KR102651290B1 - 항-il-5 항체 - Google Patents

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아담 클라크
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브리짓 앤 쿡세이
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세파론 엘엘씨
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Abstract

인간 IL-5에 면역특이적으로 결합하는 완전 인간 항체 분자가 본원에 개시된다. 항체 분자는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 적어도 약 40 pM의 평형 친화성 상수(KD)로 인간 IL-5에 결합할 수 있다.
[대표도]
도 13a 및 도 13b

Description

항-IL-5 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 12월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/438,502호의 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다. 2017년 11월 30일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 102085.000906_sl.txt이며 93,529　바이트 크기이다.
기술 분야
IL-5에 면역특이적으로 결합하는 신규한 항체 분자, 및 개시된 항체의 용도가 본원에 개시된다.
인터루킨-5(IL-5)는 B 세포 및 호산구 모두의 증식 및 분화를 유발하는 T-헬퍼 2(Th2) 사이토카인이다. B 세포에서, IL-5는 또한 면역글로불린 분비를 증가시킨다. IL-5는 호산구의 핵심 조절자이며, 호산구에서 그것은 또한 성숙, 조직으로의 이동, 생존, 및 세포자멸사의 방지를 조절한다.
2개의 분리된 모티프를 통해, IL-5는 그의 특이적 수용체(IL5-Rα) 및 인터루킨-3(IL-3)과 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GMCSF) 사이에 공유되는 공통 β-사슬(βc)인 신호전달 수용체에 결합한다. IL5-Rα에 대한 IL-5의 친화성은 중간-낮은 nM 범위(0.2-100 nM)라고 보고되었으며; 이것은 βc의 존재시 중간 pM 범위(~100 pM)로 바뀐다. IL5-Rα는 IL-5에 특이적으로 결합한 다음, βc를 IL-5R로 동원한다.
인터루킨-5(IL-5)를 표적화하는 치료 잠재력은 문헌에서의 광범위한 검증 및 레슬리주맙 및 메폴리주맙 모두에 대한 최근 양성 3상 임상 데이터에 의해 입증되었다.
표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 적어도 약 40 pM의 평형 친화성 상수(KD)로 인간 IL-5에 면역특이적으로 결합하는 인간 항체 분자가 본원에 개시된다.
서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호: 5, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7, 42, 또는 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15, 48, 51, 54, 57, 60, 또는 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체 분자가 또한 제공된다.
개시된 항체 분자는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 17, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 또는 67의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 가변성(즉, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)은 CDR 서열의 외부에서 발생한다.
개시된 항체 분자는 서열번호: 18 또는 20의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 19, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 또는 68의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있고, 가변성(즉, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)은 CDR 서열의 외부에서 발생한다.
개시된 항체 분자를 코딩하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 개시된 항체 분자를 발현하도록 형질전환된 세포가 또한 제공된다.
본원에 개시된 항체 분자 중 어느 것을 포함하는 약제학적 조성물이 또한 개시된다.
호산구성 천식(eosinophilic asthma), 과다호산구 증후군(hypereosinophilic syndrome), 호산구성 개입(eosinophilic involvement)을 갖는 비용종(nasal polyposis), 다발혈관염(polyangiitis)을 갖는 호산구성 육아종증(eosinophilic granulomatosis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis) 또는 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis)을 치료하기 위해, 본원에 개시된 항체 분자 중 어느 것, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 또는 호산구성 식도염을 갖는 대상을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염, 또는 호산구성 식도염의 치료에서, 본원에 개시된 항체 분자 중 어느 것, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량의 용도가 또한 제공된다.
호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 또는 호산구성 식도염의 치료를 위한 약제의 제조에서, 본원에 개시된 항체 분자 중 어느 것, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 용도가 또한 제공된다.
하기 상세한 설명뿐만 아니라 요약은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 이해된다. 개시된 항체 분자, 방법, 및 용도를 예시하기 위해, 항체 분자, 방법, 및 용도의 예시적인 구현예가 도면에 나타나 있으나, 항체 분자, 방법, 및 용도는 개시된 특정 구현예에 한정되지 않는다. 도면에서:
도 1은 항체 변이체 3A5.001(IgG4 포맷)이 원래의 항체 3A5(IgG1 포맷)와 동등한 효력을 보유하였음을 보여주는 TF-1.6G4 분석을 예시한다.
도 2는 항체 변이체 3A5.040이 모 항체 3A5.001과 동등한 효력을 보유하였음을 보여주는 TF-1.6G4 분석을 예시한다.
도 3은 원래의 3A5.040 VH 서열(상부 서열)에 정렬된, 3A5.040 VH CDR 상에서 생성된 상이한 단일 아미노산 치환의 위치 및 신원을 보여주는 그래픽 행렬이다. 상자는 AbM 명명법에 따라 CDR 잔기로 지정된 잔기를 함유한다. CDR 잔기 이외에도, 실시예 "항체의 기능 시험 및 특성규명"에 기재된 바와 같이 카밧(Kabat) 잔기 번호 93 및 94(HC CDR3에 인접함)이 변형되었다. 이 도면에 열거된 다양한 서열은 서열번호:73에 제공되어 있다.
도 4는 원래의 3A5.040 VL 서열(상부 서열)에 정렬된, 3A5.040 VL CDR에 생성된 상이한 단일 아미노산 치환의 위치 및 신원을 보여주는 그래픽 행렬이다. 상자는 AbM 명명법에 따라 CDR 잔기로 지정된 잔기를 함유한다. 이 도면에 열거된 다양한 서열은 서열번호:74에 제공되어 있다.
도 5는 3A5.040 VL 서열(상부 서열)에 정렬된 예시적인 경쇄 CDR 공통 서열을 예시한다. (변이체 kd 대 3A5.040 kd의 비율 ≥ 1.5) 및 (변이체 발현 수준 대 3A5.040 발현 수준의 비율 ≥0.5)의 실시예에 기재된 포함 기준에 따라 잠재적인 개선을 나타낸 3A5.040 VL CDR 단일 아미노산 치환 변이체가 공통(consensus) 서열에 포함되었다. CDR 정의 및 넘버링은 각각 AbM 및 카밧 명명법에 따른다. 상자는 CDR 잔기의 위치를 식별한다. 이 도면에 열거된 다양한 서열은 서열번호:75에 제공되어 있다.
도 6은 2.5, 1.25, 0.625, 0.313 및 0.156 μg/mL에서 재조합 인간 IL-5에 결합하는 3A5.046 항체의 다중 농도 비아코어(Biacore) 동역학 분석을 예시한다. 센서그램은 상부 기록(trace)에서 2.5 μg/mL IL-5부터 하부 기록에서 0.156 μg/mL IL-5까지의 순으로 IL-5의 감소하는 농도를 보여준다.
도 7a 및 도 7b는 IL-5에 반응한 TF-1.6G4 세포의 증식, 및 3A5.046에 의한 IL-5 유도된 증식의 억제 효력을 예시한다. 3A5.046은 메폴리주맙(mepolizumab)보다 인간 IL-5(도 7a) 및 시노몰구스 원숭이 IL-5(도 7b)의 더 강력한 억제제였다.
도 8a 및 도 8b는 3A5 항체 및 대조군 캡처 항체(R&D Systems)를 사용하여 개발된 예시적인 ELISA를 예시한다. ELISA는 재조합 IL-5(도 8a) 및 3명의 공여자의 CD3/CD28/IL-33 활성화된 일차 인간 T-세포로부터 생산된 IL-5(도 8b)를 검출할 수 있었다. 도 8b 상부 패널: 공여자 1, 도 8b 중간 패널: 공여자 3; 도 8b 하부 패널: 공여자 4.
도 9는 실시예에 기재된 바와 같이 CD34+ 제대혈 세포가 IL-5 및 다른 사이토카인을 사용하여 표현형적으로 성숙한 호산구로 분화한 실험의 결과를 예시한다. 항체 3A5.046은 IL-5 유도된 호산구 분화를 억제하는데 있어 메폴리주맙보다 더 강력하였다.
도 10a, 도 10b, 도 10c, 도 10d, 및 도 10e는 인간 IL-5(도 10a), 시노몰구스 원숭이 IL-5(도 10b), 마우스 IL-5(도 10c), 랫트 IL-5(도 10d), 및 기니어 피그 IL-5(도 10e)에 대한 항체 3A5.046 결합의 비아코어 교차반응성 분석의 결과를 예시한다. 이중 참조(기준) 센서그램이 1 μg/ml 또는 10 μg/ml의 사이토카인에의 결합에 대해 나타나 있다.
도 11a, 도 11b, 도 11c, 및 도 11d는 항체 3A5.046의 비아코어 특이성 분석의 결과를 예시한다. 이중 참조 센서그램이 10 μg/ml(도 11a 및 도 11b) 또는 1 μg/ml(도 11c 및 도 11d)의 사이토카인에의 결합에 대해 나타나 있다.
도 12는 기도 호산구증가증(airway eosinophilia)의 시노몰구스 원숭이 모델에서 돼지 회충(A. suum) 도전의 결과를 예시한다. 2일에, 3A5.046 처리된 동물과 비히클(위약) 처리된 동물을 비교할 때 폐(BALF) 호산구 수의 실질적인 차이가 있었다(p<0.01; 만-휘트니 시험).
도 13a 및 도 13b는 돼지 회충 도전 1주 전에 3A5.046 또는 아이소타입 매치된 대조군 항체("위약")로 전처리된 시노몰구스 원숭이에서 돼지 회충 도전 후 10일 동안 혈액 호산구 반응을 예시한다(도 13a). 도 13b는 도전 후 45일(투여 후 52일)까지 3A5.046 항체로 처리된 동물에 대한 혈액 호산구 수의 추가 세부사항을 예시한다. 호산구 수는 도전 1주 전에 3A5.046의 단일 용량 후 도전 후 적어도 45일 동안 기준선 미만으로 유지되었다.
도 14는 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) 도전에 반응한 인간 IL-5 넉인(knock-in; KI) 랫트 모델에서의 BALF 호산구 수준을 예시한다. 이 모델은 알터나리아 도전 후 BALF 호산구의 수를 조절하는 항-IL-5 항체의 효력을 시험하는데 사용될 수 있다.
개시된 항체 분자, 방법, 및 용도는 본 개시 내용의 일부를 형성하는 첨부된 도면과 함께 하기 상세한 설명을 참조하여 보다 용이하게 이해될 수 있다. 개시된 항체 분자, 방법, 및 용도는 본원에 기재되고/거나 나타낸 특정 항체 분자, 방법, 및 용도에 한정되지 않으며, 본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 단지 예로서 설명하기 위한 것이며, 청구된 항체 분자, 방법, 및 용도를 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 가능한 메커니즘 또는 작용 방식 또는 개선 이유에 관한 임의의 설명은 단지 예시적인 것을 의미하며, 개시된 항체 분자, 방법, 및 용도는 임의의 이러한 제시된 메커니즘 또는 작용 방식 또는 개선 이유의 정확성 또는 부정확성에 의해 제약받지 않아야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 설명은 항체 분자 및 상기 항체 분자를 사용하는 방법을 언급한다. 개시 내용이 항체 분자와 관련된 특징 또는 구현예를 기술하거나 청구하는 경우, 이러한 특징 또는 구현예는 상기 항체 분자를 사용하는 방법에 동일하게 적용될 수 있다. 마찬가지로, 개시 내용이 항체 분자를 사용하는 방법과 관련된 특징 또는 구현예를 기술하거나 청구하는 경우, 이러한 특징 또는 구현예는 항체 분자에 동일하게 적용될 수 있다.
수치의 범위가 본원에 열거되거나 확립되는 경우, 범위는 이의 종점 및 범위 내의 모든 개별 정수 및 분수를 포함하며, 또한 마치 더 좁은 범위 각각이 명시적으로 열거된 것과 동일한 정도로 언급된 범위 내에서 값의 더 큰 그룹의 하위그룹을 형성하기 위해 상기 종점 및 내부 정수 및 분수의 모든 다양한 가능한 조합에 의해 형성되는 내부의 더 좁은 범위 각각을 포함한다. 수치의 범위가 언급된 값보다 큰 것으로 본원에 언급되는 경우, 범위는 그럼에도 불구하고 유한하며, 본원에 기재된 본 발명의 문맥 내에서 작동가능한 값에 의해 그 상한이 한정된다. 수치의 범위가 언급된 값보다 작은 것으로 본원에 언급되는 경우, 범위는 그럼에도 불구하고 0이 아닌 값에 의해 그 하한이 한정된다. 본 발명의 범위는 범위를 정의할 때 열거된 특정 값에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 모든 범위는 포괄적이며 조합될 수 있다.
특정 수치의 언급은 문맥이 달리 명확히 지시하지 않는 한 적어도 상기 특정 값을 포함한다.
값이 선행사 "약"을 사용하여 근사치로 표현될 때, 특정 값이 또 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 수치 범위, 컷오프, 또는 특정 값과 관련하여 사용될 때 용어 "약"은 열거된 값이 열거된 값으로부터 최대 10% 정도까지 달라질 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 용어 "약"은 지정된 값으로부터 ± 10% 이하의 변동, ± 5% 이하의 변동, ± 1% 이하의 변동, ± 0.5% 이하의 변동, 또는 ± 0.1% 이하의 변동을 포함하는데 사용된다.
명확성을 위해 별도의 구현예의 문맥에서 본원에 기재된 개시된 항체 분자, 방법, 및 용도의 특정 특징이 또한 단일 구현예와 조합하여 제공될 수 있음이 이해되어야 한다. 반대로, 간결성을 위해 단일 구현예의 문맥에서 기재된 개시된 항체 분자, 방법, 및 용도의 다양한 특징이 또한 개별적으로 또는 임의의 하위조합으로 제공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 복수를 포함한다.
설명의 양태와 관련된 다양한 용어가 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 지시되지 않는 한 당업계의 통상의 의미가 부여되어야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본원에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다.
용어 "포함하는"은 용어 "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"에 의해 포함되는 예를 포함하는 것으로 의도되지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 유사하게도, 용어 "본질적으로 구성되는"은 용어 "구성되는"에 의해 포함되는 예를 포함하는 것으로 의도되지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "항체 분자"는 광의로 의미되며, 전장 면역글로불린 분자 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로 할당될 수 있다. IgA 및 IgG는 아이소타입 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로서 더 하위분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 2개의 명백하게 구별되는 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 할당될 수 있다.
"항원 결합 단편"은 모 전장 항체의 항원 결합 특성을 보유하는 면역글로불린 분자의 부분(즉 "이의 항원 결합 단편")을 지칭한다. 예시적인 항원 결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 2, 및/또는 3; 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 2, 및/또는 3; 중쇄 가변 영역(VH); 경쇄 가변 영역(VL); 및 이의 조합을 가질 수 있다. 항원 결합 단편은 VL, VH, 불변 경쇄(CL), 및 불변 중쇄 1(CH1) 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디설파이드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; 및 VH 도메인 또는 VL 도메인으로 구성된 도메인 항체(dAb) 단편(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989)을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 조작되고 합성 링커를 통해 서로 연결되어 단일 사슬(쇄) 항체의 다양한 유형을 형성할 수 있고, 여기서 VH 및 VL 도메인이 별도의 단일 사슬 항체 작제물에 의해 발현되는 경우 VH/VL 도메인은 분자내 또는 분자간에 쌍을 이뤄, 예를 들어 국제특허 공개 WO제1998/44001호, WO제1988/01649호, WO제1994/13804호, 및 WO제1992/01047호에 기재된 단일 사슬 Fv(scFv) 또는 디아바디와 같은 1가 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 전장 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
문구 "면역특이적으로 결합한다"는 분자의 혼합된 집단을 함유하는 샘플에서 다른 분자에 우선적으로 결합하지 않고 그의 표적(항-IL-5 항체 분자의 경우 IL-5)에 우선적으로 결합하는 개시된 항체 분자의 능력을 지칭한다. IL-5에 면역특이적으로 결합하는 항체 분자는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없다(예컨대, 항-IL-5 항체는 IL-5 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, IL-5에 면역특이적으로 결합하는 항체 분자는, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis(시노몰구스 원숭이)) IL-5를 포함하는 인간 IL-5의 오르소로그(ortholog)와 같은 다른 항원과 교차 반응성을 가질 수 있다. 본원에 개시된 항체 분자는 천연적으로 생산된 인간 IL-5 및 포유동물 또는 원핵 세포에서 재조합으로 생산된 IL-5 모두에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
항체 가변 영역은 3개의 "항원 결합 부위"에 의해 중단된 4개의 "프레임워크(framework)" 영역으로 구성된다. 항원 결합 부위는 다양한 용어를 사용하여 정의된다: (i) 상보성 결정 영역(CDR), VH에서 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및 VL에서 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3)는 서열 가변성에 기초한다(Wu and Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991); 및 (ii) "초가변 영역"("HVR" 또는 "HV"), VH에서 3개(H1, H2, H3) 및 VL에서 3개(L1, L2, L3)는 초티아와 레스크(Chothia and Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987)에 의해 정의된 바와 같이 구조가 초가변인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. CDR의 AbM 정의가 또한 널리 사용되는데, 그것은 카밧 및 초티아 넘버링 체제 사이의 절충안이며, 옥스포드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되었기 때문에 그렇게 불린다(Rees, A.R., Searle, S.M.J., Henry, A.H.and Pedersen, J.T. (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172). 다른 용어는 "IMGT-CDR"(Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) 및 "특이성 결정 잔기 용법"(SDRU)(Almagro Mol Recognit 17:132-43, 2004)을 포함한다. 국제 임뮤노제네틱스(International ImMunoGeneTics(IMGT)) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 항원 결합 부위의 표준화된 넘버링 및 정의를 제공한다. CDR, HV 및 IMGT 묘사 사이의 대응은 문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]에 기재되어 있다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원 결합 부위인 것으로 정의된 서열 이외의 가변 영역의 나머지 서열이다. 항원 결합 부위는 상기 기재된 바와 같이 다양한 용어에 의해 정의될 수 있기 때문에, 프레임워크의 정확한 아미노산 서열은 항원 결합 부위가 어떻게 정의되었는지에 달라진다. "인간 항체", "완전 인간 항체" 및 유사 용어는 프레임워크 및 항원 결합 부위 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 기원의 서열로부터 유래된다. 항체의 가변 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우, 인간 항체는 인간의 기원의 서열"로부터 유래된" 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 시스템은 파아지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 및 본원에 기재된 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 마우스와 같은 형질전환 비인간 동물을 포함한다. "인간 항체"는, 예를 들어, 자연발생 체세포 돌연변이 또는 가변 도메인(프레임워크 및 항원 결합 부위), 또는 불변 도메인 내에 치환의 의도적인 도입으로 인해, 인간 생식계열 또는 재배열된 면역글로불린 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 전형적으로, "인간 항체"는 인간 생식계열 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. 일부 경우, "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000]에 기재된 바와 같이, 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 공통 프레임워크 서열 또는, 예를 들어, 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 및 국제 특허 공개 WO제2009/085462호]에 기재된 바와 같이, 파아지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리 내로 혼입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다. 항원 결합 부위가 비인간 종으로부터 유래된 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
인간 항체는, 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되었음에도 불구하고, 합성 CDR 및/또는 합성 프레임워크를 혼입하는 파아지 디스플레이와 같은 시스템을 사용하여 생성될 수 있거나, 또는 가변 영역 또는 불변 영역 또는 둘 모두에서 항체 특성을 개선시키기 위해 시험관내 돌연변이유발되어, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에서 자연적으로 존재하지 않는 항체를 초래할 수 있다.
"재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 모든 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환성이거나 트랜스염색체성인(transchromosomal) 동물(예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마(하기에 더 기술됨); 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체; 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 및 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing)하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 항체, 또는 Fab 암 교환을 사용하여 시험관내에서 생성된 항체를 포함한다.
"단클론 항체"는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 집단을 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내거나, 또는 이중특이적 단클론 항체의 경우, 2개의 구별되는 에피토프에 대해 이중 결합 특이성을 나타낸다. 따라서, 단클론 항체는, 항체 중쇄로부터 C-말단 리신을 제거하는 것과 같은 가능한 널리 알려진 변경을 제외하고, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄에서 단일 아미노산 조성을 갖는 항체 집단을 지칭한다. 단클론 항체는 항체 집단 내에 이종 글리코실화를 가질 수 있다. 단클론 항체는 단일특이적 또는 다중특이적, 또는 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 이중특이적 항체는 용어 단클론 항체에 포함된다.
"에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 지칭한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티의 화학적 활성(예컨대, 극성, 비극성, 또는 소수성) 표면 그룹으로 구성되며, 특정 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 구조 공간 단위를 형성하는 연속 및/또는 불연속 아미노산으로 구성될 수 있다. 불연속 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분의 아미노산은 단백질 분자의 폴딩을 통해 3차원 공간에서 근접하게 된다.
"변이체"는 하나 이상의 변형, 예를 들어, 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 참조 폴리펩타이드 또는 참조 폴리뉴클레오타이드와 상이한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "돌연변이"는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 이루어진 하나 이상의 의도적인 치환을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 "90% 동일한"은 참조 항목(예컨대, 생물학적 서열)과 적어도 90% 동일한, 91% 동일한, 92% 동일한, 93% 동일한, 94% 동일한, 95% 동일한, 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 동일한, 또는 100% 동일한 것을 포함한다. 본 명세서는 서열의 수를 기술하기 위해 용어 "% 동일한"을 사용한다. 이해될 바와 같이, 용어 "% 동일한"은 특정 영역에서 2개의 서열의 비교에서, 2개의 서열이 동일한 위치에서 지정된 수의 동일한 잔기를 갖는다는 것을 의미한다. 동일성 수준은 디폴트 매개변수를 갖는 CLUSTAL W를 사용하여 결정될 수 있다.
"치료하다", "치료" 및 유사 용어는 치료적 치료 및 예방적 조치 모두를 지칭하며, 증상의 중증도 및/또는 빈도를 감소시키는 것, 증상 및/또는 증상의 근본 원인을 제거하는 것, 증상 및/또는 이들의 근본 원인의 빈도 또는 가능성을 감소시키는 것, 호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 또는 호산구성 식도염에 의해 직접 또는 간접적으로 유발된 손상을 개선하거나 교정하는 것을 포함한다. 치료는 또한 치료를 받지 않은 대상의 예상 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 포함한다. 치료될 대상은 병태 또는 장애를 갖는 대상뿐만 아니라 병태 또는 장애를 가질 경향이 있는 대상 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 대상을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상에게 투여" 및 유사한 용어는 대상의 표적 세포, 조직, 또는 몸의 부분이 개시된 항체 분자와 접촉하도록 환자 내로 개시된 항체 분자 또는 이를 포함하는 조성물을 주입하는 절차를 가리킨다.
문구 "치료적 유효량"은, 비제한적으로, 본원에 개시, 기재, 또는 예시된 생물학적 또는 치료적 결과와 같은 특정 생물학적 또는 치료적 결과를 달성하는데 효과적인 본원에 기재된 바와 같은 항체 분자의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령 성별, 및 체중, 및 대상에서 원하는 반응을 유발하는 조성물의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량의 예시적인 지표는, 예를 들어, 환자의 개선된 건강, 질환 증상의 감소, 질환 증상의 진행의 정지 또는 지연, 및/또는 질환 증상의 부재를 포함한다.
하기 약어가 본원에 사용된다: 알터나리아 알터나타(알터나리아(Alternaria)), 돼지 회충(A. suum); 상보성 결정 영역(CDR); 중쇄(HC); 경쇄(LC); 중쇄 가변 영역(VH); 경쇄 가변 영역(VL); 표면 플라즈몬 공명(SPR).
항체 분자
인간 IL-5에 면역특이적으로 결합하는 인간 항체 분자가 본원에 개시된다. 인간 항체 분자는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정되는 적어도 약 40 pM의 평형 친화성 상수(KD)로 인간 IL-5에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "적어도 약 40 pM"은 개시된 항체가 약 40 pM 이하의 KD로 인간 IL-5에 면역특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 개시된 항체는 약 40 pM, 약 30 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 또는 약 10 pM 미만의 KD로 인간 IL-5에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
개시된 인간 항체 분자는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 공통 CDR1, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 공통 CDR2, 및 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 공통 CDR3을 포함할 수 있다.
경쇄 공통 CDR1은 GX1X2X3X4X5X6KX7X8Y(서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서:
X1은 G 또는 K이고;
X2는 N 또는 D이며;
X3은 N 또는 H이고;
X4는 I 또는 A이며;
X5는 G 또는 D이고;
X6은 S 또는 K이며;
X7은 N 또는 H이고;
X8은 V 또는 A이다.
일부 구현예에서, 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 GGNNIGSKNVY(서열번호: 5)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 GKNNIGSKNVY(서열번호: 21)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 GGDNIGSKNVY(서열번호: 24)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 GGNHIGSKNVY(서열번호: 27)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 GGNNAGSKNVY(서열번호: 30)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 GGNNIDSKNVY(서열번호: 66)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 GGNNIGKKNVY(서열번호: 33)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 GGNNIGSKHVY(서열번호: 36)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 GGNNIGSKNAY(서열번호: 39)를 포함할 수 있다.
경쇄 CDR2 아미노산 서열은 DDX8X9RPS(서열번호: 2)를 포함하며, 여기서:
X8은 S 또는 L이고;
X9는 D 또는 S이다.
일부 구현예에서, 경쇄 CDR2 아미노산 서열은 DDSDRPS(서열번호: 7)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR2 아미노산 서열은 DDLDRPS(서열번호: 42)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR2 아미노산 서열은 DDSSRPS(서열번호: 45)를 포함할 수 있다.
경쇄 CDR3 아미노산 서열은 QVWX10SSSDX11VX12(서열번호: 3)를 포함하며, 여기서:
X10은 D 또는 L이고;
X11은 H, S, Y, 또는 D이며;
X12는 V, A, 또는 W이다.
일부 구현예에서, 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 QVWDSSSDHVV(서열번호: 15)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 QVWLSSSDHVV(서열번호: 48)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 QVWDSSSDSVV(서열번호: 51)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 QVWDSSSDYVV(서열번호: 54)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 QVWDSSSDDVV(서열번호: 57)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 QVWDSSSDHVA(서열번호: 60)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 QVWDSSSDHVW(서열번호: 63)를 포함할 수 있다.
개시된 인간 항체 분자는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호: 5, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7, 42, 또는 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15, 48, 51, 54, 57, 60, 또는 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 예시적인 항체 분자는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및
a. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
b. 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
c. 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
d. 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
e. 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
f. 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
g. 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
h. 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
i. 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
j. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
k. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
l. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
m. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
n. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
o. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
p. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
q. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
을 포함하며,
CDR의 아미노산 잔기의 위치는 AbM에 따라 결정된다.
개시된 항체 분자는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 17, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 또는 67의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 가변성(즉, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)은 CDR 서열의 외부에서 발생한다. 예시적인 항체 분자가 표 1 및 표 15에 제공되어 있다.
표 1. 항체 사슬/도메인 조성 요약
일부 구현예에서, 개시된 항체 분자는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
a. 서열번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b. 서열번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c. 서열번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
d. 서열번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e. 서열번호: 31의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
f. 서열번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
g. 서열번호: 37의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
h. 서열번호: 40의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
i. 서열번호: 43의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
j. 서열번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
k. 서열번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
l. 서열번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
m. 서열번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
n. 서열번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
o. 서열번호: 61의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
p. 서열번호: 64의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
q. 서열번호: 67의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함할 수 있으며;
가변성(즉, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)은 CDR 서열의 외부에서 발생한다.
개시된 항체 분자는 프레임워크 및/또는 불변 영역 내에 하나 이상의 돌연변이, 결실, 또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IgG4 항체 분자는 S228P 돌연변이를 포함할 수 있다. S228은 IgG4 항체 분자의 힌지 영역에 위치한다. 세린("S")에서 프롤린("P")으로의 돌연변이는 IgG4의 힌지를 안정화시키고 시험관내 및 생체내에서 Fab 암 교환을 방지하는 역할을 한다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 항체 분자의 생체내 반감기를 증가시키는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항체는 M252Y 돌연변이, S254T 돌연변이, 및 T256E 돌연변이(종합하여 "YTE" 돌연변이로 지칭됨)를 포함할 수 있다. M252, S254, 및 T256은 중쇄의 CH2 도메인에 위치한다. 이들 잔기에서 각각 티로신("Y"), 트레오닌("T"), 및 글루타메이트("E")로의 돌연변이는 항체 분자를 리소좀 분해로부터 보호하여 항체 분자의 혈청 반감기를 향상시킨다. 다른 항체의 예에 기초하여, 항-IL-5 항체에서 YTE 돌연변이의 도입은 혈청 반감기의 충분한 연장을 제공하여 3개월 이상의 투여간 간격을 갖는 투여 요법을 허용할 수 있다는 것이 고려된다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 포함할 수 있다. 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실은 포유동물 세포에 의해 생산될 때 항체 분자의 이종성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 돌연변이, 결실, 또는 삽입의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 개시된 항체 분자는 S228P 돌연변이 및 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 포함할 수 있다. 서열번호: 18의 중쇄 서열을 포함하는 개시된 항체는, 예를 들어, S228P 돌연변이 및 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 포함한다. 일부 양태에서, 개시된 항체 분자는 S228P 돌연변이, M252Y 돌연변이, S254T 돌연변이, T256E 돌연변이, 및 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 20의 중쇄를 포함하는 3A5.046 항체는 S228P 돌연변이, M252Y 돌연변이, S254T 돌연변이, T256E 돌연변이, 및 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 포함한다.
항체 분자는 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 IgG1 중쇄 불변 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함한다(예를 들어, 항체 3A5). 일부 구현예에서, 항체 분자는 IgG4 중쇄 불변 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함한다.
개시된 항체 분자는 서열번호: 18 또는 20의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 19, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 또는 68의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있으며, 가변성(즉, 적어도 90% 동일성)은 CDR 서열의 외부에서 발생한다. 예시적인 항체 분자가 표 1 및 표 15에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 서열번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및
a. 서열번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
b. 서열번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
c. 서열번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
d. 서열번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
e. 서열번호: 32의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
f. 서열번호: 35의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
g. 서열번호: 38의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
h. 서열번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
i. 서열번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
j. 서열번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
k. 서열번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
l. 서열번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
m. 서열번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
n. 서열번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
o. 서열번호: 62의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
p. 서열번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
q. 서열번호: 68의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함할 수 있으며,
가변성(즉, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)은 CDR 서열의 외부에서 발생한다.
개시된 항체 분자는 서열번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있으며, 가변성(즉, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)은 CDR 서열의 외부에서 발생한다.
일부 구현예에서, 항체 분자는 전장 항체 분자(중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 갖거나 갖지 않음)이다. 다른 구현예에서, 항체 분자는 항원 결합 단편이다. 적합한 항체 결합 단편은, 비제한적으로, Fab 단편, Fab2 단편, 또는 단일 사슬 항체를 포함한다.
항체 분자는 하기 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다:
a. 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 적어도 약 40 pM의 평형 친화성 상수(KD)로 인간 IL-5에 결합하는 특성;
b. IL-5 수용체에 대한 IL-5의 결합을 감소시키는 특성;
c. 적어도 약 20일의 혈청 반감기를 갖는 특성; 또는
d. 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-5에 결합하지만 마우스, 랫트, 또는 기니어 피그 IL-5에 결합하지 않는 특성.
개시된 항체 분자 중 어느 것을 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다.
개시된 항체 분자 중 어느 것을 코딩하는 핵산 분자 및 개시된 핵산 분자를 포함하는 벡터가 또한 제공된다.
개시된 항체 분자 중 어느 것을 발현하도록 형질전환된 세포가 추가로 제공된다.
방법 및 용도
개시된 항체 분자, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 및 호산구성 식도염을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 항체 분자 특징 중 어느 것은 개시된 방법 및 용도에 사용된 항체에 동일하게 적용된다.
호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 또는 호산구성 식도염을 치료하기 위해 본원에 개시된 항체 분자 중 어느 것, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 또는 호산구성 식도염을 갖는 대상을 치료하는 방법이 본원에 개시된다.
호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 또는 호산구성 식도염의 치료에서, 개시된 항체 분자 중 어느 것, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량의 용도가 또한 제공된다.
호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 또는 호산구성 식도염의 치료를 위한 약제의 제조에서, 개시된 항체 분자 중 어느 것, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 용도가 또한 제공된다.
실시예
하기 실시예는 본원에 개시된 구현예 중 일부를 더 기술하기 위해 제공된다. 실시예는 개시된 구현예를 예시하기 위한 것이지 한정하기 위한 것은 아니다.
항-인간-IL-5 항체의 생성
게놈 내로 클로닝된 인간 V-유전자를 갖고 인간 V-도메인 및 랫트 Fc 도메인을 갖는 항체를 생산하는 형질전환 랫트(OMT)로부터, 항-인간-IL-5 항체를 수득하였다. 간략하게, 형질전환 랫트를 IL-5를 코딩하는 DNA로 21일 동안 4회(0, 7, 14, 21일) 유전적으로 면역화시키고, 면역화 프로토콜의 28일에 재조합 인간 IL-5로 증강시켰다. 재조합 인간 IL-5를 사용한 ELISA 분석에 의해 혈청 항체 역가(titre)를 면역화 프로토콜의 0일 및 38일에 결정하였다. 간략하게, 각 동물의 혈청을 PBS 1% BSA에서 희석하고, 1 μg/ml 인간 IL-5, 또는 대조군으로서 BSA가 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 시험하였다. 염소 항-랫트 IgG R-피코에리트린 접합체(SouthernBiotech, #3030-09)를 2차 항체로서 10 μg/ml로 사용하였다. 이들 혈청 역가에 기초하여 하이브리도마 융합을 위한 특정 동물을 선택하였다.
인간 IL-5에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 동물로부터 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고, P3X63Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL-1580)에 융합시켰다. 세포를 평바닥 미세적정 플레이트에 약 1 x 105 세포/mL로 도말한 다음, 10% 태아 클론 혈청 및 1 x HAT(Sigma)를 포함하는 선택 배지에서 2주간 배양하였다. 하이브리도마를 96-웰 플레이트에서 4번 배지 교환을 통한 계대 배양(96-웰 스테이지 1 내지 4)에 의해 확장시킨 다음, T25 및 마지막으로 T75 플라스크 내로 확장시켰다.
하이브리도마 클론으로부터의 상층액을 초기에는 GPI 고정된 인간 IL-5로 형질감염된 세포를 사용한 전체 세포 ELISA 및 그 다음 재조합 인간 IL-5 ELISA 분석(상기 기재된 바와 같은 후자)을 사용한 ELISA에서 하이브리도마 확장 과정 동안 분석하였다. T75 스테이지로의 규모 확장 과정을 생존하고 이들 분석 모두에서 결합에 대해 주어진 역치를 초과하는 신호를 생성한 하이브로도마를 Ig v-도메인의 클로닝 및 시퀀싱을 위해 세포 펠렛으로 동결시켰다. 키메라 IgG를 생산하는 약 20개의 하이브로도마를 이들 스크리닝 단계 후 클로닝을 위해 선택하였다.
후보 키메라 IgG로부터의 인간 v-도메인을 하이브리도마 세포 펠렛으로부터 cDNA의 생성, v-도메인의 PCR 증폭, 서브클로닝, 및 DNA 시퀀싱에 의해 단리하였다. 이들 하이브리도마의 시퀀싱으로부터 총 약 35개의 중쇄 및 경쇄 조합을 수득하였다. 모든 항체를 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하고, HEK-293 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 항체를 표준 단백질 A 정제 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
항체의 기능 시험 및 특성규명
인간 IgG1 포맷의 선택된 항체를 인간 IL-5 ELISA에서 특이성에 대해 먼저 분석하였다. 간략하게, 항체를 PBS 0.1% BSA에서 희석하고, 1 μg/ml 인간 IL-5, 또는 무관한 대조군 단백질이 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 시험하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다아제 접합된 항-IgG 항체를 2차 항체로서 사용하였다.
인간 IL-5에 대해 면역특이적 결합을 나타낸 항체를 인간 TF-1.6G4(인간 적백혈구(erythroleukemic) 세포주 TF-1의 유도체) 세포를 사용하는 인간 IL-5 의존적 세포 증식 분석에서의 효력에 대해 순위를 매겼다. TF-1.6G4 세포주를 서브클로닝하고, IL-5Rα의 향상된 표면 발현 및 인간 IL-5에 대한 지속적인 증식 반응에 대해 선택하였다. TF-1.6G4 세포주를 TF-1 인간 적백혈구 세포주(ATCC: CRL-2003)에 사용된 표준 조건에 따라 배양액에 유지시켰다. 간략하게, 각각의 항체의 희석액을 웰당 45 pM 인간 IL-5 및 5 x 104 TF-1.6G4 세포의 존재하에 배양하고, 48시간 동안 배양하고, 세포 증식을 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 분석(Promega, WI)을 사용하여 결정하였다. 모든 증식 및 억제 곡선을 그래프패드 프리즘 6(GraphPad Prism 6, Version 6.04) 소프트웨어 내의 3 또는 4 매개변수 용량-반응 모델을 사용하여 피팅(fitting)하였다. 표 2는 이들 결과를 요약한다.
표 2. IgG1 포맷의 초기 시험 패널의 스크리닝 및 특성규명의 요약.
표 2에서, 시험 결과가 TF1.6G4 분석 효력의 순으로 순위가 매겨졌다. 초기 시험 패널을 효력, 친화성, IL-5Rα 억제 및 서열 책임(liability)(면역원성 및 개발가능성)에 기초하여 선택하였다.
비아코어 분석을 사용하여 재조합 인간 IL-5에 대한 시험 항체의 친화성 및 인간 IL-5에 대한 IL-5Rα 결합을 억제하는 이들의 효력을 결정하였다. 표 2는 이들 결과를 요약한다. 비아코어 시리즈 S 센서 칩 단백질 A(GE Healthcare)를 선택된 정제된 IgG 항체로 75 RU의 캡처 수준까지 코팅하여 비아코어 T200 시스템(GE Healthcare) 상에서 인간 IL-5에 대한 시험 항체의 결합 친화성(KD; 도 6)을 결정한 다음, 재조합 인간 IL-5를 1 μg/mL부터 7단계 2배 연속 희석 범위에 걸쳐 60 μL/분으로 주입하였다. 모든 실험을 HBS-EP+ 완충액(GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 생성된 센서그램을 이중 참조하였다(대조군(항체가 코팅되지 않은 단백질 A 표면) 플로우셀 값 및 또한 완충액 블랭크로부터 차감된 시험 플로우셀 값). 1:1 랭뮤어 결합 모델(Langmuir binding model)을 이중 참조된 센서그램에 피팅하여 결합 상수를 결정하였다.
각각의 시험 항체가 IL-5Rα에 대한 IL-5의 결합을 억제하였는지 여부를 결정하기 위해, 비아코어 T200 또는 비아코어 3000 시스템(GE Healthcare)을 사용하였다. 비아코어 CM5 센서 칩을 2개의 인접한(시험 및 대조군) 플로우셀 상에서 제조사의 지침에 따라 Fab 캡처 키트(GE Healthcare)를 사용하여 먼저 유도체화하였다. 이 표면을 사용하여 단일 시험 플로우셀 상에서 각각 정제된 IgG 시험 항체를 캡처하였다. 그리고 나서, 5 μg/mL의 재조합 인간 IL-5 또는 완충액 블랭크를 시험 및 대조군 플로우셀 모두에 주입하여, IL-5의 비특이적 결합을 위해 시험 플로우셀 표면 및 대조군을 각각 포화시켰다. 10 μg/mL의 정제된 IgG 시험 항체 또는 완충액 블랭크의 두 번째 주입을 시험 플로우셀 상에서 수행하여 Fab 캡처 항체로부터 IgG 시험 항체의 해리를 위해 유리 IL-5 결합 부위 및 대조군을 각각 차단시켰다.
두 플로우셀에 5 또는 20 μg/mL의 IL-5Rα-Fc(R&D Systems) 또는 완충액 블랭크의 후속 주입을 사용하여 IgG 시험 항체가 이 단계 동안 Fab 캡처 항체로부터 IgG 항체의 해리를 위해 IL-5 및 IL-5Rα 사이의 상호작용 또는 대조군에 대한 상호작용을 차단하였는지 여부를 결정하였다. IL-5Rα에 대한 IL-5의 결합을 억제한 항체는 IL-5Rα의 주입시 현저하게 감소된 신호를 나타내었다(표 2). 삼중 참조 차감 방법을 사용하여 상기 상세히 설명된 방식으로 데이터를 분석하였다. 모든 데이터를 비아코어 평가 소프트웨어로부터 내보내고, 엑셀(Microsoft) 소프트웨어에서 차감하였다. 모든 실험을 HBS-EP+ 완충액(GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다.
시험 항체의 더 작은 패널(표 2에서 3A5, 5H11 및 2B4)을 이들 결과에 기초하여 선택하였다. 항체를 인간 IgG4로서 재구성하고, 동일한 분석에서 시험하였다. 항체 3A5의 IgG4 버전(원래 IgG1)을 3A5.001로 명명하였다. 이 완전 인간 항체는 IgG1 포맷에서 원래의 시험 3A5와 동등한 효력을 갖는 것으로 입증되었다(도 1).
예측된 T-세포 에피토프를 제거하기 위해 V-도메인 영역에 도입된 특정 아미노산 치환(VH: S[68]T, N[82A]S; VL: S[2]Y, I[3]V, Y[92]D, 여기서 괄호 내의 잔기는 카밧 위치를 나타냄)을 갖는 항체 3A5.001의 변이체(3A5.040로 명명됨)를 제조하였다. 항체 3A5.040은 TF-1.6G4 분석에서 그의 모 항체 3A5.001과 동등한 효력을 갖는 것으로 입증되었다(도 2).
항체 3A5.040의 CDR 스캐닝
항체 3A5.040 변이체의 생성 - 경쇄 CDR1(CDR-L1), 경쇄 CDR2(CDR-L2), 중쇄 CDR1(CDR-H1) 및 중쇄 CDR2(CDR-H2)(AbM 명명법에 의해 정의된 바와 같음) 내의 각각의 아미노산 위치에서 9개의 대표적인 아미노산 A, S, L, Y, D, Q, K, H, W의 그룹 중 하나를 치환함으로써 항체 3A5.040의 단일 돌연변이성 변이체를 제조하였다. 경쇄 CDR3(CDR-L3), 중쇄 CDR3(CDR-H3) 내의 각각의 CDR 아미노산 위치, 및 가변 중쇄 내의 카밧 위치 93 및 94에서 10개의 대표적인 아미노산 A, S, L, Y, D, Q, K, H, W, P의 그룹 중 하나를 치환함으로써 항체 변이체를 또한 제조하였다. 생성된 모든 단일 돌연변이성 항체 변이체의 전체 목록이 각각 도 3(가변 중쇄) 및 도 4(가변 경쇄)에 나타나 있다.
항체를 발현하는 벡터의 제작 - 아미노산 서열을 DNA 서열로 역번역하여 가변 영역 변이체를 생성하였고, 이후 이를 합성 올리고뉴클레오타이드의 조립에 의해 드 노보(de novo) 합성하였다. 가변 중쇄(VH) 변이체를 인간 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 전장 항체 중쇄(인간 IgG4 중쇄 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 도메인)을 생산하였다. 유사하게, 가변 경쇄(VL) 변이체를 인간 람다 경쇄 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 전장 항체 람다 사슬을 생산하였다.
항체 변이체의 발현 - 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 별도의 발현 벡터를 EXPI293® 세포(Life Technologies, Carlsbad, CA) 내로 공동 형질감염시켜 항체를 생산하였다. 각각의 단일 돌연변이성 사슬을 EXPI293® 시스템에서의 단백질 발현을 위해 모 사슬과 쌍을 형성시켰다. 각각 20 mL 형질감염을 위해, 3.6 Х 107 세포가 20 mL의 EXPI293® 발현 배지에 필요하였다. 형질감염 전날, 세포를 0.9 Х 106 생존가능 세포/mL의 밀도로 시딩하고, 200 rpm으로 회전하는 오비탈 쉐이커에서 공기 중에 8% CO2의 가습 분위기에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 형질감염 날, 세포 수 및 생존력을 자동화 세포 계수기를 사용하여 결정하였다. >98% 생존가능 세포를 갖는 배양액만을 사용하였다. 각각 20 mL 형질감염을 위해, 10 μg의 중쇄 DNA 및 10 μg의 경쇄 DNA를 OPTI-MEM®(Life Technologies, Carlsbad, CA) I 환원 혈청 배지(카탈로그 번호 31985-062)에서 1.0 mL의 총 부피로 희석함으로써 지질-DNA 복합체를 제조하였다. 54 μL의 EXPIFECTAMINE® 293 시약(Life Technologies, Carlsbad, CA)을 OPTI-MEM® 배지에서 1.0 mL의 총 부피로 희석하였다. 두 바이알을 부드럽게 혼합하고, 실온에서 5분 동안 배양하였다. 배양 후, 희석된 DNA를 희석된 EXPIFECTAMINE® 293 시약과 혼합하고, DNA-EXPIFECTAMINE® 293 시약 혼합물을 실온에서 20분 동안 더 배양하여 DNA-EXPIFECTAMINE® 293 시약 복합체를 형성하였다. 배양 후, 2 mL의 DNA-EXPIFECTAMINE® 293 시약 복합체를 각각 50 mL 생물반응기 튜브(TPP Techno Plastic Products AG)에 첨가하였다. 2 mL의 OPTI-MEM®(Life Technologies, Carlsbad, CA) I 배지를 DNA-EXPIFECTAMINE® 293 시약 복합체 대신에 음성 대조군 튜브에 첨가하였다. 세포를 200 rpm으로 회전하는 오비탈 쉐이커에서 공기 중에 8% CO2의 가습 분위기로 37℃ 배양기에서 배양하였다. 형질감염 후 약 16-18시간에, 100 μL의 EXPIFECTAMINE® 293 형질감염 향상제 1 및 1.0 mL의 EXPIFECTAMINE® 293 형질감염 향상제 2를 각 생물반응기에 첨가하였다. 상층액을 형질감염 후 약 48시간에 채취하였다.
항체 변이체의 정제 - 각각의 항체 변이체를 20 또는 100 mL의 세포 배양액에서 EXPI293® 세포에서 발현시켰다. 배양액을 3000 x g에서 20분 동안 50 mL 팔콘 튜브에서 회전시키고, 상층액을 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하였다. 상층액을 Gilson ASPEC GX274 로봇을 사용하여 정제하였다. 간략하게, 1.2 mL MABSELECT SURE® 단백질 A 수지(GE Healthcare)가 충진된 SPE 카트리지(Agilent, 12131014)를 3 컬럼 부피의 1X PBS로 예비 평형화시켰다. 상층액을 컬럼 위로 흐르게 한 다음 4 mL 1X PBS 세척을 수행하였다. 각각의 컬럼을 9 mL의 1 M 구연산, pH 2.9로 세척하였다. 항체를 2 mL 0.1 M 구연산, pH 2.9로 용출시켰다. 항체를 PD-10 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 Sørensens PBS(5 mM KH2PO4, 3 mM Na2HPO4.2H2O, 145.4 mM NaCl(pH ~5.8)) 내로 탈염시켰다.
비아코어에 의한 상층액에서 3A5.040 변이체 항체 역가의 결정 - EXPI293® 세포에서의 발현으로부터의 항체를 함유하는 상층액을 비아코어 T200 상의 단백질 A 시리즈 S 칩을 사용하여 분석하여 이들의 역가를 결정하고 이들을 모 항체 3A5.040에 대해 순위를 매겼다. 각각의 상층액 샘플을 러닝 완충액(1 x HBS-EP+, 350 mM NaCl)으로 희석하고, 플로우셀(FC) 2 상에 60 μL/분으로 주입하여 캡처하였다. 주입 5초 후의 하나의 보고 지점으로부터 사이클 시작 5초 후의 보고 지점을 차감함으로써 FC 2-1 상에서 반응 단위(RU)의 생성된 캡처 수준을 측정하였다. 4 사이클마다 FC 1 및 2 상에 60 μL/분의 유속으로 12초 동안 50 mM NaOH를 주입하여 표면을 재생하였다. 각각의 재생 후, 러닝 완충액을 주입하여 표면 및 센서그램을 120초 동안 안정화시켰다. 이 방식으로 스크리닝된 많은 수의 항체로 인해 여러 배치를 실행하였다.
각 30초 주입에 대해 수득된 값에 상층액 희석 인자를 곱함으로써 각각의 상층액 샘플에 대해 수득된 캡처 수준(비아코어 반응 단위 "RU")을 조정하였고, 이는 상이한 실험 수행에 걸쳐 다양한 정도로 희석된 상층액 간의 캡처 수준을 비교할 수 있게 해주었다. 각 돌연변이체의 상대적 항체 발현 수준(역가)을 하기 식을 사용하여 배치 특이적 3A5.040 상층액과 비교하였다(표 3):
(30초 주입에 대해 조정된 3A5.040 참조 RU / 30초 주입에 대해 조정된 변이체 항체 RU) x 100 = 모 항체의 비례 역가(% 3A5.040 역가)
식 1
모 3A5.040 항체보다 높은 역가를 갖는 변이체 항체는 "% 3A5.040 역가" 값 >100%을 가지고 있었고, 낮은 역가를 갖는 변이체 항체는 값 <100%를 가지고 있었다. 이것은 모 항체 3A5.040보다 개선된 발현을 가질 수 있는 변이체 항체를 식별할 수 있게 해주었다. 일부 변이체의 역가는 상층액 샘플의 비아코어 분석에 의해 결정되지 않았지만, 상기와 같이 발현되고 정제되었고, 이들의 정제된 수율을 분광광도 분석(A280)에 의해 결정한 다음, 모 3A5.040 항체와 비교하였다(표 5).
비아코어에 의한 3A5.040 변이체 항체 IL-5-결합 동역학의 결정 - EXPI293® 세포에서의 발현으로부터의 항체를 함유하는 상층액 또는 정제된 항체를 비아코어 T200 시스템(GE Healthcare) 상의 단백질 A 시리즈 S 칩을 사용하여 분석하여 재조합 인간 IL-5에 대한 이들의 결합 친화성을 결정하였고, 이들을 모 항체 3A5.040에 대해 순위를 매겼다.
각각의 항체를 러닝 완충액(1 x HBS-EP+, 350 mM NaCl)에서 희석하고, FC 2 상에서 60 μL/분에서 캡처하였다. 이후, 러닝 완충액을 주입하여 표면 및 센서그램을 120초 동안 안정화시켰다. 5 μg/mL의 재조합 인간 IL-5 또는 러닝 완충액을 60 μL/분의 유속으로 70초 동안 FC 1 및 2 상에 주입하였다. IL-5를 러닝 완충액에서 300초 동안 해리시켰다. FC 1 및 2 상에 60 μL/분의 유속으로 12초 동안 50 mM NaOH를 주입하여 표면을 재생시켰다. 완충액을 주사하여 FC 1 및 2 상에서 60 μL/분의 유속으로 60초 동안 표류를 추가로 세척하였다. FC 1 및 2 위에 러닝 완충액으로 300초 동안 표면을 안정화시켰다. 모 3A5.040 항체를 함유하며 각 배치로 형질감염된 상층액을 각 실행 동안 약 25 사이클마다 수행하였다. 3A5.040 및 IgG4 람다 아이소타입 대조군의 정제된 샘플을 분석간 가변성의 척도로서 모든 배치를 이용하여 수행하였다. 이러한 방식으로 스크리닝된 많은 수의 항체로 인해 다수의 배치를 수행하였다.
데이터를 이중 참조시키고(플로우셀 2를 플로우셀 1 및 완충액 블랭크로부터 차감하였음), 센서그램을 비아코어 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅하였다. 실행 동안 각각의 3A5.040 상층액 샘플에 대해 kd(오프 속도) 값을 계산하고, 하나의 3A5.040 상층액 샘플만을 가진 실행 2.1을 제외하고 이들을 평균하여 참조 kd를 생성하였다(표 3 및 표 6-11). 각각의 상층액 항체에 대해 계산된 kd 값을 하기 식을 사용하여 3A5.040 평균 참조 kd와 비교하였다:
(3A5.040 참조 kd / 변이체 항체 kd) x 100 = 모 항체의 비례 kd(% 3A5.040 kd)
식 2
모 3A5.040 항체보다 낮은 kd(더 느린 오프 속도)를 갖는 변이체 항체는 "% 3A5.040 kd" 값 >100%을 가지고 있었고, 높은 kd(더 빠른 오프 속도)를 갖는 변이체 항체는 값 <100%을 가지고 있었다. 이것은 모 항체 3A5.040보다 IL-5에 대해 개선된 결합 동역학 및 따라서 개선된 기능을 가질 수 있는 변이체 항체를 식별할 수 있게 해 주었다. 정제된 단백질만이 생성된 변이체의 경우(표 6), 비아코어 동역학 분석을 이들 정제된 항체를 사용하여 상기와 같이 3반복으로 수행하였고, 각 3반복 분석으로부터의 평균값을 사용하여 상기와 같이 비례 kd 계산을 수행하였다(표 4 및 표 8-11).
표 3. 비아코어에 의한 상층액 3A5.040 변이체 항체 역가 및 IL-5 결합 동역학의 결정
표 4. 비아코어에 의한 정제된 3A5.040 변이체 항체 IL-5 결합 동역학의 결정
표 5. 선택된 3A5.040 항체 변이체에 대한 정제된 단백질 발현 수율
표 6. VH CDR1 스캐닝 행렬
표 7. VH CDR2 스캐닝 행렬
표 8. VH CDR3 스캐닝 행렬
표 9. VL CDR1 스캐닝 행렬
표 10. VL CDR2 스캐닝 행렬
표 11. VL CDR3 스캐닝 행렬
발현 벡터 제작
뉴클레오타이드 서열은 유전자 발현 및 후속하는 단백질 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 몇 가지 상이한 뉴클레오타이드 서열을 3A5.046의 최적 발현에 대해 조사하였다. 이들 서열이 하기 표에 요약되어 있다:
표 12. 뉴클레오타이드 서열
SPR에 의한 인간 재조합 IL-5에 대한 항체 3A5.046의 친화성의 측정
재조합 인간 IL-5에 대한 항체 3A5.046의 친화성을 비아코어 T200 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 결정하였다. 간략하게, 상업적인 마우스 항-인간 IgG 항체(Thermo Scientific)를 제조사의 권고에 따라 비아코어 CM5 칩(GE Healthcare) 상의 2개의 인접한(대조군 및 시험) 플로우셀에 커플링시켰다. 3A5.046 항체를 시험 플로우셀 표면 상에서 낮은 밀도(약 125 RU)에서 캡처하고, 재조합 인간 IL-5의 희석액 또는 완충액 블랭크를 30 μL/분으로 시험 및 대조군 플로우셀 위에 주입하였다(도 6, 표 13).
생성된 센서그램을 이중 참조하였다(대조군(항체가 코팅되지 않은 항-인간 IgG-커플링된 표면) 플로우셀 값 및 또한 완충액 블랭크으로부터 차감된 시험 플로우셀 값). 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 및 0.156 μg/mL의 인간 IL-5의 주입으로부터의 차감된 센서그램을 비아코어 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅시켜 2반복 분석으로부터 결합 상수를 결정하였다(표 13).
표 13. 2.5, 1.25, 0.625, 0.313 및 0.156 μg/mL의 재조합 인간 IL-5에 대한 3A5.046 항체 결합의 다중 농도 비아코어 동역학 분석으로부터의 동역학 상수
이들 결과는 항체 3A5.046이 재조합 인간 IL-5에 대해 높은 친화성을 갖는다는 것을 입증한다.
TF -1.6G4 세포주 증식 분석에서 메폴리주맙과 비교한 3A5.046의 효력
3A5.046 및 메폴리주맙을 TF-1.6G4 세포주 증식 분석에서 실행하였다. 3A5.046 및 메폴리주맙은 각각 13.8 pM 및 534 pM의 평균 IC50으로 인간 IL-5 증식을 억제하였다(표 14 및 도 7a 참고). 두 항체는 3A5.046에 대해 43.8 pM의 평균 IC50 및 메폴리주맙에 대해 584 pM의 평균 IC50으로, TF1.6G4 세포주 상에서 시노몰구스 원숭이 IL-5의 억제를 입증하였다(도 7b).
표 14.
본 발명의 항-IL-5 항체를 사용하여 ELISA를 통한 일차 세포로부터 천연 IL5의 검출
항체 3A5를 샌드위치 ELISA에서 캡처 시약으로 사용하였다. 상업적으로 이용가능한 검출 항체(TRFk5R; R&D systems, #MAB405)와 함께, 스파이크된 완충액 샘플 내의 재조합 IL-5 수준의 정량을 결정할 수 있었다(도 8). 이후, 이 방법을 일차 세포에 의해 분비된 천연 IL-5의 검출에 적용하였다. 4명의 공여자로부터의 CD4+ T-세포를 자극하여 IL-5를 분비하였다. 이후, 캡처 시약으로서 항체 3A5를 갖는 샌드위치 ELISA를 사용하여 IL-5 수준을 결정하였다. 4개의 공여자 T-세포 중 3개는 T-세포 자극에 반응하였고, 세포 배양 상층액에서 검출가능한 IL-5 수준을 가지고 있었다(도 8). 유사한 연구를 캡처제로서 항체 3A5.046을 사용하여 일차 인간 공여자 CD4+ T-세포로부터 분비된 인간 IL-5 상에서 수행하였고, 수득된 결과는 항체 3A5로 수득된 결과와 일치하였다(데이터는 나타내지 않음).
호산구 분화의 항-IL-5 항체 억제
CD34+ 제대혈 세포를 사용한 생존 분석을 사용하여 골수 선조세포의 호산구로의 IL-5 의존적 분화를 억제하는 항-IL-5 항체의 능력을 평가하고, 표현형적으로 성숙한 호산구 생존을 억제하는 항-IL-5 항체의 능력을 평가하였다. IL-5 처리된 대조군 세포에서, 표현형적으로 성숙한 호산구는 28일에 우세한 집단이었다(도 9, 그래프에서 음영 영역). 항체 3A5.046은 28일 동안 IL-5와 함께 배양된 CD34+ 제대혈 세포가 호산구로 분화하는 것을 억제할 수 있었다. 항체 3A5.046은 메폴리주맙보다 IL-5 매개 호산구 분화의 더 강력한 억제제였다(도 9).
X선 결정학 분석
항체 3A5.046 Fab 및 재조합 인간 IL-5 사이의 복합체의 분자 구조를 X선 결정학에 의해 조사한다. X선 결정학 실험을 준비하기 위해, 힌지 영역에서 온전한 항체를 절단하여 Fc 및 Fab 도메인을 분리시키는 파파인에 의해 3A5.046을 소화시킨다. 3A5.046 Fab를 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, 재조합 비글리코실화된 인간 IL-5와 복합체화한다. 3A5.046 Fab:인간 IL-5 복합체를 표준 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 결정화 실험을 위해 정제한다. 결정화 조건의 광범위한 샘플링을 위해, 복합체를 상업적으로 이용가능한 희소 행렬(sparse-matrix) 결정화 스크린 내로 다양한 농도로 설정한다. 희소 행렬 스크린으로부터 복합체의 결정을 제공하는 임의의 '히트(hit)' 조건의 최적화를 수행하여 필요에 따라 결정 형태학 및 결정 회절을 개선한다.
3A5.046 Fab:인간 IL-5 복합체의 결정을 채취하고, 액체 질소에 급속 냉동하고, 회절 시험 및 데이터 수집을 위해 싱크로트론(synchrotron) 설비로 옮긴다. 결정 회절 시험을 고해상도 회절을 생성하기 위해 고에너지 X선 마이크로 빔선을 수용하는 싱크로트론에서 수행한다. 이 방식으로, 3A5.046 Fab:인간 IL-5 복합체의 결정에 대한 X선 회절 데이터를 수집한다. 복합체의 초기 구조 모델은 템플레이트로서 IL-5 및 Fab의 공개된 분자 구조를 갖는 표준 분자 대체 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 3A5.046 Fab 및 인간 IL-5 복합체의 최종 구조는, 피팅 오류가 30%(0.3의 최종 Rfree)보다 우수하고 화학 결합 매개변수(예컨대, 결합 길이 및 각도의 분포, 입체 화학 및 수소 결합)가 허용가능한 한계 이내일 때까지 구조 모델의 반복적인 개선에 의해 수득될 수 있다.
비인간 모델 종의 IL-5에 대한 항체 3A5.046 결합의 특성 규명
항체 3A5.046을 재조합 사이토카인 인간 IL-5, 랫트 IL-5, 마우스 IL-5, 및 기니어 피그 IL-5에의 결합에 대해 T200 시스템(GE Healthcare)을 사용한 비아코어 분석에 의해 시험하였다. 비인간 IL-5의 이 패널이 전임상 개발에 사용된 주요 동물 모델 종을 대표하도록 선택하였다. 아이소타입 대조군 항체(IgG4) 및 항체 3A5.046을 표준 아민 커플링 방법을 사용하여 각각 시리즈 S CM5 칩(GE Healthcare)의 플로우셀 1 및 2 상에 고정시켰다. 사이토카인을 HBS-EP+ 러닝 완충액(GE Healthcare)에서 1 및 10 μg/ml로 희석하고, 플로우셀 1 및 2에 주입하였다. 플로우셀 1 및 2 상의 완충액 단독 주입을 이중 참조를 위해 포함시켰다. 데이터 분석을 비아코어 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 생성된 센서그램을 이중 참조하였다(대조군 플로우셀 값 및 또한 완충액 블랭크로부터 차감된 시험 플로우셀 값).
항체 3A5.046은 인간 IL-5 및 시노몰구스 원숭이 IL-5에 결합하지만, 마우스 IL-5, 랫트 IL-5, 또는 기니어 피그 IL-5에 결합하지 않는 것으로 나타났다(도 10a - 도 10e). 이것은 3A5.046이 시노몰구스 마카크 전임상 모델에서 사용될 수 있음을 나타내었다.
항체 3A5.046은 IL-5와 밀접하게 관련된 다른 인간 사이토카인에 결합하지 않는다
항체 3A5.046을 재조합 인간 사이토카인 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 및 성장 호르몬(GH)에의 결합에 대해 T200 시스템(GE Healthcare)을 사용한 비아코어 분석에 의해 시험하였다. 밀접하게 관련된 인간 사이토카인의 이 대표적인 패널을 인간 IL-5에 대한 이들의 구조적 및 기능적 유사성에 기초하여 선택하였다. 아이소타입 대조군 항체(IgG4) 및 항체 3A5.046을 표준 아민 커플링 방법을 사용하여 각각 시리즈 S CM5 칩(GE Healthcare)의 플로우셀 1 및 2에 고정시켰다. 사이토카인을 HBS-EP+ 러닝 완충액(GE Healthcare)에서 1 및 10 μg/ml로 희석하고, 플로우셀 1 및 2에 주입하였다. 플로우셀 1 및 2 상의 완충액 단독 주입을 이중 참조를 위해 포함시켰다. 데이터 분석을 비아코어 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 생성된 센서그램을 이중 참조하였다(대조군 플로우셀 값 및 또한 완충액 블랭크로부터 차감된 시험 플로우셀 값).
항체 3A5.046은 인간 IL-5에만 결합하고 인간 사이토카인 IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, M-CSF, 또는 GH에는 결합하지 않는 것으로 나타났으며(도 11a - 도 11d), 따라서 인간 IL-5에 대한 3A5.046의 높은 특이성을 입증하였다.
돼지 회충 유도된 시노몰구스 원숭이 기도 호산구증가증 모델에서 항체 3A5.046의 평가
문헌[Hart, T.K., et al., Preclinical efficacy and safety of mepolizumab (SB-240563), a humanized monoclonal antibody to IL-5, in cynomolgus monkeys. J Allergy Clin Immunol, 2001. 108(2): p. 250-7]에 기재된 바와 같이, 항체 3A5.046을 급성 기도 호산구증가증의 돼지 회충 시노몰구스 모델을 사용하여 시험하였다.
이전에 돼지 회충에 감작된 16마리의 암컷 시노몰구스 마카크를 돼지 회충의 피내 투여에 의한 보유된 민감도 수준에 대해 평가하였다. 이들 동물 중 14마리를 도전에 대한 피부 팽진(skin wheal) 반응에 기초하여 연구에 참여시키기 위해 선택하였고, 그룹당 n=7의 두 그룹으로 무작위 분류하였다. 피내 피부 팽진 시험 후 2주에, 기준선 혈액 및 기관지 폐포 세척액(BALF) 샘플을 수집하였다(8일). 기준선 샘플 수집 후 약 24시간에, 동물을 맹검 방식으로(7일) 위약(200 mM 아르기닌 및 25 mM 히스티딘을 갖는 수성 완충액 pH 6.3을 포함함) 또는 항체 3A5.046(200 mM 아르기닌 및 25 mM 히스티딘을 갖는 수성 완충액 pH 6.3에서 정맥내에서 10 mg/kg)로 처리하였다. 위약 또는 항체 처리 후 1주에, 두 번째 피내 돼지 회충 도전을 수행하였고, 돼지 회충 흡입 투여을 PARI LC 분무기를 통해 투여된 돼지 회충 추출물(Greer Laboratories Inc.; 멸균수에서 5 mg/ml)의 동량의 전달에 의해 돼지 회충 도전을 모든 동물에게 제공하였다(0일). 도전 15분 후 피부 팽진 직경을 측정하였다. 돼지 회충 흡입 도전 후 2일에, 혈액 및 BALF 샘플을 수집하였다. 혈액학 종점 및 PK 분석을 위한 추가의 혈액 샘플을 10일부터 45일까지 매주 수집하였다.
첫 번째 및 두 번째 피내 돼지 회충 도전 사이에 피부 팽진 반응의 유의한 차이가 없었다. 모든 동물은 돼지 회충 투여의 결과로서 BALF에서 호산구의 증가를 나타내었지만, 항체 3A5.046로 처리된 동물에서는, 이 증가는 무시할 만하였다. 돼지 회충 투여 후 48시간에 위약 처리된 동물과 비교하여 항체 3A5.046으로 처리된 동물의 BALF에서 유의하게 적은 호산구가 있었다(p<0.01; 만-휘트니 시험; 도 12).
돼지 회충 도전은 또한 도전 후 10일까지 위약 처리된 동물에서 기준선을 초과하는 유의하게 증가된 혈액 호산구를 야기하였다(도 13a). 항체 3A5.046 처리는 기준선 미만의 수준까지 혈액 호산구를 유의하게 감소시켰고(도 13a), 이러한 혈액 호산구 수의 저하는 초기 용량 후 적어도 52일 동안 유지되었다(도 13b).
요약하면, 3A5.046 처리는 도전 후 48시간에 돼지 회충 유도된 기도 호산구증가증을 유의하게 감소시켰고, 단일 정맥내(IV) 10 mg/kg 용량 후 적어도 52일 동안 기준선 수준 미만까지 혈액 호산구를 유의하게 감소시켰다.
기도 호산구증가증의 인간화된 IL-5 랫트 모델에서 항체 기능의 조사
알터나리아 알터나타(알터나리아)는 인간에서 천식을 촉발하는 것으로 알려져 있고 설치류에서 호산구증가증 및 천식 유사 증상을 유발할 수 있는 곰팡이 알레르겐이다. 알터나리아로 도전될 때, 인간화된 IL-5 넉인 랫트(랫트 IL-5가 인간 IL-5에 의해 대체된 동물)는 폐로부터의 기관지 폐포 세척액(BALF)에서 증가된 호산구 수준을 나타낸다(도 14).
알터나리아 현탁액의 단일 기관내 주입을 인간화된 IL-5 랫트에 투여하고, 혈액 및 BALF 샘플을 알터나리아 투여 후 2, 3 또는 4일에 수집한다. 전형적으로 이 모델에서, 호산구는 BALF 샘플에서 유의하게 증가하며, 혈액 샘플에서 증가되거나 변화하지 않을 수 있다. 시험 항체를 알터나리아로 호산구증가증을 유도하기 전에 투여하고, BALF 및 혈액에서 호산구 수를 감소시키는 능력에 대해 평가한다.
당업자는 본 발명의 바람직한 구현예에 많은 변화 및 변형이 이뤄질 수 있으며 이러한 변화 및 변형이 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서 이뤄질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범주 내에 속하는 이러한 모든 동등한 변경을 포함하는 것으로 의도된다.
본 문헌에 언급되거나 기재된 각각의 특허, 특허 출원, 및 공개의 개시 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
표 15. 서열
구현예
하기 구현예 목록은 이전의 설명을 대체하거나 교체하기보다는 보충하기 위한 것이다.
구현예 1. 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 적어도 약 40 pM의 평형 친화성 상수(KD)로 인간 IL-5에 면역특이적으로 결합하는 인간 항체 분자.
구현예 2. 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호: 5, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7, 42, 또는 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15, 48, 51, 54, 57, 60, 또는 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
을 포함하는 인간 IL-5에 면역특이적으로 결합하는 인간 항체 분자.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및
a. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
b. 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
c. 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
d. 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
e. 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
f. 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
g. 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
h. 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
i. 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
j. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
k. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
l. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
m. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
n. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
o. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
p. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
q. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
을 포함하며;
CDR의 아미노산 잔기의 위치는 AbM에 따라 결정되는 것인 항체 분자.
구현예 4. 구현예 3에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 항체 분자.
구현예 5. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
a. 서열번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b. 서열번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c. 서열번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
d. 서열번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e. 서열번호: 31의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
f. 서열번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
g. 서열번호: 37의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
h. 서열번호: 40의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
i. 서열번호: 43의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
j. 서열번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
k. 서열번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
l. 서열번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
m. 서열번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
n. 서열번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
o. 서열번호: 61의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
p. 서열번호: 64의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
q. 서열번호: 67의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 것인 항체 분자.
구현예 6. 구현예 1 내지 구현예 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 분자.
구현예 7. 구현예 1 내지 구현예 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 분자는
a. S228P 돌연변이;
b. M252Y 돌연변이, S254T 돌연변이, 및 T256E 돌연변이;
c. 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실; 또는
d. a 내지 c의 임의의 조합
을 포함하는 것인 항체 분자.
구현예 8. 구현예 7에 있어서, 항체 분자는 S228P 돌연변이 및 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 분자.
구현예 9. 구현예 7에 있어서, 항체 분자는 S228P 돌연변이, M252Y 돌연변이, S254T 돌연변이, T256E 돌연변이, 및 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 분자.
구현예 10. 구현예 1 내지 구현예 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 분자는 IgG4 중쇄 불변 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체 분자.
구현예 11. 구현예 1 내지 구현예 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및
a. 서열번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
b. 서열번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
c. 서열번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
d. 서열번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
e. 서열번호: 32의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
f. 서열번호: 35의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
g. 서열번호: 38의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
h. 서열번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
i. 서열번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
j. 서열번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
k. 서열번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
l. 서열번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
m. 서열번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
n. 서열번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
o. 서열번호: 62의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
p. 서열번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
q. 서열번호: 68의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 것인 항체 분자.
구현예 12. 구현예 1 내지 구현예 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 분자.
구현예 13. 구현예 2 또는 구현예 3에 있어서, 항체 분자는 Fab 단편, Fab2 단편, 또는 단일 쇄 항체인 항체 분자.
구현예 14. 구현예 1 내지 구현예 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 분자는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 것인 항체 분자:
a. IL-5 수용체에 대한 IL-5의 결합을 감소시키는 특성;
b. 적어도 약 20일의 혈청 반감기를 갖는 특성; 또는
c. 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-5에 결합하지만 마우스, 랫트, 또는 기니어 피그 IL-5에 결합하지 않는 특성.
구현예 15. 구현예 2에 있어서, 항체 분자는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 적어도 약 40 pM의 평형 친화성 상수(KD)로 인간 IL-5에 결합하는 것인 항체 분자.
구현예 16. 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예의 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물.
구현예 17. 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예의 항체 분자를 코딩하는 핵산 분자.
구현예 18. 구현예 17의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
구현예 19. 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예의 항체 분자를 발현하도록 형질전환된 세포.
구현예 20. 호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 또는 호산구성 식도염을 치료하기 위해 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예의 항체 분자 또는 구현예 16의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계
를 포함하는, 호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염, 또는 호산구성 식도염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
구현예 21. 호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염, 또는 호산구성 식도염의 치료에서 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예의 항체 분자 또는 구현예 16의 약제학적 조성물의 유효량의 용도.
구현예 22. 호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입을 갖는 비용종, 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염, 또는 호산구성 식도염의 치료를 위한 약제의 제조에서 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예의 항체 분자 또는 구현예 16의 약제학적 조성물의 용도.
SEQUENCE LISTING <110> CEPHALON, INC. <120> ANTI-IL-5 ANTIBODIES <130> 102085.000906 <140> <141> <150> 62/438,502 <151> 2016-12-23 <160> 75 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Gly or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Asn or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asn or His <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Asn or His <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Val or Ala <400> 1 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asp or Ser <400> 2 Asp Asp 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Synthetic peptide <400> 7 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Leu Gly Asn Trp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Gln Val Trp Tyr Ser Ser Ser Asp His Val Val 1 5 10 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Leu Gly Asn Trp 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 47 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Asp Val Val 1 5 10 <210> 58 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Asp 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 59 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Asp 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 62 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Trp 1 5 10 <210> 64 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 64 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Trp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 65 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Trp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Gly Gly Asn Asn Ile Asp Ser Lys Asn Val Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Asp Ser Lys Asn Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 68 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Asp Ser Lys Asn Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 69 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 69 caggtgcagc tgcaggaatc tggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgtaccg tgtccggcgg cagcatcagc aacggcggct actactggtc ctggatcaga 120 cagcaccccg gcaagggcct ggaatggatc ggctacatct actacagcgg cagcacctac 180 tacaacccca gcctgaagtc cagagtgacc atcagcgtgg acaccagcaa gaaccagttc 240 agcctgaagc tgagcagcgt gacagccgcc gacaccgccg tgtactactg cgccagcctg 300 ggcaattggt tcgactactg gggccagggc accctcgtga cagtgtcctc a 351 <210> 70 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 70 gctagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggcccctt gtagcagaag caccagcgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt caccgtgtcc 120 tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc 180 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgccctcca gcagcctggg caccaagacc 240 tacacctgta acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 300 aagtacggcc caccctgccc cccctgccct gcccctgaat ttctgggcgg accctccgtg 360 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgtatatca ctcgggagcc cgaagtgacc 420 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac 480 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa cagcacctac 540 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 600 tgcaaagtct ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 660 ggccagcccc gcgagcctca ggtgtacaca ctgcccccca gccaggaaga gatgaccaag 720 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttctacc ccagcgatat cgccgtggaa 780 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 840 gacggcagct tcttcctgta ctcccggctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 900 aacgtcttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 960 ctgagcctga gcctgggc 978 <210> 71 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 71 agctacgtgc tgacccagcc tcctagcgtg tccgtggccc ctggccagac cgccagaatc 60 acctgtggcg gcaacaacat cggcagcaag aacgtgtact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtggt gcacgacgac agcgacagac ccagcggcat ccccgagcgg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caataccgcc accctgacca tcagccgggt ggaagtgggc 240 gacgaggccg actacagctg ccaggtctgg gacagcagca gcgaccacgt ggtgttcggc 300 ggaggcacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 72 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 cagcccaagg ccgctcccag cgtgaccctg ttccccccaa gcagcgagga actgcaggcc 60 aacaaggcca ccctggtgtg cctgatcagc gacttctacc ctggggccgt gaccgtggcc 120 tggaaggccg atagcagccc tgtgaaggcc ggcgtggaaa ccaccacccc ctccaagcag 180 agcaacaaca aatacgccgc cagcagctac ctgtccctga cccccgagca gtggaagtcc 240 caccggtcct acagctgcca ggtgacacac gagggcagca ccgtggaaaa gaccgtggcc 300 cccaccgagt gcagc 315 <210> 73 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Gly, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Gly, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Ile, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Gly, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Gly, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Tyr, Ala, Ser, Leu, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> Tyr, Ala, Ser, Leu, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Trp, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys or His <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Tyr, Ala, Ser, Leu, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> Ile, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> Tyr, Ala, Ser, Leu, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (55)..(55) <223> Tyr, Ala, Ser, Leu, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Ser, Ala, Leu, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(57) <223> Gly, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (58)..(58) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Thr, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (60)..(60) <223> Tyr, Ala, Ser, Leu, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (98)..(98) <223> Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (99)..(99) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (100)..(100) <223> Leu, Ala, Ser, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (101)..(101) <223> Gly, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (102)..(102) <223> Asn, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(103) <223> Trp, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> Phe, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (105)..(105) <223> Asp, Ala, Ser, Leu, Tyr, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (106)..(106) <223> Tyr, Ala, Ser, Leu, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Gly, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Gly, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Asn, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Asn, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Ile, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Gly, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Lys, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Val, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Tyr, Ala, Ser, Leu, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(49) <223> Asp, Ala, Ser, Leu, Tyr, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Asp, Ala, Ser, Leu, Tyr, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (51)..(51) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Asp, Ala, Ser, Leu, Tyr, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> Arg, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> Pro, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (55)..(55) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (88)..(88) <223> Gln, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (89)..(89) <223> Val, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (90)..(90) <223> Trp, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(91) <223> Asp, Ala, Ser, Leu, Tyr, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (93)..(93) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> Ser, Ala, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (95)..(95) <223> Asp, Ala, Ser, Leu, Tyr, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (96)..(96) <223> His, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (97)..(97) <223> Val, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (98)..(98) <223> Val, Ala, Ser, Leu, Tyr, Asp, Gln, Lys, His, Trp or Pro <400> 74 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 75 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Gly or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Asn or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Asn or His <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Ile or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Gly or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Ser or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn or His <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Val or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (51)..(51) <223> Ser or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Asp or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(91) <223> Asp or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (96)..(96) <223> His, Ser, Tyr or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (98)..(98) <223> Val, Ala or Trp <400> 75 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Xaa Xaa Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Ser Cys Gln Val Trp Xaa Ser Ser Ser Asp Xaa 85 90 95 Val Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105

Claims (22)

  1. 서열번호: 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3, 서열번호: 5, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 또는 66의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7, 42, 또는 45의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15, 48, 51, 54, 57, 60, 또는 63의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 IL-5에 면역특이적으로 결합하는 인간 항체 분자.
  2. 제1항에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3, 및
    a. 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    b. 서열번호: 21의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    c. 서열번호: 24의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    d. 서열번호: 27의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    e. 서열번호: 30의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    f. 서열번호: 33의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    g. 서열번호: 36의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    h. 서열번호: 39의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    i. 서열번호: 66의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    j. 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 42의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    k. 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 45의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    l. 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 48의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    m. 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 51의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    n. 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 54의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    o. 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 57의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3;
    p. 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 60의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3; 또는
    q. 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 63의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3
    을 포함하며;
    CDR의 아미노산 잔기의 위치는 AbM에 따라 결정되는 것인 인간 항체 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호: 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3, 서열번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 인간 항체 분자.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
    a. 서열번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    b. 서열번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    c. 서열번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    d. 서열번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    e. 서열번호: 31의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    f. 서열번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    g. 서열번호: 37의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    h. 서열번호: 40의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    i. 서열번호: 43의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    j. 서열번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    k. 서열번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    l. 서열번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    m. 서열번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    n. 서열번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    o. 서열번호: 61의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    p. 서열번호: 64의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    q. 서열번호: 67의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 인간 항체 분자.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 인간 항체 분자.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는
    a. S228P 돌연변이;
    b. M252Y 돌연변이, S254T 돌연변이, 및 T256E 돌연변이;
    c. 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실; 또는
    d. a 내지 c 중 둘 이상의 조합
    을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 인간 항체 분자.
  7. 제6항에 있어서, 항체 분자는 S228P 돌연변이 및 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 포함하는 것인 인간 항체 분자.
  8. 제6항에 있어서, 항체 분자는 S228P 돌연변이, M252Y 돌연변이, S254T 돌연변이, T256E 돌연변이, 및 중쇄 C-말단 리신 잔기의 결실을 포함하는 것인 인간 항체 분자.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는 IgG4 중쇄 불변 영역 및 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 인간 항체 분자.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및
    a. 서열번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    b. 서열번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    c. 서열번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    d. 서열번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    e. 서열번호: 32의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    f. 서열번호: 35의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    g. 서열번호: 38의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    h. 서열번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    i. 서열번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    j. 서열번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    k. 서열번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    l. 서열번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    m. 서열번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    n. 서열번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    o. 서열번호: 62의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    p. 서열번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    q. 서열번호: 68의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 인간 항체 분자.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는 서열번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 인간 항체 분자.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는 Fab 단편, Fab2 단편, 또는 단일 쇄 항체인 인간 항체 분자.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 것인 인간 항체 분자:
    a. IL-5 수용체에 대한 IL-5의 결합을 감소시키는 특성;
    b. 20일 이상의 혈청 반감기를 갖는 특성; 또는
    c. 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-5에 결합하지만 마우스, 랫트, 또는 기니어 피그 IL-5에 결합하지 않는 특성.
  14. 제1항에 있어서, 항체 분자는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 40 pM 이하의 평형 친화성 상수(KD)로 인간 IL-5에 결합하는 것인 인간 항체 분자.
  15. 제1항 또는 제2항의 인간 항체 분자를 포함하는, 호산구성 천식, 과다호산구 증후군, 호산구성 개입(eosinophilic involvement)을 갖는 비용종(nasal polyposis), 다발혈관염을 갖는 호산구성 육아종증, 아토피성 피부염 또는 호산구성 식도염의 치료를 위한 약제학적 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항의 인간 항체 분자를 코딩하는 핵산 분자.
  17. 제16항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  18. 제1항 또는 제2항의 인간 항체 분자를 발현하도록 형질전환된 단리된 세포.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
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