нейтрализовать вызванную ИЛ-15 пролиферацию клеток CTLL-2.

Клетки CTLL-2 инкубировали в полной среде без ИЛ-2 или ИЛ-15 в течение 4 ч перед тестированием. Клетки CTLL-2 (5х10⁴/лунка) инкубировали в 96-луночных планшетах с комплексом ИЛ-15 с рецептором-альфа ИЛ-15 при 200 пМ для индукции пролиферации клеток. Надосадки гибридомы добавляли в планшеты и инкубировали в течение 48 ч. Ингибирование пролиферации клеток затем оценивали с использованием анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CELLTITER-GLO® (Promega) в соответствии с инструкциями производителя и считывания с люминометра GLOMAX® 96 Microplate (Promega). Данные не показаны.

3.2 Анализы BIACORE®

Параллельно с анализами на основе клеток, описанными выше, 1500 гибридом также тестировали на активность связывания комплекса ИЛ-15 и измеряли их аффинность. Использовали поверхностный плазмонный резонанс (SPR). SPR-скрининг проводили с использованием биосенсора BIACORE® 4000 (GE Healthcare) в одной концентрации аналита в анализе прогона. CM5 Series S (GE Healthcare) была установлена в машине. Использовали нормализацию с помощью раствора Bia Normalization (GE Healthcare). Гидродинамическая адресация выполнялась на пристыкованном чипе и прошла внутренний контроль качества.

Антитело против Fc-фрагмента крысы (Bethyl A110-136A) иммобилизовали на поверхности сенсорного чипа CM5 с использованием набора для аминного связывания (GE Healthcare). Антитело разводили в ацетате натрия pH 4,5 до концентрации 50 мкг/мл для иммобилизации и иммобилизовали в точках 1, 2, 4, 5 в проточных ячейках 1-4 с использованием буфера HBS-EP+ (GE Healthcare) и время связывания 10 мин. Все взаимодействия были измерены при 25°C. Это привело к уровню иммобилизации от между 10000 до 12000 единиц ответа для каждой точки на четырех проточных ячейках. Клетки регенерировали с использованием 100 мМ буфера фосфорной кислоты. Для оценки связывания гибридомы 70 мкл рабочего буфера HBS-EP+ добавляли к 50 мкл надосадка гибридомы крысы. Использовался следующий метод:

Запуск - Регенерация 3 цикла по 10 с каждый со скоростью 30 мкл/мин.

Пробный прогон:

Захват - Точка 1 - Проточные ячейки 1-4 - 130 с инъекция - 30 мкл/мин - нормальная инъекция - на этом этапе 4 различных образца загружаются в точку 1 из каждой из четырех проточных ячеек

Захват - Точка 5 - Проточные ячейки 1-4 - 130 с инъекция - 30 мкл/мин - нормальная инъекция - на этом этапе 4 различных образца загружаются в точку 1 из каждой из четырех проточных ячеек

Образец - все точки, все проточные ячейки - 60-секундная инъекция, 60-секундная скорость смещения - 30 мкл/мин - нормальная инъекция - комплекс ИЛ-15 человека (20 мкг/мл; партия 491p90A) вводится через все проточные ячейки и все точки.

Регенерация 1-20 с 100 мМ фосфорной кислоты

Регенерация 2-15 с 100 мМ фосфорной кислоты

Регенерация 3-10 с 100 мМ фосфорной кислоты

Между каждым 96-луночным планшетом выполнялся другой цикл регенерации - в соответствии с циклом запуска.

Анализ

Используя программное обеспечение BiaEvaluation, для анализа использовали захват с кинетикой. Сенсограммы для 5-4 и 1-2 были проанализированы. Это позволило вычитать сигнал комплекса ИЛ-15 из точки, в которой не было антител. Точка 3 не использовалась в анализе. Затем каждую сенсограмму анализировали, и те образцы, которые не обнаруживали связывания антитела с комплексом, отбрасывали, а образцы, которые демонстрировали связывание с комплексом ИЛ-15 с рецептором-альфа ИЛ-15, были одобрены. Была выполнена подгонка кривой и получена таблица измерений сродства.

3.3 Секвенирование вариабельного участка

Молекулярная идентичность вариабельных участков антител в отобранных пеллетах некональной гибридомы была установлена с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Вкратце, 96-луночные планшеты, содержащие пеллеты гибридомы, размораживали после криоконсервации при -80°C в RNALATER® (Thermo). Планшеты центрифугировали при 1000xg в течение 5 мин для осаждения клеток и удаляли буфер RNALATER®. РНК выделяли из планшетов гибридом с использованием 96-луночного набора для очистки РНК GENELUTE™ (Sigma #RTN9602, RTN9604) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию и качество полученных образцов РНК определяли с использованием спектрофотометра NANODROP® 8000 (Thermo). РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием олиго(dT) праймера и обратной транскриптазы AccuScript (Agilent # 600184). Реакцию синтеза кДНК собирали в соответствии с протоколом производителя и синтез кДНК проводили при 42°C в течение 30 мин.

Амплификацию вариабельных участков антител человека из гибридом, полученных от трансгенных грызунов, осуществляли с помощью ПЦР с использованием либо PfuUltraII (Agilent), либо ДНК полиме

- 25 040821 раз высокого разрешения Q5 (NEB) в соответствии с указаниями производителя. Тяжелые цепи амплифицировали с использованием пар праймеров, специфичных для последовательности ДНК константного участка тяжелой цепи грызуна и последовательностей ДНК лидерных последовательностей тяжелой цепи человека. Вариабельные участки легкой цепи лямбда амплифицировали аналогичным образом, используя пары праймеров, специфичных для последовательности ДНК константного участка лямбда человека и последовательности ДНК лидерных последовательностей лямбда цепи человека.

Успешная амплификация вариабельных участков была подтверждена запуском небольшой аликвоты в реакции ПЦР на геле с использованием системы электрофореза в э-геле (Thermo). Реакции очистки после ПНР проводились с использованием 96-луночной системы очистки ПЦР GENELUTE™ (Sigma # PCR9604) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию полученной очищенной ДНК оценивали с использованием спектрофотометра Nanodrop. Секвенирование по Сэнгеру фрагментов ПЦР проводили с использованием олиго, предназначенных для внутреннего связывания с ампликонами тяжелой или легкой цепи. Полученные последовательности ДНК были концептуально транслированы в аминокислотные последовательности для дальнейшего анализа перед их использованием для производства полноразмерных цепей антител. Вариабельные участки антител с уникальными аминокислотными последовательностями (по меньшей мере, с одной аминокислотной заменой в полной последовательности) отбирали для превращения в полноразмерные человеческие антитела.

3.4 . Получение плазмид для получения антител.

Последовательности вариабельного участка обратно транслировали в последовательности ДНК с использованием технологии GENEOPTIMIZER® перед синтезом полученной ДНК de novo путем сборки синтетических олигонуклеотидов (GeneArt, Германия). Синтезированные последовательности вариабельного участка тяжелой и легкой цепей субклонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие либо константный участок тяжелой цепи IgG1 человека (такую как регистрационный номер Swissprot PO1857), либо константный участок лямбда человека (регистрационный номер Swissprot P0CG05) для получения полноразмерных цепей антител.

3.5 Экспрессия антител

Антитела продуцировали путем совместной трансфекции плазмид, кодирующих тяжелые и легкие цепи антител, в клетки EXPI293® (Life Technologies). За день до трансфекции определяли количество клеток, необходимое для эксперимента. Для каждых 20 мл трансфекции требовалось 3,6x10⁷ клеток в 20 мл среды экспрессии EXPI293®. За день до трансфекции клетки высевали в 50 мл пробирки биореактора TPP с плотностью 0,9x106 жизнеспособных клеток/мл и инкубировали в течение ночи при 37°C в увлажненной атмосфере с 8% CO₂ в воздухе на орбитальном шейкере, вращающемся при 200 оборотах в минуту. В день трансфекции количество клеток и их жизнеспособность определяли с использованием автоматического счетчика клеток. Использовали только культуры с > 98% жизнеспособных клеток. Для каждых 20 мл трансфекции липид-ДНК-комплексы готовили путем разбавления 10 мкг ДНК тяжелой цепи и 10 мкг ДНК легкой цепи в OPTI-MEM® I в среде с уменьшенной сывороткой (кат. № 31985-062) до общего объема 1,0 мл. 54 мкл реагента EXPIFECTAMINE® 293 разводили в среде OPTI-MEM® I до общего объема 1,0 мл. Оба флакона осторожно перемешивали и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации разбавленную ДНК смешивали с разведенным реагентом EXPIFECTAMINE® 293 и смесью реагентов DNA-EXPIFECTAMINE® 293 инкубировали еще 20 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование комплексов реагента DNA-EXPIFECTAMINE® 293. После инкубации 2 мл комплекса реагента ДНК-EXPIFECTAMINE® 293 добавляли в каждую пробирку биореактора TPP объемом 50 мл. В пробирку с отрицательным контролем добавляли 2 мл среды OPTIMEM® I вместо комплекса реагента ДНК-EXPIFECTAMINE® 293. Клетки инкубировали в инкубаторе при 37°C с увлажненной атмосферой с 8% CO2 в воздухе на орбитальном шейкере, вращающемся со скоростью 200 об/мин. Приблизительно через 16-18 ч после трансфекции в каждую пробирку добавляли 100 мкл энхансера трансфекции 1 EXPIFECTAMINE® 293 и 1,0 мл энхансера трансфекции 2 EXPIFECTAMINE® 293. Антитела собирали приблизительно через 72 ч после трансфекции.

3.6 Очистка антител

Культуры трансфицированных клеток EXPI293® центрифугировали в пробирках объемом 50 мл при 3000xg в течение 20 мин и надосадки фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкм (Corning). Содержащие антитела надосадки очищали с использованием робота Gilson ASPEC GX274 с помощью хроматографии на протеине A. Вкратце, картриджи SPE (Agilent, 12131014), заполненные 1,2 мл смолы MABSELECT SURE® белка A (GE Healthcare), предварительно уравновешивали 1X ФСБ 3 объемами колонки. 18 мл надосадка пропускали через колонки с последующей промывкой 4 мл 1X ФСБ. Каждую колонку предварительно элюировали с 0,9 мл 0,1 М лимонной кислоты, pH 2,9. Очищенные антитела элюировали с 2 мл 0,1 М лимонной кислоты, pH 2,9. Антитела обессоливали в S0rensens ФСБ (59,5 мМ KH2PO4, 7,3 мМ Na₂HPO₄, 2H2O, 145,4 мМ NaCl (pH ~ 5,8)) с использованием колонок PD-10 (GE Healthcare).

- 26 040821

3.7 Трехточечное разведение на клетках CTLL-2

Каждое очищенное антитело тестировали в трех разных разведениях на его способность ингибировать опосредованную ИЛ-15 пролиферацию клеток CTLL2.

Клетки CTLL-2 инкубировали в полной среде без ИЛ-2 или ИЛ-15 в течение 4 часов перед тестированием. Клетки (5х10⁴/лунка) инкубировали в 96-луночных планшетах с 200 пМ комплекса ИЛ-15 с рецептором-альфа ИЛ-15, концентрацией, которая индуцировала 50% максимальной клеточной пролиферации (EC50). Разведения антител добавляли в планшеты и инкубировали в течение 48 ч. Были использованы три разведения анти-ИЛ-15 антител: 2000, 200 и 20 пМ. Ингибирование пролиферации клеток затем оценивали с использованием анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CELLTITER-GLO® (Promega) в соответствии с инструкциями производителя и считывания с люминометра GLOMAX® 96 Microplate (Promega). Данные выражали в единицах относительной люминесценции (количество жизнеспособных клеток в культуре на основе количественного определения присутствующего АТФ, показателя метаболически активных клеток).

Этот грубый ответ на дозу способности антител функционально нейтрализовать биологическую активность ИЛ-15 использовали для отбора антител для дальнейшего анализа. Репрезентативный выбор результатов продемонстрирован на фиг. 2A. Антитело 4 было сильнодействующим антагонистом активности ИЛ-15.

3.8 Полная доза-ответ на клетках CTLL-2

Выбранные антитела прогоняли в 10-точечной версии вышеуказанного анализа клеток CTLL-2 с целью получения кривых полная доза-ответ.

Репрезентативный выбор результатов продемонстрирован на фиг. 2B. Относительный профиль ингибирования каждого антитела оценивали с использованием значения IC₅₀ (концентрация анти-ИЛ-15 антител, при которой пролиферация клеток уменьшается вдвое). Из протестированных антител наиболее сильными антителами были антитело 4 и антитело 10F.

3.9 Полная доза-ответ на клетках НК-92

Наиболее сильные антитела в анализе клеток CTLL-2 были подвергнуты дополнительному анализу клеток с использованием клеток НК-92. Клеточная линия происходит от НК злокачественной неходжкинской лимфомы (ATCC: CRL-2407).

Клетки НК-92 инкубировали в полной среде без ИЛ-2 или ИЛ-15 в течение 4 ч перед тестированием. Клетки (5х10⁴/лунка) инкубировали в 96-луночных планшетах с ИЛ-15 в комплексе с рецепторомальфа ИЛ-15 при 25 пМ (EC50) для индукции пролиферации клеток. Дозы антител добавляли в планшеты и инкубировали в течение 48 ч. Ингибирование пролиферации клеток затем оценивали с использованием анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CELLTITER-GLO® (Promega) в соответствии с инструкциями производителя и считывания с люминометра GLOMAX® 96 Microplate (Promega), как описано выше. Данные были выражены как относительные единицы люминесценции.

Репрезентативный выбор результатов продемонстрирован на фиг. 3. Относительный профиль ингибирования каждого антитела оценивали с использованием значения IC₅₀. Антитело 4 имело самое низкое ингибирующее значение IC₅₀ (0,1 нМ) и было идентифицировано как наиболее мощный ингибитор клеточной пролиферации, управляемой ИЛ-15.

Пример 4. Модификация антитела

Антитело 4 было модифицировано с целью оказания положительного влияния на биофизические свойства антитела, а также улучшения активности.

4.1 Расположение критических для связывания аминокислот

Варианты родительского антитела были получены путем модификации каждого остатка в последовательностях CDR и оценки влияния на активность и свойства связывания антитела (сканирование CDR). Девять вариантов в каждом положении CDR были получены путем модификации остатков на аланин (A), аспарагиновую кислоту (D), гистидин (H), лизин (K), лейцин (L), глутамин (Q), серин (S), триптофан (W) или тирозин (Y). Эти девять аминокислот были выбраны из-за их диапазона свойств, так что все функциональные свойства были протестированы, как продемонстрировано в табл. 1.

Т аблица , 1. Функциональные свойства аминокислоты

Аминокислота	Функциональное свойство
Аланин(А)	Маленький размер
Аспарагиновая кислота(D)	Кислая
Гистидин (Н)	Основная; Кольцевая структура
Лизин (К)	Основная

- 27 040821

Лейцин(L)	Гидрофобная
Глутамин (Q)	Амид
Серин (S)	Нуклеофильная
Триптофан (W)	Ароматическая
Тирозин (Y)	Ароматическая

Это привело к отбору -520 вариантов антитела 4, каждый из которых отличался от антитела 4 на 1 аминокислоту. Антитела генерировали, как описано ранее, и скрининг проводили с использованием поверхностного плазмонного резонанса на системе Biacore T200 (GE Healthcare) с использованием чипа CM5 Protein A (GE Healthcare). В качестве рабочего буфера использовался HBS-EP+ (GE Healthcare), и все взаимодействия измерялись при 25°C, а скорость сбора данных была установлена на 10 Гц. Перед запуском способа был выполнен цикл запуска, в котором обе проточные ячейки чипа были очищены двумя последовательными 60-секундными импульсами 0,1 М лимонной кислоты (pH 3,0).

Надосадки EXPI293® F-клеток, коэкспрессирующих варианты антитела, разводили 1 к 100 в HBSEP+ (GE Healthcare), и комплекс ИЛ-15 человека разводили до 10 мкг/мл в том же буфере. Антитела захватывались во вторую проточную ячейку чипа и измерялось связывание путем инъекции 30 мкл комплекса ИЛ-15 человека со скоростью потока 30 мкл/мин через обе проточные ячейки и давая 120 с времени диссоциации. Поверхность чипа регенерировали между циклами двумя последовательными 60секундными импульсами 0,1 М лимонной кислоты (pH 3,0) на обе проточные ячейки.

Данные от FC2-1 использовались для анализа. Полученные сенсограммы были проанализированы путем создания двух пользовательских точек отчета, каждая из которых рассчитывалась для окна старта продолжительностью 1 с, начинающегося либо через 5 с после введения образца (раннее связывание), либо за 5 с до окончания диссоциации (позднее связывание). Антитела были ранжированы на основе отношения этих двух точек отчета (позднее связывание/раннее связывание) в качестве оценки скорости диссоциации. Относительные уровни захвата были использованы в качестве приблизительного показателя производительности. Результаты экспериментов по модификации CDR продемонстрированы на фиг. 5-34. На фиг. 5-33 показаны отдельные модификации, которые привели к улучшенному антителу (заштриховано серым), а на фиг. 34 обобщены единичные и множественные протестированные модификации, которые привели к улучшению антитела.

Эти эксперименты идентифицировали аминокислоты, которые были критически важны для связывания и активности, а также аминокислоты, которые могли быть заменены без изменения связывания или активности. Неожиданно было обнаружено, что замена аминокислот в положении 54 или 56 в CDR2 тяжелой цепи ароматическими аминокислотами Y или W приводила к увеличению активности антитела.

Дальнейшие варианты были сделаны для проверки замены аминокислот в положении 54 или 56 в CDR2 тяжелой цепи ароматической аминокислотой фенилаланин (F). Эти два варианта также показали увеличение активности в анализе пролиферации клеток НК-92.

Были созданы двойные варианты, где обе аминокислоты в положении 54 или 56 CDR2 тяжелой цепи были модифицированы либо на Y, W, либо на F. Активность двойных вариантов оценивали в анализе пролиферации клеток НК-92, как описано в разделе 3.9. Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2. Двойные варианты 54-56.

Положение 54

Положение 56

4,9 пМ

11,2пМ

8,3 пМ

6,6 пМ

7,4 пМ

7,6 пМ

3,4 пМ

10,1 пМ

5,1 пМ

Было обнаружено, что эффект от включения двух ароматических аминокислот в положениях 54 и 56 вместо того, чтобы быть противодействующим, вместо этого приводил к кумулятивному улучшению активности.

Антитело 11 (содержащее 54Y и 56Y) имеет по меньшей мере 10-кратное улучшение IC₅₀ в анализе пролиферации клеток НК-92 по сравнению с антителом 4 (фиг. 35 и табл. 3).

4.2 Модификация антитела 4 для снижения потенциальных иммуногенных эпитопов

Для удаления потенциально иммуногенных эпитопов в антителах могут быть сделаны замены пептидной последовательности, чтобы вернуть последовательность в этой области обратно в последовательность антител зародышевой линии. Замена I82aS в тяжелой цепи (антитело 63) привела к последовательности зародышевой линии и удалила предсказанный иммуногенный пептид в этой области. Эта замена не оказала влияния на активность в анализе НК-92, как показано в табл. 3 (антитело 63 по сравнению с антителом 11).

Замена N30S в легкой цепи (антитело 73) привела к последовательности зародышевой линии и удалила предсказанный иммуногенный пептид в этой области. Эта замена оказала незначительное влияние на активность в анализе НК-92, как показано в табл. 3 (антитело 73 по сравнению с антителом 11).

Когда обе замены были объединены в одно антитело, антитело 64, наблюдалось небольшое снижение активности по сравнению с антителом 11 (фиг. 35).

- 28 040821

Таблица 3. Список вариантов пониженной иммуногенности

Антитело №	Замены тяжелой цепи	Замены легкой цепи	IC 50 (НК92) в пМ	VHSEQ ID NO:	VL SEQ ID NO:	Полная L SEQ ID NO:
Антитело 4	Дикий тип	дт	148	7	8	9
Антитело 11	S54Y + N56Y	дт	6,3	454	8	9
Антитело 63	S54Y + N56Y +I82aS	ДТ	4,21075	4	8
Антитело 64	S54Y + N56Y +I82aS	N30S	13,5975	4	455	456
Антитело 65	S54Y + N56Y +I82aS	D92E	42,48	4	503
Антитело 66	S54Y + N56Y +I82aS	S93L	6,0443	4	457	458
Антитело 67	S54Y + N56Y +I82aS	S93E	7,688	4	505
Антитело 68	S54Y + N56Y +I82aS	S93F	5,338	4	459	460
Антитело 69	S54Y + N56Y +I82aS	N30S + D92E	162,5	4	507
Антитело 70а	S54Y + N56Y +I82aS	N30S + S93L	18,178	4	5	6
Антитело 71	S54Y + N56Y +I82aS	N30S + S93E	26,39	4	509
Антитело 72	S54Y + N56Y +I82aS	N30S + S93F	20,93	4	510
Антитело 73	S54Y + N56Y	N30S	11,842	454	455
Антитело 74	S54Y + N56Y	D92E	33,9	454	503
Антитело 75	S54Y + N56Y	S93L	3,136	454	457
Антитело 76	S54Y + N56Y	S93E	7,686	454	505
Антитело 77	S54Y + N56Y	S93F	5,694	454	506
Антитело 78	S54Y + N56Y	N30S + D92E	168	454	507
Антитело 79	S54Y + N56Y	N30S + S93L	12,38	454	5
Антитело 80	S54Y + N56Y	N30S + S93E	22,75	454	509
Антитело 81	S54Y + N56Y	N30S + S93F	17,29	454	510

4.3 Модификация антитела 64 для улучшения технологичности изготовления

Аминокислотный анализ вариабельной последовательности тяжелой и легкой цепи антитела 64 и родственных антител идентифицировал аминокислоты, которые могут подвергаться изомеризации. Изменения в этих аминокислотах могут со временем изменить стабильность антитела. В легкой цепи D92 и S93 были идентифицированы как потенциальный сайт изомеризации аспарагиновой кислоты. Чтобы уменьшить потенциальное влияние этих предсказанных проблем, были изготовлены варианты антитела 64, содержащие консервативные или полуконсервативные аминокислотные замены в этих положениях. Эти замены и их влияние на активность полученных вариантов приведены в табл. 4. На фиг. 35 продемонстрирована репрезентативная выборка вариантов, протестированных в анализе пролиферации клеток НК-92.

Модификации для повышения технологичности изготовления путем изменения D92 приводят к потере активности (см. Антитело 68 по сравнению с антителом 11). Изменение S93 на L93 неожиданно привело к улучшению активности антитела, как показано в табл. 3 и на фиг. 35.

Краткое изложение модификаций, внесенных в антитело 4 для создания антитела 70, приведено в табл. 4.

- 29 040821

Таблица 4. Краткое изложение модификации

Аминокислотное положение	Немодифицированный остаток (антитело 4)	Модифицированный остаток (антитело 70)	Улучшенное свойство
Н54	S	Y	Улучшенная активность
Н56	N	Y	Улучшенная активность
Н82а	I	S	Удаляет потенциальный иммуногенный эпитоп с помощью модифицирования на уровне генов зародышевой линии
L30	N	S	Удаляет потенциальный иммуногенный эпитоп с помощью модифицирования на уровне генов зародышевой линии
L93	S	L	Уменьшает потенциальную изомеризацию сайта

Пример 5. Сродство к рецептору и селективность вариантов антитела 70

Были созданы варианты константного участка антитела 70. Вариабельный участок тяжелой цепи антитела 70 был синтезирован в рамке с константными доменами изотипа IgG человека, описанными в табл. 5.

Таблица 5. Варианты антитела 70

Варианты антитела 70	SEQ ID NO
Антитело 70а	33
Антитело 70b	35
Антитело 70е	47
Антитело 70f	49

ИЛ-15 связывается с и передает сигналы через комплекс, состоящий из ИЛ-15Ра, ИЛ-2Рв и ИЛ-2Pγ. Антитела оценивали на их способность связывать ИЛ-15Ра, а также цитокины, которые имеют общий рецептор ИЛ-2Pβ/γ, такие как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 и ИЛ-21. Варианты антитела 70 не связывались с ИЛ-15Ра, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 и ИЛ-21.

Связывание вариантов антитела 70 с ИЛ-15 человека в комплексе с рецептором-альфа ИЛ-15 оценивали с использованием поверхностного плазмонного резонанса на системе BIACORE® T200 (GE Healthcare) с использованием сенсорного чипа белка A (GE Healthcare). Антитела захватывали во вторую проточную ячейку до уровня 150-200 RU. Очищенные цитокины разбавляли до 10 мкг/мл в HBS-EP+. Связывание измеряли путем инъекции 45 мкл каждого цитокина при скорости потока 30 мкл/мин по обеим проточным ячейкам и давали 180 с времени диссоциации. Поверхность чипа регенерировали между циклами двумя 10-секундными импульсами 50 мМ гидроксида натрия. В качестве рабочего буфера использовался HBS-EP+ (GE Healthcare), и все взаимодействия измерялись при 25°C, а скорость сбора данных равной 10 Гц.

Краткое содержание данных поверхностного плазмонного резонанса показано на фиг. 36. Сродство может быть измерено с помощью KD (константа равновесной диссоциации между антителом и его антигеном). Варианты антитела 70 имели самые низкие значения KD (от 0,133 до 0,193 нМ) по сравнению с антителом 4 (среднее KD=0,629 нМ) и AMG714 (среднее KD=1,84 нМ). Большая разница в KD между вариантами антитела 70 и AMG714 обусловлена скоростью диссоциации (kd). ИЛ-15 диссоциирует от AMG714 в десять раз быстрее, чем скорость диссоциации ИЛ-15 от вариантов антитела 70. После связывания с ИЛ-15, антитело 70 и его варианты остаются связанными дольше и поэтому превосходно ингибируют активность ИЛ-15. Это было проверено в анализе эффективности на основе клеток.

Активность вариантов антитела 70 и AMG714 оценивали в анализе пролиферации НК-92 с ИЛ-15 в комплексе с рецептором-альфа ИЛ-15 при 25 пМ (EC₅₀) для индукции пролиферации клеток, как описано в примере 3. На фиг. 37 и в табл. 6 показано, что IC₅₀ вариантов антитела 70 была в 83-98 раз ниже, чем IC₅₀ AMG714. Следовательно, антитело 70 превосходно ингибировало активность ИЛ-15 в анализе активности на основе клеток.

- 30 040821

Таблица 6. Значения 1С₅р для анти-ИЛ-15 антител в анализе пролиферации НК-92

Антитело	Среднее значение 1С₅о (пМ)	Ст. Откл.	Мин. IC50 (пМ)	Макс. IC50 (пМ)
AMG714	1303,2	666,2	377,8	2653,9
Антитело 70а	14,7	3,8	10,2	22,0
Антитело 70b	13,3	2,5	10,6	16,6
Антитело 70е	15,7	4,7	11,7	20,9
Антитело 70f	14,6	5,0	7,3	29,8

Последующие исследования с антителом 70F привели к среднему сродству к эпитопу, имеющему KD 430 пМ. В целом, эти результаты предполагают, что варианты антитела 70 имеют улучшенную способность к связыванию, аффинность и активность с ИЛ-15 человека по сравнению с AMG714.

Пример 6. Эпитопное картирование антитела 70

Картирование эпитопа проводили с использованием экспериментов по сканированию аланином. Был проведен модельный анализ для определения вероятных экспонированных остатков ИЛ-15, которые не были вовлечены в связывание ИЛ-15Ра. Затем были сконструированы конструкции ИЛ-15, в которых каждый из этих теоретически экспонированных остатков был замещен аланином. Список этих вариантов приведен в табл. 7.

Таблица 7. Список вариантов аланина ИЛ-15

Остаток	Положение	Процент воздействия растворителя на боковую цепь
N	1	37,7
V	3	52
N	4	55
S	7	55,1
D	8	26,8
К	10	66,1
К	11	53,6
Е	13	35,2
D	14	65,5
L	15	35,2
Q	17	70,7
S	18	79,1
н	20	94,5
S	29	34
D	30	78,8
Н	32	57,2
Р	33	61,1
S	34	69,8
к	36	46
к	41	63,6
Q	48	61,4
D	56	43,7
А	57	66,7
Н	60	56,4
D	61	61
Е	64	70,4
I	68	64,6
L	69	31,6
N	72	59,6
S	75	70,2
N	77	77,9
N	79	96,5
V	80	96,9
Т	81	91,5
Е	82	42,9
S	83	93,8
К	86	65,7
Е	92	64,1
К	94	50,5
N	95	59,2
К	97	77,1
Е	98	37,6
Q	101	49,5
н	105	55,2
Q	108	60,7
м	109	55,4
I	111	41,3
N	112	93,3

Эти конструкции затем коэкспрессировали с ИЛ-15Ра и надосадком из экспрессионных культур, протестированных на экспрессию белка и связывание с антителом 70а с использованием SPR.

-31 040821

Используемый рабочий буфер был HBS-EP+ (GE Healthcare). Все взаимодействия были измерены при 25°C, и скорость сбора данных была установлена на 10 Гц. Данные от FC2-1 использовались для анализа. Полученные сенсограммы были проанализированы путем создания двух пользовательских точек отчета, каждая из которых рассчитывалась для окна старта продолжительностью 5 с, начинающегося либо через 10 с после введения образца (раннее связывание), либо за 10 с до окончания диссоциации (позднее связывание). Эти значения были вычтены из значений для нетрансфицированного контроля, и сначала была оценена относительная скорость диссоциации, взяв соотношение этих двух пользовательских точек отчета (позднее связывание/раннее связывание), а затем получив результирующие значения как фракцию значения, рассчитанного для ИЛ-15 человека дикого типа, находящегося в комплексе с рецептором-альфа ИЛ-15 (данные не показаны).

Чтобы подтвердить результаты скрининга надосадка, образцы, которые показали более высокую скорость диссоциации по сравнению с ИЛ-15 человека дикого типа, образующим комплекс с рецептором-альфа ИЛ-15, были очищены и повторно протестированы с помощью SPR. Сенсорный чип белка A (GE Healthcare) использовался для захвата антитела 70a во вторую проточную ячейку до уровня захвата 150-200 RU. Очищенные аланиновые сканируемые конструкции ИЛ-15 разбавляли до 10 мкг/мл в HBSEP+ и затем делали серию 2-кратных разведений. Связывание измеряли путем инъекции 45 мкл каждого разведения при скорости потока 30 мкл/мин через обе проточные ячейки и давали 600 с времени диссоциации. Поверхность чипа регенерировали между циклами с помощью 10-секундного импульса 50 мМ гидроксида натрия. В качестве рабочего буфера использовался HBS-EP+ (GE Healthcare) Все взаимодействия измерялись при 25°C, а скорость сбора данных была установлена на 10 Гц. Данные из Fc2-1 были использованы для анализа, и сгенерированные сенсограммы были подобраны с использованием уравнения Ленгмюра 1:1 (с использованием локальной подгонки Rmax) для определения KD. Данные показаны на фиг. 38 для всех вариантов аланина ИЛ-15, коэкспрессированных с ИЛ-15Ри, которые показали снижение связывания с тестируемыми анти-ИЛ-15 антителами. Антитело 70a имело низкое связывание с мутированным ИЛ-15 с заменой Q108A. AMG714 не имеет связывания или значительно снижает связывание с мутированным ИЛ-15 со следующими аминокислотными заменами: E98A, Q101A, H105A и Q108A. Эти результаты показывают, что мутация этих 4 аминокислот нарушает связывание AMG714 с комплексом ИЛ-15 с альфа-рецептором ИЛ-15, и только мутация Q108 нарушает связывание антитела 70a с ИЛ-15, образующим комплекс с рецептором-альфа ИЛ-15. Результаты на фиг. 38 показывают, что для тестируемых остатков в ИЛ-15 связывание антитела AMG714 уменьшается при изменении остатков, тогда как связывание антитела 70a не снижается путем изменения, учитывая высокую аффинность антитела для ИЛ-15; только изменение Q108 в ИЛ-15 приводило к снижению связывания антителом 70a.

Учитывая, что оба антитела (антитело 70a и AMG714) имели слабое связывание или не связывались с мутантом ИЛ-15 Q108A, был проведен дополнительный скрининг на антитело 70a с другим анти-ИЛ-15 антителом, которое связывало Q108 и комплекс ИЛ-15 дикого типа с равным сродством, демонстрирующим, что мутант Q108A правильно свернут. Аланиновое сканирование идентифицирует остатки, которые при мутировании могут нарушать связывание антитела с ИЛ-15. Чтобы определить точные остатки, которые контактируют с ИЛ-15 и, таким образом, определить эпитоп, связывающий антитело 70a, взаимодействие антитела 70a с ИЛ-15 человека было охарактеризовано с помощью рентгеновской кристаллографии.

При подготовке к экспериментам по кристаллизации рекомбинантный ИЛ-15 человека был экспрессирован и очищен от бактерий. Fab антитела 70a (где FAb представляет собой фрагмент, связывающий антиген) получали путем опосредованного папаином расщепления шарнира антитела, которое отделяет FAb антитела от Fc. FAb очищали с помощью стандартных методов хроматографии на белке-A и формировали комплекс с ИЛ-15. FAb: ИЛ-15 очищали с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру и устанавливали для скрининга на кристаллизацию с использованием скринов на кристаллизацию с разреженной матрицей. Конечные кристаллы, использованные для сбора дифракционных данных, были сформированы в 10% полиэтиленгликоле (ПЭГ) 20000, 20% ПЭГ 500 монометиловом эфире (MME), 30 мМ CaCl₂, 30 мМ MgCl₂, 100 мМ неуказанного имидазола/какодилата натрия/MES (кислота)/Бис-Трис буферной смеси, pH 6,5. Данные дифракции были собраны до 2,25 ::: на линии луча i04 на установке Diamond Synchrotron. Структура была решена путем молекулярной замены с использованием опубликованных структур человеческих молекул ИЛ-15 и FAb в качестве шаблонов для построения модели. Структура была итеративно уточнена по экспериментальным данным до значений R/Rfree 23,6/28,9. Структура показывает, что вариабельные участки антитела 70a связываются в сайтах связывания ИЛ-2Ру и ИЛ-2Pβ ИЛ-15 человека, таким образом блокируя взаимодействие этих рецепторных единиц с ИЛ-15 (фиг. 39A и 39B). Это дополнительно демонстрируется путем изучения взаимодействия боковых цепей ИЛ-15 с боковыми цепями FAb, сравнения их с боковыми цепями ИЛ-15, которые взаимодействуют с ИЛ-2Ру и ИЛ-2Pβ, и поиска боковых цепей или остатков общее для обоих взаимодействий.

В табл. 8 перечислены взаимодействия между боковыми цепями ИЛ-15 и боковыми цепями фрагмента FAb антитела 70a. Боковые цепи антитела 70a FAb, которые связываются с ИЛ-15, образуют паратоп антитела 70a и родственных антител. Представленные в таблице интерпретации соответствуют гид- 32 040821 рофобным взаимодействиям - ван-дер-ваальсовым взаимодействиям между парами атомов; опосредованным водой - опосредованные водой водородные связи между парами атомов; водородная связь водородные связи гетероатомов между 2,5-3,5 :::; H-pi водородная связь - водородная связь, соответствующая донорному/акцепторному атому в ароматическом соединении

Таблица 8. Боковые цепи взаимодействия ИЛ-15 с FAb антитела 70a

Остаток ИЛ-15	Антитело 70а Fab	Название химического атома	Интерпретация
остаток	Название химического атома
CDR	Остаток
Неб Ser7 LyslO	боковая цепь Карбонильный остов Аминогруппа	CDRL1 CDRL1 CDRL1	Tyr31 Arg29 Leu28	Фенильное кольцо Карбонильный остов Карбонильный остов	Гидрофобное взаимодействие Водноопосредованная водородная связь Водородная связь
LyslO	Аминогруппа	CDRL1	Arg29	Карбонильный остов	Водородная связь
LyslO LyslO	Карбонильный остов Алифатическая часть боковой цепи	CDRL1 CDRL1	Tyr32 Tyr32	Г идроксильная группа Фенильное кольцо	Водородная связь Гидрофобное взаимодействие
Glul3	Карбоксилат	CDR ИЗ	Trp99	Индольный азот	Водородная связь
Glul3 Glul3 Asp 14	Карбоксилат Карбоксилат Карбоксилатная группа	CDR L2 CDRL2 CDR LI	Lys51 Asn53 Tyr32	Амидный остов Амидный азот Г идроксильная группа	Водноопосредованная водородная связь Водноопосредованная водородная связь Водородная связь
Asp 14	Карбоксилатная группа	CDRL2	Lys51	Аминогруппа	Водородная связь
Ser29	Карбонильный остов	CDRHl	Ser32	Г идроксильная группа	Водородная связь
Val31	Карбонильный остов	CDR_H2	Tyr52	Г идроксильная группа	Водородная связь
Pro81	Боковая цепь	CDRH2	Tyr54	Фенильные кольца	Гидрофобное взаимодействие
GlnlOl	Амидный азот	CDR_H3	Ile97	Карбонильный остов	Водородная связь
Vai 104	Боковая цепь	CDR_H3	Trp99	Индольная группа	Гидрофобное взаимодействие
Hisl05	Азот боковой цепи	CDR_H3	Gly98	Амидный остов	Водородная связь
Hisl05	Азот боковой цепи	CDRHl	Ser32	Карбонильный остов	Водородная связь
Glnl08	Амидный азот	CDR L3	Gly95	Карбонильный остов	Водородная связь
Glnl08	Амидный кислород	CDR LI	Tyr31	Г идроксильная группа	Водородная связь
Glnl08	Амидный кислород	CDR_H3	Gly99	Карбонильный остов	Водноопосредованная водородная связь
Ilelll	Карбонильный остов	CDRL3	Lys95A	Аминогруппа	Водородная связь
Asnll2	Амидный азот	CDRHl	Trp34	Индольная группа	H-pi водородная связь
Asnll2	Карбонильный остов	CDR_H2	Asn58	Амидный азот	Водородная связь
Thrll3	Метил боковой цепи	CDR_H2	Tyr56	Фенильное кольцо	Гидрофобное взаимодействие
Seri 14	С-конец	CDR L3	Lys95A	Аминогруппа	Водородная связь

Аналогичный анализ был выполнен на рентгеновской структуре четвертичного комплекса рецептора ИЛ-15 (код pdb 4GS7). В табл. 9 показаны остатки ИЛ-15, важные для связывания комплекса ИЛ-15 с ИЛ-2Ру и ИЛ-2₽в на основе водородной связи, которая происходит между боковыми цепями ИЛ-15 и боковыми цепями ИЛ-2₽у и ИЛ-2₽в.

- 33 040821

Таблица 9. Взаимодействия боковых цепей ИЛ-15 с ИЛ-2Pγ и ИЛ-2Рв

Остаток ИЛ-15	Остаток ИЛ-2Ру
Остаток	Название химического атома	Остаток	Название химического атома	Интерпретация
Asp30	Амидный кислород	Asn71	Азот боковой цепи	Водородная связь
Asp30	Карбоксилатная группа	Thrl05	Г идроксильная группа	Водородная связь
His32	Азот боковой цепи	Asp73	Карбоксилатная группа	Водородная связь
Glnl08	Амидный кислород	ТугЮЗ	Г идроксильная группа	Водородная связь
Glnl08	Аминогруппа	Pro207	Амидный кислород	Водородная связь
Glnl08	Аминогруппа	Ser211	Г идроксильная группа	Водородная связь
Asnll2	Карбоксилатная группа	Cysl60	Сульфид	Водородная связь
Asnll2	Аминогруппа	ТугЮЗ	Г идроксильная группа	Водородная связь

Остаток ИЛ-15	Остаток ИЛ-ΙΡβ
Остаток	Название химического атома	Остаток	Название химического атома	Интерпретация
Asnl	Карбоксилатная группа	Thr74	Г идроксильная группа	Водородная связь
Asp 8	Карбоксилатная группа	Hisl33	Азот боковой цепи	Водородная связь
Asp8	Карбоксилатная группа	Tyrl34	Г идроксильная группа	Водородная связь
Glu64	Карбоксилатная группа	Arg42	Аминогруппа	Водородная связь
Asn65	Карбоксилатная группа	Arg42	Аминогруппа	Водородная связь
Asn65	Карбоксилатная группа	Arg42	Аминогруппа	Водородная связь
Ser7	Г идроксильная группа	Glul36	Карбоксилатная группа	Водородная связь
Asn65	Азот боковой цепи	Gln70	Карбонильный остов	Водородная связь

Площадь поверхности, доступная растворителю, образованная при взаимодействии антитела 70 с ИЛ-15 человека, составляет 2270,9 :::2. Эта величина была рассчитана в PYMOL с использованием метода Strake and Rupley (1973) J. Mol. Biol. 79: 351-71.

Сравнение взаимодействий боковой цепи FAb антитела 70a с ИЛ-15 и взаимодействий боковой цепи бета- и гамма-цепей ИЛ2Р с ИЛ-15 идентифицирует несколько общих остатков. S7 (Ser7) образует водородную связь с ИЛ-2РЗ, a Q108 (Gln108) и N112 (Asn112) образуют водородные связи с ИЛ-2Pγ (фиг. 39C-39E). Эти 3 остатка также образуют эпитоп на ИЛ-15, с которым FAb антитела 70a связывается и образует водородные связи, тем самым предотвращая взаимодействие ИЛ-15 с ИЛ-2РЗ и ИЛ-2Pγ.

Тройной мотив тирозина, содержащий Y52/54/56 в CDRH2, обнаруженный во время созревания аффинности и активности антитела 70a, является ключевой детерминантой связывания антитела с ИЛ-15 человека. Изучая кристаллическую структуру (фиг. 39F-39H), можно видеть, что этот мотив скрывает и защищает гидрофобные остатки вокруг спирали-4 ИЛ-15, предотвращая сольватацию и стабилизируя структуру.

Пример 7. Обнаружение проточной цитометрией вариантов связывания с ИЛ-15 на первичных клетках человека

Чтобы дополнительно охарактеризовать антитела, была проверена их способность связывать ИЛ-15 на первичных клетках человека. Периферические мононуклеарные клетки человека (PBMC) были выделены и очищены от лейкоцитарной пленки с использованием Lymphoprep (Axis-Shield, Lymphoprep), и связывание свинца Ат было оценено с помощью анализа проточной цитометрией.

1х10⁶ жизнеспособных PBMC первоначально высевали на лунку в 96-луночный полипропиленовый планшет (Sigma/Corning) и окрашивали красителем Zombie Violet (Biolegend) в течение 20 мин при 4°C. Клетки дополнительно окрашивали TruStain FcX Fc блоком (Biolegend), разведенным в буфере FACS, в течение 10 мин при комнатной температуре. Для окрашивания поверхности, PBMC окрашивали 10 мкг/мл тестируемых антител или антител изотипического контроля (перечислены в табл. 10) и инкубировали в течение 20 мин при 4°C. После иммуноокрашивания образцы затем фиксировали с помощью BD цитофикс/цитоперм (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя и хранили при 4°C

- 34 040821 до анализа. Для внутриклеточного окрашивания PBMC фиксировали с помощью BD цитофикс/цитоперм (BD Biosciences) перед окрашиванием. Образцы анализировали с использованием BD FACSCanto II (BD Biosciences).

Первоначальная дублетная дискриминация была выполнена на всех клеточных событиях, чтобы удалить клеточные агрегаты из анализа. Живые клетки отбирали после исключения мертвых клеток с использованием красителя на жизнеспособность. Первичное стробирование лейкоцитов разделяло клетки на следующие: CD3-CD8- клетки, CD3+CD8+ T-клетки и CD3+CD8- (предположительно CD4⁺) Tклетки. Дальнейший анализ CD3- популяции разделил клетки на CD19+ В-клетки и CD19- клеточную популяцию. Последняя популяция снова была подвергнута дополнительному стробированию для отбора на CD56dimCD16+ и CD56briCD16dim/- НК-клетки. Кроме того, на основании уровней экспрессии CD14 и CD16 моноциты (Hi SSC-популяция) были впоследствии подразделены на три основных подгруппы моноцитов: классические (CD14+ CD16-), промежуточные (CD14intCD16int) и неклассические (CD14dimCD16+). Анализ данных проводился с использованием программного обеспечения для анализа FLOWJO®V.10.

Таблица 10. Список антител и конъюгатов

Специфичность	Конъюгат	Клон	Виды и Изотип	Поставщик
Анти-человеческие антитела
CD3	APC-Vio770	REA613	Рекомбинантный человеческий IgGl	Miltenyi Biotec
CD8	VioGreen	BW135/80	IgG2a мыши	Miltenyi Biotec
CD14	PerCP	TUK4	IgG2a к мыши	Miltenyi Biotec
CD16	FITC	REA423	Рекомбинантный человеческий IgGl	Miltenyi Biotec
CD19	PE	LT19	IgGl к мыши	Miltenyi Biotec
CD56	PE Vio770	AF12-7H3	IgGl мыши	Miltenyi Biotec
ИЛ-15	iFluor647	Антитело 70a	IgGl к человека	Внутренний
	iFluor647	Антитело 70b	IgGl к человека	Внутренний
	iFluor647	Антитело 70e	IgG4 λ человека	Внутренний
iFluor647 Антитело 70f Антитела изотипического контроля	IgG4 λ человека	Внутренний
Анти-KLH СЗ IgGl	iFluor647		IgGl человека	Внутренний
Анти-KLH СЗ IgG4	iFluor647		IgG4 человека	Внутренний
АРС: аллофикоцианин; FITC: Флуоресцеин изотиоцианат; РЕ: Фикоэритрин; РегСР: Перидинина хлорофилл белок

Репрезентативное связывание вариантов антитела 70 с моноцитами продемонстрировано на фиг. 40. Умеренное связывание вариантов антитела 70 было обнаружено на клеточной поверхности всех подгрупп моноцитов (классических, промежуточных и неклассических). Сообщалось о более высоких уровнях связывания во внутриклеточном связывании во всех подгруппах моноцитов. Маргинальные различия в уровнях обнаружения связывания были обнаружены между обоими вариантами антитела 70. На поверхности T-клеток CD4⁺ и CD8⁺ и всех подмножеств НК-клеток не было обнаружено или было обнаружено слабое связывание. Эти результаты показывают, что варианты антитела 70 были способны связывать ИЛ-15 человека на первичных клетках.

Пример 8. Эффективность анти-ИЛ-15-антител в животных моделях

8.1 Нейтрализация in vivo ИЛ-15 человека и ИЛ-15 в комплексе с рецептором-альфа ИЛ-15

Это исследование было предпринято для определения степени, в которой рекомбинантный ИЛ-15 человека или комплекс ИЛ-15/ИЛ-15Ра может индуцировать размножение НК и НКТ-клеток у мышей C57BL/6, и степени, в которой иллюстративное антитело по данному изобретению может нейтрализовать такую индукцию.

Группам из 8 самцов мышей C57Bl/6 вводили одну дозу антитела 70f (в дозе 10, 3, 1, 0,3 или 0,1 мг/кг) или изотипического контроля (10 мг/кг) внутрибрюшинно в день 1 (за 1 ч до первой инъекции цитокина). НК1.1+ клетки индуцировали внутрибрюшинной инъекцией рекомбинантного комплекса ИЛ-15 (где ИЛ-15Ра представляет собой химеру Fc) (1,5 мкг/мышь) ежедневно в течение 3 дней с 1 по 3 день. На день 4 собирали селезенки мышей. Суспензии клеток готовили из всей селезенки каждой мыши и подсчитывали на автоматическом счетчике клеток. Количество НК1.1+ оценивали по суспензиям клеток методом проточной цитометрии в расчете на % от общего количества спленоцитов. Использовали конъюгированное с фикоэритрином антимышиное НК-1.1 (BD553165). 50000 событий/образец были получены на цитометре.

Как продемонстрировано на фиг. 41, инъекция комплекса ИЛ-15/ИЛ-15Ра индуцировала накопле

- 35 040821 ние НК1.1+ клеток в селезенке мыши. Это накопление может быть значительно ингибировано лечением антителом 70f от 0,3 мг/кг, но не антителом изотипического контроля человека.

8.2. Влияние анти-ИЛ-15 антител на количество циркулирующих НК-клеток у приматов, не являющихся человеком

Ранее было показано, что введение анти-ИЛ-15 антител снижает количество циркулирующих НКклеток у обезьян Cynomolgus (Lebrec et al. (2013) J. Immunol. 191:5551-5558). Чтобы дополнительно охарактеризовать антитело 70, следствие антагонистической активности ИЛ-15 на циркулирующих НКклетках тестировали in vivo. Группы из 4 самцов обезьян cynomologus получали одну внутривенную инъекцию антитела 70f в дозе 1 или 10 мг/кг или антитела 70b в дозе 10 мг/кг. Циркулирующие количества НК-клеток были определены количественно по экспрессии маркера НК-клеток CD159a (NKG2A), определенной с помощью анализа проточной цитометрии образцов цельной крови до введения дозы и в дни исследования 2, 5, 8, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 102, 120 и 150.

Отдельные временные точки для каждой обезьяны и среднее (сплошная линия) количество НКклеток периферической крови продемонстрированы на фиг. 42. Введение антитела 70f в дозе 1 или 10 мг/кг или антитела 70b в дозе 10 мг/кг приводило к значительному уменьшению количества циркулирующих НК-клеток до введения дозы, начиная с 7 дня исследования, которое поддерживалось до 120 дня исследования у большинства животных.

8.3. Влияние анти-ИЛ-15 антител на резус-модель целиакии у приматов, не являющихся человеком

Хроническая диарейная болезнь под названием Чувствительная к глютену энтеропатия была описана в подгруппе макак-резусов в неволе, которых кормили глютенсодержащей пищей. При кормлении глютенсодержащей пищей чувствительные к глютену макаки демонстрировали признаки и симптомы целиакии, в том числе наличие аутоантител к трансглутаминазам кишечной ткани, антиглиадиновые сывороточные антитела, снижение резорбции питательных веществ, снижение метаболизма ксенобиотиков, атрофию ворсинок, снижение разнообразия микробиома кишечника, хроническую диарею, потерю веса, предрасположенность к раку и иммуногенетическую (MHC II-связанную) ассоциацию (Bethune MT et al. (2008) PLoS ONE. 3(2):e1614). Безглютеновая диета полностью изменила эти клинические, гистологические и серологические особенности, в то время как повторное введение пищевого глютена вызвало быстрый рецидив. Интересно, что биопсия чувствительных к глютену макак показала сверхэкспрессию ИЛ-15 в тканях тонкого кишечника (Sestak K. et al. (2016) Nutrients. 8(7):401.)

Способность анти-ИЛ-15 антитела по изобретению ингибировать глютениндуцированные симптомы тестировали на макаках-резусах с чувствительной к глютену энтеропатией. Безглютеновые (GFD) и глютенсодержащие (GD) диеты давали всем 6 чувствительным к глютену макакам, чтобы вызвать стадии иммунологической ремиссии и рецидива, соответственно, характеризуемые антиглиадин (AGA) и антитрансглюатаминаза 2 (TG2) положительными и отрицательными ответами антител плазмы, как описано в Sestak et al., 2015; 2016. После индукции рецидива AGA/TG2 антитела, антитело 70f внутривенно (в/в) вводили еженедельно в дозе 10 мг/кг (BW) трем животным в течение 28 дней (группа 1) и трем животным в течение 90 дней (группа 2) в то время как макаки по-прежнему питались глютенсодержащей диетой. Кишечные биопсии были взяты на этапах исследования, чтобы измерить отношение высоты ворсинки к глубине крипты, и количество интраэпителиальных лимфоцитов (IEL). Присутствие аутоантител против антител к трансглутаминазе-2 и антиглиадину измеряли на образцах сыворотки. Дизайн исследования продемонстрирован на фиг. 45A.

Оценка антител AGA и TG2 в плазме (IgG), энтеропатии GS, включая морфометрическую оценку высоты ворсинок тонкого кишечника в зависимости к глубине крипты, то есть отношение V/C, была проведена в соответствии с ранее установленными протоколами Sestak et al, 2015; 2016. Биопсии тонкого кишечника собирали в моменты времени, соответствующие иммунологическому рецидиву (GD) и ремиссии (GFD), а также началу и концу периода лечения анти-ИЛ-15 антителом. Биопсии были собраны и обработаны для подсчета внутриэпителиальных лимфоцитов (IEL), как описано Sestak et al., 2016.

Результаты

Оценка биопсии тканей тонкого кишечника, собранной от чувствительных к глютену макак-резус до, во время и после лечения анти-ИЛ-15 антителом, показала улучшение энтеропатии при морфологической оценке структуры ткани тонкого кишечника, то есть соотношения высоты ворсинки к глубине крипты (V/C). На глютеновой диете у макак в обеих группах отмечалась значительная потеря высоты ворсинок, структуры ткани глубины крипты (фиг. 45B). Соотношения V/C значительно улучшились при лечении анти-ИЛ15-антителами (p<0,0001) в пользу обеих групп целиакии, поскольку все обработанные животные демонстрировали повышенную высоту ворсинок тонкого кишечника, то есть соотношения V/C в степени сопоставимой со здоровым соответствующему возрасту контролю (фиг. 45B).

Чтобы оценить эффективность лечения анти-ИЛ-15 антителами макак-резусов, чувствительных к глютену, сравнивали количество IEL тонкого кишечника между образцами биопсии, взятыми в моменты времени, представляющие диету GD (6 месяцев), GFD (3 месяца) и лечение анти-ИЛ-15 антителами (дни 35 и 61) во время GD (фиг. 45C). По сравнению с подсчетом IEL, взятым в более ранний момент времени, когда животные находились на GD, в обеих группах, получавших лечение анти-ИЛ-15 антителом,

-

Claims

уровень IEL был значительно ниже (p<0,0001). Несмотря на то, что на диете, содержащей глютен, лечение анти-ИЛ15 антителами, измеренное на 35-й день после лечения (TD35) в группе 1 и на TD61 у макак группы 2, привело к большему снижению IEL (p<0,0001), чем связанное с 3 месяцами GFD (фиг. 45C).

До начала лечения уровни антиглиадиновых антител увеличивались при воздействии глютена и снижались на безглютеновой диете у 5/6 животных (животное 1B не имело ответа AGA), что указывало на то, что животные были чувствительны к глютену (фиг. 45D). Лечение анти-ИЛ-15 снижала антиглиадиновые антитела (AGA) у 5/5 животных, которые имели высокие уровни AGA до лечения, что было удивительно, учитывая, что эти животные все еще подвергались воздействию GD.

Таким образом, лечение анти-ИЛ15 антителами ослабляло индуцированное глютеном повреждение слизистой оболочки тонкого кишечника (улучшенное отношение V/C), ослабляло индуцированное глютеном воспаление слизистой оболочки тонкого кишечника (уменьшенное количество IEL) и ослабляло индуцированные глютеном сывороточные антитела (сниженные антиглиадиновые антитела), как измерено в модели макаки-резуса при целиакии.

Описание не ограничено вариантами осуществления, описанными и приведенными в качестве примера выше, но допускает изменение и модификацию в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Антитело, содержащее HCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, причем указанное антитело специфически связывается с ИЛ-15 человека, причем указанный ИЛ-15 образует комплекс с рецептором альфа ИЛ-15(ИЛ-15Pα).
2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что содержит HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
3. Антитело по п.1 или 2, отличающееся тем, что содержит LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30;

отличающееся тем, что содержит LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31;

отличающееся тем, что содержит LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31;

отличающееся тем, что содержит LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; или отличающееся тем, что содержит LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 519.
4. Антитело по п.3, отличающееся тем, что содержит (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

отличающееся тем, что антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий (i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;

отличающееся тем, что антитело содержит (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 456;

отличающееся тем, что антитело содержит (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 458; или отличающееся тем, что антитело содержит (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 459, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 460.
5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что содержит HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и FR3 тяжелой цепи, со

- 37 040821 держащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
6. Антитело по п.5, отличающееся тем, что содержит (i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и (ii) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
7. Антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем указанное антитело специфически связывается с ИЛ-15 человека, причем указанный ИЛ-15 образует комплекс с рецептором альфа ИЛ-15 (ИЛ-15Ри).
8. Антитело по п.7, отличающееся тем, что содержит:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455;

(d) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457; или (e) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 459.
9. Антитело, которое специфически связывается с ИЛ-15 человека, причем указанный ИЛ-15 образует комплекс с рецептором альфа ИЛ-15 (ИЛ-15Ри), при этом указанное антитело содержит:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 505;

(d) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 507;

(e) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 509;

(f) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 510;

(g) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 455;

(h) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 503;

(i) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 457;

(j) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 505;

(k) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 506;

(l) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID

- 38 040821

NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 507;

(m) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;

(n) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 509; или (o) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 454, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 510.
10. Антитело по любому из пп.1-9, отличающееся тем, что содержит константный домен IgG.
11. Антитело по п.10, отличающееся тем, что содержит константный домен IgG4, константный домен IgG1 или константный домен IgG2.
12. Антитело по п.11, отличающееся тем, что константный домен IgG4 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51, отличающееся тем, что константный домен IgG1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, или отличающееся тем, что константный домен IgG2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43.
13. Антитело по любому из пп.1-12, отличающееся тем, что ингибирует пролиферацию клеток натуральных киллеров (НК) с IC₅₀ от около 0,1 до около 900 пМ в анализе пролиферации НК-клеток, отличающееся тем, что антитело ингибирует пролиферацию НК-клеток с IC₅₀ от около 1 до около 60 пМ в анализе пролиферации НК-клеток, отличающееся тем, что антитело ингибирует пролиферацию НК-клеток с IC₅₀ от около 5 до около 35 пМ в анализе пролиферации НК-клеток, отличающееся тем, что антитело способно нейтрализовать ИЛ-15.
14. Антитело по любому из пп.1-13, отличающееся тем, что связывается с эпитопом, содержащим остаток Q108 ИЛ-15 человека.
15. Антитело по п.14, в котором эпитоп дополнительно содержит остатки S7 и N112 ИЛ-15 человека.
16. Антитело по любому из пп.1-16, отличающееся тем, что имеет афинность к ИЛ-15 человека, которая имеет значение константы диссоциации (KD) менее чем около 1,8x10’9 М, как определено поверхностным плазмонным резонансом, или при этом константа диссоциации (KD) составляет менее чем 1x10’9 М.
17. Антитело, которое связывается с ИЛ-15, причем указанный ИЛ-15 находится в комплексе с рецептором альфа ИЛ-15 (ИЛ-15Ра), содержащее вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, отличающееся тем, что указанный вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и отличающееся тем, что вариабельный участок легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
18. Антитело по п.17, отличающееся тем, что содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, отличающееся тем, что антитело, дополнительно содержит константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, или отличающееся тем, что антитело, дополнительно содержит константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, или отличающееся тем, что антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.
19. Композиция для лечения целиакии, рефрактерной целиакии, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, диабета 1 типа, очаговой алопеции, T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов, аутоиммунного заболевания, аутоиммунного заболевания, при котором нарушается регуляция ИЛ-15, воспалительного заболевания или воспалительного состояния, или воспалительного заболевания или воспалительного состояния, при котором нарушается регуляция ИЛ15, содержащая антитело по любому из пп.1-18 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
20. Применение антитела по любому из пп.1-18 для лечения целиакии, рефрактерной целиакии, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, диабета 1 типа, очаговой алопеции, T-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов, аутоиммунного заболевания, аутоиммунного заболевания при котором нарушается регуляция ИЛ-15, воспалительного заболевания или воспалительного состояния, или воспалительного заболевания или воспалительного состояния при котором нарушается регуляция ИЛ-15.

-