KR100511544B1 - Ｉｌ－5 매개된 질환의 치료에 유용한 재조합 ｉｌ－5길항제 - Google Patents

Ｉｌ－5 매개된 질환의 치료에 유용한 재조합 ｉｌ－5길항제

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Abstract

본 발명은 고친화성 중화 mAbs로부터 유도된, 키메릭, 인체에 적응시킨 IL-5 mAbs 및 다른 IL-5 mAbs, 이를 포함하는 제약학적 조성물, 치료 및 진단 방법을 제공한다.

Description

ＩＬ－5 매개된 질환의 치료에 유용한 재조합 ＩＬ－5 길항제 {RECOMBINANT IL-5 ANTAGONISTS USEFUL IN TREATMENT OF IL-5 MEDIATED DISORDERS}
관련 출원의 참조
본 출원은 1995년 6월 6일에 출원된 미국 특허 출원 제08/470110 및 08/467420의 일부 계속 출원이고, 상기 출원은 1994년 12월 23일에 출원된 미국 특허 출원 제08/363131의 일부 계속 출원이다.
본 발명은 IL-5 및 과잉의 호산구 생산에 의해 매개된 질병의 치료 및 진단에 유용한 항체 및 변형된 항체, 특히 mAbs, Fabs, 키메릭 항체 및 인체에 적응시킨 항체에 관한 것이다.
호산구는 폐 조직에서 과민감성 반응과 관련된 알레르기 질병을 포함하는 다양한 염증성 질병의 발병에 관여한다(버터필드(Butterfield) 등, Immunopharmacology of Eosinophils, H. Smith and R. Cook, Eds., p151-192, 아카데믹 프레스, 런던(1993)). 주목할만한 예는 비특이적 기관지 과반응성을 초래하는 기도의 가역적 장애로 특성화되는 질병인 천식이다. 이는 거대 파아지, 임파구 세포 및 호산구에 의한 기관지 점막 및 특징적 폐침윤 수준의 만성적 염증 반응의 발생에 의존한다. 호산구는 질병의 점막 손상을 개시하는데 중요한 역할을 한다(코리간(Corrigan) 등, Immunol. Today, 13:501-507(1992)). 순환계, 만성적 천식 환자의 기관지 분비물 및 폐 실질 중 증가된 수의 활성화된 호산구가 보고되어 왔고, 다양한 폐의 기능 실험에 의해 측정된 바와 같이 질병의 심도는 혈액의 호산구 수와 관련이 있다(Griffen 등, J. Aller. Clin. Immunol., 67:548-557(1991)). 탈과립화 과정 중 증가된 수의 호산구는 종종 말기 천식을 앓고 있는 환자의 기관지 폐포(bronchoalveolar BAL) 체액에서 회수되었고, 통상적으로 스테로이드 요법의 결과로서 호산구의 수의 감소는 임상적 증상의 발병과 관련이 있다(부스켓(Bousquet) 등, N. Eng. J. Med., 323:1033-1039(1990)).
인터루킨(IL-5)은 활성화된 CD4+ T 임파구 세포에 의해 우세하게 생산되는 동질 이중체 당단백질이다. 인간에서, IL-5는 대게 호산구의 증식 및 분화를 조절한다. 상승된 수준의 IL-5는 천식의 기관지폐포 세척액에서 검출된다(모토지마(Motojima) 등, Allergy, 48:98(1993)). IL-5로의 트랜스제닉 생쥐는 항원의 증진(덴트(Dent) 등, J. Exp. Med., 172:1425(1990))없이 말단 혈액 및 조직에서 현저한 호산구를 보이고, 항-뮤린 IL-5 단일클론 항체는 생쥐의 혈액 및 조직 중 호산구(히토시(Hitoshi) 등, Int. Immunol., 3:135(1991)) 및 실험 동물에서 기생충 감염 및 알레르기 변화와 관련된 호산구를 감소시키는 효과를 보였다(코프만(Coffman) 등, Science, 245:308-310(1989), 쉐르(Sher) 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:61-65(1990), 챤드(Chand) 둥, Eur. J. Pharmacol., 211:121-123(1992)).
비록, 코르티코스테로이드는 호산구 수 및 천식의 다른 염증 성분을 억제하는데 매우 효과적이더라도, 심한 천식 및 최근에는 온화 내지 절제된 천식에서 모두 부작용을 일으킨다. 다른 주요 항-염증성 약제 요법-크로모글리케이츠(나트륨크로몰린 및 네도크로밀)만이 코르티코스테로이드보다 상당히 효과가 낮고, 그들의 정확한 작용 메카니즘은 밝혀지지 않았다.
최근의 개발에서는 신규 흡입용 스테로이드, 장기간의 기관지 확장 작용 및 신규 생화학 또는 제약학적 표적에 작용하는 작용제(예를 들어, 칼륨 채널 활성화제, 루코트리엔 길항제, 5-리폭시게나제(5-LO) 억제제 등)에 관해 촛점이 맞춰지고 있다. 이상적 약제는 스테로이드의 효능과 나트륨 크로몰린과 관련된 안정성이 결합된 것이고, 선별성 및 작용의 신속한 개시까지도 증가될 것이다. 이간에서 중화 IL-5 항체는 호산구 관련 증상을 완화시키는데 잠재적으로 유용할 것이다.
따라서, 고친화도 IL-5 길항제, 예를 들어 인간 인터루킨 5에 대한 증화 단일클론 항체에 대한 요구가 있어왔고, 이는 호산구 분화 및 증식(즉, 호산구의 축적)을 감소시켜서 호산구 염증을 감소시킬 것이다.
발명의 요약
본 발명의 첫번째 측면은 인간 인터루킨-5에 특이적이고, 상세한 설명에 기재된 약 3.5×10-11M 이하의 해리 상수에 의해 특성화되는 결합 친화도를 갖는 설치류(예를 들어, 래트 및 뮤린)의 중화 단일클론 항체를 제공하는 것이다. 이러한 단일클론 항체의 예는 뮤린의 단일클론 항체 2B6, 2E6 및 2F2이고, 4A6와 같은 래트의 단일클론 항체가 있다. 본 발명의 다른 측면은 SK119-2B6.206.75(1), SK119-2E3.39.40.2, SK119-2F2.37.80.12, 4A6(1)G1F7 및 5D3(1)F5D6와 같은 하이브리도마이다.
관련된 측면에서 본 발명은 본 발명의 설치류의 중화 단일클론 항체의 Fc 영역을 삭제함으로써 생산되는, 인간 인터루킨-5에 대해 특이적인 중화 Fab 단편 또는 그의 F(ab')2 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 설치류의 중화 단일클론 항체로부터 단리된 중쇄(또는 경쇄) 이뮤노글로불린이 필라멘트상 파아지 Fab 디스플레이 라이브러리에서 인터루킨-5 면역화 설치류로부터 단리된 경쇄(또는 중쇄, 각각) 이뮤노글로불린 라이브러리와 발현됨으로써, 사슬 셔플링(shuffling) 기술에 의해 생산된, 인간 인터루킨-5에 대해 특이적 중화 Fab 단편 또는 그의 F(ab')2 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 인터루킨-5 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 대한 약 3.5×10-11M 이하의 해리 상수로 특성화된 비인체 중화 단일클론 항체(mAb)로부터 유도된 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함하는 인간 인터루킨-5에 대해 특이적인 변형된 항체를 제공한다. 변형된 항체가 인체에 적응시킨 항체인 경우, 비인체 이뮤노글로불린의 상보성 결정 영역을 코딩하는 서열은 제1 이뮤노글로불린 파트너로 삽입되고, 여기서 적어도 하나, 바람직하게는 제1 이뮤노글로불린 파트너의 모든 상보성 결정 영역(CDRs)은 비인체 단일클론 항체의 CDRs로 치환된다. 바람직하게는, 제1 이뮤노글로불린 파트너는 이뮤노글로불린 불변 체인의 모든 부분 또는 일부를 포함하는 제2 이뮤노글로불린 파트너와 작동가능하게 연결된다.
관련된 측면에서, 본 발명은 인간 인터루킨-5에 대한 약 3.5×10-11M 이하의 해리 상수에 의해 특성화된 비인체 중화 단일클론 항체(mAbs)로부터 유도된 CDRs및 이를 코딩하는 핵산분자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 인간 인터루킨-5에 대한 약 3.5×10-11M 이하의 해리 상수에 의해 특성화된 비인체의 중화 단일클론 항체로부터 유도된 인간의 중쇄 및 경쇄 의 불변 영역 및, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 함유하는 키메릭 항체를 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 상기 변형된 항체 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 제약학적 조성물을 인체에 투여함으로써 인체에서 과잉의 호산구 생산과 관련된 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 IL-5에 대해 약 3.5×10-11M 이하의 해리 상수에 의해 특성화된 비인체의 중화 단일클론 항체(mAbs)로부터 유도된 변형된 항체(예를 들어, 조작된 항체, CDRs, Fab 또는 F(ab)2 단편 또는 그의 유사체)의 재조합 생산에 유용한 방법 및 성분을 제공한다. 이 성분들은 이를 코딩하는 단리된 핵산 서열, 재조합 플라스미드로 트랜스펙트된 숙주 세포(바람직하게는 포유동물)에서 그들의 발현을 조절할 수 있는 선택된 조절 서열의 조절 하의 핵산 서열을 함유하는 재조합 플라스미드를 함유한다. 생산 방법은 변화된 항체, 바람직하게는 인체에 적응시킨 항체가 숙주 세포에서 발현될 수 있는 조건 하에 본 발명의 트랜스펙트된 숙주 세포주의 배양 및 발현된 생산물의 단리에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 환자로부터 생물적 체액 시료를 얻고, 본 발명의 항체 및 변형된 항체가 IL-5/(단일클론 또는 변형된) 항체 복합체가 형성되는 조건 하에서 상기 시료와 접촉하도록 하고, 상기 IL-5/항체 복합체의 존재 여부를 검출하는 것으로 이루어진 과잉의 호산구 생산과 관련된 질병을 진단하는 방법이다.
본 발명의 다른 측면 및 잇점은 상세한 설명 및 바람직한 실시 태양에 기재되어 있다.
본 발명은 뮤린의 단일 클론 항체 2B6에서 예시된 바와 같이 인간 IL-5 결합 특이성, 중화 활성, 및 인간 IL-5에 대한 높은 친화성을 특징으로 하는 각종 항체, 변형된 항체 및 그의 단편을 제공한다. 본 발명의 항체는 통상의 하이브리도마 기술, 파아지 디스플레이 조합 라이브러리, 이뮤노글로불린 사슬 셔플링(shuffling), 및 새로운 중화 항체를 생성하기 위한 인체에 적응시킨 기술에 의해 제조된다. 이들 생성물은 IL-5 개재된 질환(예: 천식) 치료용 치료 및 제약 조성물에 유용하다. 이들 생성물은 또한 인체 내의 내생 IL-5 수준 또는 활성화된 세포로부터 생체외 방출된 IL-5의 측정(예: 효소 결합 면역흡수 분석(ELISA))에 의한 IL-5 개재된 상태의 진단에도 유용하다.
Ⅰ. 정의
"개조된 항체"란 선택된 숙주 세포 내에서 발현시켜 얻을 수 있는, 변형된 이뮤노글로불린 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질을 의미한다. 이러한 변형된 항체는 조작된 항체(예: 키메릭 또는 인체에 적응시킨 항체) 또는 이뮤노글로불린 정상 영역의 전체 또는 일부분이 결핍된 항체 단편, 예를 들면 Fv, Fab, 또는 F(ab)2 등이다.
"개조된 이뮤노글로불린 코딩 영역"이란 본 발명의 변형된 항체를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 변형된 항체가 CDR-그라프트되거나 또는 인체에 적응시킨 항체인 경우, 비인체 이뮤노글로불린으로부터 상보성 결정 영역(CDRs)을 코딩하는 서열은 인간 가변 프레임워크 서열을 포함하는 제1 이뮤노글로불린 파트너 내에 삽입된다. 임의로, 제1 이뮤노글로불린 파트너는 제2 이뮤노글로불린 파트너에 작동가능하게 연결된다.
"제1 이뮤노글로불린 파트너"란 천연(또는 자연 발생적) CDR 코딩 영역이 제공자 항체의 CDR 코딩 영역으로 치환되어 있는, 인간 프레임워크 또는 인간 이뮤노글로불린 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 인간 가변 영역은 이뮤노글로불린 중쇄, 경쇄(또는 양쪽 사슬 모두), 유사체 또는 그의 기능적 단편일 수 있다. 항체(이뮤노글로불린)의 가변 영역 내에 위치하는 상기 CDR 영역은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면 카뱃(Kabat) 등의 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제4판, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]에는 CDRs를 찾기 위한 규칙이 기재되어 있다. 또한, CDR 영역/구조를 식별하는 데에 유용한 컴퓨터 프로그램도 공지되어 있다.
"중화"란 인간 IL-5가 그의 특이적 수용체에 결합하는 것을 방해하거나, 또는 결합이 일어났다면 IL-5의 수용체를 통한 그의 신호화를 억제함으로써 IL-5 활성을 억제하는 항체를 의미한다. mAb는 B13 세포 생체분석에서 측정된 바와 같이 IL-5 활성을 억제하는 데에 90%의 효율, 바람직하게는 95%의 효율, 가장 바람직하게는 100%의 효율을 갖는 경우에 중화된다(IL-5 중화 분석, 실시예 2C 참조).
"고친화성"이란 용어는 광학 바이오센서 분석(실시예 2D 참조)에 의해 측정된 바와 같이 인간 IL-5에 대한 Kd가 3.5 x 10-11 M 이하인 것을 특징으로 하는 결합 친화성을 갖는 항체를 의미한다.
"인간 IL-5에 대한 결합 특이성"이란 인간 IL-5에 대해서는 높은 친화성을 갖지만 뮤린의 IL-5에 대해서는 그렇지 않음을 의미한다.
"제2 이뮤노글로불린 파트너"란 제1 이뮤노글로불린 파트너가 프레임 내에 또는 임의로 통상의 링커 서열에 의해 융합되어 있는(즉, 작동가능하게 연결되어 있는) 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이것으로는 이뮤노글로불린 유전자가 바람직하다. 제2 이뮤노글로불린 파트너는 동일하거나(즉, 동종 - 제1 및 제2 개조된 항체는 동일한 공급원으로부터 유래됨) 또는 다른(즉, 이종) 목적 항체에 대한 전체 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이것은 단일한 폴리펩티드의 일부분으로서 이뮤노글로불린 중쇄 또는 경쇄 (또는 양쪽 사슬 모두)일 수 있다. 제2 이뮤노글로불린 파트너는 특정 이뮤노글로불린 종류 또는 이소타입에 한정되지는 않는다. 또한, 제2 이뮤노글로불린 파트너는 Fab, 또는 F(ab)2에서 발견되는 바와 같이 이뮤노글로불린 불변 영역의 일부분(즉, 적합한 인간 불변 영역 또는 프레임워크 영역의 분리된 부분)을 포함할 수 있다. 이러한 제2 이뮤노글로불린 파트너는 예를 들면 파지 디스플레이 라이브러리의 일부분으로서 숙주 세포의 외부 표면 위에 노출된 막내 단백질을 코딩하는 서열, 또는 분석 또는 진단 검출용 단백질, 예를 들면 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제 등을 코딩하는 서열도 포함할 수 있다.
Fv, Fc, Fd, Fab 또는 F(ab)2란 용어는 이들의 표준 의미로 사용된다[예: Harlow 등, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 참조].
본 명세서에 사용되는 "조작된 항체"란 용어는 선택된 수용체 항체의 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 영역의 한 부분이 선택된 에피토프에 대해 특이성을 갖는 하나 이상의 제공자 항체로부터 유래된 동일 부분에 의해 치환되어 있는 변형된 항체, 즉 전길이 합성 항체 (예: 항체 단편에 대립하는 것으로서 키메릭 또는 인체에 적응시킨 항체)의 형태를 의미한다. 예를 들면, 이러한 분자는 개질되지 않은 경쇄와 결합된 인체에 적응시킨 중쇄, 또는 그 반대의 것을 특징으로 하는 항체를 포함할 수 있다. 조작된 항체는 또한 제공자 항체 결합 특이성을 유지하기 위한, 수용체 항체 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 영역 구조 영역을 코딩하는 핵산 서열의 변화를 특징으로 할 수 있다. 이들 항체는 본 명세서에 기재된 제공자 항체로부터 유래된 CDRs를 갖는 수용체 항체로부터의 하나 이상의 CDRs (바람직하게는 전체)의 치환을 포함할 수 있다.
"키메릭 항체"란 수용체 항체로부터 유래되는 경쇄 및 중쇄 정상 영역과 관련하여 제공자 항체로부터 유래된 자연 발생적 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)을 함유하는 조작된 항체의 종류를 의미한다.
"인체에 적응시킨 항체"란 비인체 제공자 이뮤노글로불린으로부터 유래된 CDRs를 갖고 분자의 나머지 이뮤노글로불린-유래된 부분은 하나 이상의 인간 이뮤노글로불린(들)로부터 유래된 것인 조작된 항체의 종류를 의미한다. 또한, 프레임워크 지지 잔기들은 결합 친화성을 유지하기 위하여 변형될 수 있다 [예: Queen 등, Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson 등, Bio/Technology, 9: 421 (1991) 참조].
"제공자 항체"란 그의 가변 영역, CDRs, 또는 기타 기능적 단편 또는 그의 유사체의 핵산 서열을 제1 이뮤노글로불린 파트너에 제공하여, 변형된 이뮤노글로불린 코딩 영역과, 제공자 항체의 항원 특이성 및 중화 활성 특성을 갖는 발현된 변형 항체를 제공하는 (단일 클론 또는 재조합) 항체를 의미한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 제공자 항체중 하나는 2B6로 표시되는 비인체(즉, 뮤린)의 중화 단일 클론 항체이다. 항체 2B6는 적합한 뮤린의 IgG 정상 영역 위에 가변 중쇄 DNA 및 서열 확인 번호 1 및 15 각각의 아미노산 서열, 및 가변 경쇄 DNA 및 서열 확인 번호 2 및 16 각각의 아미노산 서열을 갖는 이소타입 IgG1의 높은 친화성의 인간-IL-5 특이적 중화 항체(즉, 뮤린의 IL-5는 인식하지 못함)로 정의된다.
"수용체 항체"란 그의 중쇄 및(또는) 경쇄 구조 영역 및(또는) 그의 중쇄 및(또는) 경쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열 전체 (또는 임의의 부분, 그러나 바람직하게는 전체)를 제1 이뮤노글로불린 파트너에 제공하는, 제공자 항체에 대한 이종 (단일 클론 또는 재조합) 항체를 의미한다. 바람직하게, 수용체 항체는 인체 항체이다.
"CDRs"는 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 초 가변 영역인 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 정의된다. 예를 들면 캐봇 등의 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제4판, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조한다. 이뮤노글로불린의 가변부에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDRs (또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 "CDRs"란 3개의 중쇄 CDRs 모두, 또는 3개의 경쇄 CDRs 모두 (또는 적합한 경우 중쇄 및 경쇄 CDRs 모두)를 의미한다.
CDRs는 항체를 항원 또는 에피토프에 결합시키기 위한 접촉 잔기의 대부분을 제공한다. 본 발명에서 흥미로운 CDRs는 제공자 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래하며, 천연 CDRs의 유사체를 포함하는데, 여기서 유사체도 이들이 유래된 제공자 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화 능력을 공유 또는 유지한다.
'항원 결합 특이성 또는 중화 능력을 공유한다'라고 함은 예를 들면 mAb 2B6가 특정 수준의 항원 친화성을 특징으로 한다고 하더라도, 적합한 구조적 환경에서 2B6의 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR은 더 낮거나 또는 더 높은 친화성을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 환경에서의 2B6의 CDRs는 2B6와 동일한 에피토프(들)을 인식할 것이다. 2B6의 중쇄 CDRs의 예로는 서열 확인 번호 7, 서열 확인 번호 8, 및 서열 확인 번호 9를 들 수 있고, 2B6의 경쇄 CDRs의 예로는 서열 확인 번호 10, 서열 확인 번호 11, 및 서열 확인 번호 12를 들 수 있다.
"기능적 단편"은 단편이 유도된 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화 능력을 보유하는, 부분적으로 중쇄 또는 경쇄 가변 서열 (예컨대, 이뮤노글로불린 가변 영역의 아미노 또는 카르복시 말단에서 소수 결실물 (monor deletions))이다.
"유사체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 개질된 아미노산 서열이며, 여기서 개질은 소수의 아미노산 (즉, 10개 이하)의 화학 작용 또는 치환 또는 재배열일 수 있으며, 변형은 아미노산 서열이 개질되지 않은 서열의 생물학적 특성, 예컨대 항원 특이성 및 고친화성을 보유하게 한다. 예를 들면, (사이런트) 돌연변이가 치환을 통하여 조작될 수 있으며, 이때 특정 엔도누클레아제 제한 위치가 CDR-코딩 영역 내 또는 주위에서 만들어진다.
유사체는 또한 대립형질 변형물로서 발생할 수 있다. "대립형질 변형 또는 개질"은 본 발명의 아미노산 또는 펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열의 변형이다. 이러한 변화 또는 개질은 유전 코드에서의 퇴화성(degeneracy)에 기인할 수 있으며, 또는 목적하는 특성을 제공하기 위하여 의도적으로 조작될 수 있다. 이들 변형물 또는 개질물은 임의의 코딩된 아미노산 서열의 변화를 초래하거나 또는 초래하지 않을 수 있다.
용어 "이펙터제(effector agent)"란 변화된 항체, 및(또는) 제공자 항체의 천연 또는 합성 경쇄 또는 중쇄, 또는 제공자 항체의 다른 단편이 통상의 기술에 의해 결합될 수 있는 비단백질 담체 분자를 일컫는다. 이러한 비단백질 담체는 진단 분야에서 사용된 종래의 담체, 예컨대, BIA코어 [파마시아] 계에서 사용된 것과 같은 폴리스틸렌 또는 다른 플라스틱 비드, 폴리사카라이드, 또는 의료 분야에서 유용하고 인체 및 동물에 투여시 안전한 다른 비단백질 물질을 포함할 수 있다. 기타 이펙터제는 중금속 원자, 또는 방사성동위원소를 킬레이트하기 위한 거대환을 포함할 수 있다. 이러한 이펙터제, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜은 또한 변화된 항체의 반감기를 증가시키는데 유용할 수 있다.
II. 고친화성 IL-5-단일클론 항체
항체를 조작하는데 사용하기 위하여, 본 발명의 변화된 항체 및 단편, 비인체 종 (예를 들면, 소, 양, 원숭이, 닭, 설치류 (예컨대, 뮤린 및 래트) 등)가 사용되어 그로부터 자생 인간 IL-5 또는 펩티드 에피토프를 제공시 바람직한 이뮤노글로불린을 생성할 수 있다. 종래의 하이브리도마 기법이 사용되어 비인체 mAb 내지 IL-5를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 이후, 이러한 하이브리도마는 실시예 부분에서 기술한 바와 같이, 96-웰 플레이트에 코팅된 IL-5를 사용하거나 또는 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 결합된 비오티닐화된 IL-5를 사용하여 결합된 것을 선별한다.
본 발명의 고친화성의 중화 mAb의 하나의 예로는 하기 실시예 1에서 보다 상세히 기술된 키메릭 또는 인체에 적응시킨 항체의 개발을 위하여 사용될 수 있는 뮤린 항체 mAb 2B6이다. 2B6 mAb는 인간 IL-5에 대한 항원 결합 특이성에 의해 특성화되며, IL-5에 대한 Kd는 3.5x10-11M 미만 (약 2.2x10-11M)이다. 2B6(실시예 3H 참조)으로부터의 Fab 단편의 IL-5에 대한 Kd는 광학 바이오센서에 의해 측정한 바에 따르면 약 9x10-11로 측정된다. MAb 2B6은 인간 IL-5와 인간 IL-5 수용체 간의 α-사슬 간의 결합 작용을 봉쇄하는 것으로 보인다.
또다른 바람직한 제공자 항체는 뮤린(murine) mAb, 2E3이다. 이 mAb는 이소타입 표본 IgG2a이고, hIL-5에 대한 해리 상수가 3.5x10-11M 미만(약 2.0x10-11 M)를 갖는 것에 의해 특성화된다.
또다른 바람직한 제공자 항체는 래트 (rat) mAb, 4A6이다. 이 mAb는 3.5x10-11M 미만(약 1.8x10-11M)의 hIL-5에 대한 해리 상수를 지님으로써 특징화된다. 또한, mAb 4A6은 인간 IL-5와 IL-5 수용체의 β-사슬 간의 결합 상호 작용을 봉쇄하기 위한 것으로 보인다.
본 발명은 2B6 mAb, 2E3 mAb, 또는 그의 초가변 (즉, CDR) 서열의 용도에 한정되지 않는다. 인간 IL-5 및 상응하는 항-IL-5 CDR에 대한 3.5x10-11M 이하의 해리 상수에 의해 특징화된 임의의 다른 적합한 고친화성의 IL-5 항체는 치환될 수 있다. 하기 설명에서 제공자 항체가 2B6 또는 2E3으로 식별되는 경우, 이 표기는 단지 설명 및 기술을 간단하게 하기 위하여 행해진다.
III. 항체 단편
본 발명은 또한 인간 IL-5에 대항하는 mAbs로부터 유도된 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편의 용도를 포함한다. 이들 단편은 생체 내에서는 IL-5 및 호산구-매개된 질병에 대한 생체 내 보호제 및 시험관 내에서는 IL-5 진단제의 일부로서 유용하다. Fab 단편은 경쇄 전체 및 중쇄의 아미노 말단 부분을 포함하고, F(ab')2 단편은 디술피드 결합에 의해 결합된 2개의 Fab 단편에 의해 형성된 단편이다. MAbs 2B6, 2E3, 및 다른 유사 고친화성의 IL-5 결합 항체는 종래의 수단, 예를 들면 적절한 단백질 분해 효소, 파파인 및(또는) 펩신을 사용한 mAb의 절단, 또는 재조합 방법에 의해 얻을 수 있는 Fab 단편 및 F(ab')2 단편의 공급원을 제공한다. 상기 Fab 또는 F(ab')2 단편은 치료제, 예방제 또는 진단제, 및 본 출원에서 기술된 재조합 또는 인체에 적응시킨 항체의 형성에 사용가능한 가변 영역 및 CDR 서열을 포함하는 서열의 제공자로서 자체로 유용하다.
Fab 및 F(ab')2 단편은 조합 파아지 라이브러리 (예컨대, 윈터(Winter) 등, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994) 참조)를 통하여 또는 선별된 항체 (예컨대, 2B6)의 Fd 또는 VH 이뮤노글로불린이 경쇄 이뮤노글로불린, VL (또는 VK )의 레퍼토리와 결합하여 신규 Fabs를 형성하는, 이뮤노글로불린 사슬 셔플링 (예컨대, Marks 등, Bio/Technology, 10:779-783 (1992) 참조, 이들은 모두 전부 본원에서 참고 문헌으로 삽입되어 있음)을 통하여 제작될 수 있다. 거꾸로, 선택된 항체의 경쇄 이뮤노글로불린은 중쇄 이뮤노글로불린, VH (또는 Fd)의 레퍼토리와 결합되어서 신규 Fabs를 형성할 수 있다. 중화 IL-5 Fabs는 실시예 부분에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, mAb 2B6이 경쇄 이뮤노글로불린의 레퍼토리와 결합하게 되는 경우에 얻어졌다. 따라서, 사슬 셔플링 기술로부터 독특한 서열 (뉴클레오티드 및 아미노산)을 갖는 중화 Fabs를 회수할 수 있다.
IV. 목적하는 안티-IL-5 아미노산 및 뉴클레오티드 서열
전술한 mAb 2B6 또는 다른 항체는 가변 중쇄 및(또는) 경쇄 펩티드 서열, 프레임워크 서열, CDR 서열, 기능적 단편 및 그의 유사체, 및 이들을 코딩하는 핵산 서열 등의 서열에 공헌할 수 있으며, 제공자 항체의 항원 결합 특이성에 의해 특징화되는 다양한 개조된 항체를 도안하고 얻는데 유용하다.
따라서, 본 발명의 한 실시예는 IL-5 뮤린 항체 2B6의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열 및 그로부터 유도된 서열을 제공한다. 2B6의 중쇄 가변성 영역은 도 1에 도시되어 있다. CDR-코딩 영역은 상자 내의 영역으로 나타나고, 서열 확인 번호: 7, 서열 확인 번호: 8 및 서열 확인 번호: 9에서 제공된다. 2B6의 경쇄 클론 가변 영역은 도 2에 도시되어 있다. CDR-코딩 영역은 서열 확인 번호: 10, 서열 확인 번호: 11 및 서열 확인 번호: 12에서 제공된다.
인체에 적응시킨 중쇄 가변 영역은 도 8에 도시되어 있다 [서열 확인 번호: 18 및 19]. 신호 서열은 또한 서열 확인 번호: 17에 제공된다. 당업자에게 공지된 다른 적합한 신호 서열이 본원에서 예시화된 신호 서열에 대해 대체될 수 있다. 상기 제작물의 CDR 아미노산 서열은 자생 뮤린의 키메릭 중쇄 CDR과 동일하며, 서열 확인 번호: 7, 서열 확인 번호: 8 및 서열 확인 번호: 9에 의해 제공된다. 전형적인 (합성된) 인체에 적응시킨 경쇄 가변성 서열은 도 9 [서열 확인 번호: 20 및 21]에 예시되어 있다.
가변 경쇄 및 중쇄 펩티드 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 서열, 또는 그의 단편은 또한 CDR 또는 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산 서열 내에 특이적 변화의 돌연 변이를 도입하고, 생성된 개질 또는 융합 핵산 서열을 발현을 위한 플라스미드 내로 혼입하는데 유용하다. 예를 들면, 프레임워크 및 CDR 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열에서의 사이런트(Silent) 치환은 돌연변이화된 CDR (및(또는) 프레임워크) 영역의 삽입을 촉진시키는 제한 효소 자리를 생성하는데 사용되었다. 이들 CDR-코팅 영역은 본 발명의 인체에 적응시킨 항체를 제작하는데 사용되었다.
유전가 코드의 퇴화성을 고려하여, 가변 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열, 및 제공자 항체의 항원 특이성을 공유하는 본 발명의 CDR 서열 및 관능성 단편 및 그의 유사체를 코딩하는 다양한 코딩 서열이 조작될 수 있다. 가변성 사슬 펩티드 서열 또는 CDR을 코딩하는 본 발명의 단리된 핵산 서열, 또는 그의 단편은 개조된 항체, 예컨대 키메릭 또는 인체에 적응시킨 항체, 또는 제2의 이뮤노글로불린 파트너와 작동가능하게 연결되는 경우에는 본 발명의 다른 조작된 항체를 생산하기 위하여 사용될 수 있다.
본원에서 기술된 개조된 항체 및 항원의 일부를 코딩하는 단리된 핵산 서열이외에 다른 상기 핵산 서열이 본 발명에 포함될 수 있다는 것을 주목해야 하며, 이들은 자생 CDR-코딩 서열에 상보적인 것 또는 CDR-코딩 영역을 둘러싸는 개질된 인간 프레임워크 영역에 상보적인 것을 예로 들수 있다. 유용한 DNA 서열은 엄격한 혼성 조건하에서 DNA 서열과 혼성화되는 서열을 포함한다 [T. Maniatis 등, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pp 387 내지 389]. 하나의 상기 엄격한 혼성 조건의 예는 65℃에서 4XSSC에서 혼성화 후, 65℃에서 1시간 동안 0.1XSSC로 세척하는 것이다. 별법으로, 전형적인 엄격한 혼성 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 4XSSC이다. 바람직하게는, 상기 DNA 서열의 혼성화는 길이 면에서 약 18개의 뉴클레오티드 이상, 즉, 약 CDR의 크기이다.
V. 개조된 이뮤노글로불린 분자 및 개조된 항체
개조된 이뮤노글로불린 분자는 키메릭 항체 및 인체에 적응시킨 항체 등의 조작된 항체를 포함하는 개조된 항체를 코딩할 수 있다. 바람직한 개조된 이뮤노글로불린 코딩 영역은 IL-5 항체, 바람직하게는 본 발명에 의해 제공되고, 제1 이뮤노글로불린 파트너 (인간 프레임워크 또는 인간 이뮤노글로불린 가변성 영역)으로 삽입되는 등의 고친화성 항체의 항원 특이성을 갖는 펩티드를 코딩하는 CDR-코딩 영역을 포함한다.
바람직하게는, 제1 이뮤노글로불린 파트너는 제2 이뮤노글로불린 파트너와 작동가능하게 연결된다. 제2 이뮤노글로불린 파트너는 상기에서 정의되어 있으며, 목적하는 제2 항체 영역, 예를 들면 Fc 영역을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 제2 이뮤노글로불린 파트너는 또한 경쇄 또는 중쇄 불변 영역이 프레임내로 또는 링커 서열에 의해 융합되는 다른 이뮤노글로불린을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. IL-5의 관능성 단편 또는 유사체에 대해 작용하는 조작된 항체를 동일 항체와 의 결합이 개선되도록 고안할 수 있다.
또한, 제2 이뮤노글로불린 파트너는 비단백질 담체 분자를 포함하여 상기한 바와 같은 이펙터제와 결합될 수 있는데, 제2 이뮤노글로불린 파트너는 종래 수단에 의해 기능적으로 결합될 수 있다.
제2 이뮤노글로불린 파트너, 예를 들면 항체 서열과 이펙터제간의 융합 또는 결합은 임의의 적합한 수단, 예를 들면 종래 공유 또는 이온 결합, 단백질 융합 또는 이종 이관능성 가교제, 예를 들면 카르보디이미드, 글루타르알데히드 등에 의할 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 알려져 있고, 종래 화학 및 생화학 책에 쉽게 기재되어 있다.
추가로, 제2 이뮤노글로불린 파트너와 이펙터제 사이에 필요한 양의 공간을 간단히 제공하기 위한 종래 링커 서열은 개조된 이뮤노글로불린 코딩 영역으로 제조할 수도 있다. 이러한 링커의 디자인은 당업자에게 잘 알려져 있다.
이외에, 본 발명의 분자에 대한 신호 서열을 변경하여 발현을 강화시킬 수 있다. 한 예로서 뮤린의 중쇄 서열로부터 유도된 CDR 및 신호 서열을 갖는 2B6 인체에 적응시킨 항체는 다른 신호 서열 [서열 확인 번호: 17]로 교체된 원래의 신호 펩티드를 갖는다.
전형적인 개조된 항체는 mAb 2B6의 항원 특이성을 갖는 가변성 중쇄 및(또는) 경쇄 펩티드 또는 단백질 서열, 예를 들면 VH 및 VL 쇄를 함유한다. 본 발명의 또다른 바람직한 개조된 항체는 뮤린의 항체 분자 2B6의 중쇄 및(또는) 경쇄의 가변성 영역의 하나 이상, 바람직하게는 모든 CDR을 함유하는 아미노산 서열에 의해 특징화 되며, 나머지 서열은 인간 공급원 또는 관능성 프레그먼트 또는 그의 동등물로부터 유도된다. 예를 들면 인체에 적응시킨 VH 및 VL 영역을 참고한다(도 8 및 9).
또다른 실시태양에서, 본 발명의 조작된 항체에는 부가적 작용제가 부착될 수 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 기술의 절차를 사용하여 완전 항체 분자의 Fc 프레그먼트 또는 CH2CH3 도메인이 효소 또는 다른 검출가능한 분자(즉, 폴리펩티드 이펙터 또는 리포터 분자)로 교체된 본 발명의 조작된 항체를 제조할 수 있다.
제2 이뮤노글로불린 파트너는 비이뮤노글로불린 펩티드, 단백질 또는 뮤린의 2B6의 항원 특이성을 갖는 CDR 함유 서열과 이종 구조의 그의 프레그먼트에 작동가능하게 결합시킬 수 있다. 얻어진 단백질은 발현될 때 항-IL-5 항원 특이성 및 비이뮤노글로불린의 특성 모두를 나타낼 수 있다. 융합 파트너 특성은 예를 들면 또다른 결합 또는 리셉터 도메인과 같은 기능적 특성, 또는 융합 파트너 그 자체가 치료 단백질인 치료 특성, 또는 추가의 항원적 특성일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 단백질은 전길이의 중쇄 및 경쇄, 또는 Fab 또는 F(ab')2 프레그먼트와 같은 그의 임의의 분리된 프레그먼트, 중쇄 이량체, 또는 Fv와 같은 그의 임의의 최소 재조합 프레그먼트 또는 단일쇄 항체(SCA) 또는 선택된 제공자 mAb와 동일한 특이성을 갖는 임의의 다른 분자, 예를 들면 mAb 2B6 또는 2E3을 포함할 수 있다. 이러한 단백질은 개조된 항체의 형태로 사용하거나, 또는 비융합 형태로 사용할 수 있다.
제2 이뮤노글로불린 파트너를 제공자 항체와 상이한 항체, 예를 들면 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 불변 영역의 임의의 이소타입 또는 군으로부터 유도할 때마다 조작된 항체가 얻어진다. 조작된 항체는 이뮤노글로불린(Ig) 불변 영역 및 한 공급원으로부터의 가변성 프레임워크 영역, 예를 들면 수용체 항체, 및 제공자 항체로부터의 하나 이상의 (바람직하게는 모든) CDR, 예를 들면 본 명세서에 기재된 항-IL-5 항체를 포함할 수 있다. 이외에, 제공자 항체 항원 결합 특이성을 유지하기 위하여 핵산 또는 아미노산 수준의 수용체 mAb 경쇄 및(또는) 중쇄 가변성 도메인 프레임워크 영역, 또는 제공자 CDR 영역의 개조, 예를 들면 결실, 치환 또는 첨가할 수 있다.
이와 같이 조작된 항체는 (임의로는 기재된 바와 같이 개질된) IL-5-mAb의 가변 중쇄 및(또는) 경쇄 중 하나(또는 둘다) 또는 아래 동정된 1개 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR(도 7 참조)을 사용하여 고안한다. 본 발명의 조작된 항체는 중화되어 IL-5 단백질의 리셉터에 대한 결합을 차단하며, 또한 IL-5 의존성 세포의 증식을 차단 또는 방지한다.
이와 같이 조작된 항체는 선택된 인간 이뮤노글로불린 또는 서브타입의 프레임워크 영역을 함유하는 인체에 적응시킨 항체 또는 IL-5 항체 관능성 프레그먼트에 융합된 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 함유하는 키메릭 항체를 포함할 수 있다. 적합한 인간 (또는 다른 동물)의 수용체 항체는 제공자 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 상동 관계에 의해, 종래 데이터베이스, 예를 들면 카바트(KABAT(R)) 데이터베이스, 로스 알라모스(Los Alamos) 데이터베이스, 및 스위스 프로테인(Swiss Protein) 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. (아미노산 기재의) 제공자 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동 관계에 의해 특징화된 인간 항체는 제공자 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및(또는) 중쇄 가변성 프레임워크 영역을 제공하는데 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변성 프레임워크 영역을 제공할 수 있는 적합한 수용체 항체는 유사한 방법으로 선택할 수 있다. 수용체 항체인 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용체 항체로부터 유도될 필요가 없다는 것을 알아야 한다.
바람직하게는, 이종 프레임워크 및 불변 영역은 인간 이뮤노글로불린 군 및 이소타입, 예를 들면 IgG(서브타입 1 내지 4), IgM, IgA 및 IgE로부터 선택된다. 그러나, 수용체 항체가 인간 이뮤노글로불린 단백질 서열만을 포함할 필요는 없다. 예를 들면 인간 이뮤노글로불린 사슬의 DNA 서열 코딩 부분이 폴리펩티드 이펙터 또는 리포터 분자와 같은 비이뮤노글로불린 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열에 융합된 유전자를 구조화할 수 있다.
특히 바람직한 인체에 적응시킨 항체의 한 예는 선택된 인간 항체 서열의 프레임워크 영역에 삽입된 2B6의 CDR을 함유하는 것이다. 인체에 적응시킨 항체에 IL-5 항체의 중쇄 및(또는) 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 바람직하게는 3개의 CDR을 선택된 인간 항체 서열의 프레임워크 영역에 삽입하여 인간 항체의 천연 CDR을 교체한다.
바람직하게는, 인체에 적응시킨 항체에 있어서, 인간의 중쇄 및 경쇄 모두에 있는 가변성 도메인은 1회 이상의 CDR 치환에 의해 조작된다. 6개 모두의 CDR을 사용하거나, 또는 6개 미만의 CDR의 각종 조합을 사용할 수 있다. 바람직하게는 6개 모두의 CDR을 치환한다. 경쇄로서 인간 수용체 항체로부터의 비개질된 경쇄를 사용하여 인간 중쇄에 있는 CDR만을 교체할 수 있다. 별법으로, 종래 항체 데이터베이스를 사용하여 다른 인간 항체로부터 적합한 경쇄를 선택할 수 있다. 조작된 나머지 항체는 임의의 적합한 수용체 인간 이뮤노글로불린으로부터 유도할 수 있다.
따라서, 조작된 인체에 적응시킨 항체는 바람직하게는 천연 인간 항체 또는 그의 프레그먼트의 구조를 가지며, 효과적인 치료 용도, 예를 들면 인체에서 IL-5-매개된 염증성 질병의 치료에 요구되는 특성 또는 진단 용도에 요구되는 특성의 조합을 갖는다.
또다른 예로서, 조작된 항체는 2E3의 가변성 경쇄 영역의 3개의 CDR [서열 확인 번호: 10, 11 및 13] 및 2B6의 가변 중쇄 영역의 3개의 CDR [서열 확인 번호: 7, 8 및 9]를 함유할 수 있다. 얻어진 인체에 적응시킨 항체는 mAb 2B6의 고친화성 및 동일한 항원 결합 특이성에 의해 특징화되야 한다.
당업자는 조작된 항체를 제공자 항체(즉, 유사체)의 고친화성 및 특이성에 반드시 영향을 주지는 않으면서 가변성 도메인 아미노산의 변화에 의해 더 변경할 수 있다는 것을 알 것이다. 중쇄 및 경쇄 아미노산을 가변성 도메인 프레임워크 또는 CDR 중 하나 또는 모두에서 다른 아미노산으로 치환할 수 있다는 것도 예상된다.
이외에, 본 발명의 분자의 선택적인 특성을 강화 또는 감소시키기 위하여 불변 영역을 예를 들면, 이량화, Fc 리셉터에 대한 결합 또는 보충물의 할성화 및 결합능에 의해 개조할 수 있다(예를 들면 문헌 [Angal 등, Mol. Immunol. 30:105-108 1993)], [Xu 등, J. Biol. Chem, 269:3469-3474 (1994)], [Winter 등, 유럽 특허 공고 제307,434호] 참조).
키메릭 항체인 개조된 항체는 중쇄 및 경쇄 모두에 대한 인간 이뮤노글로불린 불변 영역과 함께, 프레임워크 영역을 포함하여, 전체 비인체 제공자 항체 중쇄 및 경쇄 가변성 영역을 제공함으로써 상기한 인체에 적응시킨 항체와는 상이하다. 본 발명의 인체에 적응시킨 항체에 대한 추가의 비인체 서열을 보유하는 키메릭 항체는 인간에서 상당한 면역 반응을 유도해낼 수 있을 것으로 예상된다.
이러한 항체는 다음에 논의되는 바와 같은 IL-5 매개된 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
VI. 개조된 항체 및 조작된 항체의 생산
바람직하게는, mAb 2B6 또는 다른 적합한 제공자 mAbs(예, 2E3, 2F2, 4A6 등)의 가변성 경쇄 및(또는) 중쇄 서열 및, CDR 그들의 코딩 핵산 서열을 본 발명의 개조된 항체, 바람직하게는 인체에 적응시킨 항체를 제작하는데 다음 방법을 이용할 수 있다. 동일 또는 유사 기술을 사용하여 본 발명의 다른 실시태양을 만들 수도 있다.
선택된 제공자 mAb, 예를 들면 뮤린의 항체 2B6을 생산하는 하이브리도마는 통상적으로 클로닝되고, 그의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 DNA는 당업자에게 알려진 기술, 예를 들면 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]에 기재된 기술에 의해 얻는다. 제공자 mAb 결합 특이성을 보유하기 위하여 적어도 CDR-코딩 영역을 함유하는 2B6의 가변성 중쇄 및 경쇄 영역 및 수용체 mAb 경쇄 및(또는) 중쇄 가변성 도메인 프레임워크 영역의 일부가 요구될 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드 프라이머 및 역 전사 효소를 사용하여 인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 항체 사슬의 잔류 이뮤노글로불린 유도된 부분을 얻는다. CDR 코딩 영역은 공지 데이터베이스를 사용하고 다른 항체와 비교하여 동정한다.
이어서, 마우스/인간 키메라 항체를 제조하여 결합능에 대해 분석할 수 있다. 이와 같은 키메라 항체는 중쇄 및 경쇄 모두에 대한 인간 Ig 불변 영역과 함께, 전체 비인체 제공자 항체 VH 및 VL 영역을 함유한다.
인간 항체로부터의 중쇄 가변 영역의 동질성 프레임워크 영역은 컴퓨터화된 데이터 베이스, 예컨대, 카벳 (KABAT)(등록 상표)를 사용하여 확인되었고, 2B6과 상동인 인간 항체가 수용체 항체로서 선택되었다. 인간 항체 프레임워크 내에서 2B6 CDR-코딩 영역을 포함하는 합성 중쇄 가변 영역의 서열은 프레임워크 영역에서 임의로 뉴클레오티드 치환되도록 고안되어 제한 부위를 도입한다. 이어서, 이같이 고안된 서열은 긴 합성 올리고머를 이용하여 합성된다. 별법으로, 이같이 고안된 서열은 올리고뉴클레오티드를 중복시키고, 폴리머라제 연쇄 반응법 (PCR)에 의해 증폭되고, 오류를 수정함으로써 합성될 수 있다.
적합한 경쇄 가변 프레임워크 영역이 유사한 방법으로 고안되었다.
인체에 적응시킨 항체는 키메릭 항체로부터 유도될 수 있으나, 바람직하게는 중쇄 및 경쇄로부터의 제공자 mAb CDR-코딩 영역을 선택된 중쇄 및 경쇄 플레임워크 내에 적합하게 삽입시켜 합성된다. 별법으로, 본 발명의 인체에 적응시킨 항체는 표준 돌연변이화 기술에 의해 제조된다. 즉, 수득된 항체는 인간의 프레임워크 영역 및 제공자 mAb CDR-코딩 영역을 포함한다. 후속적으로, 프레임워크 잔기를 조작할 수 있다. 수득된 인체에 적응시킨 항체는 재조합 숙주 세포, 예컨대, COS, CHO 또는 골수종 세포에서 발현될 수 있다. 기타 인체에 적응시킨 항체는 상기 기술을 이용하여 다른 적합한 IL-5-특정화, 중화, 고친화성이 있는 비인간 항체 상에 제조될 수 있다.
통상 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 숙주 세포에서의 복제 및 발현 및 (또는) 숙주 세포로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상의 조절 통제 서열과 작동가능하게 결합된 개조된 항체에 대해 이들 코딩 서열을 배치시켜 형성된다. 조절 서열로는 프로모터 서열, 예컨대 CMV 프로모터 및 다른 공지된 항체로부터 유도될 수 있는 시그날 서열이 있다. 유사하게, 제 2 발현 벡터는 상보적인 항체 경쇄 또는 중쇄를 코팅하는 DNA 서열을 갖도록 제조될 수 있다. 바람직하게는, 이들 제2 발현 벡터는 코딩 서열 및 선택성 마커에 관한 것을 제외하고는 제1 발현 벡터와 동일하고, 가능한 각 폴리펩티드 사슬이 관능적으로 발현되는 것을 확신할 수 있다. 별법으로, 개조된 항체의 중쇄 및 경쇄 코딩 서열은 단일 벡터 상에 잔류할 수 있다.
선택된 숙주 세포는 제1 및 제2 벡터를 이용한 통상의 기술에 의해 동시 트랜스팩트된 (또는 단일 벡터에 의해 단순히 트랜스팩트됨) 재조합 또는 합성 경쇄 및 중쇄로 이루어진 본 발명의 트랜스팩트된 숙주 세포를 창출한다. 이어서, 트랜스펙트된 세포는 통상의 기술에 의해 배양되어 본 발명의 조작된 항체를 생산한다. 재조합 중쇄 및 (또는) 경쇄와 연관된 항체는 ELISA 또는 RIA와 같은 적합한 분석법에 의해 배양액으로부터 스크리닝된다. 유사한 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 다른 개조된 항체 및 분자를 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제조 및 방법에 사용된 클로닝 및 서브클로닝 단계를 위한 적합한 벡터는 당업자에 의해 선정될 수 있다. 예컨대, 클로닝 벡터의 통상적인 pUC 서열을 사용할 수 있다. 사용된 하나의 벡터는 아머샴 (Amersham, 영국 버팅함샤이어 소재) 또는 파마시아 (Pharmacia, 스웨덴 우프살라 소재)와 같은 공급사로에서 시판되는 pUC19이다. 또한, 쉽게 복제될 수 있고, 다수의 클로닝 부위 및 선택성 유전자 (예컨대, 항생 물질 내성)를 갖는 임의의 벡터 및 쉽게 조작되는 임의의 벡터가 클로닝을 위해 사용될 수 있다. 즉, 크로닝 벡터의 선택은 본 발명의 제한적 요소가 아니다.
유사하게, 본 발명에 따라 조작된 항체를 발현시키기 위해 사용되는 벡터는 통상의 임의 벡터로부터 당업자에 의해 선택될 수 있다. 또한, 벡터는 선택된 숙주 세포에서 이종성 DNA 서열의 복제 및 발현을 조절하는 선택된 조절 서열 (예컨대, CMV 프로모터)을 포함할 수 있다. 이들 벡터는 조작된 항체 또는 개조된 면역글로블린 코딩 영역을 코딩하는 상기 DNA 서열을 포함한다. 또한, 벡터는 용이한 조작을 위한 바람직한 제한 부위를 삽입시켜 개질된 선택 면역글로브린을 혼입할 수 있다.
발현 벡터는 포유류의 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 (DHFR)와 같은 이종 DNA 서열의 발현을 증폭시키기에 적합한 유전자에 의해 특성화된다. 다른 바람직한 벡터 서열로는 소의 성장 호르몬 (BGH) 등으로부터의 폴리 A 신호 서열 및 베타글로빈 프로모터 서열 (베타글로프로)가 있다. 본원에서 유용한 발현 벡터는 당업자에 공지된 기술에 의해 합성될 수 있다.
레프리콘, 선택 유전자, 인헨서(enhencer), 프로모터, 신호 서열 등의 상기 벡터의 성분은 시판되거나 또는 천연 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 선택된 숙주에서 재조합 DNA 생성물의 발현 및 (또는) 분비를 조절하는데 사용되는 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다. 포유류, 세균, 곤충, 효모 및 진균 발현에 대해 당업계에 공지된 수많은 유형의 다른 적합한 발현 벡터가 이같은 목적을 위해 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 조작된 항체 또는 이의 개조된 면역글로브린 분자의 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙트된 세포주를 포함한다. 또한, 클로닝 및 이들 클로닝 벡터의 다른 조작에 유용한 숙주는 통상적이다. 하지만, 가장 바람직하게는, 이. 콜리의 다양한 균주 세포가 클로닝 벡터의 복제, 및 본 발명의 개조된 항체를 구조화하는 다른 단계를 위해 사용된다.
본 발명의 조작된 항체 또는 개조된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 바람직하게는 CHO, COS와 같은 포유류 세포, 섬유아세포 (예: 3T3), 및 골수 세포이고, 더욱 바람직하게는 CHO 또는 골수 세포이다. 인간 세포가 사용될 수 있고, 이로 인해 분자가 인체의 글리코실화 유형으로 개질될 수 있다. 별법으로, 다른 진핵생물 세포주를 사용할 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 선별 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생산 및 정제를 위한 방법이 당업계에 공지되어 있다. (상기 "Sambrook et al." 참조)
세균 세포는 본 발명의 재조합 Fab의 발현에 적합한 숙주 세포로 유용한 것으로 입증될 수 있다. (예컨대, "Plueckthun, A., Immunol, Rev., 130: 151 - 188 (1992) 참조) 하지만, 세균 세포에서 발현된 단백질이 폴딩되지 않거나 또는 적합하게 폴딩된 형태이거나 또는 비글리코실화된 형태인 경향으로 인해, 세균 세포에서 생산된 임의의 재조합 Fab은 항원 결합력의 보유에 대해 스크리닝되야 한다. 세균 세포에 의해 발현된 분자가 적합하게 폴딩된 형태로 제조된다면, 이들 박테리아 세포는 바람직한 숙주가 될 것이다. 예컨대, 발현을 위해 사용되는 이. 콜리의 다양한 균주는 생물공학 분야에서 숙주 세포로 공지되어 있다. 또한, 바실러스 서브틸러스(B. subtilis, Streptomyces), 다양한 균주가 본 방법에서 사용될 수 있다.
필요한 경우, 당업자에 공지된 효모 세포 균주는 숙주 세포뿐만 아니라 Drosophila 및 Lepidoptera와 같은 곤충세포 및 바이러스성 발현계로로 유용하다. (Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenun Press (1986) 및 여기에 언급된 참고 문헌 참조)
본 발명의 벡터가 제작될 수 있는 일반적인 방법, 본 발명의 숙주 세포를 생산하기 위해 요구되는 세포 감염 방법, 및 이들 숙주 세포로부터 본 발명의 개조된 항체를 생산하기 위해 필요한 배양 방법은 모두 통상의 기술이다. 일단 제조되면, 본 발명의 변형된 항체는 황산암모늄 침전법, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당업계의 표준 방법에 따라 세포 배양 함유물로부터 유사하게 정제될 수 있다. 이들 기술은 당업계의 기술 분야에 포함되는 것으로 본 발명을 제한하지 않는다.
인체에 적응시킨 항체의 다른 발현 방법은 미국 특허 제 4,873,316에 기재된 트랜스제닉 동물에서의 발현을 이용할 수 있다. 이것은 동물의 카제인 프로모터를 사용하는 발현계에 관한 것으로, 포유류에 트랜스진(transgene)으로 혼입될 때 암컷의 젖내에 필요한 재조합 단백질을 생산하게 된다.
바람직한 방법에 의해 발현될 후, 이어서 조작된 항체는 적합한 분석법에 의해 시험관내 활성에 대해 시험된다. 현재의 통상적인 ELISA 분석 포맷을 사용하여 조작된 항체의 IL-5에 대한 정성적 및 정량적 결합을 측정한다. 또한, 다른 시험관내 분석을 사용하여 중화 효율을 입증하고, 이후 인간에 대한 임상 연구를 수행하여 일반적인 제거(clearance) 메카니즘에도 불구하고 체내의 조작된 항체의 지속성을 평가할 수 있다.
2B6으로부터 제조된 항체에 대해 기재된 방법에 의해, 당업자는 본원에 기재된 다른 제공자 IL-5 항체, 가변성 영역 서열 및 CDR 펩티드로부터 인체에 적응시킨 항체를 형성할 수도 있다. 조작된 항체는 조작된 항체의 수용체에 의해 자체 인식되는 잠재적인 가변 영역 프레임워크로 제조될 수 있다. 가변 영역 프레임워크에 작은 변형을 가하여 수용체의 면역유발성을 크게 증가시키지 않으면서 항원의 결합을 크게 증가시킬 수 있다. 이같이 조작된 항체는 효과적으로 IL-5 매개된 질병에 대해 인간을 효과적으로 치료할 수 있다. 또한, 이들 항체는 이같은 질병을 진단하기에 유용할 수 있다.
VII. 치료/예방 용도
또한, 본 발명은 하나 이상의 조작된 항체 또는 본원의 개조된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 유효량의 항체를 투여하는 것으로 이루어진, 천식과 같은 호산구 증가와 관련된 증상을 경험하는 인간의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 분자를 사용하여 유도되는 치료 반응은 인간 IL-5에 결합시키고, 이어서 호산구 증진을 막음으로써 이루어진다. 즉, 본 발명의 분자는 치료용으로 적합하게 제조 및 제형될 때, 알레르기성 및 (또는) 아토피성 반응, 또는 호산구 증가증과 관련돤 반응, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 알레르기성 비염, 천식, 만성 호산구증가 페렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 복강 질환, 호산구증가 위장염, 처그-스트라우스 증후군 (결절성동맥주위염 및 아토피), 호산구증가 근육통 증후군, 과호산구증가 증후군, 에피소딕 안지오데마를 포함하는 부종 반응, 기생충 감염 (호수구증가는 보호작용을 할 수 있음), 사상충속 피부염 및 아토피성 피부염을 경험하는 사람에게 매우 바람직하다.
본 발명의 개조된 항체(들) 및 그의 단편을 본 발명의 조작된 항체가 조적하는 질병에 대해 다른 항체, 특히 다른 마커(에피토프)와 반응성인 인간 mAbs와 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 치료제는 알레르기 상태 치료를 위해서 약 2일 내지 약 3 주, 또는 필요한 만큼의 기간이 요망된다. 예를 들면, 계절적 비염 등을 치료할 때는 더 장기간의 치료가 바람직할 것이다. 이는 IL-5 매개 질환의 선행 기술 치료법으로 현재 사용되는 주입 프로토콜을 능가하는 상당한 진전을 의미한다. 치료 투여량 및 치료 기간은 인체 순환시에 본 발명의 분자의 상대적 지속 기간과 관계가 있으며, 치료 조건 및 환자의 총괄적인 건강 상태에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다.
본 발명의 치료제의 투여 방식은 숙주에게 이 제제를 전달하는 임의의 적당한 경로일 수 있다. 본 발명의 변형된 항체, 항체, 조작된 항체, 및 그의 단편 및 제약 조성물은 비경구 투여, 즉 피하내, 근육내, 정맥내 또는 비강내 투여에 특히 유용하다.
본 발명의 치료제는 활성 성분으로서 본 발명의 조작된 (예를 들면, 인체에 적응시킨) 항체의 유효량을 제약학적으로 허용가능한 담체 중에 함유하는 제약 조성물로서 제조될 수 있다. 본 발명의 예방제로는 즉석 주사 형태의, 바람직하게는 생리 pH로 완충된 조작된 항체를 함유하는 수성 현탁액 또는 수용액이 바람직하다. 비경구 투여를 위한 조성물은 보통 본 발명의 제악학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된, 조작된 항체의 용액 또는 그의 칵테일로 이루어질 것이다. 다양한 수성 담체를 사용할 수 있고, 예를 들면, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등이 있다. 이 용액이 무균이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이 용액은 통상의, 널리 공지된 멸균 기술 (예를 들면, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 이 조성물은 생리학적 조건에 근접하도록 pH 조정제 및 완충제 등과 같은 제약학적으로 허용가능한 보조 물질을 필요한 만큼 함유할 수 있다. 이러한 약제 내 본 발명의 항체의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5% 초과, 일반적으로는 약 1% 이상으로부터 15 또는 20 중량% 정도 까지 변할 수 있으며 일차적으로 유체 용적, 점도 등에 기초하여, 선택된 특정 투여 방식에 따라 선택될 것이다.
따라서, 본발명의 근육내 주사용 제약 조성물은 무균 완충수 1mL, 및 본 발명의 조작된 항체 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들면 약 50 ng 내지 약 30 mg 또는 보다 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg를 함유한다. 유사하게, 본 발명의 정맥내 주입용 제약 조성물은 링겔액 약 250 ml 및 본 발명의 조작된 항체 약 1 내지 약 30, 바람직하게는 5 mg 내지 약 25 mg을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구로 투여가능한 조성물의 실제 제조 방법은 널리 공지되어 있거나, 당업자에게는 명확할 것이고, 예를 들면 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 보다 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 치료제는 약제일 때 단위 투여 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 적당한 치료학적 유효 투여량은 당업자라면 쉽게 결정할 수 있다. 인간 또는 다른 동물의 염증 질환을 효과적으로 치료하기 위해서는, 체중 70 kg 당 본 발명의 단백질 또는 항체 약 0.1 mg 내지 약 20 mg의 일회 투여량을 비경구로, 바람직하게는 정맥내로 또는 근육내로 투여하여야 한다. 필요하다면, 이러한 투여량을 염증 반응 중에 의사가 적절히 선택한 적당한 시간 간격을 두고 반복할 수 있다.
본 발명의 변형된 항체 및 조작된 항체는 이러한 질병의 치료 진전을 추적하거나, 또는 IL-5 매개 질병의 결정용과 같은 진단 분야에 이용될 수 있다. 진단 시약으로서, 상기 변형된 항체는 혈청, 혈장 또는 다른 적당한 조직 내 IL-5 수준의 측정, 또는 배양물 내에서 인간 세포에 의한 방출을 측정하기 위한 ELISA 및 다른 통상의 검정 포맷에 서용하기 위해서는 통상 라벨링될 수 있다. 변형된 항체를 이용하는 검정법의 성질은 통상적이며 이 기재에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명의 한가지 실시양태는 환자로부터 얻어진 시료 (혈장 또는 조직) 중의 인간 IL-5의 양을 측정하고 상기 측정량을 정상 집단 내 인간 IL-5의 평균량과 비교하는 단계들을 포함하는, 알레르기 또는 환자내 과량의 호산구 생산과 관련된 다른 상태의 진단을 보조하는 방법에 관한 것으로, 이에 의해 환자 시료 내 상당히 상승된 양의 IL-5가 존재한다는 것은 알레르기 및 과량의 호산구 생산과 관련된 다른 상태를 의미하는 것이다.
본 명세서에 기재된 항체, 변형된 항체 또는 그의 단편은 저장을 위해 동결건조되고 사용 전에 적당한 담체 내에 재구성될 수 있다. 이 기술은 통상의 면역글로블린에 의해 효과적임이 입증되었고 업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다.
하기 실시예는 조작된 항체의 제작 및 적당한 벡터 내에서 그의 발현에 대한 일례를 비롯하여 본 발명의 다양한 측면을 설명하며, 이로써 본 발명의 범위가 제한 되는 것은 아니다. 모든 아미노산은 통상 3개의 문자 또는 1개의 문자 코드에 의해 식별된다. 모든 필수 제한 효소, 플라스미드, 및 기타 시약 및 물질은 달리 명시되지 않는 한 상업적으로 구입했다. 모든 일반 클로닝 리게이션 및 기타 재조합 DNA 방법은 상기 언급된 매니아틱스 일동(T. Maniatix et al.)의 문헌 또는 동일 출판사에 의한 샘브룩 일동(Sambrook et al.)의 제2판에 실행되었다.
실시예 1- hIL-5에 대한 MAb의 생산
인간 IL-5를 트로소필라 슈나이더(Drosophila Schneider) 2 (S2)에서 발현시키고, 균일하게 정제했다. 뮤린 IL-5를 스포도프테라 프르지펠다(Spodoptera frugiperda) 21 (Sf21) 세포를 사용하여 바쿨로바이러스 내에서 발현시키고 균일하게 정제했다. 단일클론성 항체 TRFK-5 (중화 랫트 항-마우스 IL-5 항체)를 젠자임 코프사(매사추세츠주 캠브리지 소재)로부터 얻었다.
A. 면역 절차
7 마리의 CAF1 암컷 마우스 (매사추세츠주 윌밍톤 소재의 찰스 리버) 실험 대상에게 면역원으로서 재조합 인간 IL-5(IL-5)를 사용했다. 이 동물들에게 4 개월의 기간에 걸쳐 1 대 1의 비율의 TiterMAXTM (CytoRx Corp. 조지아주 노크로스 소재)로써 유탁된 인산 완충 염수 (PBS) 중 IL-5를 3회 피하 주사했다. 초기 항원 투여량은 50 μg (마이크로그램)이었고, 추가자극은 25 및 10μg (마이크로그램)이었다. 추가 자극 후에, 혈청 시료를 수집하고, 수용체 결합 억제 검정 및 B13 증식 검정 (또는 IL-5 중화 검정 (실시예 2C))에 의해 IL-5 결합 및 중화 활성 모두에 대해 검정했다. 모든 마우스가 IL-5에 결합된 혈청 시료를 생산했다. 비장 제공자로서 선택된 동물을 안락사시키기 3일 전에 재조합 인간 IL-5 10 μg (마이크로그램)으로 정맥내로 추가 자극을 주었다.
B. 하이브리도마 개발
처음 문헌 [Kohler et al., (Nature, 256:495 (1975))]에 의해 보고되었던 융합 절차의 변형법을 사용하여 세포 단층을 사용하는 기술을 수행했다 (Kennet et al., Eds., "Hybridomas: A new dimension in biological analysis", pp. 368-377, Plenum Press, New York). 두 마리의 제공자 마우스로부터의 비장 세포를 풀링하고 비장 세포 5천만개 대 SP2/0/Ag14 골수종 세포 1천만개의 비율을 사용하여 융합을 수행했다. 융합-양성 세포로부터의 상등액에 대해 ELISA에 의해 IL-5에 대한 결합 여부를 검정했다. IL-5에 대한 항체를 생산하는 세포를 함유하는 웰을 증대시키고, IL-5 수용체 결합 억제 검정, 및 B13 (중화) 증식 검정 (하기 기재됨)으로 상등액을 스크리닝했다.
IL-5와 반응성인 mAb를 분비하는 16개의 하이브리도마를 단리했다. 하이브리도마 상등액을 요오드 표지된 IL-5와 혼합하고, IL-5 수용체 (IL-5R)의 α-사슬을 발현하는 드로소필리아 세포로부터 제조된 막 추출물에 첨가하고, 수용체 결합 억제에 대해 검정했다. 11개의 하이브리도마 상등액이 IL-5 수용체 α-사슬에 대한 요오드 표지된 IL-5의 결합을 60% 보다 크게 억제했다. 세 개의 mAb인 2B6, 2E3 및 2F2도 또한 뮤린 IL-5가 아니라 인간 IL-5에 반응하여 뮤린 B13 세포의 증식을 70% 보다 크게 억제했다. 4개는 결합 및(또는) 증식을 차단하고 (IC6, 2B6, 2E3 및 2F2), 1개는 비-중화성 (24G9)인 5개의 하이브리도마를 반복적으로 연질 한천 내에서 2차 클로닝시켜 안정한 클론 셀 라인을 생성했다. 클로닝된 셀라인으로부터의 상등액을 ELISA에 의해 교차 반응성에 대해 스크리닝했고, 이 상등액은 인간 IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-8, M-CSF 또는 TGFα에 결합하지 않았다. mAb을 정제했고, 결합 친화도를 광학 바이오센서 (BIAcore) 분석으로부터 평가하여 10 내지 100 pM의 범위였다. 이 셀라인으로부터 상등액을 뮤린 기준 표본 시약(PharMingen, 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 사용하여 기준 표본화했다. mAb 들의 친화도 및 중화활성에 대한 IC50의 요약이 표 1 에 제시되어 있다 (실시예 2).
유사한 방법으로, 면역된 랫트로부터 필적하는 면역 프로토콜 및 마우스에 대해 기재된 바의 융합용 랫트 골수종을 사용하여 랫트 하이드브리도마를 유도했다. 두 개의 랫트 하이브리도마, 4A6 및 5D3가 IL-5에 결합된 mAb들을 생산함을 확인했다. mAb인 2B6, 2E3 및 2F2와 유사하게, mAb인 4A6 및 5D3가 하기 기재된 B13 검정에서 중화됨이 발견됐다.
C. 하이브리도마 기탁:
단일클론 항체 2B6를 생산하는 하이브리도마 셀 라인 SK119-2B6.206.75(1)을 기탁 번호 HB 11783 하에 미국 매릴랜드주 록빌시에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁했고, 이는 특허 절차를 위한 미생물 기탁에 관한 1977년의 부다페스트 조약에 의한 특허 기탁으로 인정되었다.
단일클론성 항체 2E3을 생산하는 하이브리도마 셀 라인 SK119-2E3.39.40.2를 기탁 번호 HB 11782 하에 미국 매릴랜드주 록빌시에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁했고, 이는 특허 절차를 위한 미생물 기탁에 관한 1977년의 부다페스트 조약에 의한 특허 기탁으로 인정되었다.
단일클론 항체 2F2를 생산하는 하이브리도마 셀 라인 SK119-2F2.37.80.12를 기탁 번호 HB 11781 하에 미국 매릴랜드주 록빌시에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁했고, 이는 특허 절차를 위한 미생물 기탁에 관한 1977년의 부다페스트 조약에 의한 특허 기탁으로 인정되었다.
단일클론 항체 24G9를 생산하는 하이브리도마 셀 라인 SK119-24G9.8.20.5를 기탁 번호 HB 11780 하에 미국 매릴랜드주 록빌시에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁했고, 이는 특허 절차를 위한 미생물 기탁에 관한 1977년의 부다페스트 조약에 의한 특허 기탁으로 인정되었다.
단일클론 항체 4A6을 생산하는 히브리도마 세포선 4A6(1)G1F7은 미국 메릴랜드주 록크빌 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, American Type Culture Collection)에 기탁 번호 HB 11943으로 기탁되어 있으며 특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁을 규제하는 1977 년의 부다페스트 조약에 따라 특허 기탁물로서 인정받았다.
단일클론 항체 5D3을 생산하는 히브리도마 세포선 5D3(1)F5D6은 미국 메릴랜드주 록크빌 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, American Type Culture Collection)에 기탁 번호 HB 11942로 기탁되어 있으며 특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁을 규제하는 1977 년의 부다페스트 조약에 따라 특허 기탁물로서 인정받았다.
실시예 2 - 평가
A. 엘리사:
MaxiSorb(상품명) 면역 플레이트(일리노이주 네이퍼빌 소재의 눙크(Nunc))의 각 웰을 0.05 M 탄산 완충액(pH 9.6) 내 IL-5 0.2 ㎍으로 코팅하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 0.025% Tween 20(등록 상표)을 함유한 PBS로 헹구고, 2 시간 동안 실온에서 0.025% Tween 20(등록 상표)을 함유한 PBS 내 1% BSA로 블록킹시켰다. 희석하지 않은 하이브리드 상등액을 IL-5 코팅된 웰에 첨가하고 실온에서 2 시간 도안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 헹군 후, 퍼옥시다아제 표지된 염소 안티 마우스 IgG & IgM(인디애나주 인디애나폴리스 소재의 붸링머 맨하임(Boehringer Mannheim))을 1% BSA 및 0.025% Tween 20(등록 상표)을 함유한 PBS 내에 1/7500 희석율로 첨가하였다. 두 시간 후 플레이트를 세척하고 0.1% 우레아 퍼옥사이드 및 1 ㎎/㎖ 올쏘페닐렌디아민을 함유한 0.1 M 시트르산염 완충액(pH 4.75) 0.2 ㎖를 첨가하였다. 15 분 후 플레이트를 VMax(상품명) MicroplateReader(캘리포니아 멘로 파크 소재의 몰레큘라 디바이스(Molecular Devices)) 상 450 ㎚에서 판독하였다.
B. 수용기 결합 억제 분석:
인간 IL-5 수용기(IL-5R)의 α-사슬을 발현시키는 드로소필라 S2 세포의 막 추출물을 사용하여 수용기에 결합한 IL-5에 대한 항체의 효과를 측정하였다. 막을 제조하기 위해 109개 세포를 4℃에서 10 분 동안 1000 x g으로 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 건조 얼음/에탄올 베쓰 내에서 15 분 동안 냉동시켰다. 펠릿을 해동시키고 4℃ PBS 10 ㎖ 내에 재현탁시키고 10 분 동안 1000 x g에서 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 PBS 내에서 2X 세척하고 저장성 완충액(10 mM 트리스 pH 7.5, 3 mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 μM 류펩틴, 1 μM 펩스타틴 에이) 13.5 ㎖ 내에 재현탁시키고 얼음상에서 5 분 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 15 ㎖ 둔스(Dounce) 호모지나이저 내에서 균질화하고 최종 농도를 0.25 M로 하여 2.5 M 수크로즈 용액을 얻었다. 세포 잔해를 15 분 원심분리기에서 1000 x g로 제거하였다. 세포박을 4℃에서 90 분 동안 100,000 x g로 펠릿화하고 10 mM 트리스 (pH 7.5), 3 mM MgCl2, 250 mM 수크로스 50 ㎖ 내에 재현탁시키고 -70℃에 보관하였다.
수용기를 함유한 드로소필라 막의 분석은 25 mM HEPES 완충액(pH 7.2) 및 0.1% BSA(결합 완충액)을 함유한 드로소필라 조직 배양 매질 M3(Lindquist 일동, Drosophila Inf. Serv., 58: 163(1982))를 사용하여 MultiscreenGV(상품명) 플레이트(마사츄우셋츠주 베드포드 소재의 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.))에서 수행하였다. 웰을 0.1 ㎖ 결합 완충액으로 사전에 블록킹시켰다. 삼중 실험으로 검사 샘플 50 ㎕를 웰에 첨가하고 요오딘화(125I) IL-5 25 ㎕를 첨가하였다. 실온에서 20 분 인큐베이션시킨 후, 인간 IL5R의 α-사슬을 발현시키는 드로소필라 S2 세포의 막 추출물 25 ㎕를 웰에 첨가하였다. 1 시간 추가로 인큐베이션시킨 후 막을 진공 여과에 의해 수거하고 결합 완충액으로 3 회 세척하였다. 필터를 건조시키고 계수하였다.
C. IL-5 중화 분석
뮤린의 IL-5/IL-3 의존적 세포주 LyH7.B13(B13)을 알. 팔라시오스, 바젤 인스티튜트 오브 이뮤놀로지(R. Palacios, Basel Institute Of Immunology, 스위스 소재)에서 구입하였다. 세포를 RPMI 1640 배지(GibcoBRL, 영국 레프루쉬어)에서 매주 두번씩 하부배양하고, L-글루타민, 비필수적 아미노산, 피르브산나트륨, 페니실린-스트렙토마이신(GibcoBRL)로 보충하고, 2-메르캅토에탄올(5×10-5 M, 시그마사), 10% 소의 태아 혈청(글로베르팜, 영국 서레이 소재) 및 1-10 유닛의 뮤린의 IL-5를 첨가하였다. 분석을 위하여, 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 적절히 희석된 실험 시료의 존재 하에 48시간 동안 3배 (500 세포/웰) 배양하고, 마지막 4시간 동안 0.5 uCi 3H-티미딘(아메르샴, 영국 벅스 소재)를 첨가하였다. 이들을 1205 베타플레이트에서 신틸레이션 계수기로 측정하였다(LKB Wallac, 영국 베드 소재).
D. 광학 바이오센서
고정화 hIL-5 및 항체에 대한 키네틱 및 평형 결합 특성을 BIA코어 광학 바이오센서(파르마시아 바이오센서, 스웨덴 업살라 소재)를 사용하여 측정하였다. 키네틱 자료는 상기된 문헌(칼슨 등, J. Immunol. Meth., 145:229-240(1991))을 사용하여 측정하고, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 첨부된다.
3개의 중화 mAbs, 즉 2B6, 2E3 및 2F2는 막 수용체에 대한 125I-IL-5의 결합 억제 및 B 세포 증식의 중화에 대해 매우 유사한 잠재능을 갖고, 또한 IL-5에 대해 매우 유사한 친화도를 갖는다(표 1 참조). 3개의 mAbs, 2개의 IgG1 및 1개의 IgG2a로부터의 각각의 VH 및 VL의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 이 서열은 몇개의 잔사를 제외하고는 매유 유사하였다.
표 1
인간 IL-5과 반응하는 mAbs의 친화 및 중화 활성
mAb Kd(pM)a 중화
결합 IC50(nM)b 증식 IC50c 100% 억제c
2B6 22 1 70 200
2E3 20 1 90 600
2F2 13 1 150 340
1C6 86 43 12,200 ND
24G9 ND 〉133 〉100,000 ND
4A6 18 〉88 28 100
5D3 ND ND 100 10,000
a 광학 바이오센서(BIAcore) 분석법으로 측정됨(25℃) b 드로소필라(Drosophila) 막의 IL-5R(α사슬)에 대한125I-IL-5 결합의 억제 c 8 pM 사람 IL-5에 반응하는 B13 세포의 증식의 억제ND 자료 없음
실시예 3-조합적 라이브러리의 IL-5 Fab의 단리 및 특성화
A. PCR 및 조합적 라이브러리의 제작
3마리의 생쥐의 비장으로부터 정제된 RNA를 프라이머(dT)15가 공급된 장치 또는 3'FD(IgG1, IgG2a & IgG3) 및 카파 경쇄 프라이머를 사용하는 cDNA 장치(베링거 만하임, 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 역 전사시켰고, 이 방법은 휴스(Huse) 등의 문헌(Science, 246:1275(1989)) 및 캉(Kang, S.A.)의 문헌(Methods:Companion Methods Enzymol., 2:111(1991))에 치개된 바와 같고, 이 문헌들은 본 명세서에 참고문헌으로 첨부되었다. 이뮤노글로불린 cDNA를 프라이머 및 후스 등의 상기 문헌에 기재된 열 순환 조건을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. AmpliWaxTMPCR Gem 100(페르킨 엘머 세투스, 코넷티커주 노르워크 소재) 및 비드를 사용하는 "핫 스타트(Hot Start)" 기술 및 제조자의 프로토콜을 모든 반응에 사용하였다. PCR 생성물을 겔 정제하고, 소화시키고, pMKFabGene3 벡터(아메스 등, J. Immunol., 152:4572(1994))로 라이게이션하였다. Fd cDNA로 라이게이션한 후 라이브러리 적정은 5.1×107 CFU였고, 카파 cDNA로 라이게이션 후 라이브러리 적정은 1.5×106 CFU였다. 파아지미드 라이브러리로 형질전환된 XL-1-블루 세포(스트라타젠, 캘리포니아주 라졸라 소재)를 헬퍼 파아지 VCSM13(스트라타젠)로 감염시키고, 파아지는 바르바스 및 러너의 문헌(Methods: Companion Methods Enzymol., 2:119(1991))에 기재된 바와 같이 제조하였다.
B. 바이오패닝(Biopanning)
4개의 마이크로티터 웰(Immulon II Removawell Strips, Dynatech Laboratories Inc., 버지니아주 챤틸리 소재)를 밤새 4℃에서 0.1M 중탄산염, pH8.6 중 IL-5(1 ㎍/웰)로 코팅하였다. 웰을 물로 세척하고, 3% BSA를 함유하는 PBS로 37℃에서 1시간 동안 블럭킹하였다. 블록킹 용액을 제거하고, 라이브러리를 마이크로티터 웰(50 ㎕/웰)에 가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 웰을 부착된 파아지를 0.1M HCl으로 용출하기 전에 TBS/트윈(등록 상표)(50 밀리몰 트리스-HCl, pH 7.5, 150 밀리몰 NaCl, 0.5% 트윈(등록상표) 20)으로 10번, H2O로 한번 세척하고, 1 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 글리신으로 pH 2.2로 조정하였다.
C. 콜로니 리프트
바이오패팅의 제3 및 제4 단계로부터 단리된 클론으로부터 콜로니 리프트를 상기 바르바스 및 로노의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 처리하였다. 필터를 볼튼-헌터 시약(NEN, 캘리포니아주 빌레리카 소재)을 사용하여 요오드화된 0.5-1.0 uCi125I-IL-5와 함께 제조자의 추천된 방법에 따라 1% BSA를 함유하는 PBS에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였고, 0.25% 트윈을 함유하는 PBS로 세척하고, Kodak XAR 막에 노출시켰다. IL-5 반응성 Fabs를 발현하는 콜로니를 오토라디오그라피에 의해 검출하였다.
D. 가용성 FABs의 제조
파아지미드 디를 Nhel 및 SpeI로 소화시켜서 유전자 III을 제거하고, 스스로 라이게이션되었다. XL-1블루 세포를 형질전화하고, 단리된 클론을 1% 글루코스 및 50 ㎍/㎖ 카르베니실린을 함유하는 5.0 ㎖의 수퍼 액체(SB) 배지(30 g 트립톤, 20 g 이스트 추출물, 10 g의 3-[N-모르폴리노]프로판술폰산, pH 7로 조정된 MOPS)에서 밤새 37℃에서 증식시켰다. 이 배양액으로 부터의 세포를 베크만 GS-6R 원심분리기에서 3500 rpm의 속도로 10분 동안 펠릿화하고, 이를 50 ㎍/㎖의 카르베니실린을 함유하는 5 ㎖의 SB에 접종시켰다. 배양물을 37℃에서 1시간 동안 교반하고, 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG; 1밀리몰)을 가하고, 배양물을 28℃로 밤새 옮겨놓았다. 세포 펠릿을 20% 수크로스 현탁된 30 밀리몰 트리스 pH 8.0에 4℃에서 20분 동안 용해시켜서 가용성 Fab를 페리플라즘 추출물로부터 제조하고, 마이크로푸즈에서 10분 동안 원심분리하였다. Fab 농출물을 공지된 양의 뮤린의 FAB를 함유하는 시료를 비교하여서 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 상이한 세균 페리플라즘 추출물은 유사한 농도의 Fab를 함유하였고, 1 내지 20 ㎍/㎖의 범위에서 웨스턴 블롯 분석법에 의해 측정하였다.
E. FAB의 정제
단백질 정제를 돕기 위해 킬레이트화 펩티드를 중쇄의 카르복시-말단상에 조작하였다. NheⅠ 및 SpeⅠ로의 소화를 통해 M13 GeneⅢ 코딩 영역을 제거한 후에, 6개의 히스티딘 잔기를 코딩하는 하기 서열 확인 번호 43 및 44의 한쌍의 겹치는 올리고뉴클레오티드를 Fab 발현 벡터내로 서브클로닝하였다:
[서열 확인 번호 43] 5'-CTAGCCACCACCACCACCACCACTAA-3',
[서열 확인 번호 44] 3'-GGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGATC-5'.
Fab 발현의 유도를 전술된 바와 같이 수행하였다. 28℃에서 밤새 유도한 후, 4℃에서 20% 수크로스 및 30mM 트리스 pH 8.0 중에서 30분 동안 배양함으로써 세포 펠릿의 세포질 라이세이트를 제조하였다. 우레아 및 Brij-35 세제를 정화된 상청액에 각각 2M 및 1%의 최종 농도로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후에, 처리되고 정화된 상청액을 0.5㎖/분의 속도로 완충액 A(100mM Na-포스페이트, 10mM 트리스, 0.3M NaCl, 2M 우레아, pH 8.0)으로 평형시킨 5㎖ 니켈-NTA 금속 킬레이트화 칼럼(1.5x3㎝) 상에 직접 부하하였다. 4배의 칼럼 용적(20㎖)으로 세척]한 후에, 결합된 물질을 상기와 동일한 완충액 중에서 pH 8 내지 pH 4의 역 pH 구배의 6배의 칼럼 용적(30㎖)으로 용출하였다. 정제된 Fab를 pH 5.5에서 날카로운 대칭 피크에서 칼럼으로부터 용출하였다. 이들은 순도가 90% 이상이며 DNA를 포함하지 않는다.
F. FAB ELISA:
임뮤론(Immulon) Ⅱ 플레이트(Dynatech)를 4℃에서 0.1M 중탄산 완충액, pH 8.6 중에 현탁된 단백질(1㎎/㎖; 1웰당 50㎖)로 밤새 피복시켰다. 희석 및 세척을 0.05%의 Tween(상표) 20을 함유하는 PBS 중에서 수행하였다. 플레이트를 세척하고, 실온에서 1% BSA를 함유하는 PBS로 1시간 동안 차단하였다. 가용성 Fab를 함유하는 박테리아 상청액의 다양한 희석액 또는 정제된 Fab를 플레이트에 첨가하였다. 1시간 동안 배양한 후에, 플레이트를 세척하고, 1시간 동안 바이오티닐레이트된(biotinylated) 염소 항마우스 카파(Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL)를 첨가하였다(1:2000 희석액; 50㎕/웰). 플레이트를 세척하고, 1시간 동안 스트렙타비딘 표지된 양고추냉이 퍼록시다제를 첨가하였다(1:2000 희석액; 50㎕/웰). 플레이트를 세척하고, ABTS 퍼록시다제 기질을 첨가하고(100㎕/웰; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), 405㎚에서의 광학 밀도를 UVmax(상표)(분자 장치) 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
G. 조합 라이브러리로부터 Fab의 단리 및 특성화
IL-5에 대한 Fab를 포함하는 파지를 IL-5로 피복된 마이크로역가 웰에 대한 다수 라운드의 바이오패닝에 의해 라이브러리로부터 선별하였다. 4라운드의 선별 후에, IL-5 반응성 Fab를 125I-IL-5를 사용하는 콜로니 리프트 분석에 의해 동정하였다. 표지된 IL-5에 결합된, 제 3 라운드로부터 34개의 콜로니 및 제 4 라운드로부터 4개의 콜로니를 동정하였다. IL-5에 대한 결합을 Fab-geneⅢ 융합 단백질을 발현하는 배양 상청액을 사용하는 직접 결합 ELISA에 의해 확정하였다. 이들 콜로니로부터 DNA를 분리하고, M13 geneⅢ의 코딩 영역을 제거한 후에, 가용성 Fab 발현이 유도되었다. 세포질 분획을 제조하고 IL-5에 대한 결합을 ELISA에 의해 분석하였다. Fab는 다른 단백질(rC5a)에 명백하게 결합하지는 않고, IL-5에 특이적으로 결합하였다.
비희석된 세포질 추출물(1 내지 20㎍/㎖ Fab를 함유)을 IL-5R 결합 저해 분석으로 분석하였다(실시예 2). 모든 Fab는 IL-5Rα에 대한 요오드화된 IL-5의 결합을 35% 이상으로 저해하지 않았다.
H. 중화 mAb의 FAB로의 전환:
mAb(2B6)의 κcDNA 및 Fd를 전술된 조건을 사용하여 PCR에 의해 분리하였다. 겔-정제된 단편을 유전자 Ⅲ cDNA의 헥사-His 서열 3'을 포함하도록 변경된 pMKFabGene3 벡터내로 서브클로닝하여, 플라스미드 pMKFabGene3H를 제작하였다. 2B6 중쇄 및 경쇄를 포함하는 작용성, IL-5 결합 Fab 클론을 콜로니 리프트 분석에 의해 동정하였다. NheⅠ/SpeⅡ 소화 및 자기-결찰에 의해 유전자 Ⅲ을 제거하면, 중쇄가 헥사-His로의 프레임내에 융합되어, 전술된 바와 같은 정제를 허용하였다. 용량 의존적인 방식으로, 이 Fab는 모 mAb, 뮤린 2B6의 것과 유사하게, 약 7.5㎍/㎖의 IC50으로 수용체 결합을 저해하였다.
I. 사슬-셔플된 라이브러리의 제작 및 스크리닝:
중화 mAb 2B6의 Fd를 코딩하는 cDNA를 XhoⅠ/SpeⅠ 단편으로서 경쇄 cDNA 대신 SstⅠ/XbaⅠ 단편을 포함하는 pMKFabGene3H내로 서브클로닝하였다. 이 파지미드를 SstⅠ 및 XbaⅠ로 소화시키고, IL-5 면역된 마우스로부터 유도된 경쇄 PCR 생성물로 소화된 SstⅠ/XbaⅠ로 결찰하였다(전술됨). 결찰에 뒤이은 라이브러리 역가는 4×105CFU였다. 결합 라이브러리에 대해 바이오패닝 및 콜로니 리프트 분석을 전술된 바와 같이 수행하였다.
중화 mAb 2B6의 Fd를 코딩하는 cDNA를 IL-5 면역된 마우스로부터 회수된 동일한 경쇄 레퍼터리와 짝지음으로써 라이브러리를 제작하여, 결합 라이브러리를 생성하기 위해 사용하였다. 이 사슬로 셔플된 라이브러리를 고정된 IL-5에 대해 4라운드의 바이오패닝시키고, 생성된 콜로니를 콜로니 리프트 분석을 이용하여 IL-5 반응성에 대해 분석하였다. 요오드화 IL-5에 결합하는 양성 콜로니를 ELISA 및 IL-5Rα에 의해 추가로 분석하였다. 사슬 셔플된 라이브러리로부터 회수된 두 개의 Fab(2 및 15)는 IL-5Rα에 대한 IL-5의 결합을 차단하고, B13 분석에서 IL-5 의존성 증식을 저해하였다. 이들 2 Vk의 서열은 2B6 Vk(2B6 VH에 대한 원 경쇄 파트너)의 서열과 유사하였다. Fab 2 및 15에 대한 경쇄 서열은 각각 서열 확인 번호 45 및 46이다. Fab 2에 대해, CDR 1 내지 3은 각각 서열 확인 번호 10, 11 및 47이다. Fab 15에 대해, CDR 1 내지 3은 각각 10, 11 및 48이다.
모든 항체 아미노산 서열은 CDR에서의 가변성을 허용하는 KABAT 넘버링 시스템 및 프레임워크 길이를 사용하여 실시예 4 및 5에서 하기에 나열하였다. 즉, 주요 아미노산은 그들에 우선하는 아미노산의 실제 수에 상관없이 항상 동일한 숫자로 지정된다. 예를 들면, 모든 경쇄의 CDR1에 우선하는 시스테인은 항상 KABAT 23위치이고, CDR1에 뒤이어 오는 트립토판 잔기는 CDR1이 17개 이하의 아미노산을 포함할 수 있더라도 항상 KABAT 35 위치이다.
실시예 4-인체에 적응시킨 항체
하나의 인체에 적응시킨 항체를 인간 항체 프레임워크내에 뮤린 CDR을 함유하도록 디자인하였다. IL-5 특이 마우스 항체 2B6의 인체에 적응시킨 버전을 하기의 조작을 수행함으로써 제조하였다.
A. 유전자 클로닝:
mRNA를 베링거 만하임(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)으로부터 구입한 키트를 사용하여 개별적인 2B6, 2F2 및 2E3 하이브리도마 세포주(실시예 1을 참조)의 각각으로부터 분리한 후, cDNA 키트(Boehringer Mannheim)로 보충된 프라이머(dT)15를 사용하여 역전사시켜 cDNA를 제조하였다. 마우스 이뮤노글로불린에 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여, 경쇄 가변 영역의 아미노산 #9(KABAT 넘버링 시스템)로부터 불변 영역의 끝까지 신장된 도메인을 위한 DNA 코딩을 증폭시켰다. 독립적인 PCR 반응에 의해 각각의 항체 사슬의 수개의 클론을 수득하였다.
사용된 마우스 감마 1 힌지 영역 프라이머는 서열 확인 번호 22이다:
[서열 확인 번호 22]: 5' GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC 3'.
사용된 마우스 감마 2a 힌지 영역 프라이머는 서열 확인 번호 23이다:
[서열 확인 번호 23]: 5' GGACAGGGCTTACTAGTGGGCCCTCTGGGCTC 3'.
사용된 마우스 중쇄 가변 영역 프라이머는 서열 확인 번호 24이다:
[서열 확인 번호 24]: 5' AGGT(C 또는 G)(C 또는 A)A(G 또는 A)CT(G 또는T)TCTCGAGTC(T 또는 A)GG 3'.
사용된 마우스 카파 사슬 불변 영역은 서열 확인 번호 25이다:
[서열 확인 번호 25]: 5' CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG 3'
사용된 마우스 경쇄 가변 영역 프라이머는 서열 확인 번호 26이다:
[서열 확인 번호 26]: 5' CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA 3'.
PCR 단편을 플라스미드 pGEM7f+(Promega)내로 클로닝시키고, 이어서, 이를 이. 콜리 DH5a(Bethesda Research Labs)내로 형질전환시켰다.
B. DNA 서열화:
상기 파트 A로부터의 중쇄 및 경쇄 뮤린 cDNA 클론을 서열화하였다. 이 클론의 가변 영역의 서열화 결과를 서열 확인 번호 1 내지 6(도 1 내지 6)에 나타내었다. 각 클론은 뮤린의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 여역 중 보존적인 것으로 공지된 아미노산을 함유하였다. CDR 아미노산 영역은 하기에 기록되었다.
2B6 중쇄에 대한 CDR 영역은 서열 확인 번호 7, 8 및 9이다(도 7을 참조). 이 서열들은 서열 확인 번호 1에 의해 코팅된다. 경쇄에 대한 CDR 영역은 서열 확인 번호 10, 11 및 12이다(도 7 참조). 이 서열들은 서열 확인 번호 2에 의해 코팅된다.
2F2 중쇄에 대한 CDR 영역은 서열 확인 번호 7, 8 및 9이다(도 7 참조). 이 서열들은 서열 확인 번호 3에 의해 코팅된다. 경쇄를 위한 CDR 영역은 서열 확인 번호 10, 11 및 13이다(도 7 참조). 이 서열들은 서열 확인 번호 6에 의해 코팅된다.
2E3 중쇄에 대한 CDR 영역은 서열 확인 번호 7, 8 및 14이다(도 7 참조). 이 서열들은 서열 확인 번호 5에 의해 코팅된다. 경쇄를 위한 CDR 영역은 서열 확인 번호 10, 11 및 13이다(도 7 참조). 이 서열들은 서열 확인 번호 6에 의해 코팅된다.
C. 인간 프레임워크의 선별
2B6을 클로닝한 후, N-말단 잔사에 대해 아미노산을 할당하기 위하여 가변 영역의 아미노산 서열 중쇄 및 경쇄(도 1 및 도 2)(서열 확인 번호 15 및 16)을 KABAT SWISS-PROT(Nuc. Acids Res., 20:2019-2022(1992)) 단백질 서열 데이타베이스 중 공지된 뮤린의 이뮤노글로불린 서열과 비교하였다. 아미노산 서열을 제외한 2B6 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인간 이뮤노글로불린 단백질 서열 데이탑[이스와 비교하여서 뮤린의 서열과 가장 밀접하게 부합되는 중쇄 및 경쇄에 대한 인간 프레임워크를 확인하였다. 또한, 중쇄 및 경쇄를 Fab 도메인의 구조 모델로부터 생성된 위치 데이타베이스로 측정하여서 CDR 제시에 영향을 미칠 수 있는 아미노산으로 인한 잠재적 마찰을 평가하였다. 마찰을 인체에 적용시킨 가변 영역 프레임워크를 합성하는 동안 그 위치에서의 상응하는 뮤린의 아미노산을 치환시킴으로써 해결하였다.
인간의 골수 이뮤노글로불린(COR)로부터 얻은 항체의 중쇄 프레임워크 영역을 사용하였다(E.M. Press and N.M. Hogg, Biochem. J., 117:641-660(1970)). 인간 중쇄 프레임워크 아미노산 서열은 2B6 프레임워크에 대해 약 66%의 동질성을 갖는 것로 발견되었다.
적절한 경쇄 가변 영역 프레임워크를 위해 벤스-존스 (Bence-Jones) 단백질 (LEN) (Schneider et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356:507-557 (1975))의 경쇄 가변 프레임워크 서열을 사용하였다. 인간 경쇄 프레임워크 영역은 아미노산 수준에서 무린 2B6 경쇄 프레임워크 영역과 약 82% 상동성이었다.
선발된 인간 프레임워크를 역번역하여 DNA 서열을 제공하였다.
D. 인체에 적응시킨 MAb 유전자의 구조화
2B6 중쇄 CDR [도 7 및 서열 확인 번호: 1-2] 및 인간 항체의 프레임워크 서열이 제공되면 합성 중쇄 가변 영역 [서열 확인 번호: 18]을 제조하였다. 이 영역은 결합시에 아미노산 #21 - #106 (KABAT 계수법)을 코딩하는 4개의 합성 올리고뉴클레오티드 [서열 확인 번호: 27 및 28] [서열 확인 번호: 29 및 30]을 사용하여 제조하였다. 이어서, 올리고뉴클레오티드를 COR 프레임워크 (상기 문헌)를 기초로 한 다른 인체에 적응시킨 중쇄에서 유래한 서열을 포함하는 pUC18계 플라스미드의 HpaI-KpnI 제한 부위에 라이게이션시켰다. 이 플라스미드는 신호 서열 [서열 확인 번호: 17] 및 나머지 가변 영역 서열을 제공한다. 맵핑된 서열 내의 임의의 오류는 변이원 프라이머를 사용한 PCR에 의해 또는 존재하는 제한 부위에 합성 링커를 첨가하여 보정하였다.
신호 서열 및 인체에 적응시킨 중쇄 가변 영역을 EcoRI-ApaI 단편으로서 pUC계 플라스미드로부터 절단하고 IgG1 인간 불변 영역을 포함하는 발현 벡터 pCD에 라이게이션시켰다. 합성 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 8 [서열 확인 번호: 18 및 19]에 제공된다. 인간 프레임워크 잔기는 서열 확인 번호 19의 아미노산 1-30, 36-49, 66-97 및 109-119이다. CDR의 아미노산 서열은 무린 2B6 CDR과 동일하다. 생성 발현 벡터 pCDIL5HZHC1.0은 도 10에 도시하였다.
2B6 경쇄 CDR [도 7 및 서열 확인 번호: 10, 11 및 12] 및 인간 항체의 프레임워크 서열이 제공되면 합성 경쇄 가변 영역 [서열 확인 번호: 20]을 제조하였다. SacI-KpnI 및 PstI-HindIII 말단을 갖는 인체에 적응시킨 VL의 아미노산 #27 - #58 (KABAT 계수법) [서열 확인 번호: 31 및 32] 및 아미노산 서열 #80 - #109를 각각 코딩하는 4개의 합성 올리고뉴클레오티드를 LEN 프레임워크와 고도의 상동성을 공유하는 다른 인간 경쇄 프레임워크 (B17) [Marsh et al., Nuc. Acids Res., 13:6531-6544 (1985)]에서 유래한 서열을 포함하는 pUC18계 플라스미드에 삽입하였다. 이 플라스미드는 나머지 가변 영역 서열을 제공한다. 맵핑된 서열 내의 임의의 오류 및 LEN과 B17 사이의 하나의 아미노산 차이는 변이원 프라이머를 사용한 PCR에 의해 또는 존재하는 제한 부위에 합성링커를 첨가하여 보정하였다.
인체에 적응시킨 경쇄 가변 영역을 EcoRV-NarI 단편으로서 pUC 플라스미드로부터 단리하고 kappa 인간 불변 영역과 함께 신호 서열 [서열 확인 번호:17]을 포함하는 발현 벡터 pCN에 라이게이션시켰다. 합성 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 9 [서열 확인 번호: 20 및 21]에 제공된다. 인간 프레임워크 잔기는 서열 확인 번호 21의 아미노산 1-23, 41-55, 63-94 및 104-113이다. CDR의 아미노산 서열은 무린 2B6 CDR과 동일하다. 그러나, 이들 CDR의 코팅 서열은 제한효소 부위를 생성시키는 무린 2B6 코딩 서열과 상이하다. 생성 발현 벡터 중의 하나인 pCNIL5HZLC1.0은 도 11에 도시하였다. 이들 합성 가변 경쇄 및(또는) 중쇄 서열은 인체에 적응시킨 항체의 제조에 사용된다.
E. 인체에 적응시킨 MAb의 발현
IgG1 이소형에서 유래한 인체에 적응시킨 중쇄는 서열 확인 번호: 19에 제공된 합성 중쇄 가변 영역을 이용한다. 2B6 중쇄 CDR을 포함하는 이 합성 VH를 고안하여 상기한 바와 같이 합성하였다.
인체에 적응시킨 경쇄인 인간 kappa 사슬은 서열 확인 번호: 21에 제공된 합성 경쇄 가변 영역을 이용한다. 2B6 중쇄 CDR을 포함하는 이 합성 VH를 고안하여 상기한 바와 같이 합성하였다. 신호 서열을 이용하고 CMV 프로모터 및 하기 실시예 5에서 제조되는 키메라의 인간 중쇄 또는 인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 pUC19계 포유동물 세포 발현 플라스미드에 통상의 방법 [Maniatis 등의 상기 문헌]에 의해 인체에 적응시킨 가변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 삽입하여 플라스미드 pCDIL5HZHC1.0 (중쇄) [서열 확인 번호: 49, 도 10 참조] 및 pCNIL5HZLC1.0 (경쇄) [서열 확인 번호: 50, 도 11 참조]을 생성시켰다. 플라스미드를 COS 세포에 동시에 형질감염시키고 각각 3일 및 5일 후에 실시예 5에서 기술된 ELISA에 의해 상등액에 대해 인간 항체의 존재를 분석하였다.
상기 실시예는 예시적인 공학적 항체의 제조를 기술한 것이다. 이와 유사한 방법으로, 통상의 방법으로 제조된 다른 항-IL-5 항체 (예를 들면, 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9 등)를 사용하여 다른 공학적 항체를 개발할 수 있다.
F. 정제
CHO 발현 키메라 및 인체에 적응시킨 2B6은 통상의 단백질 A (또는 G) 친화도 크로마토그래피를 실시한 후 이온 교환 및 분자체 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 다른 mAbs (예를 들면, 호흡계 발진 바이러스, 인터루킨-4 및 말라리아 서어컴스포로조이트 (circumsporozoite) 항원)를 95% 이상의 순도로 정제하기 위해 유사한 방법을 사용할 수 있다.
G. 또다른 인체에 적응시킨 mAbs 및 발현 플라스미드
플라스미드 pCDIL5HZHC1.0 [서열 확인 번호: 49]가 제공되면 프레임워크 위치 73에서 트레오닌을 아스파라긴으로 치환하는 발현 플라스미드 pCDIL5HZHC1.1을 제조하였다. 이것은 EcoRV 및 XhoI 말단 [서열 확인 번호: 51 및 52]을 갖는 합성 링커를 동일하게 분해된 pCDIL5HZHC1.0에 라이게이션시켜 실시하였다. 이와 유사하게, 발현 플라스미드 pCDIL5HZHC1.2는 프레임워크 위치 37에서 발린을 이소류신으로 치환한다. 이것은 HpaI 및 XbaI 말단 [서열 확인 번호: 53 및 54]을 갖는 합성 링커를 동일하게 분해된 pCDIL5HZHC1.0에 라이게이션시켜 실시하였다. 또한, HpaI 및 XbaI 말단 [서열 확인 번호: 53 및 54]을 갖는 합성 링커를 동일하게 분해된 pCDIL5HZHC1.1에 라이게이션시켜 발현 플라스미드 pCDIL5HZHC1.3을 제조하였다.
4개의 합성 올리고뉴클레오티드 [서열 확인 번호: 31, 32, 33 및 34]를 포함하는 상기한 pUC18계 플라스미드가 제공되면 프레임워크 위치 #15가 류신에서 알라닌으로 변경된 인체에 적응시킨 경쇄 가변 영역을 제조하였다. 이 플라스미드를 NheI 및 SacI 제한 효소를 사용하여 분해하고 합성 링커 [서열 확인 번호: 55 및 56]을 삽입하였다. 이어서, EcoRV-NarI 단편을 단리하여 동일하게 분해된 발현 벡터 pCNIL5HZLC1.0에 라이게이션시켜 pCNIL5HZLC1.1을 생성시켰다.
이뮤노글로불린 (NEW) [Saul et al., J. Biol. Chem. 253:585-597 (1978)]로부터 얻은 중쇄 프레임워크 영역 및 2B6 경쇄 CDR [도 7 및 서열 확인 번호: 1-2]를 사용하여 합성 가변 영역을 제조하였다. CDR에 영향을 줄 수 있는 프레임워크아미노산을 확인하여 상기한 방법에 의해 치환시켰다. 어닐링되어 신장될 경우 신호 서열 [서열 확인 번호: 17]을 나타내는 아미노산 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 4개의 중복 합성 올리고뉴클레오티드 [서열 확인 번호: 57, 58, 59 및 60]가 생성되었다. 이어서, 이 합성 유전자를 PCR 프라이머 [서열 확인 번호: 63 및 64]를 사용하여 증폭하여 COR 프레임워크를 기초로 하여 다른 인체에 적응시킨 경쇄로부터 유래한 서열을 포함하는 pUC18계 플라스미드에 BstXI-HindIII 제한 단편으로서 라이게이션시켰다. 합성 올리고뉴클레오티드 링커 [서열 확인 번호: 75 및 76]를 SacII 및 KpnI 제한 부위에 삽입하여 아미노산 위치 91 (Kabat 계수 시스템) (도 12의 위치 94에 해당)에서 페닐알라닌을 티로신으로 프레임워크 치환하였다. 생성되는 경쇄 가변 영역 [도 12 및 서열 확인 번호: 61, 62]은 NEWM 인체에 적응시킨 경쇄로 언급한다.
맵핑된 서열 내의 임의의 오류는 변이원 프라이머를 사용한 PCR에 의해 또는 존재하는 제한 부위에 합성 링커를 첨가하여 보정하였다. 신호 서열 및 인체에 적응시킨 경쇄 가변 영역을 EcoRI-ApaI 단편으로서 pUC계 플라스미드로부터 절단하여 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 발현 벡터 pCD에 라이게이션시켜 플라스미드 pCDIL5NEWM을 생성시켰다. CDR의 아미노산 서열은 무린 2B6 중쇄 CDR과 동일하였다.
이뮤노글로불린 (REI) [Palm et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 356:167-191 (1975)]로부터 얻은 경쇄 프레임워크 영역 및 2B6 경쇄 CDR [도 7 및 서열 확인 번호: 10, 11 및 12]를 사용하여 합성 가변 영역을 제조하였다. CDR에 영향을 줄 수 있는 프레임워크아미노산을 확인하여 상기한 방법에 의해 치환시켰다. 어닐링되어 신장될 경우 REI 인체에 적응시킨 경쇄로 언급되는 경쇄 가변 영역을 나타내는 아미노산 [도 13 및 서열 확인 번호: 69, 70]을 코딩하는 4개의 중복 합성 올리고뉴클레오티드 [서열 확인 번호: 65, 66, 67 및 68]가 생성되었다. 이어서, 이 합성 유전자를 PCR 프라이머 [서열 확인 번호: 71 및 72]를 사용하여 증폭하여 pGEM-7Zf(+) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega Corporation사)에 EcoRI-HindIII 제한 단편으로서 라이게이션시켰다.
맵핑된 서열 내의 임의의 오류는 변이원 프라이머를 사용한 PCR에 의해 또는 존재하는 제한 부위에 합성 링커를 첨가하여 보정하였다. 인체에 적응시킨 경쇄 가변 영역을 EcoRV-NarI 단편으로서 pGEM-7Zf(+)계 플라스미드로부터 절단하여 인간 Kappa 불변 영역과 함께 신호 서열 [서열 확인 번호: 17]을 포함하는 발현 벡터 pCN에 라이게이션시켜 플라스미드 pCNIL5REI를 생성시켰다. CDR의 아미노산 서열은 무린 2B6 경쇄 CDR과 동일하였다. 그러나, 이들 CDR의 코팅 서열은 제한효소 부위를 생성시키는 무린 2B6 코딩 서열과 상이하다. 이들 합성 가변 경쇄 및(또는) 중쇄 서열을 인체에 적응시킨 항체의 제조에 사용된다.
상기 pGEM-7Zf(+)계 플라스미드가 제공되면 프레임워크 위치 #15가 발린에서 알라닌으로 변경된 인체에 적응시킨 경쇄 가변 영역을 제조할 수 있다. 이 플라스미드를 NheI 및 SacI 제한 효소를 사용하여 분해하고 합성 링커 [서열 확인 번호: 73 및 74]을 삽입하였다. 이어서, EcoRV-NarI 단편을 단리하여 동일하게 분해된 발현 벡터 pCNIL5HZREI에 라이게이션시켜 pCNIL5REIV15A를 생성시켰다.
실시예 5-키메릭 항체의 제작
뮤린 mAb 2B6 중쇄 변형 영역의 아미노산 #9-#104 (KABAT 통계)에 대한 DNA 코딩을 2B6 하이브리도마 세포주 (실시예 4)로부터 발생하는 cDNA의 pGEM7Zf 기재 PCR 클론으로부터 AvaII-StyI 제한 단편으로 분리하였다. 측면 중쇄 변형 영역 서열 및 단일 서열 [서열 확인 번호: 17]을 4개의 작은 합성 올리고머 링커 [서열 확인 번호: 35 및 36] [서열 확인 번호: 37 및 38]과 함께 이 단편을 BstX1-HindIII로 소화된 pUC18 기재 플라스미드 중으로 결합시킴으로써 제공하였다. 근접하게 관련된 뮤린 중쇄로부터 유도되는 N-말단 아미노산의 교감을 제1 8개의 VH 잔기에 대해 할당되고 서열 확인 번호: 35 및 36으로 코드된다. 중쇄의 유도된 아미노산 서열을 2B6 중쇄의 제1 15개의 N-말단 아미노산의 배열에 의해 증명하였다.
단일 및 VH 영역에 대한 EcoRI-ApaI 단편을 함유하는 서열을 분리하고 인간 IgG1 불변 영역을 이미 코드화한 플라스미드 pCD 중으로 결찰시켰다.
뮤린 mAb 2B6 경쇄 변형 영역의 아미노산 #12-#99 (KABAT 통계)에 대한 DNA 코딩을 2B6 하이브리도마 세포주 (실시예 4)로부터 발생하는 cDNA의 pGEM7Zf 기재 PCR 클론으로부터 DdeI-AvaI 제한 단편으로 분리하였다. 측면 경쇄 변형 영역 서열을 4개의 작은 합성 올리고머 링커 [서열 확인 번호: 39 및 40] [서열 확인 번호: 41 및 42]와 함께 이 단편을 EcoRV-HindIII로 소화된 pUC18 기재 플라스미드 중으로 결합시킴으로써 제공하였다. 밀접하게 연관된 뮤린의 중쇄로부터 유도되는 N-말단 아미노산의 교감을 제1 8개의 VL 잔기에 대해 할당되고 서열 확인 번호: 39 및 40으로 코드된다. 경쇄의 유도된 아미노산 서열을 2B6 경쇄의 제1 15개의 N-말단 아미노산의 배열에 의해 증명하였다. 이어서, 이 변형 영역을 EcoPV-NarI 단편으로부터 분리하고 인간의 카파 영역 및 단일 서열을 이미 함유하는 표현 벡터 pCN 중으로 결찰시켰다.
키메릭 항체의 표현을 COS 세포 중으로 pCD 및 pCN 기재 플라스미드의 코트랜스펙션에 의해 성취하였다. 배양 상징액을 3 일 및 5 일 후에 모으고 하기에 기술된 ELISA에 의해 이뮤노글로불린 표현에 대해 분석하였다. 마지막 단계를 제외한 각 단계는 PBS 세척을 이어서 행하였다. 마이크로역가 플레이트를 인간 항체의 Fc 영역에 대해 특정한 염소 항체 100 ng/50 ㎕/웰로 하룻밤 코팅시켰다. 배양 상징액을 가하고 1 시간 동안 배양시켰다. 이어서, 염소 안티 인간 IgG 항체에 접합된 호르세라디쉬 퍼옥시다제를 가하고 1 시간 동안 배양시켰다. 이어서, 이를 ABTS 퍼옥시다제 기재 (Kirkegaad & Perry Laboratories Lnc., 매릴랜드 게터스버그)를 가하였다. 1 시간 배양 후, 405 ㎚에서 흡광도를 마이크로역가 판 판독기 (Molecular Devices Corporation, 캘리포니아주 멘로 파크) 상에 판독하였다. 키메릭 항체의 표현을 검출하였다. 유사한 ELISA에서, 키메릭 항체를 함유하는 COS 세포 상징액을 인간 IL-5 단백질로 피복된 마이크로역가 웰에 특정적으로 결합시켰다. 이 결과는 IL-5에 대한 항체의 유전자 코딩이 합성되고 표현되었다는 것을 증명하였다.
상기 실시예는 보기예 항체의 제조를 기술한다. 유사한 과정을 종래의 방법으로 개발된 다른 안티-IL-5 공여기 항체 (예를 들어, 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9 등)을 사용하여 다른 항체의 개발에 대해 따를 수 있다.
본 발명은 인간 인터루킨-5에 특이적이고, 상세한 설명에 기재된 약 3.5×10-11M 이하의 해리 상수에 의해 특성화되는 결합 친화도를 갖는 설치류(예를 들어, 래트 및 뮤린)의 중화 단일클론 항체를 제공한다.
도 1 [서열 확인 번호 1 및 15]는 뮤린의 항체 2B6 및 뮤린/인간 2B6 키메릭 항체에 대한 중쇄 가변 영역을 예시한 도. 상자 안의 영역은 CDRs를 의미한다.
도 2 [서열 확인 번호 2 및 16]는 뮤린의 항체 2B6 및 뮤린/인간 2B6 키메릭 항체의 경쇄 가변 영역을 예시한 도. 상자 안의 영역은 CDRs를 의미한다.
도 3 [서열 확인 번호 3]은 뮤린의 항체 2F2의 중쇄 가변 영역을 예시한 도. 상자 안의 영역은 CDRs를 의미한다.
도 4 [서열 확인 번호 4]는 뮤린의 항체 2F2의 경쇄 가변 영역을 예시한 도. 상자 안의 영역은 CDRs를 의미한다.
도 5 [서열 확인 번호 5]는 뮤린의 항체 2E3의 중쇄 가변 영역을 예시한 도. 상자 안의 영역은 CDRs를 의미한다.
도 6 [서열 확인 번호 6]는 뮤린의 항체 2E3의 경쇄 가변 영역을 예시한 도. 상자 안의 영역은 CDRs를 의미한다.
도 7 [서열 확인 번호 7-14]는 뮤린의 항체 2B6, 2F2 및 2E3의 중쇄 가변 영역을 예시한 도. 상자 안의 영역은 CDRs를 의미한다.
도 8 [서열 확인 번호: 18, 19]은 인체에 적응시킨 항체 2B6에 대한 중쇄 가변 영역을 예시한다. 상자 안의 영역은 CDRs를 나타낸다.
도 9 [서열 확인 번호: 20, 21]는 인체에 적응시킨 항체 2B6에 대한 경쇄 가변 영역을 예시한다. 상자 안의 영역은 CDRs를 나타낸다.
도 10은 포유동물 세포 내에서 인체에 적응시킨 중쇄 유전자를 발현시키는데 사용되는 플라스미드 pCDIL5HZHC1.0의 개략도이다. 플라스미드는 베타 락타마제 유전제(BETA LAC), SV-40 복제 기점(SV40), 시토메갈로바이러스 프로모터 서열(CMV), 신호 서열, 인체에 적응시킨 중쇄, 소 성장 호르몬(BGH)의 폴리 A 신호, 베타글로빈 프로모터(베타 글로프로), 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자(DHFR), 및 pUC19 바탕 내의 기타 BGH 서열 폴리 A 신호를 함유한다.
도 11은 포유동물 세포 내에서 인체에 적응시킨 경쇄 유전자를 발현시키는데 사용되는 플라스미드 pCDIL5HZLC1.0의 개략도이다.
도 12 [서열 확인 번호: 61, 62]는 인체에 적응시킨 항체 2B6에 대한 NewM 중쇄 가변 영역을 예시한다. 상자 안의 영역은 CDRs를 나타낸다.
도 13 [서열 확인 번호: 69, 70]은 인체에 적응시킨 항체 2B6에 대한 REI 경쇄 가변 영역을 예시한다. 상자 안의 영역은 CDRs를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Ames, Robert S. Appelbaum, Edward R. Chaiken, Irwin M. Cook, Richard M. Gross, Mitchell S. Holmes, Stephen D. McMillan, Lynette J. Theisen, Timothy W. (ii) TITLE OF INVENTION: Recombinant IL5 Antagonists Useful in Treatment of IL5 Mediated Disorders (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 76 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: SmithKline Beecham Corp./Corporate (B) STREET: P.O. 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Claims (6)

  1. 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역이 하나 이상의 선택된 항체로부터 유도되고; 또한,
    중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열이,
    중쇄 가변 영역이 (a) 서열 확인 번호 7, 8, 9 또는 (b) 서열 확인 번호 7, 8, 14를 포함하고, 경쇄 가변 영역이 (a) 서열 확인 번호 10, 11, 12 또는 (b) 서열 확인 번호 10, 11, 13을 포함하는 것인, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 인간 인터루킨-5 (IL-5)에 대해 특이성을 갖는 설치류 중화 단일클론 항체로부터 유도되는,
    중쇄 및 경쇄로 이루어진 개조된 항체 유효량 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는, 과량의 호산구 생산, 알레르기성 비염, 천식, 만성 호산구증가 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 복강 질환, 호산구증가 위장염, 처그-스트라우스 증후군 (결절성동맥주위염 및 아토피), 호산구증가 근육통 증후군, 과호산구증가 증후군, 에피소딕 안지오데마를 포함하는 부종 반응, 기생충 감염 (호산구증가는 보호작용을 할 수 있음), 사상충속 피부염 및 아토피성 피부염으로 이루어진 군 중에서 선택된 증상의 치료용 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 과량의 호산구 생산과 관련된 질환이 천식인 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 과량의 호산구 생산과 관련된 질환이 알레르기성 비염인 제약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 과량의 호산구 생산과 관련된 질환이 아토피성 피부염인 제약 조성물.
  5. 환자로부터 생물학적 유체의 시료를 얻고,
    중쇄 가변 영역이 (a) 서열 확인 번호 7, 8, 9 또는 (b) 서열 확인 번호 7, 8, 14를 포함하고, 경쇄 가변 영역이 (a) 서열 확인 번호 10, 11, 12 또는 (b) 서열 확인 번호 10, 11, 13을 포함하는 것인, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 인간 인터루킨-5 (IL-5)에 대해 특이성을 갖는 설치류 중화 단일클론 항체를 IL-5/단일클론 항체 복합체가 형성되게 하는 조건 하에서 시료와 접촉시켜서,
    상기 IL-5/단일클론 항체 복합체의 존재 여부를 검출하여 인간에 있어서 인간 IL-5의 존재 또는 부재를 평가하기 위한 키트.
  6. 제5항의 키트에 있어서, 환자의 시료 중에서 인간 IL-5의 양을 결정하고, 이것을 정상 집단의 인간 IL-5의 평균량과 비교하고, 이것에 의해 상당히 상승된 인간 IL-5의 양의 존재가 알레르기 및 과량의 호산구 생산, 알레르기성 비염, 천식, 만성 호산구증가 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 복강 질환, 호산구증가 위장염, 처그-스트라우스 증후군 (결절성동맥주위염 및 아토피), 호산구증가 근육통 증후군, 과호산구증가 증후군, 에피소딕 안지오데마를 포함하는 부종 반응, 기생충 감염 (호산구증가는 보호작용을 할 수 있음), 사상충속 피부염 및 아토피성 피부염으로 이루어진 군 중에서 선택된 과량의 호산구 생산에 관련된 질환의 표시인 것인, 알레르기 및 과량의 호산구 생산에 관련된 질환의 진단을 보조하기 위한 키트.
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