KR20110043786A - 조작된 항-ｉｌ-13 항체, 조성물, 방법 및 용도 - Google Patents

조작된 항-ｉｌ-13 항체, 조성물, 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 인터류킨-13(IL-13) 단백질 또는 그 단편에 대하여 면역특이적인 조작된 항체와, 그의 제조 및 사용 방법 - 치료 징후를 포함함 - 에 관한 것이다.

Description

조작된 항-ＩＬ-13 항체, 조성물, 방법 및 용도{ENGINEERED ANTI-IL-13 ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES}
선출원
본 출원은 2008년 9월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/097,232호, 및 2008년 8월 20일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/090,472호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 미국 특허 출원 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 인간 인터류킨-13(IL-13) 단백질 또는 그 단편에 대하여 면역특이적인 조작된 항체와, 그의 제조 및 사용 방법 - 치료 징후를 포함함 - 에 관한 것이다.
IL-13은 4개의 α-나선(α-helix)을 포함하며 성장 호르몬-유사 사이토카인 패밀리에 속하는 구상 단백질인데, 이는 IL-4, 과립구 대식세포-콜로니-자극 인자(granulocyte macrophage-colony-stimulating factor), IL-2, 및 대식세포-콜로니-자극 인자를 포함한다. IL-13은 52-kDa 서브유닛(subunit)인 IL-13Rα1, 및 140kDa 서브유닛인 p140으로 구성된 이종이량체 수용체(heterodimeric receptor)에 결합되어 STAT6을 활성화시킨다. 또한 제2 IL-13 수용체인 Ra2가 존재하는 것으로 공지되어 있다. Ra1 수용체는 IL-13과의 결합시 시그널링 캐스케이드(signaling cascade)의 개시에 책임이 있다. Ra2 수용체는 Ra1보다 더 큰 친화도로 IL-13에 결합되지만, 그의 기능은 조만간에 결정되어야 한다.
천식 반응을 경험하고 있는 환자에서는 기도의 염증을 야기하는 활성화된 CD4+ Th2 림프구가 증가된다. 활성화된 Th2 림프구는 기도 과민반응과 관련된 조직 손상을 야기하는 염증을 자극하는 사이토카인류(IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13)를 분비한다. IL-13은 쥐과 모델에서 천식의 주요 기여 인자인 것으로 밝혀졌으며, 단일 뉴클레오티드 다형성의 인간 IL-13 변이체, R130Q (문헌[Graves, et al., 2000 J Allergy Clin Immunol 105: 506-13])는 천식 발병에 있어서 상당한 위험 인자인 것으로 밝혀졌다 (문헌[Heinzmann et al., 2000 Hum. Mol. Genet. 9:549-559]; 문헌[Am. J. Respir.; Howard et al., 2001 Cell Mol. Biol. 25:377-384]; 국제특허 공개 WO0123410호). 쥐과 모델에서 항-IL-13 중화 Mab를 이용한 처리는 자극된 동물에서 천식 반응을 저해하였다. 따라서, 증거에 의하면 중화 IL-13은 환자에서 천식 및 기도 협착 치료에 유익할 수 있음이 나타났다.
따라서, IL-13-매개 질환을 감소시키거나 제거하기 위한 치료법에서 사용하기 위한, 인간 IL-13에 특이적인 인간 항체와, 공지된 항체 또는 그의 단편에 비하여 개선된 항체를 제공할 필요가 있다.
본 명세서에 기재되고 청구된 발명 대상은 항-IL-13 항체 및 조성물에 관한 것인데, 이는 호흡기 병태, 예를 들어 천식 및 폐 섬유증, 심혈관 병태, 암, 피부 병태 및 섬유증 병태를 포함하지만 이에 한정되지 않는, IL-13과 관련된 병상(pathology) 또는 병태를 앓고 있는 대상의 치료에 유용하다. 본 발명은 시험관 내에서, 생체 내에서 또는 원위치에서 IL-13의 생물 활성을 차단시킬 수 있는 항-IL-13 단클론 항체를 제공하며, 상기 차단은 인간 IL-13의 야생형 또는 천연 변이체가 인간 IL-13 수용체 알파 1에 결합하는 것의 저해, 인간 IL-13 또는 인간 IL-13의 천연 변이체가 인간 IL-13 수용체 알파 2에 결합하는 것의 저해, 인간 종양 세포의 인간 IL-13-의존성 증식의 방지 또는 억제, 인간 IL-13-의존성 IgE 생성의 저해, 조직의 호산구 침윤의 감소를 포함하지만 이에 한정되지 않고, 이 항체는 인간 IL-13 상에 특이적 결합 부위를 갖는다. 예시적인 항-IL-13 단클론 항체의 아미노산 서열이 제공되며, 이는 숙주 세포에서의 발현을 위한 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
선택된 결합 단편들로부터 제작된 결합 도메인을 갖는 그리고 서열 번호 27 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 명시된 변이체로서의 항체 또는 항체 단편은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 발명은 서열 번호 2의 서열 내지 서열 번호 29의 서열로부터 선택되는 면역글로불린 가변 도메인 중의, 항원 결합에 연루된 잔기들을 포함하는 명시된 조성물의 제조를 위한 교시 및 그러한 조성물을 제공한다. 이들 결합 도메인은 원하는 특성을 가지며, 특정 IL-13-관련 병상의 치료에 필요한 생물 활성을 조정할 수 있다. 일 태양에서, 본 발명은 서열 번호 28의 중쇄 가변 영역 및 하기 화학식 I에 따른 경쇄 CDR3(L-CDR3)을 포함하는 단리된 항체이다:
[화학식 I]
Q-Q-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-P-Y-T (서열 번호 29)
상기 식에서, Xaa1은 His, Gln, 또는 Pro일 수 있으며;
Xaa2는 Asn, Asp, Ser, Leu, Pro, Ile, Phe, Glu, 또는 Val일 수 있고;
Xaa3은 Glu, Asp, Gly, Ser, Ile, Tyr, Tryp, Asn, His, Val, Met, Arg, Leu, Phe, Pro이거나 존재하지 않을 수 있으며;
Xaa4는 Tyr, Gly, Ser, Ala, Val, Phe, Thr, Glu이거나 존재하지 않을 수 있다.
특정 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 25 및 서열 번호 26의 결합 도메인을 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 서열 번호 25의 서열 및 서열 번호 26의 서열을 포함하는 조작된 항-IL-13 항체 M1295 및 (서열 번호 2의 서열 및 서열 번호 3의 서열을 포함하는) C863으로 표기되는 쥐과-인간 키메라 항체의 결합에 의해 정해지는 인간 야생형 IL-13 (서열 번호 1) 상의 공통 에피토프에 결합하는 항체에 관한 것이다. 이들 항체에 의해 인식되는 에피토프는 IL-13의 8개의 잔기를 포함하는데, 3개는 나선 A로부터의 것이고 (Arg10, Ile13, Glu14) 5개의 잔기는 나선 D로부터의 것이며 (Leu100, Lys103, Phe106, Arg107, Glu108), 여기서 원자간 거리는 4.0 Å을 초과하지 않는다. 접촉 개수를 기반으로 하면, Arg10 및 Arg107이 에피토프의 핵심 잔기인 것으로 보인다.
추가의 실시 형태에서, 백신의 성분으로서의 항원 에피토프가 제공된다. 서열 번호 1의 서열의 잔기 10, 13, 14, 100, 103, 및 106-108을 포함하는 상기에 기재된 에피토프는 본 발명의 항체에 의해 인식되며, IL-13에 대한 항체의 생성을 야기하기 위하여 숙주를 능동 면역화하는 데 유용하다. 생성된 항체는 IL-13 생활성과 관련된 병리학적 병태를 치료 또는 예방할 수 있다.
다른 실시 형태는 IL-13의 생물 활성과 관련된 병리학적 병태의 치료 또는 예방에 관한 것으로서, 이는 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 항체 또는 항체 조합을 그러한 처리를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계에 의한 것이다. 일 태양에서, 항-IL-13 항체는 천식으로 진단된 환자에게 투여된다. 다른 태양에서, 항-IL-13 항체는 아토피성 피부염으로 진단된 환자에게 투여된다.
일 태양에서 본 발명은 본 명세서에 기재된 항-IL-13 항체의 서열, 도메인, 일부분 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 항-IL-13 항체를 코딩하는 핵산 서열에 혼성화되거나 상보적인 핵산 서열이 또한 고려된다. 본 발명은 추가로 상기 항-IL-13 항체 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 그러한 핵산 및/또는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 그러한 항체 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포의 제조 및/또는 사용 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 IL-13 결합 항체의 코딩된 서열, 도메인, 일부분 또는 변이체를 적합한 담체 용액 또는 에이전트(agent)를 함유하는 조성물 형태로 약학적으로 허용가능한 조성물로서 환자에게 투여할 수 있는 것을 제공한다.
또한 본 발명은 치료적 또는 예방적 유효량의 항체를 투여하는 단계에 의해 IL-13 생활성과 관련된 병리학적 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본 발명에 기재된 항체를 생성, 정제 및 패키징하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 숙주 세포에서 항-IL-13 항체를 발현시키는 방법을 제공하며, 이는 항-IL-13 항체를 검출가능하고 회수가능한 양으로 발현시키는 조건 하에서 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
요컨대, 본 명세서에 개시되고 청구된 발명 대상은 하기를 포함한다:
IL-13 (서열 번호 1)의 에피토프에 결합되는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 에피토프는 서열 번호 1의 10 위치의 아르기닌 및 107 위치의 아르기닌을 포함하고, 서열 번호 1의 6 위치의 세린, 13 위치의 아이소류신, 14 위치의 글루탐산, 100 위치의 류신, 103 위치의 라이신, 106 위치의 페닐알라닌 및 108 위치의 글루탐산을 추가로 포함할 수 있음;
경쇄 가변 영역을 포함하고, a) 10 위치의 아르기닌에서 IL-13과 상호작용하며 b) 서열 번호 1의 14 위치의 글루탐산과 결합을 형성하는 타이로신 잔기를 추가로 포함하는 파라토프(paratope)를 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편. 파라토프는 상기 경쇄 가변 영역 상에 히스티딘 잔기 및 아스파라긴 잔기를 추가로 포함할 수 있으며, 타이로신, 트립토판, 아스파르트산, 발린 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 파라토프 접촉 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있으며, 파라토프의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 서열을 포함할 수 있으며, 상기 타이로신은 서열 번호 2의 32 위치에 있고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3의 서열을 포함하며 상기 접촉 잔기는 32 위치의 타이로신, 54 위치의 트립토판, 및 104 위치의 타이로신을 포함함;
경쇄 가변 영역을 포함하며 a) 10 위치의 아르기닌에서 IL-13과 상호작용하고 b) 서열 번호 1의 6 위치의 세린과 결합을 형성하는 아스파르트산 잔기를 추가로 포함하는 파라토프를 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 파라토프는 상기 경쇄 가변 영역 상에 타이로신 잔기 및 히스티딘 잔기를 추가로 포함하며, 파라토프는 타이로신, 트립토판, 아스파르트산, 발린 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 파라토프 접촉 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 25의 서열을 포함할 수 있으며, 상기 아스파르트산은 서열 번호 25의 92 위치에 있고, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 26의 서열을 포함할 수 있으며, 상기 접촉 잔기는 32 위치의 타이로신, 54 위치의 트립토판 및 104 위치의 타이로신을 포함함;
IL-13의 에피토프에 결합하는 것에 대하여 C863, HFAL62, 및 M1295로 이루어진 군으로부터 선택되는 단클론 항체와 경쟁하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 단클론 항체는 서열 번호 29의 경쇄 CDR3(L-CDR3)을 포함하며, 서열 번호 29의 L-CDR3은 추가로 하기 화학식 I:
[화학식 I]
--Q-Q-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-P-Y-T (서열 번호 29)
(상기 식에서, Xaa1은 His, Gln, 또는 Pro일 수 있으며;
Xaa2는 Asn, Asp, Ser, Leu, Pro, Ile, Phe, Glu, 또는 Val일 수 있고; Xaa3은 Glu, Asp, Gly, Ser, Ile, Tyr, Tryp, Asn, His, Val, Met, Arg, Leu, Phe, Pro이거나 존재하지 않을 수 있으며;
Xaa4는 Tyr, Gly, Ser, Ala, Val, Phe, Thr, Glu이거나 없을 수 있음)에 예시된 바와 같이 정의되고, 단클론 항체는 서열 번호 28의 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호 27의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있음;
서열 번호 9의 가변 경쇄 및 그의 변이체와, 서열 번호 20의 가변 중쇄 및 그의 변이체를 포함하는 단리된 단클론 항체로서, 서열 번호 9의 가변 경쇄의 변이체는 91 위치의 히스티딘, 92 위치의 아스파라긴, 93 위치의 글루탐산 및 94 위치의 타이로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서의 변화를 포함하며, 상기 잔기들은 출원된 본 출원에서 청구항 18의 표에 반영된 바와 같이 변화 또는 결실될 수 있고, 서열 번호 20의 가변 중쇄의 변이체는 31 위치의 트레오닌, 34 위치의 메티오닌, 100 위치의 메티오닌 및 106 위치의 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서의 변화를 포함하며, 상기 잔기들은 출원된 본 출원에서 청구항 20의 표에 반영된 바와 같이 변화 또는 결실됨;
서열 번호 25의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 본 항체는 상응하는 경쇄 면역 글로불린 불변 영역 및 중쇄 면역글로불린 불변 영역과 중쇄 경첩 영역을 추가로 포함하고, 본 항체, 및 본 명세서에 기재된 임의의 기타 항체가 약학 조성물 형태로 제조될 수 있으며, 단리된 항체는 서열 번호 25의 서열 및 서열 번호 26의 서열의 서열 변이체를 포함할 수 있고, 그러한 변이체는 IL-13 (서열 번호 1)의 에피토프에 결합하는 능력을 보유하고, 상기 에피토프는 서열 번호 1의 10 위치의 아르기닌 및 107 위치의 아르기닌을 포함하며, 에피토프는 서열 번호 1의 6 위치의 세린, 13 위치의 아이소류신, 14 위치의 글루탐산, 100 위치의 류신, 103 위치의 라이신, 106 위치의 페닐알라닌 및 108 위치의 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기를 추가로 포함할 수 있음;
인간화 중쇄 가변 영역 및 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간화 재조합 항체로서, 인간화 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3의 중쇄로부터의 3개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR) 및 인간 억셉터 항체(acceptor antibody) 중쇄로부터의 인간 프레임워크(framework) 영역을 포함하며, 인간화 경쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 경쇄로부터의 3개의 상보성 결정 영역 및 인간 억셉터 항체 경쇄로부터의 인간 프레임워크 영역을 포함하고, 여기서 인간화 항체는 STAT6 시그널링에 의해 측정할 때 THP-1 세포 상의 IL-13 수용체에 IL-13이 결합하는 것을 감소시키며, 본 항체는 (a) 야생형 IL-13 유도 Stat-6 인산화에 의해 측정할 때 인간 재조합 야생형 인간 IL-13이 인간 IL-13 수용체 알파 1 또는 적합한 동물 IL-13 수용체에 결합하는 것의 저해, (b) 인간 재조합 야생형 인간 IL-13이 인간 IL-13 수용체 알파 2 또는 적합한 동물 IL-13 수용체에 결합하는 것의 저해, (c) 염수 처리된 ova-감작 동물과 비교할 때 항체로 처리된 쥐의 군에서 호산구, 림프구, 대식세포 및 호중구 세포의 개수의 감소, 및 (d) 비특이적 대조 에이전트와 비교할 때 화학적으로 챌린징된(challenged) 동물에서의 기도 저항의 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는 IL-13 폴리펩티드의 활성을 사실상 조정하고, 본 항체는 서열 번호 3의 서열, 서열 번호 20의 서열 및 서열 번호 26의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 2의 서열, 서열 번호 9의 서열, 서열 번호 14의 서열 및 서열 번호 26의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역으로부터의 CDR을 포함할 수 있음;
플라즈몬 표면 공명(plasmon surface resonance) (비아코어(Biacore))에 의해 측정할 때 250 pM (0.250 × 10-9 M) 미만의 KD로 IL-13 변이체 R110Q에 결합하며 STAT6 시그널링에 의해 측정할 때 THP-1 세포 상의 IL-13R2알파1에 IL-13이 결합하는 것을 방지하는, 인간 IL-13에 면역특이적인 항원 결합 항체 단편으로서, 항체는 Arg10, Ile13, Glu14를 포함하는 나선 A로부터의 잔기 및 Lys103, Phe106, Arg107, Glu108을 포함하는 나선 D로부터의 잔기에서 인간 IL-13과 접촉하는 것으로 나타날 수 있음 - 여기서, 원자간 거리는 4.0 Å을 초과하지 않음 - ;
청구항 1의 IL-13 항체 또는 본 명세서에 개시되고 청구된 항체들 중 임의의 항체를 코딩하는 단리된 핵산; 및 그러한 핵산을 포함하는 벡터, 숙주 세포;
청구항 1의 IL-13 항체 또는 본 명세서에 개시된 임의의 기타 항체를 함유하는, 약학 조성물을 포함하는 조성물;
본 명세서에 개시된 항체의 유효량(0.001-50 ㎎/㎏)을 함유하는 조성물과 접촉시키거나 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 천식을 포함하는 IL-13 관련 병태를 진단 또는 치료하는 방법;
나선 A로부터의 잔기 (Arg10, Ile13, Glu14) 및 나선 D로부터의 잔기 (Lys103, Phe106, Arg107, Glu108)를 포함하는 IL-13 에피토프 또는 그의 모방 펩티드를 사용하여 숙주를 면역화하는 방법; 및
출원된 청구항 1 내지 청구항 22 및 청구항 24 내지 청구항 30 중 임의의 하나의 항체를 함유하는 약학 조성물 및 IL-13에 의해 매개되는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 출원된 청구항 1 내지 청구항 22 및 청구항 24 내지 청구항 30 중 임의의 하나의 항-IL-13 항체의 용도.
<도 1>
도 1. 경쇄 (상부 정렬) 및 중쇄 (하부 정렬)에 대하여 혼입된(engrafted) 쥐과 C836 CDR (박스 내)의 인간형 개조(adaptation)에 사용된 인간 프레임워크 라이브러리로부터 선택되는 V-영역들의 정렬.
<도 2>
도 2. L-CDR3 변이체 (명시되어 있음)는 중쇄 변이체 2C02와 쌍을 형성하였으며, 비오티닐화 IL-13-WT는 500 pg/㎖로 사용한, C863의 인간화 변이체를 사용하여 생성한 몇몇 고 친화성 mAb에 대한 IL-13R-알파2 경쟁 결합 분석으로부터 얻어진 데이터.
<도 3>
도 3. 바람직한 항체의 구조를 정의하기 위한 상이한 넘버링(numbering) 체계를 반영한 표.
Figure pct00001

Figure pct00002
약어
CDR = 상보성 결정 영역; ELISA= 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay); Fab= 항원 결합 단편; Hc = 항체의 중쇄; HFA = 인간 프레임워크 개조(Human Framework Adapted); HV: 초가변 영역(hypervariable region); 성숙 쇄의 IL-13 변이체 IL-13 R130Q (시그널 펩티드의 1번 메티오닌으로부터 넘버링) 또는 IL-13 R110Q; Lc = 항체의 경쇄; mAb = 단클론 항체; Ra1 또는 R 알파 1 = 인간 IL-13 수용체 알파 1; Ra2 또는 R 알파 2 = 인간 IL-13 수용체 알파 2; SDRU: 특이성 결정 잔기 사용(Specificity Determining Residue Usage); TBST: 트윈(Tween)을 포함하는 트리스 완충 염수(Tris buffered saline with Tween).
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항체의 "항원 결합 도메인", 또는 "항원 결합 부분"이라는 용어는 항원 (예를 들어, IL-13)에 특이적으로 결합되는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편들의 예에는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 갖는 1가 단편인 Fab 단편; 경첩 영역에서 다이설파이드 가교(들)에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 도메인 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 도메인 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 도메인 항체 또는 dAb 단편 (문헌[Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 특히 CDR3 (예를 들어, 그 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 국제특허 공개 WO03/025019호 참조)이 포함된다.
항원-결합 영역은 다양한 용어를 사용하여 정의된다. "상보성 결정 영역(CDR)"이라는 용어는 서열 가변성을 기반으로 한다 (문헌[Wu and Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970]). 6개의 CDR이 있는데, 즉 가변 중쇄 또는 VH 내에 있고 전형적으로 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3으로 표기되는 3개의 CDR 및 가변 경쇄 또는 VL 내에 있고 전형적으로 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3으로 표기되는 3개의 CDR이 있다 (문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 정의되는 바와 같이 구조 면에서 가변성인 항체 가변 도메인의 영역들을 말한다 (문헌[Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987]). 6개의 HVR이 있는데, 즉 3개는 VH 내에 있고 (H1, H2, H3) 3개는 VL 내에 있다 (L1, L2, L3). 초티아 및 레스크는 구조적으로 보존된 HV를 "정준 구조체"로 지칭한다. 면역글로불린으로부터의 V 도메인과 T-세포 수용체의 비교(문헌[Lefranc et al., Developmental & Comparative Immunology 27:55-77, 2003])에 기반한, 항원-결합 부위를 형성하는 영역들을 설명하는 다른 방법이 르프랑크(Lefranc)에 의해 제안되었다 (문헌[Lefranc et al., Developmental & Comparative Immunology 27:55-77, 2003]). 또한 항원-결합 부위는 알마그로(Almagro)에 따른, "특이성 결정 잔기 사용(SDRU)"을 기반으로 하여 서술될 수 있으며 (문헌[Almagro, Mol. Recognit. 17:132-43, 2004]), 여기서 SDRU는 항원 접촉에 직접적으로 연루된 면역글로불린의 아미노산 잔기를 말한다. 개시되고 청구된 예시적인 항체의 결합 영역의 상이한 정의들 사이의 일치가 도 3에 제시되어 있다. 본 발명자는 본 명세서에서 초티아 넘버링(Chothia's numbering) 및 인델 협정(indel convention)을 이용하였으며 (문헌[Al-lazikani et al., J Mol. Biol. 1997]), CDR 영역으로서의 CDR은 VH 또는 VL의 선형 서열 내의 특정 위치로서 정의되는데, 이는 이들 잔기의 항원 결합에의 기여 또는 잠재적인 기여를 고려한다.
더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자들에 의해 코딩되지만, 상기 두 도메인은 재조합 방법을 이용하여 이들이 단일 단백질 쇄로서 만들어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있으며, 여기서 VL 영역 및 VH 영역은 쌍을 형성하여 1가 분자 (단쇄 Fv (single chain Fv; scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al., 1988 Proc. Nat. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 그러한 단쇄 항체는 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻어지며, 이 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 사실상 없는 항체를 말한다 (예를 들어, IL-13에 특이적으로 결합되는 단리된 항체에는 IL-13 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 사실상 없다). 그러나 IL-13에 특이적으로 결합되는 단리된 항체는 다른 종 유래의 IL-13 분자와 같은 다른 항원에 대하여 교차 반응성을 가질 수 있다. 게다가, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 사실상 없을 수 있다.
일반적으로 "단클론 항체", "Mab", 또는 "단클론 항체 조성물"이라는 용어는 항체가 한 가지 유형의 항체만을 분비할 수 있는 하이브리도마(hybridoma)의 생성물이거나, 이것이 트랜스펙토마(transfectoma)에 의해 생성되거나, 이것이 하이브리도마, 트랜스펙토마 또는 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 재조합 방법에 의해 제조 및 단리된 항체이거나, 항체가 인간 면역글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부분의 다른 DNA 서열에의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 또는 항체 조성물인 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인간화 항체", "조작된 항체", "인간 프레임워크 개조", 및 "HFA"라는 용어는 인간 기원의 서열로부터 유래되는 가변 영역 프레임워크를 갖는 항체를 포함하고자 한다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 포함할 경우, 불변 영역은 전형적으로 그러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식 세포 계열(germline) 서열, 또는 인간 생식 세포 계열 서열의 자연 발생 버전(version) (예를 들어, 알로타입(allotype)) 또는 돌연변이 버전으로부터 유래된다. 본 발명의 인간화 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서의 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다.
"인터류킨-13" 또는 "IL- 13"이라는 용어는, 문맥이 달리 기술하는 경우를 제외하고는 서열 번호 1에 예시된 성숙 쇄로 나타내어지는 바와 같이 인간 IL- 13이다. 본 발명은 인간 IL-13 상의 아미노산 잔기에 결합되는 항체, 특히 인간 또는 인간화 항체를 제공하며, 이들 잔기가 IL-13 분자 내에서 3차원 에피토프를 제시하는 한에 있어서는, 본 발명의 단클론 항체는 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey) 및 붉은털 원숭이(rhesus monkey) IL-13 또는 다른 종 유래의 기타 IL-13 상동체를 포함하는 인간외(non-human) 영장류 IL-13과 교차 반응할 것으로 기대될 수 있다. 본 발명의 실시 형태에 따른 항체는 130 위치의 아미노산에서 아르기닌 잔기가 글루타민으로 대체된 IL-13의 변이체에 결합된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항체에 있어서 "고 친화도"라는 용어는 KD가 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 10-9 M 이하, 그리고 더욱 더 바람직하게는 10-10 M 이하인 항체를 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Kdis" 또는 " KD" 또는 " Kd"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 말하고자 한다. "KD"는 회합 속도(k1) 또는 "온-속도(on-rate)(kon)" 또는 " ka"의 속도에 대한, "오프-속도(off-rate)(koff)" 또는 "kd"로도 불리는 해리 속도(k2)의 비이다. 따라서, KD는 k2/k1 또는 koff / kon 또는 kd / ka와 같으며, 몰 농도(M)로 표현된다. 이것은 KD가 작을수록 결합성은 더 강해진다는 것을 따른다. 따라서 10-6M (또는 1 μM)의 KD는 10-9 M (또는 1 nM)과 비교하여 약한 결합을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "특이적 결합" 또는 "면역특이적 결합" 또는 "면역특이적으로 결합하는"은 항체가 소정의 항원에 결합하는 것을 말한다. 전형적으로 항체는 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)로 결합하며, 소정의 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인, 또는 다른 비-특이적 폴리펩티드)에 대한 결합에 있어서의 그의 KD보다 적어도 2배 더 작은 KD로 소정의 항원에 결합한다. 본 명세서에서 "IL-13을 인식하는 항체" 및 "IL-13에 특이적인 항체"라는 어구는 "IL-13에 면역특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 서로 바꾸어서 사용될 수 있다.
항체-특징
본 발명에서 개시되고 청구된 발명 대상은 생체 내에서, 시험관 내에서 및/또는 원위치에서 IL-13에 결합되어 바람직하게는 IL-13 활성 또는 결합을 간섭하는 조작된 항-IL-13 항체에 관한 것이다. 바람직한 항-IL-13 항체, 그의 명시된 일부분, 또는 변이체가 IL-13 수용체 시그널링, IL-13 수용체 상향 조절 또는 하향 조절, IgE를 포함한 단백질 방출, RNA, DNA 또는 단백질 합성, 수용체 시그널링과 관련된 IL-13 활성, 및 주 조직적합 복합체 클래스 II 항원 및 CD23의 유도와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 IL-13의 활성 또는 기능을 또한 조정할 수 있다.
조작된 항체는 임의의 클래스의 항체로부터의 임의의 유형의 불변 도메인을 포함할 수 있으며, 이는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE와, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 서브클래스(subclass) (이소타입(isotype))를 포함한다. 조작된 항체가 세포독성 활성을 나타내기를 원할 때, 불변 도메인은 일반적으로 보체-고정(complement-fixing) 불변 도메인이며 그 클래스는 전형적으로 IgG1이다. 그러한 세포독성 활성이 바람직하지 않을 때에는, 불변 도메인은 IgG2 클래스의 것일 수 있다. 조작된 항체는 한 가지 초과의 클래스 또는 아이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있다.
조작된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 - 불변 영역에 선택적으로 연결됨 - 을 코딩하는 핵산이 발현 벡터 내로 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 항체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 절편은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 그러한 조절 서열은 시그널 서열, 프로모터, 인핸서, 및 전사 종결 서열을 포함한다 (실제로 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)]; 국제특허 공개 WO 90/07861호; 문헌[Co et al., J. Immunol. 148, 1149 (1992)] 참조). 유전자 코드에서의 유전자 중복으로 인하여, 면역글로불린 쇄, 그의 서브도메인(subdomain) 또는 단편을 코딩하는 DNA 절편은 자연 발생 인간 핵산 서열, 그러한 서열에 혼성화가능한 서열, 또는 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 전적 인공 서열의 부분으로부터 선택되는 다양한 조성의 것일 수 있다.
본 발명의 인간 단클론 항체는 예를 들어 표준 ELISA에 의해 IL-13에의 결합에 대하여 시험될 수 있다.
일 태양에서, 본 발명의 항체는 시험관 내에서, 생체 내에서 또는 원위치에서 IL-13 매개 생물 활성을 조정하고 (바람직하게는 저해하고) 하기 기준 중 하나 이상을 나타내는 IL-13-특이적 항체, 또는 그의 IL-13 결합 단편, 그의 특정 부분, 또는 변이체를 포함한다:
1. 고상 분석에서 인간 야생형 재조합 IL-13 또는 정제 IL-13 (서열 번호 1), 및 그의 자연 발생 IL-13 변이체 Q110, 또는 단편에 결합함;
2. 인간 IL-13 야생형 또는 특정 돌연변이체에 대한 겉보기 Kd가 (표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때) 0.25 nM 미만임;
3. IL-13Ra1 특이적 신호 전달 이벤트인 야생형 IL-13 유도 Stat-6 인산화에 의해 측정되는 바와 같이 인간 IL-13 수용체 알파 1 또는 인간외 동물 IL-13 수용체에 인간 재조합 야생형 인간 IL-13이 결합하는 것을 저해함;
4. 인간 재조합 야생형 인간 IL-13이 인간 IL-13 수용체 알파 2 또는 적합한 인간외 동물 IL-13 수용체에 결합하는 것을 저해함;
5. 나선 A 상의 잔기 (Arg10, Ile13, Glu14) 및 나선 D로부터의 5개의 잔기 (Leu100, Lys103, Phe106, Arg107, Glu108)에서 IL-13과 접촉함 - 여기서, 원자간 거리는 4.0 Å을 초과하지 않음 - .
6. pH 7.4의 PBS 중 용해도가 적어도 10-100 ㎎/㎖, 예를 들어 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 80 ㎎/㎖임;
7. 항체가 존재함이 없이 소정 농도의 IL-13의 존재 하에서의 성장과 비교할 때 인간 종양 THP-1 세포의 야생형 인간 IL-13 의존성 증식의 증식을 방지 또는 억제함;
8. 항체의 부재 하에서 동일 농도의 IL-13으로 자극된 신선한 B-세포와 비교할 때 신선한 인간 B-세포 제제에서 인간 IL-13 야생형 재조합 인간 IL-13 의존성 시험관 내 IgE 생성을 저해함; 및
9. IL-13 의존성 생분석(bioassay) 또는 고상 결합 분석에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 재조합 IL-13에 있어서의 능력과 유사한 능력으로 천연 야생형 인간 IL-13에 결합함.
본 발명의 다른 태양에서, 결합 도메인의 구조적 특징부를 사용하여 본 발명의 항체의 기능적 특성, 예를 들어 IL-13에의 결합성을 보유하는 구조적으로 관련된 인간 항-IL-13 항체를 생성한다. 더 구체적으로, 본 명세서에 개시된 항체 및 변이체의 하나 이상의 CDR 영역을 공지된 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합적으로 조합하여 본 발명의 추가의, 재조합적으로 조작된 인간 항-IL-13 항체를 생성할 수 있다.
예를 들어, 상기에 기재된 특징들 중 하나 이상을 갖는 IL-13 특이적 항체를 제조하기 위하여 취해지는 한 가지 접근법은 IL-13 (서열 번호 1)의 인간 R130Q 변이체의 성숙 형태로 면역화한 생쥐로부터 취한 림프양 조직 유래의 쥐과 하이브리도마를 생성하는 것이었다. 면역화 후, 쥐과 항-인간 IL-13 R130Q 단클론 항체를 얻었으며 이를 "C836"으로 표기하였다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 (각각 서열 번호 2 및 서열 번호 3)의 C836 CDR을 선택된 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 내로 그래프팅시키고 결합 친화성을 최적화하였다. 구체적으로, 변이체 IL-13 R130Q 및 인간 IL-13에 대한 이들 인간 프레임워크 개조(HFA) 항체의 결합 친화성은 파지 디스플레이된 Fab 라이브러리로부터의 랜덤화 및 선발에 의해, 또는 특정 부위 돌연변이 유발(site directed mutagenesis)에 의해 유발된 돌연변이에 의해 향상되어, 인간 IL-13및 그 변이체인 IL-13 R130Q (이는 "IL-13 R110Q"라는 표기를 또한 가짐)에 대하여 고 친화성의 결합을 할 수 있는 중쇄 및 경쇄의 패널이 개발되게 되었다. 본 명세서에 기재된 친화성 성숙 중쇄 및 경쇄의 쌍 형성은 대략적으로 약 50 pM일 수 있는 개선된 KD 값과, 인산염 완충 염수 중 100 ㎎/㎖ 초과의 용해도를 갖는 완벽한 항체의 제작을 가능하게 한다. 친화성-성숙 항체는 IL-13이 IL-13 알파 1(Rα1) 및 알파 2(Rα2) 수용체에 결합하는 것을 차단한다. 이 항체는 포유류 발현 시스템, 예를 들어 인간 배아 신장 293 세포(human embryonic kidney 293 cell; HEK293) 또는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포에서 발현될 때 이들 특징을 디스플레이한다.
특히, 진보된 특성화에 대하여 허용된 하나의 mAb는 Lc6 (서열 번호 9)의 파지-매개 성숙으로부터의 경쇄 및 Hc2 (서열 번호 20)의 CDR 내의 2개의 메티오닌의 특정 부위 돌연변이 유발로부터의 중쇄를 포함한다. 이 mAb에는 M1295라는 표기가 주어지며, 이는 각각 Lc 및 Hc-가변 영역으로서 서열 번호 25의 서열 및 서열 번호 26의 서열을 포함하고, 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되고 숙주 세포 또는 기타 시스템 - 전사 및/또는 번역에 필요한 구성요소를 포함함 - 에서 발현될 수 있다.
본 발명은 서열 번호 2의 서열 내지 서열 번호 28의 서열 중 임의의 하나로부터 선택되는 가변 도메인을 포함하는, IL-13 매개 장애의 치료를 위하여 원하는 특징 및 생물 활성을 갖는 명시된 조성물 및 그 조성물의 제조 방법을 추가로 제공한다. 상기에 기술한 바와 같이, 일 실시 형태에서, C836 항체의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR 또는 항원 결합 단편이 사용되며, 이는 표 2에 예시된 바와 같다. 바람직하게는 재조합 항체는 표 2에 예시된 바와 같이 C836의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역, 및 그의 변이체와, 서열 번호 27 내지 서열 번호 29의 명시된 영역의 잔기들을 포함한다. 이 항체는 C836의 CDR2 도메인 및 그의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 C836의 CDR1 도메인 및 그의 변이체를 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 (1) 인간 중쇄 프레임워크 영역, 및 (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역을 바람직한 CDR 도메인과 함께 포함하는 항-IL-13 항체를 제공할 수 있다. 인간 프레임워크 영역은 서열 번호 4 내지 서열 번호 28의 프레임워크 영역과 사실상 동일하다. 그러나, 바람직한 CDR 영역과 조합된 다른 프레임워크 영역을 사용하여 관심 대상 표적 (예를 들어, IL-13)에 대한 원하는 특성을 갖는 항체를 얻을 수 있다.
그에 더하여, 그리고 비제한적인 예로서, 항체 또는 항원 결합 부분 또는 변이체는 서열 번호 19 내지 서열 번호 24의 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 4 내지 서열 번호 18의 경쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄의 일부분을 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 다른 특정 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄의 일부분을 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 그러한 항체는 통상적인 기술을 사용하여 항체의 다양한 부분 (예를 들어, CDR, 프레임워크 등)을 함께 화학적으로 연결하거나, 재조합 DNA 기술의 통상적인 기술을 사용하여 중쇄 또는 경쇄 서열(들)을 코딩하는 핵산 분자를 제조 및 발현시키거나 임의의 다른 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
조작된 항체의 CDR1, 2, 및/또는 3 도메인은 본 명세서에 개시된 특정 아미노산 서열(들)로 이루어질 수 있다. 부가적으로, CDR 영역은 서열 가변성을 견딜 수 있으며 그의 원하는 결합 특징 및 생물학적 특징을 보유할 수 있다. 따라서, 다른 실시 형태에서, 조작된 항체는 표 2에 예시된 바와 같이 예를 들어 C836의 하나 이상의 CDR과 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 CDR 및 서열 번호 2 내지 서열 번호 29의 명시된 위치에 주어져 있는 변이체를 포함할 수 있다. 면역글로불린의 프레임워크 영역은 이것이 유래되는 인간 생식 세포 계열 가변 영역의 프레임워크 영역과 사실상 동일하거나 동일하다. 프레임워크 영역 내의 아미노산들 중 많은 아미노산은 항체의 특이성 또는 친화성에 대하여 직접적 기여를 거의 하지 않거나 전혀 하지 않는다. 따라서, 프레임워크 잔기들의 많은 보존적 치환은 생성된 인간화 면역글로불린의 특이성 또는 친화성의 상당한 변화 없이 견디어질 수 있다. 프레임워크 영역은 면역글로불린의 가변 영역이 표적 (예를 들어, IL-13)의 잔기와 접촉하는 능력을 유지하게 허용하면서 본 명세서에 기재된 프레임워크들 중 하나 이상과 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일할 수 있다. 상기에 설명된 바와 같이 생성된 인간화 항체의 가변 절편은 전형적으로 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분에 연결된다. 본 항체는 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역 둘 모두를 포함할 것이다. 중쇄 불변 영역은 일반적으로 CH1, 경첩, CH2, CH3을 포함하며, 가끔 CH4 도메인을 포함한다.
IL-13 항체 구조 (또는 그의 단편)는 IL-13 또는 IL-13 변이체와 복합체를 형성한 조작된 IL-13 항체의 3차원 결정 구조에 따라 또한 정의될 수 있다. IL-13 항체의 아미노산 서열은 변경될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 조작된 IL-13 항체가 IL-13 에피토프에 접촉하여 중화 IL-13 특이적 항체를 생성할 수 있게 하는 3차원 결정 구조를 보유할 수 있다. 바람직하게는, 항체 프레임워크 영역은 당해 면역글로불린의 가변 영역이 특정한 나선 A로부터의 IL-13의 잔기 (Arg10, Ile13, Glu14) 및 나선 D로부터의 잔기 (Leu100, Lys103, Phe106, Arg107, Glu108)와 접촉하는 능력을 보유하게 하면서 본 명세서에 개시된 프레임워크들 중 하나 이상과 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일할 수 있으며, 여기서 원자간 거리는 4.0 Å을 초과하지 않는다.
본 명세서에 개시된 IL-13 항체는 IL-13에 결합하는 것과 관련된 파라토프의 견지에서 또한 정의될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 2의 경쇄 잔기 Tyr32, His91, Asn92에 의해 주어지는, "1"로서 아미노 말단 잔기로부터 넘버링되는 경쇄 가변 영역의 잔기와, "1"로서 아미노 말단 잔기로부터 넘버링되는 서열 번호 3의 중쇄로부터의 9개의 잔기 Tyr32, Trp54, Trp55, Asp56, Val58, Arg60, Asp103, Tyr104, Asp105를 포함하는 파라토프 영역을 갖는 항체가 그러한 조작된 항체의 특정 실시 형태이다. 다른 특정 실시 형태로는 경쇄로부터의 잔기 Tyr32, His91, Asp92 (서열 번호 25) 및 서열 번호 3의 중쇄로부터의 잔기 Tyr32, Trp54, Trp55, Asp56, Val58, Arg60, Asp103, Tyr104, Asp105를 포함하는 항체가 있다.
IL-13에 결합하는 것에 더하여, 상기에 기재된 것과 같은 조작된 항체는 IL-13이 IL-13R-알파1에 결합하는 것을 저해하여 STAT6을 통한 IL-13R-알파1 시그널링을 방지하고 그럼으로써 생체 내에서 세포, 조직 및 기관에서 관련 생물활성을 차단 또는 감소시키는 능력과 같은 본 발명의 항체의 다른 기능적 특성을 그가 보유하는 것에 대하여 선발될 수 있다.
항-IL-13 항체의 제조 및 시험 방법
선택적으로 본 발명의 항-IL-13 항체는 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술 (하이브리도마법)을 비롯한 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 생쥐 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이(macaque monkey)는 본 명세서에 설명된 바와 같이 면역화되어 림프구를 야기하며, 상기 림프구는 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있다. 대안적으로, 림프구는 적합한 융합 에이전트, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 시험관 내에서 면역화되어 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성할 수 있다.
또한 항-IL-13 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 및/또는 당업계에 공지된 바와 같이, 인간 항체의 레퍼토리(repertoire)를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 인간외 영장류 등)의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 인간 항-IL-13 항체를 생성하는 세포가 그러한 동물로부터 단리될 수 있고, 이는 적합한 방법, 예를 들어 하이브리도마로서 기재된 방법 또는 당업계에 공지된 기타 방법을 사용하여 불멸화될 수 있다. 대안적으로, 항체 코딩 서열은 본 명세서에 교시된 방법 및 당업계에 공지된 방법에 의해 항체의 발현 및 단리를 위하여 적합한 벡터 내로 클로닝, 도입되어 숙주 세포의 트랜스펙션을 위하여 사용될 수 있다.
인간 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 그의 생식 세포 계열 구성 내에 지니고 있는 트랜스제닉 생쥐의 사용은 정상적인 인간 면역계가 용인하는 인간 자기 항원을 비롯한 다양한 표적에 대하여 유도된 고 친화도 완전 인간 단클론 항체의 단리를 제공한다 (예를 들어, 론버그, 엔.(Lonberg, N.) 등의 미국 특허 제5,569,825호, 미국 특허 제6,300,129호; 쿠셸라파티(Kucherlapati) 등의 미국 특허 제6,713,610호 참조). 상기 생쥐에서 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실되어, 내인성 유전자에 의해 코딩되는 항체를 생산하는 동물의 능력을 제거할 수 있다. 게다가, 아브제닉스, 인크.(Abgenix, Inc.) (미국 캘리포니아주 프리몬트 소재) 및 메다렉스(Medarex) (미국 캘리포니아주 새너제이 소재)와 같은 회사는 상기에 기재된 기술을 사용하여 선택 항원에 대하여 유도된 인간 항체를 제공하도록 관여될 수 있다.
인간외 공급원으로부터 얻어진 항체는 인간화될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 필요한 특이성을 갖는 인간외 기원, 예를 들어 생쥐의 면역글로불린으로부터 유래되는, 그리고 인간 기원의 면역글로불린 서열 (예를 들어, 키메라 면역글로불린)로부터 유래되는 부분, 통상적인 기술 (예를 들어 합성 기술)에 의해 화학적으로 함께 연결되는 부분, 또는 유전 공학 기술 (예를 들어, 키메라 항체의 당해 단백질 부분을 코딩하는 DNA는 인접한 폴리펩티드 쇄를 생성하도록 발현될 수 있음)을 사용하여 인접한 폴리펩티드로서 제조되는 부분을 포함할 수 있다. 인간화 면역글로불린의 다른 예로는 인간외 기원의 항체로부터 유래되는 CDR 및 인간 기원의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래되는 프레임워크 영역을 포함하는 하나 이상의 면역글로불린 쇄를 포함하는 것 (예를 들어, 프레임워크 변화가 있거나 없는 CDR-그래프팅된 항체)이 있다. 프레임워크 개조 공정은 생쥐 mAb C836과 인간 생식 세포 계열 데이터베이스 내의 서열 사이의 프레임워크 영역들의 유사성을 기반으로 하며, 이는 본질적으로 국제특허 공개 WO/08052108A2호 "인간-개조 단클론 항체에서의 사용 방법[Methods For Use In Human-Adapting Monoclonal Antibodies]"에 기재되어 있는 바와 같은데, 여기서 프레임워크의 길이는 모(parental) 가변 영역 또는 V-영역의 잔기에 대해 매치되는 잔기이다. 전체적으로, 16개의 경쇄(LC) 및 6개의 중쇄(HC) 프레임워크는 C836 CDR을 선택된 인간 프레임워크와 조합함으로써 개조되는 인간 프레임워크였다.
일 실시 형태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선발되며, 여기서 상기 파지는 인간 면역글로불린 유전자를 포함하고 라이브러리는 인간 항체 결합 도메인을 예를 들어 단쇄 항체(scFv)로서, Fab, 또는 파지 코트(coat) 단백질들 중 하나 이상에 융합된 쌍을 형성하거나 형성하지 않은 항체 가변 영역을 나타내는 몇몇 다른 제작물로서 발현한다. 인간 항체의 단리를 위한 그러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에서 확립되어 있으며, 예를 들어 랜더(Ladner) 등의 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제5,403,484호; 및 미국 특허 제5,571,698호; 다우어(Dower) 등의 미국 특허 제5,427,908호 및 미국 특허 제5,580,717호; 맥카퍼티(McCafferty) 등의 미국 특허 제5,969,108호 및 미국 특허 제6,172,197호; 및 그리피스(Griffiths) 등의 미국 특허 제5,885,793호; 미국 특허 제6,521,404호; 미국 특허 제6,544,731호; 미국 특허 제6,555,313호; 미국 특허 제6,582,915호 및 미국 특허 제6,593,081호를 참조한다.
본 발명의 단리된 핵산은 당업계에 공지된 바와 같이 (a) 재조합 방법; (b) 합성 기술; (c) 정제 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 단클론 항체를 코딩하는 DNA는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 (예를 들어, 쥐과 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용에 의해) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 하이브리도마가 생성될 경우, 그러한 세포는 그러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열 및 번역 생성물이 연결된 디스플레이 기술, 예를 들어 파지 또는 리보좀 디스플레이 라이브러리를 사용하면, 바인더 및 핵산의 선발은 단순화된다. 파지 선발 후, 파지로부터의 항체 코딩 영역을 단리하고 이를 사용하여 인간 항체 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 포함하는 전 항체를 생성하고, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현시킬 수 있다. 상업적 제조를 위하여, 항체 코딩 DNA를 적합한 숙주 세포 내로 트랜스펙션시키고, 안정한 클론을 단리하고, 이 세포주를 마스터 세포 은행(master cell bank)으로 확장시킬 것이다.
항-IL-13 항체의 사용 방법
또한 본 발명은 당업계에 공지된 바와 같이 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 IL-13 관련 질환을 본 발명의 항-IL-13 항체를 사용하여 조정 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 섬유성 질환, 신생물, 대사, 면역 또는 염증 관련 질환, 심혈관, 감염, 피부 또는 신경 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 IL-13 관련 질환을 조정 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한 본 명세서에 개시된 발명 대상은 천식, 아토피성 피부염, 알러지성 비염, 및 관련 호흡기 장애를 포함하지만 이에 한정되지 않는 IL-13 매개 장애, 및 본 명세서에 기재된 기타 IL-13 매개 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 명세서에 개시된 항-IL-13 항체의 용도를 포함한다.
인터류킨 13(IL-13)은 천식, 아토피성 피부염 및 알러지성 비염의 아토피성 3징후(triad)에서 예시되는 제II형 염증 반응과 관련된다. 신흥 증거에 의하면 호산구 매개성 위장 질환인 호산구성 식도염(EE)의 병인에서 IL-13 경로가 연계된다. 부가적으로, IL-13은 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)에 걸린 비-아토피 대상에서, 그리고 전신 경화증(SSc), 및 특발성 폐섬유증(IPF)을 포함하는 섬유성 질환에 걸린 환자에서 관찰되는 염증 및 조직 리모델링 둘 모두에 관련된 비-아토피 질환 병상과 관련된다. IL-13을 표적화하는 것에 대한 이론적 설명은 특정 질환 하위세트에서의 아토피 반응 및 비-아토피 반응 둘 모두가 IL-13에 의해 유도되며 IL-13 단백질의 길항 작용이 그러한 반응들을 방해할 것이라는 것이다.
호흡기 질환
본 발명은 또한 천식; 폐렴; 폐농양; 흡기 물질 또는 흡입 물질로 인한 직업성 폐질환; 및 호흡 부전 및 호흡 부전을 초래하는 증상 또는 원인을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 기관지, 폐 또는 흉막 질환을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 과활동성 기도 질환; 폐쇄성 섬유성 세기관지염; 과민성 폐렴 (외인성 알러지성 폐포염), 알러지성 기관지 폐 아스페르길루스증, 및 약물 반응을 포함한 폐의 과민성 질환; 성인성 호흡곤란 증후군 (ARDS), 구드패스츄어 증후군, 만성 폐쇄성 기도질환 (COPD), 특발성 간질성 폐질환, 예컨대 특발성 폐섬유증 및 유육종증; 박리성 간질성 폐렴; 급성 간질성 폐렴; 호흡 세기관지염 관련 간질성 폐질환; 특발성 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴; 림프구성 간질성 폐렴; 랑게르한스 세포 육아종증; 특발성 폐혈철증; 급성 기관지염; 폐포단백증; 기관지확장증; 폐확장부전; 낭포성 섬유증; 폐 종양; 및 폐색전증을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다.
종양성 질환
본 발명은 또한 백혈병; 급성 백혈병; 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); B-세포, T-세포 또는 FAB ALL; 급성 골수성 백혈병 (AML); 만성 골수성 백혈병 (CML); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 모발상 세포 백혈병; 골수 이형성 증후군 (MDS); 림프종, 특히 비호지킨 (non-Hodgkin) 림프종, 호지킨병, 비악성 림프종, 버킷 (Burkitt) 림프종; 다발성 골수종; 원발성 질환 또는 전이성 질환으로서의 고형 종양; 카포시 육종; 결장직장암; 전립선암; 고환암; 신세포암; 중피종을 포함한 폐암; 염증성 유방암을 포함한 유방암; 비인두암종; 악성 조직구 증식증, 종양 수반 증후군/악성종양에 의한 고칼슘혈증; 선암종; 특히, 경두부의 편평상피세포암; 육종; 악성 흑색종, 특히 전이성 흑색종; 혈관종; 전이성 질환; 암 관련 골흡수; 암 관련 뼈통증 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 악성 및 종양성 질환을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 항체는 내분비 기관, 예컨대 뇌하수체, 갑상선, 부신, 췌장의 원발성 또는 이차성 종양을 치료함으로써, 유즙 누출증, 저신장증, 거인증 및 말단비대증, 요붕증, 당뇨병, 애디슨병, 쿠싱 증후군, 알도스테론증, 부신 기능 부전, 크롬친화세포종, 산염기 장애, 및 포르피린증과 같은 그러한 관련 질환을 개선, 예방 또는 완화시키는데 사용될 수 있다.
면역 관련 및 염증성 질환
본 발명은 또한 류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염, 전신성 소아 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 위궤양, 혈청 반응 음성 관절염, 골관절염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 루푸스, 항인지질 증후군, 홍채섬모체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신성 혈관염/베게너 육아종증, 유육종증, 고환염/정관절제술 역전 처치 (reversal procedure), 알러지성/아토피성 질환, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염 (습진), 식도염, 알러지성 접촉 피부염, 알러지성 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 패혈증 증후군, 그람 양성균 패혈증, 그람 음성균 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구 감소성 발열, 요로성 패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리방사선 피폭, 급성 췌장염, 성인성 호흡곤란 증후군, 류머티스성 관절염, 알코올성 간염, 만성 염증성 병변, 크론병, 겸상적혈구 빈혈, 당뇨병, 신장증, 다른 아토피성 질환, 과민 반응, 알러지성 비염, 고초열, 다년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 두드러기, 전신성 아나팔락시스, 피부염, 악성 빈혈, 용혈성 질환, 혈소판 감소증, 임의의 기관 또는 조직의 이식 거부반응, 신장 이식 거부반응, 심장 이식 거부 반응, 간 이식 거부 반응, 췌장 이식 거부 반응, 폐 이식 거부 반응, 골수 이식 (BMT) 거부반응, 피부 동종이식 거부반응, 연골 이식 거부 반응, 뼈 이식 거부반응, 소장 이식 거부 반응, 태아 흉선 이식 거부반응, 부갑상선 이식 거부 반응, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식 거부반응, 동종이식 거부반응, 항수용체 과민 반응, 그레이브스 (Graves) 병, 레이노병, B형 인슐린 저항성 당뇨병, 천식, 중증 근무력증, 항체 매개성 세포독성, III형 과민 반응, 전신성 홍반성 루푸스, POEMS 증후군 (다발성 신경병증, 기관비대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 및 피부 변화 증후군), 항인지질 증후군, 천포창, 피부경화증, 혼합성 결합조직 질환, 특발성 애디슨병, 당뇨병, 만성 활동성 간염, 원발성 답즙성 간경변증, 백반, 혈관염, 심근 경색후 (post-MI) 심장절개술 증후군, IV형 과민증, 접촉 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식 거부반응, 세포내 생물에 의한 육아종, 대사성 또는 특발성 약물 과민증, 윌슨병, 혈색소증, 알파-1 항트립신 결핍증, 당뇨병성 망막증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 시상하부-뇌하수체-부신축 평가, 원발성 담즙성 간경변증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭포성 섬유증, 신생아 만성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 피부 질환, 건선, 탈모증, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 급성 신부전증, 혈액 투석, 요독증, 독성, 자간전증, 및 항-CD3 요법, 사이토카인 요법, 화학 요법, 방사선 요법에 의한 염증 (예를 들어, 무력증, 빈혈, 악액질 등을 포함하나 이에 한정되지 않음), 만성 살리실산염 중독 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 면역 관련 질환을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 항-IL-13 항체, 이의 단편, 또는 이의 변이체는 호산구 매개성 염증; 호산구 매개성 식도염, 폐, 기관, 치조 또는 천식 관련 염증; 예컨대 호산구성 위장염, 위염 또는 장염; 및, 특히, STAT6 매개성 시그널링이 STAT6 매개성 위장염 및 호산구성 식도염에서와 같은 그러한 호산구성 염증을 일으키는 경우의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
심혈관 질환
본 발명은 또한 부정맥 및 전도 장애; 동맥성 고혈압; 동맥경화증; 심장 종양; 심근증; 관상동맥질환; 대동맥염 및 대동맥 분지 폐색증; 심내막염; 폐부종; 심막염; 및 말초 신경, 동맥, 정맥 및 림프관 장애; 및 심장 판막 장애와 관련되거나 이로 인해 발생되는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자의 심혈관 질환을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 심장 기절 (cardiac stun) 증후군, 심근경색증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 출혈, 재협착, 당뇨병성 동맥경화성 질환, 고혈압, 동맥성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심부전, 폐심장증, 원발성 폐고혈압, 심부정맥, 관류후 증후군, 심폐 바이패스 염증 반응, 혼돈성 또는 다소성 심방 빈맥, 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 특정 부정맥, 심실세동, 히스 다발 (His bundle) 부정맥, 방실 차단, 다발 갈래 차단, 심근 허혈 장애, 협심증, 심근경색증, 심근병증, 확장형 울혈성 심근병증, 제한성 심근병증, 대동맥류 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 장애, 레이노 현상 및 레이노병, 말단청색증, 피부홍통증, 정맥혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥루, 림프부종, 부종, 불안정성 협심증, 재관류 손상, 펌프 후 (post pump) 증후군, 허혈-재관류 손상 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자의 심혈관 질환을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다.
신경 질환
본 발명은 또한 뇌척수액 및 이의 순환; 두개내 종양 및 종양수반성 장애; 신경계 감염증 (박테리아, 진균, 스피로헤타, 기생충, 바이러스 또는 프리온); 유육종증; 뇌혈관 질환; 두개뇌 외상; 다발성 경화증 및 관련 탈수초성 질환; 신경계의 유전병 및 발달장애; 신경계의 대사장애; 알코올, 약물, 독소, 및 기타 화학 약품에 의한 신경계 장애; 척수 질환; 및 말초 신경 및 근육 질환 중 하나 이상의 장애의 원인 또는 후유증을 비롯한 신경 질환을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 신경 변성 질환; 다발성 경화증; 편두통; AIDS 치매 복합증; 급성 횡단성 척수염; 추체외로 및 소뇌 질환, 예컨대 피질 척수계 병변; 기저핵 질환 또는 소뇌 질환; 과다운동성 운동 장애, 예컨대 헌팅턴 무도병 및 노인무도병; 약물유발성 운동 장애, 예컨대 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 것; 과소운동성 운동 장애, 예컨대 파킨슨병; 진행성 핵상마비; 소뇌 구조 병변; 척수 소뇌 변성증, 예컨대 척수성 운동실조증; 프리이드라이히 운동실조증; 소뇌 피질 변성증; 다발계통 변성증 (멘셀 (Mencel), 데제린-토마스 (Dejerine-Thomas), Shi-Drager (샤이-드래거), 및 마카도-조셉 (Machado-Joseph)); 전신성 질환 (레프섬 병, 무베타리포단백혈증, 모세혈관확장성 운동실조증, 및 미토콘드리아 다발계통 질환); 탈수초성 코어 (core) 질환, 예컨대 다발성 경화증; 급성 횡단성 척수염; 및 운동단위 질환, 예컨대 신경성 근위축증 (전각 세포 변성, 예컨대 근위축성 측삭경화증, 유아 척수성 근육위축증 및 소아 척수성 근육위축증); 알츠하이머병; 다운 증후군 관련 정신 장애; 미만성 루이소체병; 루이소체형 노인성 치매; 베르니케-코르사코프 증후군; 만성 알코올 중독 관련 정신 장애; 프리온병, 예컨대 크로이츠펠트-야콥병; 아급성 경화성 범뇌염; 할러포르텐-스파츠 병; 권투선수 치매 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 신경 질환을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의로 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 항-IL-13 항체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
항-IL-13 항체의 다른 치료적 용도
상술한 증상 및 질환 이외에도, 본 발명은 또한 다양한 병인의 섬유성 질환, 예컨대 간섬유증 (알코올성 간경변증, 바이러스성 간경변증, 자가면역성 간염을 포함하나 이에 한정되지 않음); 폐섬유증 (피부경화증, 특발성 폐섬유증을 포함하나 이에 한정되지 않음); 신장 섬유증 (피부경화증, 당뇨병성 신장염, 사구체신염, 루푸스 신장염을 포함하나 이에 한정되지 않음); 피부섬유증 (피부경화증, 비후 및 켈로이드 흉터 형성, 화상을 포함하나 이에 한정되지 않음); 골수섬유증; 신경섬유종증; 섬유종; 장 섬유증; 및 기관 또는 이식을 비롯한 외과적 처치에 의한 섬유성 유착을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 박테리아, 바이러스 및 진균 감염증을 포함한 급성 또는 만성 박테리아 감염증, 급성 및 만성 기생충성 과정 또는 감염 과정, HIV 감염증/HIV 신경병증, 수막염, 간염 (A형, B형 또는 C형 등), 패혈성 관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, 대장균 (E. coli), 용혈성 요독증후군, 말라리아, 뎅기 출혈열, 리슈만편모충증, 나병, 독성 쇼크 증후군, 연쇄상구균 근염, 가스괴저, 인간형 결핵균, 조류형 결핵균, 폐포자충 폐렴, 골반 염증성 질환, 고환염/부고환염, 레지오넬라, 라임병, A형 인플루엔자, 엡스타인-바 바이러스, 바이러스 관련 혈구탐식 증후군, 바이러스성 뇌염/무균성 수막염 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 감염성 질환을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 결막염, 각막 궤양, 원추각막, 간질성 각막염, 주변부 궤양성 각막염, 플릭텐성 결막염, 표층점상 각막염, 안건염, 포도막염, 및 연령 관련 황반 변성을 예로 들 수 있으나 이에 한정되지 않는, 염증, 감염, 또는 섬유성 또는 협착성 질환에 의한 눈 질환을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다.
항-IL-13 항체를 포함하는 투여, 조성물 및 키트
본 발명의 단리된 단클론 항체는 IL-13 상의 에피토프에 결합하며 시험관 내 및/또는 생체 내에서 IL-13 저해 활성을 나타내는 반면, IL-13이 수용체 IL-13R1알파 및 IL-13R2알파에 결합하는 것을 저해할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간과 동물에서 IL-13-관련 병태의 치료 또는 방지를 위한 치료제 및 예방제 둘 모두로서 적합하다.
일반적으로, 사용은 민감한 대상 또는 종양 성장과 전이와 같은, IL-13 활성이 병리학적 결과를 갖는 것으로 알려진 병태 또는 강제 호기량(FEV)의 감소와 같은 천식 증상을 나타내는 대상에게 본 발명의 단클론 항체 또는 항원 결합 단편 하나 이상의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함할 것이다. Fab 및 F(ab')2 단편을 비롯한 항체의 임의의 활성 형태가 투여될 수 있다.
바람직하게는, 사용된 항체는 수용체 종과 상용성이어서 MAb에 대한 면역 반응은 허용할 수 없는 짧은 순환 반감기를 야기하거나 대상에서 MAb에 대한 면역 반응을 유도하지 않는다. 바람직하게는, 투여된 MAb는 대상의 Fc 수용체에의 결합 및 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 기전의 활성화와 같은 일부 이차 기능을 나타낸다.
개인의 치료는 본 발명의 항체의 치료적 유효량의 투여를 포함할 수 있다. 항체는 후술하는 바와 같이 키트로 제공될 수 있다. 항체는 단독으로 또는 다른 치료제, 진통제, 또는 진단제와 혼합되어 사용되거나 투여될 수 있다. 환자에게 IL-13에 결합할 수 있는 항체 또는 그 단편, 또는 수령 환자에서 IL-13에 대해 보호할 수 있는 항체를 제공함에 있어서, 투여되는 에이전트의 투여량은 환자의 연령, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 상태, 이전의 병력 등과 같은 인자에 따라 변할 것이다.
적합한 비히클 및 그들의 제형 및 패키징은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st ed., Troy, D. ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD (2005) Chapters 40 and 41)]에 개시된다. 추가의 제약적 방법이 작용의 지속을 조절하기 위해 이용될 수 있다. 조절 방출 제제는 화합물과 복합체를 형성하거나 화합물을 흡수하기 위해 중합체를 사용함으로써 이루어질 수 있다. 조절 방출 제제에 의해 작용의 지속을 조절하는 다른 가능한 방법은 본 발명의 화합물을 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로젤, 폴리(락트산) 또는 에틸렌 비닐아세테이트 공중합체와 같은 중합체성 물질의 입자내로 포함시키는 것이다. 대안적으로, 중합체성 입자 내로 이들 에이전트를 포함시키는 대신, 예를 들어, 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 각각, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트)-미세캡슐에, 또는 콜로이드 약물 전달 시스템, 예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 미세에멀젼, 나노입자, 및 나노캡슐에 또는 미세에멀젼에 이들 물질을 포획시키는 것이 가능하다.
일반적으로, 항체의 전신성 용량을 투여한다면, 약 1 ng/㎏-100 ng/㎏, 100 ng/㎏-500 ng/㎏, 500 ng/㎏-1 ug/㎏, 1 ug/㎏-100 ug/㎏, 100 ug/㎏-500 ug/㎏, 500 ug/㎏-1 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏-50 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏-100 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏-500 ㎎/㎏ (수용자의 체중)의 범위인 항체 투여량을 수령자에게 제공하는 것이 바람직하지만, 더 낮거나 더 높은 투여량이 투여될 수 있다. 약 1.0 ㎎/㎏ 만큼 낮은 투여량이 일부 효능을 나타낼 것으로 예상될 수 있다. 바람직하게는, 약 5 ㎎/㎏이 허용가능한 투여량이지만, 최대 약 50 ㎎/㎏의 투여량 수준 또한 치료적 용도를 위해 특히 바람직하다. 대안적으로, 1 ug - 100 ug, 1 ㎎ - 100 ㎎, 또는 1 gm - 100 gm의 범위 내의 양과 같은 환자의 체중을 기초로 하지 않는 특정 양의 항체의 투여가 주어질 수 있다. 예를 들어, 부위 특이적 투여는 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 수단과 같은 신체 구획 또는 공동에 이루어질 수 있다.
IL-13 항체 조성물은 특히 액체 용액 또는 현탁액 형태로 비경구(피하, 근내 또는 정맥내) 또는 임의의 다른 투여를 위한 용도를 위해; 특히 반고형 형태, 예를 들어, 이로 제한되지 않지만 크림 및 좌약으로 질내 또는 직장 투여에서의 사용을 위해; 예를 들어, 이로 제한되지 않지만 정제 또는 캡슐 형태와 같이 구강내 또는 설하 투여를 위해; 또는 예를 들어, 이로 제한되지 않지만, 파우더, 점비액 또는 에어로졸 또는 일부 제제 형태와 같은 비강내로; 또는 예를 들어, 이로 제한되지 않지만 젤, 연고, 로션, 현탁액 또는 피부 구조를 변경하거나 경피 패치내의 약물 농도를 증가시키기 위한 화학 증강제 또는 단백질 및 펩티드를 함유한 제형을 피부 상에 적용하거나(국제 특허 공개 WO 98/53847호), 또는 전기천공과 같은 일시적인 수송 경로를 생성하거나 이온영동(iontophoresis)과 같은 피부를 통한 전하를 띈 약물의 이동성을 증가시키기 위해 전기장을 적용하거나, 또는 음파영동(sonophoresis)과 같은 초음파를 적용할 수 있도록 하는 에이전트를 가진 패치 전달 시스템과 같은 경피로 사용하기 위해 제조될 수 있다(미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호) (상기 공보 및 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다).
유사한 접근법으로, 본 발명의 단클론 항체의 다른 치료적 용도는 본 단클론 항체 중 하나에 대해 생성된 항-이디오타입(idiotype) 항체를 이용한 환자의 능동 면역이다. 에피토프의 구조를 모방하는 항-이디오타입을 이용한 면역은 활성 항-IL13 반응을 유도할 수 있다.
이와 유사하게, 능동 면역은 백신의 성분으로서 하나 이상의 항원성 및/또는 면역원성 에피토프를 투여함으로써 유도될 수 있다. 백신접종은 수령자가 이러한 생물학적으로 기능성인 영역에 대한 보호성 항체를 생성하도록 하기에 충분한 양으로 경구로 또는 비경구로, 예방적으로 또는 치료적으로 수행될 수 있다. 숙주는 순수한 형태의 항원성/면역원성 펩티드, 펩티드의 단편, 또는 펩티드의 변경된 형태로 능동적으로 면역될 수 있다. 원래의 단백질 서열에 상응하지 않는 하나 이상의 아미노산이 원래의 펩티드, 또는 절단된 펩티드 형태의 아미노 또는 카르복실 말단에 첨가될 수 있다. 그러한 여분의 아미노산은 펩티드를 다른 펩티드, 더 큰 캐리어 단백질, 또는 지지체에 커플링시키는 데 유용하다. 이들 목적에 유용한 아미노산은 타이로신, 라이신, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인 및 그 유도체를 포함한다. 펩티드를 다른 단백질 또는 펩티드 분자에 또는 지지체에 커플링시키거나 융합시키기 위한 추가 수단을 제공하기 위하여, 대안적 단백질 변경 기술, 예를 들어, NH2-아세틸화 또는 COOH-말단 아미드화를 이용할 수 있다. 면역원성 에피토프의 실시 형태는 나선 A로부터의 IL-13의 잔기 (Arg10, Ile13, Glu14) 및 나선 D로부터의 잔기 (Leu100, Lys103, Phe106, Arg107, Glu108)를 포함하는 것이다. 항원 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질의 특정 실시 형태에서, 펩티드는 X-선 결정학에 의해 나타난 IL-13 또는 변이체의 Arg10과 Arg107의 공간적 연합을 모방하는 미미토프(mimitope)를 나타낸다.
IL-13 생활성에 대해 보호할 수 있는 본 발명의 항체는 IL-13-관련 증상 또는 병상의 감소, 해결, 또는 완화를 일으키기에 충분한 양으로 대상에게 제공될 것이 의도된다. 만일 에이전트의 투여량, 투여 경로, 및 투약 스케줄이 그러한 반응에 영향을 주기에 충분하면 양은 증상의 감소를 "일으키기에" 충분하거나 "치료적 유효량"이라고 말한다. 항체 투여에 대한 반응은 영상화 기술에 의해 또는 조직 샘플의 엑스 비보(ex vivo) 분석에 의해서처럼 대상의 영향받은 조직, 기관 또는 세포의 분석에 의해 측정될 수 있다. 에이전트는 그 존재가 수령 환자의 생리학에서 검출가능한 변화를 야기한다면 생리학적으로 유의하다.
본 발명의 항체는 약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위해 공지 방법에 따라 제형화될 수 있으며, 이에 의해 이들 물질, 또는 그들의 기능적 유도체는 약학적 허용 담체 비히클과 혼합되어 조합된다. 치료는 단일 용량 스케줄로, 또는 바람직하게는 다중 용량 스케줄로 주어질 수 있으며, 다중 용량 스케줄에서는 치료의 일차 코스는 1-10 별도 용량으로 이루어질 수 있으며, 이어서 반응을 유지하고/하거나 강화하는 데 필요한 후속 시간 간격에, 예를 들어, 제2 용량을 위해 1-4개월에 다른 용량이 주어지며, 그리고 필요하면, 몇 개월 후 후속 용량(들)이 주어진다. 적합한 치료 스케줄의 예는 (i) 0, 1개월 및 6개월, (ii) 0, 7일 및 1개월, (iii) 0 및 1개월, (iv) 0 및 6개월, 또는 질병 증상을 감소시키거나 질병의 심각성을 감소시킬 것으로 예상되는 바람직한 반응을 유도하는 데 충분한 다른 스케줄을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명을 실시하는 데 유용한 키트를 제공한다. 본 키트는 상기한 항체를 함유하거나 상기 항체와 연합되어 패키징된 제1 용기를 포함한다. 키트는 또한 본 발명의 실시에 필요하거나 편리한 용액을 함유하거나 용액과 연합되어 패키징된 다른 용기를 포함할 수 있다. 용기는 유리, 플라스틱 또는 포일로 제조될 수 있으며 바이알, 병, 파우치, 튜브, 백 등일 수 있다. 키트는 또한 기록된 정보, 예를 들어, 본 발명의 실시를 위한 절차 또는 분석 정보, 예를 들어, 제1 용기 수단에 함유된 시약의 양을 포함할 수 있다. 용기는 기록된 정보와 함께, 다른 용기 장치, 예를 들어, 박스 또는 백 내에 있을 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 생물학적 샘플 내의 IL-13의 검출을 위한 키트이다. 키트는 IL-13의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체를 보유하는 용기 및 면역학적 복합체를 형성하기 위하여 IL-13에 결합시키고 면역학적 복합체의 형성을 검출하여 면역학적 복합체의 존재 또는 부재가 샘플 내의 IL-13의 존재 또는 부재와 상관되도록 하는 목적을 위하여 항체를 이용하기 위한 설명서를 포함한다. 용기의 예는 다수 샘플 내의 IL-13의 동시 검출을 허용하는 다중웰 플레이트를 포함한다.
본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 인용된 참고문헌의 내용(문헌 참고문헌, 등록 특허, 공개 특허 출원, 및 공계류 중인 특허 출원 포함)은 본 명세서에 참고로 명백하게 포함된다.
본 발명의 다른 특징은 본 발명의 예시를 위해 주어지며 이를 제한하고자 의도되지 않는 예시적 실시 형태의 하기 설명 과정에서 명백해질 것이다.
실시예 1. 항-IL-13 항체 생성
뮤린(murine) 하이브리도마인 C836을 인간 IL-13의 자연 변이체인 R130Q에 대해 제조하였으며, 이 R130Q는 서열 번호 1의 R110Q 변이체이다. 번호 72 및 75로 명명한 2마리의 12-14주령 Balb/c 마우스(찰스 리버 래보러터리즈(Charles River Laboratories))를 사용하였다. 마우스 #72에는 저부(Gerbu) 애쥬번트(애큐레이트(Accurate)) 중의, 복막내(IP) 및 피부내(ID)로 제공되는 50 ㎎의 인간 IL-13 R130Q의 주사를 격주로 총 3회 제공하였다. 마우스 #75에는 뮤린 인터페론-a 및 b(바이오소스(Biosource)) 각각의 0.33×105 유닛과 병용하여 50 ㎎의 R130Q를 사용하여 꼬리의 기저부(BOT)에 피하(SQ)로 면역화시켰다. 2일 및 3일째에, 마우스의 기저부에 피하(SQ BOT)로 인터페론-a 및 b를 주사하였다(1일째와 동일한 투여량). 기저부에 피하(SQ BOT)로 제공되는, 100 ㎎의 항-뮤린 CD40 작용제 Mab(R&D)와 병용한 50 ㎎의 R130Q의 2회의 부스터(booster) 주사를 58일과 85일째에 수행하였다. 안와후(retroorbital) 천공에 의해 수집한 혈액으로부터 항체 역가(titer)를 스크리닝하였다. R130Q 고체상 EIA 분석을 수행하여, 항-R130Q IgG에 대한 혈청 역가를 평가하였다.
MattA로 명명된 융합을 위해, 마우스 #72를 인산염 완충된 염수(PBS) 중에 100 ㎖로 희석한 50 ㎎의 R130Q를 사용하여 정맥내(IV)로 부스팅시켰다. MattB로 명명된 융합을 위해, 마우스 #75에 50 ㎎의 항-뮤린 CD40 작용제와 병용한 15 ㎎의 R130Q의 최종 부스터를 기저부에 피하(SQ BOT)로 제공하였다. 최종 부스터 주사 후 3일째에, 마우스를 희생시키고, 림프 기관을 무균적으로 제거하고, 비장 및/또는 림프절을 작은 페슬(pestle)을 사용하여 미세 메쉬 스크린(fine mesh screen)을 통해 그라인딩(grinding)시키고, 따뜻한 DMEM으로 헹굼으로써, 면역림프구를 획득하였다.
염소 항-뮤린 IgG-Fc로 코팅된 96-웰 플레이트(코스타(Costar), 9018)를 사용하여 뮤린 혈청을 인간 IL-13의 자연 발생 변이체(R130Q)에 특이적인 항체에 대해 스크리닝하기 위하여 고체상 EIA를 사용하였다. 마우스 혈청을 1:50 희석에서 시작하여 PBS 중에 2배 단계 희석하고, 50 ul/웰로 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정한 다음, 300 ng/㎖, 50 ㎖/웰의 비오티닐화된 R130Q와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정하고, 과산화효소-컨쥬게이트된(conjugated) 스트렙트아비딘으로 프로빙시키고(probed), H202 및 OPD를 사용하여 현상하였다(developed). 흡광도를 자동화된 플레이트 분광광도계를 통하여 490 ㎚에서 측정하였다.
미분비(non-secreting) Balb/c 마우스 골수종 융합 파트너인 FO를 ATCC로부터 구입하였다(CRL-1646). MattA 융합을 1:2의 FO 뮤린 골수종 세포 대 생존가능한 비장 세포의 비에서 수행하였다. MattB 융합을 위해, 비장 및 슬와(popliteal)/서혜부(inguinal) 림프절(LN)으로부터의 림프구를 풀링시켜(pooled), 융합을 수행하였다. 상기 융합을 1:1의 뮤린 골수종 세포(FO) 대 생존가능한 림프구의 비에서 수행하였다. 융합된 세포를 HAT 배지(100 μM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘) 중에 재현탁화시키고, 25 × 96-웰 플레이트 내에 200 ㎕/웰로 플레이팅하고, 7-10일 동안 인큐베이션하였다.
뮤린 림프구와 뮤린 골수종 세포의 융합으로부터 발생한 하이브리도마를 EIA에 의해 성숙 R130Q(서열 번호 1의 IL-13 R110Q 변이체)에 결합할 수 있는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 양성 웰 내의 세포를 24-웰 플레이트로 옮겨, 세포 수를 증가시키고, 후에 제한 희석으로 서브클로닝하여(subcloned), 세포주의 균질성을 보장하였다. 마우스 모노클로날(Monoclonal) 항체 아이소타이핑(Isotyping) 키트-아이소스트립(IsoStrip), 딥스틱 포맷(Dipstick Format)(로슈(Roche))을 제조자의 지시에 따라 사용하여 아이소타입을 결정하였다.
EIA를 통하여, 12개의 R130Q 반응성 MAb를 MattA 융합으로부터 결정하고, 3개를 MattB 융합으로부터 결정하였다. 13개의 항체가 뮤린 IgG1/κ로 동정되었고, 1개는 IgG2aκ로 동정되었으며, 1개는 IgG1/λ 아이소타입으로 동정되었다. 균질한 하이브리도마 세포주에 C 코드 명칭을 부여하고, 각각의 MAb에 CNTO 번호를 부여하였다(표 1).
[표 1]
Figure pct00003
뮤린 하이브리도마에 대한 경쇄 및 중쇄의 cDNA를 실온-PCR에 의해 클로닝하고, 서열분석(sequenced)하였다. cDNA를 경쇄 및 중쇄 각각에 대해, 론자(Lonza) 진핵 발현 벡터 pEE12.4 및 pEE6.4에 삽입하였으며, 이들 벡터는 CMV 프로모터의 제어 하에 있으며 GS 선택가능한 유전자 마커를 함유한다. 클로닝된 서열으로부터의 C836 mAb를 HEK293 세포로 일시적으로 트랜스펙션(transfected)시키고, 하이브리도마로부터 분비된 항체에 대하여 분석하였다. V-영역으로부터의 CDR을 하기(표 2) 및 경쇄 및 중쇄 V-영역에 대한 서열 목록(각각 서열 번호 2 및 3)에 나타내었다.
[표 2]
Figure pct00004
클로닝된 서열으로부터 발현되는 정제된 mAB의 활성이 하이브리도마 C836으로부터의 조절된 배지에서 관찰되는 활성과 같은 것으로 입증되었다. 활성은 150 ng/㎖의 비오티닐화된 IL-13의 IL-13R-알파2에 대한 결합의 억제를 평가하기 위한 분석을 사용하여 측정하였다.
실시예 2: 인간 프레임워크에 적응화된(hfa) 라이브러리의 생성
mAb C836의 인간화 과정은 2개의 일반적인 과정을 수반한다: 1) 프레임워크 적응화; 및 2) 주로 선택된 프레임워크 내부로부터의 친화도 성숙. 또한, 단백질 안정성을 증진시키기 위해 특정 잔기를 변형시켰다.
프레임워크 적응화 과정은 마우스 mAb C836과, 본질적으로 프레임워크 길이가 모(parental) 가변 또는 V-영역에 대한 잔기에 대해 매치되는 잔기인, 제WO/08052108A2호(발명의 명칭: "Methods For Use In Human-Adapting Monoclonal Antibodies")에 기재된 바와 같은 인간 생식계열 데이터베이스 내의 서열 사이의 프레임워크 영역의 유사성을 기반으로 한다. 전체적으로, 16개의 경쇄(LC) 및 6개의 중쇄(HC) 프레임워크는 C836 CDR을 표 3(LC) 및 표 4(HC)에 나타낸 바와 같은 선택된 인간 프레임워크와 결합시킴으로써 적응화된 인간 프레임워크였다. CDR은 두 표 모두에서 밑줄로 강조하였다.
경쇄 프레임워크 O12(서열 번호 5), L6(서열 번호 9), L12(서열 번호 11) 및 L18(서열 번호 6)은 뮤린 V-영역(서열 번호 2)과 가장 높은 유사성을 갖는다(도 1 상측 정렬). 중쇄 CDR에 대하여, 인간 프레임워크 2-26(서열 번호 20) 및 2-05(서열 번호 21)은 뮤린 V-영역(서열 번호 3)과 가장 높은 유사성을 갖는다(도 1 하측 정렬).
[표 3]
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
[표 4]
Figure pct00009
Figure pct00010
중쇄의 프레임워크 적응화된 V-영역을 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 방법을 사용하여, 인간 IgG1의 C-카파(경쇄) 및 CH1 - CH3(중쇄)에 융합시켰다. 또한, 마우스-인간 IgG1 키메라 작제물을 만들었으며(Mab 167), 여기에서 뮤린 VH 영역을 CH1 도메인에서 인간 IgG1에 융합시키고, 뮤린 VL를 인간 C-카파 도메인에 융합시켜, 각각 총 16개의 경쇄 및 7개의 중쇄를 야기하였다.
인간 프레임워크 적응화된 경쇄 및 중쇄의 합성을 에반스(Evans) 등에 의해 교시된 방법에 따라, 전장 코딩 서열로 조립되는 폴리뉴클레오티드 단편의 전체적인 화학적 합성에 의해 수행하였다(참조예: 미국 특허 제6,521,427호 및 제6,670,127호). 합성된 유전자를 CMV 프로모터 벡터인 pUNDER에 삽입하고, 서열을 확인하였다. 그 다음, 이들 벡터를 후술되는 바와 같은 일시적인 뱃치(batch) 트랜스펙션 또는 다양한 규모에 사용하였다.
소규모 트랜스펙션 및 발현. HEK293 세포를 사용하여 소규모로 각각의 HFA 중쇄(Hc)가 각각의 HFA 경쇄(Lc)와 쌍을 이루게 하는 매트릭스 포맷에서 HFA 변이체의 발현을 수행하여, 스크리닝에 이용가능한 90개의 HFA mAb(15 Lc × 6 Hc)를 야기하였다. 마우스 모-인간 키메라 Lc 및 Hc가 쌍을 이루게 하고, 대조군과 동일한 방식으로 발현시켰다. 간단히 말해서, HEK293-E 세포(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠(Invitrogen))를 48-웰 플레이트에 웰당 1.5 × 106개의 생존가능한 세포를 0.5 ㎖의 성장 배지와 함께 플레이팅하였으며, 각각의 DNA (Lc+Hc) 쌍을 리포펙타민 2000(인비트로젠)과 복합체화시키고, DNA-지질 복합체를 2벌의 웰에 첨가하여 세포를 트랜스펙션시켰다. 4 mM L-글루타민(인비트로젠)과 함께 293 SFM II(인비트로젠)의 배지를 24시간 후에 교체하였다. 분비된 항체를 함유하는 상층액을 96시간 후에 획득하고, 분석을 위해 여과시켰다.
HEK293 -E 또는 CHO -S 세포의 파일럿( Pilot ) 규모 트랜스펙션 . HEK293-E 세포를 셀스택(Cellstack) 2-층 용기(코닝(Corning))에 200 ㎖의 성장 배지와 함께 용기당 8.0 × 104개 세포로 플레이팅하였다. DNA-리포펙타민 복합체를 소규모 트랜스펙션 방법에 기재된 바와 같이 제조하였다.
트랜스펙션 당일에, CHO-S 배양을 위하여, 세포를 2 L 쉐이크 플라스크당 500 ㎖의 배지 중에 ㎖당 7.5 × 105개 세포로 희석하였다. DNA를 Opti-Pro 배지(인비트로젠 카탈로그 번호 12309)로 희석하고, 프리스타일 맥스(FreeStyle Max) 트랜스펙션 시약(인비트로젠 카탈로그 번호 16447)과 혼합하였다. DNA 맥스 복합체(10 ㎖)를 세포가 있는 플라스크에 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션하고, 상층액을 4일 후에 획득하였다.
대규모(4-5 L), 생물반응기 생성. 트랜스펙션 전날에, 세포를 세포 배양 바이오번들 (Cell Culture BioBundle) 생물반응기(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 아플리콘(Applikon))내에 ㎖당 2.0 × 105개 세포로 씨딩하였으며, 상기 생물반응기는 37℃로 유지하고, 헤드스페이스(headspace)의 산소(O2)를 모니터링하여 50%로 조절하며, pH를 소듐 바이카보네이트를 사용하여 pH 7.2로 조절하였다. 트렌스펙션 시에, pH를 6.8으로 낮추었다. DNA-지질 복합체를 위하여, 트랜스펙션 리터당 1.25 ㎎의 전체 DNA를 50 ㎖의 Opti-Pro 중에 희석하였다. 유사하게, 트랜스펙션 리터당 1.25 ㎖의 프리스타일 맥스 트랜스펙션 시약을 50 ㎖의 Opti-Pro 중에 희석하였다. 희석된 DNA를 희석된 프리스타일 맥스 시약과 혼합하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 전체 DNA-프리스타일 맥스 복합체(100 ㎖의 총 부피)를 생물반응기에 첨가하였다. 트랜스펙션시에, 세포는 전형적으로 ㎖당 7.0 × 105개 세포였다. 상층액을 4일 후에 획득하였다.
파일럿 규모(0.3-3.0 ㎎)의 정제를 AKTA Xpress 크로마토그래피 시스템에서 수행하고, 대규모(3 ㎎ 이상)의 정제를 AKTA FPLC 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행하였다. 파일럿 및 대규모 제조를 위한 정제 절차는 동일하였다. 일시적으로 트랜스펙션된 HEK293-E 또는 CHO-S 세포로부터의 세포 상층액을 원심분리(30 분, 6000 rpm)에 의해 투명하게 만들고 여과(0.2 um PES 멤브레인, 코닝)하였다. IgG의 상대량을 옥테트(Octet) 기기(포르테바이오(ForteBio))를 사용하여 결정하였다. 대규모(5 내지 20 리터)로 트랜스펙션된 샘플을 LV 센트라메이트(Centramate)(폴(Pall)) 농축기를 사용하여 5배 농축시켰다. 농축된 샘플을 PBS로 헹구고, 다시 0.2 um로 여과시켰다. 희석된 상층액을 평형화된(PBS, pH 7) 하이트랩 맵셀렉트 슈어(HiTrap MabSelect Sure) 단백질 A 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))에 수지 1㎖당 약 10㎎의 단백질의 상대 농도로 로딩하였다. 로딩 후에, 컬럼을 세정하고, 단백질을 컬럼 부피의 10배의 0.1 M Na-아세테이트(pH 3)를 사용하여 용출시켰다. 용출된 단백질 분획을 Tris 완충액으로의 용출에 의해 중화시켰다. 피크 분획을 풀링하고, 여과하고(0.2um), PBS(pH 7)에 대하여 밤새 4℃에서 투석하였다. 투석된 단백질을 여과시키고(0.2um), 단백질 농도를 BioTek SynergyHT™ 분광 광도계 상에서 280 ㎚ 및 310 ㎚에서의 흡광도에 의해 결정하였다. 필요에 따라, 정제된 단백질을 10K MWCO 원심분리 농축기(밀리포어(Millipore))를 사용해 농축시켰다. 정제된 단백질의 특질을 SDS-PAGE 및 크기 배제 HPLC(다이오넥스(Dionex) HPLC 시스템)에 의해 평가하였다. 필요에 따라, 엔도톡신 수준을 LAL 분석(미국 매사추세츠주 케이프 코드 소재의 케이프 코드 어쏘시에이츠(Cape Cod Associates))으로 측정하였다. 정제된 단백질을 특이성 및 활성 시험을 행하기 전에 4℃에서 보관하였다.
실시예 3: 항-IL-13 항체의 평가를 위한 분석
단일의 아미노산 돌연변이를 갖는, IL-13 R110Q 또는 IL-13 R130Q(서열 번호 1)로 명명된 IL-13의 자연 발생 변이체를 후보물질 스크리닝에 사용하였다. IL-13 변이체 및 야생형 단백질을 미국 뉴져지주 록키 힐 소재의 페프로테크(Peprotech)에서 구매하였다.
항원 비오티닐화 IL-13 단백질을 피어스(Pierce), EZ-링크(link) NHS-LC-비오틴(#21336)을 사용하여 4:1 몰비로 비오티닐화시켰다. 이를 이루기 위하여, 비오틴 시약을 적절한 부피의 밀리포어(Millipore) 물에 용해하여, 10 mM 스톡(stock)을 달성하였다. 적절한 부피의 비오틴 스톡을 실온에서 2시간 동안 PBS (0.1M NaHCO3, pH8.5) 중의 IL-13 변이체 R130Q((미국 뉴져지주 록키 힐 소재의 페프로테크) 200-13A)에 첨가하여, 4:1의 몰비를 달성하였다. 비오티닐화 반응을 1 ㎖의 1M 에탄올아민을 사용하여 실온에서 2시간 동안 퀀칭하고, 과량의 미반응 비오틴을 PBS를 사용하여 4℃에서 밤새 투석하여 제거하였다. 분취물을 급속 동결시키고, -80℃에 보관하였다. 비오티닐화된 IL-13 야생형 및 변이체를 OD260으로 다시 정량화하였다. 비오티닐화된 IL-13 형태("b-"로 명명)를 후술되는 (a) IL-13 Rα1에 대한 결합을 위한 THP-1 세포에서의 STAT6의 활성화; 및 (b) ELISA를 통한, Rα2(미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D 시스템즈)에서의 IL-13 Rα2에 대한 결합에 의해 평가하였다.
참조 항체
일부 항체를 참조 항체로 사용하였으며, 이는 1) 서열 번호 2 및 3의 V-영역을 포함하는, C836 뮤린/인간 키메라인 mAb 167; 2) mAb 62 또는 Fab 62( HFA62 또는 HFAL62); 3) 서열 번호 9 및 20의 V-영역을 포함하는 C836 인간 프레임워크 LC6HC2; 및 4) 인간 IgG1 아이소타입 대조군인 mAb 442를 포함한다. 다수의 생활성 분석을 사용하여, 항-IL-13 mAb의 결합 특징을 스크리닝하고 정의하였으며, 이는 후술된다.
IL-13 직접 결합 ELISA
블랙(Black) 96-웰 맥시소르프(Maxisorp) 플레이트를 0.1M 카보네이트-바이카보네이트 코팅 완충액 중에 8 ug/㎖의 염소 항-인간 Fc 캡쳐(Capture) 항체 100 ul와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 0.05% Tween-20을 갖는 PBS로 세정하고, 1% BSA와 함께 PBS로 블로킹(blocking)하였다. 항체(100ul) 시험 샘플을 분석 완충액(1% BSA 및 0.05% Tween-20을 갖는 PBS) 중에 웰마다 7 ng/㎖ 로 희석하고, 쉐이킹하면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세정(5X) 후에, 분석 완충액 중에 9 ng/㎖로 희석된 비오티닐화된 IL-13 R130Q 항원 100 ul를 쉐이킹하면서 실온에서 1시간 동안 첨가하고, 세정을 반복하였다. TBS-T 완충액 중에서 1 ug/㎖로 희석된, 스트렙트아비딘-알칼라인 포스파타아제와에 컨쥬게이트된 2차 항체를 첨가하고(100 ul), 쉐이킹하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세정(5X) 후에, 실온으로 평형화되고, 10 ul의 AP 기질:100 ul의 인핸서(enhancer):890 ul의 분석 완충액의 비로 희석한 BM 화학발광 기질 100 ul를 첨가하고, 쉐이킹하면서 10분 동안 인큐베이션하였다. 맞춤형 "BM 화학발광" 프로그램을 사용하여 엔비젼 판독기(Envision Reader)로 형광을 판독하였다. 데이터를 검출 한계 및 양성 대조군 mAb로 정규화시켜, 항원 결합 퍼센트를 얻었다.
R알파2 결합 억제 분석
R알파2 결합 억제 분석은 구매한 용해성 IL-13R-알파2를 플레이트로 흡수시키고, 비오티닐화된 IL-13-R130Q의 결합을 방지하는 시험 항체의 능력을 측정하는 것을 수반한다. 분석을 위해, IL-13Rα2(R&D 시스템즈)를 DPBS 중에 희석된 100ul × 300ng/㎖(30 ng)로 넝크(Nunc) 맥시소르브 플레이트에 흡수시키고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 세정(5X, TBST +0.05% Tween-20) 후에, 총 부피 100ul의 샘플 또는 표준물을 다음과 같이 각 웰에 쉐이킹하면서 실온에서 1시간 동안 첨가하였다: 200ng/㎖의 항체 50ul에 이어서, 분석 완충액(PBS + 0.5% BSA) 중에 8ng/㎖의 b-R130Q 50ul. 세정 후에, TBST 중의 1ug/㎖의 스트렙트아비딘-알칼라인 포스파타아제 컨쥬게이트된 2차 항체 100ul를 첨가하고, 쉐이킹하면서 0.5시간 인큐베이션하였다. 세정 후에, BM 아토포스(AttoPhos) 기질 100 ul를 실온으로 평형화하고, 1부의 기질 A 대 4부의 기질 B의 비로 희석하였으며, 쉐이킹하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 추가 45분 동안 색상이 현상되도록 하고, 엔비젼 판독기를 사용하여 형광을 측정하였다. 백그라운드(background) 웰 값을 감산하고, 항체가 없는 비오티닐화된-IL-13-R130Q(bR130Q로 표지된 웰)를 0%로 설정함으로써 퍼센트 억제를 계산하여 원시(raw) 데이터를 분석하였다. 억제 퍼센트는 다음과 같이 계산하였다: (1-((항체 샘플이 갖는 값)/(단독의 비오티닐화된 IL-13-R130Q))×100%).
퍼킨 엘머 ( Perkin Elmer ) 알파스크린(AlphaScreen®)을 사용하는 IgG 정량화
퍼킨 엘머 알파스크린(3-AS-0004 v1)은 엔지니어링된 mAb 및 Fab의 정량화에 사용되는 384-웰의 균질한 비드 기반의 분석이다. 단백질 샘플을 단백질 A 코팅된 수용체(acceptor) 비드, 항-카파 경쇄 항체 및 스트렙트아비딘 코팅된 공여체(donor) 비드에 첨가하였다. 모든 4개의 성분이 복합체를 형성할 때, 수용체 비드 및 공여체 비드는 공여체 비드가 단일의 산소 이온을 수용체 비드에 전달하여, 수용체 비드에서 신호를 생성하기에 충분히 가까이 인접해 있다. 이 신호를 퍼킨-엘머 엔비젼 플레이트 판독기에서 측정하였다. 샘플을 플레이트 상에서 알려진 항체의 표준 곡선을 사용하여 정량화하였다. 사용된 재료: 384-웰, 불투명 백색, 옵티플레이트(OptiPlate)(퍼킨 엘머), 단백질-A 코팅된 수용체 비드(퍼킨 엘머), 스트렙트아비딘 코팅된 공여체 비드(퍼킨 엘머), 염소 항-인간 카파 경쇄-비오틴(피어스(Pierce)) 및 Tween-20을 갖는 Tris 완충된 염수(테크노바(Teknova)) 또는 소 혈청 알부민, 프로부민 진단 등급 K(밀리포어(Millipore)). 백그라운드를 감산하고, 모든 희석물을 각 플레이트 상의 표준 곡선에 핏팅(fitting)시킴으로써 농도를 결정하였다.
포스포-STAT6 분석을 사용하는 IL-13R1알파 신호전달
THP-1 세포에서 IL-13-유도성 Stat 6 인산화의 유세포 분석의 측정은 유세포 분석(FC)에 의한 IL-13 유도성 Stat6 인산화(P-Stat 6)의 검출을 기반으로 하여, 항체에 의한 IL-13의 중화 활성을 평가하기 위한 민감한 분석이다. 이러한 분석은 일차 인간 B 세포 기반의 p-Stat 6 분석에 대한 감도(EC50, 5000pg/㎖)보다 더 높은 감도(EC50, 332 pg/㎖)로, rhIL-13에 대한 THP-1 세포의 반응의 신속하고 정량적인 측정을 허용한다.
THP-1 세포를 ATCC(TIB-202™)로부터 얻고, 4-6일 마다 1회 계대하고, 완전 RPMI-1640 배지 중에 유지시켰다. 기타 시약에는 다음이 포함된다: 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488-마우스 항-P-Stat 6 mAb (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BD 트랜스덕션 래보러터리즈(BD Transduction Laboratories™)), 사이토픽스(Cytofix)/사이토펌(Cytoperm) TM (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BD 파민젠(BD Pharmingen)), 인간 재조합 IL-13(미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D 시스템). 분석을 위해, 세포를 획득하고, 새로운 완전 배지 중에 ㎖당 5 × 105 내지 1 × 106세포로 재현탁시켰다. 시험 시약을 10% FBS:항체가 있는 RPMI-1640 중에서, 지시된 바와 같이, 또는 2 ㎎/㎖에서 시작하여 2- 또는 3-배의 8회의 희석액으로 단계 희석하고, 배지만 있는 것과 각각의 항체 희석액 25 ul를 96-웰 플레이트로 옮기고, 이어서 25 ul/웰 × 20 ng/㎖(0.5 ng)의 rIL-13을 옮기고, 실온에 10분간 놔두었다. IL-13 또는 변이체의 활성을 지시된 바와 같은, 또는 2 ng/㎖에서 시작하는 IL-13의 2- 또는 3-배 단계 희석을 사용하여 유사하게 시험할 수 있다.
전형적인 분석을 위해, THP-1 세포를 항체 및/또는 IL-13을 함유하는 웰에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 세포를 3분 동안의 원심분리(450 × g)에 의해 펠렛화(pelleted)하고, 상층액을 버렸다. 사이토픽스/사이토펌 완충액을 37℃에서 10분 동안 첨가하고, 이어서 차가운 90% 메탄올을 사용하여 얼음 상에서 30분간(또는 세포는 최대 1달 동안 -20℃에 보관될 수 있음) 세정하고 투과화시킴으로써 재현탁화된 세포를 고정하고, 다시 펠렛화시켰다. 세포를 20 ul의 알렉사 푸로-항-P-Stat 6를 함유하는 염색 완충액(1x PBS, 1% FBS, 0.09% NaN3) 중에 재현탁화시킴으로써 염색하고, 암 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 데이터 수집 및 분석을 위해 FACSCalibur 또는 CellQuestPro(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BD)중 어느 하나를 사용하는 유세포 분석(FC)을 위해 염색 완충액으로 세정하고 재현탁시켰다. P-Stat 6 양성 THP-1 세포 = (P-Stat 6의 수 + THP-1 세포 / THP-1 세포의 총수) × 100.
바이아코어(Biacore) 분석
표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하는 친화도 측정을 바이아코어 3000 옵티컬 바이오센서(optical biosensor)(바이아코어)를 사용하여 수행하였다. 아민-커플링 화학을 위한 제조자의 지시를 사용하여 항-인간 IgG Fc 단편 특이적 항체(잭슨(Jackson))를 CM-5 칩(바이아코어)의 카복시메틸화된 덱스트란 표면에 커플링시킴으로써 바이오센서 표면을 준비하였다. 대략 20,000 RU(반응 유닛)의 항-인간 IgG Fc 항체를 4개의 유세포 각각에 고정시켰다. PBS 러닝(running) 완충액(0.005% 계면활성제 P20 및 3 mM EDTA를 함유) 중에서 25℃에서 동력학적 실험을 수행하였다. 이 완충액을 사용 전에 여과하고, 적어도 30분 동안 탈기시켰다. 33 nM 내지 0.046 nM의 IL-13의 단계 희석물을 러닝 완충액 중에 제조하였다. 약 250 RU의 시험 mAb를 센서 칩의 유세포 2, 3 및 4 상에서 캡쳐하였다. 유세포 1을 참조 표면으로 사용하였다.
mAb의 캡쳐링 이후에, 50 uL/분의 IL-13의 3분 주입(회합(association) 상태) 이후에, 10분의 완충액 흐름(해리 상태)으로 이어졌다. 칩 표면을 100 mM H3PO4(시그마(Sigma) 카탈로그 번호 7961)의 50 uL/분에서의 12초 주입의 2회 펄스로 재생시켰다. 수집된 데이터를 BIAevaluation 소프트웨어, 버전 3.2(바이아코어)를 사용하여 처리하였다. 먼저, 피분석물 주입에 대한 참조-감산된 곡선으로부터 완충액 주입에 의해 생성된 곡선을 감산함으로써, 데이터의 이중 참조 감산을 수행하였다. 그 다음, 전체적인 적합도(fit)를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터의 동력학적 분석을 수행하였다. 각각의 mAb에 대한 결과를 Ka(온(on)-속도), Kd(오프(off)-속도) 및 KD(친화도 상수)의 형식으로 기록하였다.
원심성 한외여과에 의한 PBS 중의 항체 용해도 결정
실온에서 다양한 항체의 용해도를 결정하기 위하여, 한외여과 스핀(spin) 컬럼을 사용하여 실험을 수행하였다. 간단하게 말하면, 인산염 완충된 염수(PBS) 완충액 중의 항체 제제를 실온에서 비바스핀(Vivaspin)-15(15 ㎖) 한외여과 스핀 컬럼(30,000 MWCO, 독일 괴팅엔 소재의 사토리우스(Sartorius))에 첨가하였다. 컬럼을 스윙하는 버켓(bucket) 로터를 사용하여 에펜도르프(Eppendorf) 5804R 원심분리기 내에서 3000 × g에서 20분 간격으로 회전시켰다. 부피가 약 2 ㎖로 감소되면, 상층액을 비바스핀-4 (4 ㎖) 컬럼(30,000 MWCO)으로 옮기고, 4,000 × g에서 20분 간격으로 원심분리시켰다. 샘플 부피를 500 ul로 감소시킨 후에, 샘플을 비바스핀-500 컬럼으로 옮기고, 에펜도르프 5415R 원심분리기에서 15,000 × g로 15분 동안 원심분리시켰다. 침전이 관찰될 때까지 이를 반복하였다. 이 때에, 원심분리를 중단하고, 샘플을 실온에서 밤새 두어, 평형에 도달하게 하였다. 다음날 아침에, 샘플을 회전시켜, 침전물을 제거하고, 적절히 희석하여, 나노드롭(Nanodrop)(미국 델라웨어주 윌밍턴 소재의 써모-피셔(Thermo-Fisher))를 사용하여, A280에서 단백질 농도를 결정하였다. 농도가 100 ㎎/㎖보다 크면, 과정을 중단하였다. 침전이 발생하지 않는다면, 모든 스핀 이후 마다 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 농도가 100 ㎎/㎖보다 큰 것으로 관찰되면, 원심분리를 중단하였다. 또한, 본 명세서에 기재된 항체를 추가로 스크리닝하여, 특정 항체를 추가의 개발에 대한 이상적인 후보물질로 만들 것인 특징을 동정하였다. 이들 항체를 스크리닝하는 데 사용되는 방법은 미국 특허 출원 제61/022,385호에 기재되었다.
실시예 4: 항-IL-13 항체의 HFA 변이체.
각각의 HFA 중쇄 변이체와 쌍을 이루고 있는 각각의 HFA 경쇄 변이체(실시예 2, 각각 표 3 및 4)의 매트릭스 트랜스펙션으로부터 생성된 90개의 mAb를 먼저 용액 중의 비오티닐화된-IL-13 R130Q에 대한 직접적 결합을 측정하고, 1.1 nM Mab 및 2 nM b-IL-13 R130Q를 사용하여, IL-13 R130Q의 IL-13 Rα2에 대한 결합을 억제하는 능력을 측정함으로써, 스크리닝하였다.
재조합 Mab 샘플의 결합 또는 억제 활성을 키메라 mAb인, 서열 번호 2 및 서열 번호 3을 포함하는 Lc16Hc7(mAb 167)의 결합 또는 억제 활성과 비교하였다. 소규모 트랜스펙션으로부터의 미정제된 조직 배양 상층액을 사용하는 이들 스크린에서의 데이터로, 변이체가 발현, 정제 및 추가의 평가를 위해 규모가 확대되어야하는 것으로 결정되었다(표 5). 선택된 HFA mAb를 HEK293 세포에서 대규모로 발현시키고, 정제하였다. 이들을 바이아코어로 평가하여, IL-13 변이체 R130Q에 대한 이들의 결합 친화도를 결정하였다.
[표 5]
Figure pct00011
[표 6]
Figure pct00012
이들 데이터에 기초하여, HFA 변이체 Lc6Hc2 및 Lc14Hc2를 친화도 성숙을 위해 선별하였다.
실시예 5: 항-IL-13 항체의 변이체의 친화도 성숙 및 생성.
공지의 3차원 구조의 항체-항체 복합체의 연구로, 특이성-결정 잔기(SDR)로 불리우는, CDR 내의 항원-접촉 잔기가 드러났다(문헌[Padlan, et al., 1995, FASEB J 9:133-9]; 문헌[Almagro 2004, J Mol Recognit. 17:132-143]). 리드(lead) HFA 변이체의 친화도를 개선시키기 위하여, 단백질 항원 인지를 위해 많이 사용되는 4개의 SDR인, L-CDR3의 잔기 H91, N92, E93 및 Y94 내의 무작위 라이브러리를 사용하였다.
파지미드 IL013-62로 불리우는 CDR 그라프트된(grafted) Lc6 -VB_Lc6를 라이브러리 작제를 위한 골격으로 사용하고, 두번째는 파지미드 IL-13-142로 불리우는 Lc14 VB_L12(서열 번호 17)를 사용하여 L-CDR3 변이체의 2개 파지 라이브러리를 만들었다. 두 라이브러리 모두를 Hc2(서열 번호 20)와 결합시키고, Fab 단편으로 클로닝하였다. 서열 번호 9(Lc6) 및 서열 번호 17(Lc14) 내의 L-CDR3의 4개의 잔기(H91, N92, E93 및 Y94)를 1.9 × 105 개 변이체의 이론적 다양성을 제공하기 위하여 "NNK" 코돈을 사용하여 전체 다양성을 도입함으로써, 무작위화시켰다. 또한, 모 뮤린 Mab인 C836의 V-영역을 갖는 파지미드를 작제하고, IL-13-167로 명명하였다.
Fab 라이브러리를 미국 특허 제6,472,147호(Scripps) 및 동출원인의 제WO2009/085462호로 공개된 동시-계류중인 출원에 기재된 바와 같은 pIX 파지 디스플레이 시스템에서 작제하였다. 파지미드 IL-13-62를 IL-13Lc6 및 IL-13Hc2의 가변 영역을 함유하는 디시스트로닉(dicistronic) 유닛으로 발현시켰다. 라이브러리의 작제를 이전에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다(문헌[Almagro et al., 2006. J Mol Recognit 19: 413-422]). 모 분자로부터 별개의 N-말단 및 C-말단 단편을 캡쳐하기 위하여 N-말단 영역(단편 1) 및 C-말단 영역(단편 3)으로 구성된 3개의 단편으로부터 네스티드(nested) PCR에 의해 라이브러리를 조립하였다. 생성되면, 외측의 단편을 각각의 SDR을 표적으로 하는 내부 단편(단편 2)과 혼합하였다. 단편 2를 축퇴(degenerate) 올리고로부터 만들고, 전장 라이브러리 서열을 생성하기 위하여 단편 1 및 3을 브리징(bridged)시키는 데 사용하였다. 전장 서열을 각각의 경쇄 파지 벡터로 클로닝하였다.
라이브러리를 비오티닐화된 IL-13 R130Q에 대하여 패닝(panned)하였다. 간단하게 말하면, 패닝 이전에, 스트렙트아비딘으로 코팅된 상자성(paramagnetic) 비드(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠)를 케미블로커(Chemiblocker)(미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘(Chemicon))에서 블로킹하였다. 유사하게, L-CDR3 파지 라이브러리를 0.05% Tween-20 (T)을 갖는 Tris 완충된 염수(TBS) 중에 1:1로 희석된 케미블로커 중에서 실온에서 30분 동안 사전 블로킹한 다음, 사전-흡수 단계로 진행하였으며, 여기에서, L-CDR3 라이브러리를 블로킹된 자성 비드와 함께 인큐베이션하여, 비특이적인 결합제를 제거하였다. 그 다음, 비오티닐화된 IL-13 변이체 R130Q(미국 뉴져지주 록키 힐 소재의 페프로테크)를 3회의 연속 라운드의 패닝을 위해 상이한 농도(10 nM 내지 0.01 nM)로 파지 라이브러리에 첨가하였다. 항원-결합 파지를 자성 비드를 사용하여 캡쳐하고, 1 ㎖의 지수적으로 성장하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) TG-1 세포(OD(600 ㎚) = 0.5)를 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 복구하였다. 그 다음, 파지를 다음 라운드(round)의 패닝을 위해 생성 및 제조하였다. Fab-pIX를 TG-1 콜로니의 미정제(crude) 박테리아 세포 용해물로부터 생성하였다.
파지 패닝 노력으로부터 변이체를 평가하기 위하여, 높은 효율(high throughput)의 단일점(10 nM) ELISA를 사용하였다. 파지 pIX 단백질 상에 디스플레이되는 특정 SDRU 변이체 Fab의 비오티닐화된 IL-13R130Q에 대한 결합 곡선을 도시하였다. IL-13-167보다 더 높은 신호를 갖는 클론(뮤린-인간 키메라 Fab보다 더 큰 친화도 결합제)을 Fab의 Mab로의 전환에 대하여 선별하였다. 서열 번호 9 및 20을 기초로 한 IL-13-62 라이브러리에 대해 평가된 데이터를 표 7A에 제시하였으며, 여기에서, 적어도 40개의 클론이 뮤린 모 서열 Fab(파지-Lc16H7)보다 더 높은 IL-13에 대한 친화도를 가졌다. 표 7B는 서열 번호 17 및 20을 기초로 한 IL-13-142 라이브러리에 대한 비교 데이터를 나타낸 것이며, 여기에서 53개의 클론이 뮤린 모 서열(Lc16H7)보다 더 큰 친화도를 가졌다. 소수의 클론이 프레임워크 내의 돌연변이를 함유하였다(기재된 바와 같이).
[표 7A]
Figure pct00013
Figure pct00014
[표 7B]
Figure pct00015
Figure pct00016
Fab의 MAb로의 전환
IL-13-62 라이브러리(표 7A)로부터 선택된 Fab를 스크리닝을 위하여, 제한효소 분해 및 pUNDER 벡터로의 삽입에 의해 전장 mAb로 전환시켰다. 이들 Lc6-기반의 변이체가 인간 IgG1 중쇄를 함유하는 Hc2(서열 번호 20)와 쌍을 이루게 하고, 미정제 상층액 및 IL-13을 사용하는 HEK293 세포에서의 소규모 트랜스펙션에 의해 다시 스크리닝하였다(표 8).
[표 8]
Figure pct00017
Figure pct00018
IL-13-62 라이브러리(표 7A) 및 IL-13-142 라이브러리(표 7B)로부터의 완전한 IL12Ra2 결합 결과를 신호 세기의 면에서 직접 비교할 수 없는데, 이는 분석이 약간 상이한 조건을 사용하여 행해지기 때문이다. 142개 라이브러리로부터의 변이체를 Mab 형식으로 시험하지 않았다.
CDR 내의 특정 잔기를 표적으로 하는 위치 지정 돌연변이유발
pIX 파지 디스플레이 및 패닝이 프레임워크 적응화된 C836 경쇄의 친화도 성숙을 위한 방식으로 선별되었지만, 위치 지정 돌연변이유발(SDM)도 또한 Lc6 및 Hc2 상에 사용하였다. SDM을 사용하여, SDR의 특정 잔기를 메티오닌과 시스테인을 제외한 모든 가능한 아미노산으로 무작위화시켰다. 역으로, SDR 내의 임의의 메티오닌 또는 시스테인을 제거하여, 산화되기 쉬운 잔기의 존재를 막았다. 따라서, Hc2(서열 번호 20)에서, M34 및 M100을 SDM에 의해 변경시켰으며, 이들 단일 위치 변이체는, 추가의 돌연변이를 포함하는 서열과 함께 결합 활성의 증가에 대하여 스크리닝하였다.
간단하게 말하면, 높은 효율의 위치 지정 돌연변이유발에 의하여 Lc6-Hc2의 약 200개 경쇄 변이체 및 400개 중쇄 변이체를 생성하였다. 상기 분석을 위하여, 각각의 경쇄 변이체가 Hc2 서열과 쌍을 이루게 하고, 활성에 대하여 스크리닝하였다(데이터 미도시). 유사하게, IL-13 직접 결합의 스크리닝 및 IL-13과의 Ra2 결합 경쟁 분석을 위하여 각각의 중쇄 변이체가 Lc6과 쌍을 이루게 하였다. 이러한 접근법을 사용하여, 경쇄 및 중쇄 변이체 둘 모두를 갖는 몇몇의 개선된 항체를 동정하였다. 많은 변이체는 원래의 뮤린 항체에 비하여 개선을 나타내었으며, 나머지는 HFA V-영역 L6(서열 번호 9) 및 H2(서열 번호 20)에 비해 개선되었다. 향상된 경쇄 돌연변이의 일부는 파지 변이체 라이브러리 방법으로부터 동정된 양성의 돌연변이와 동일한 위치에 있었다. 또한, 개선된 활성을 갖는 선택된 중쇄 변이체를 파지 유래의 경쇄와 결합시켜, 완전한 MAb를 형성하고, 재시험하였다. 이들 조합체의 일부가 IL-13 R130Q에 대한 결합 친화도의 부가적인 향상을 생성해내었다. 즉, 결합 친화도는 원래의 뮤린 Mab(C836)에 대해 측정된 결합 친화도보다 더 컸으며, HFA V-영역, Lc6 및 Hc2에 비해서는 수배 더 컸다. 이들 MAb를 정제하고, 플라즈몬 공명(바이아코어)을 사용하여 결합 친화도 측정을 행하고, 시험한 MAb 중 50개 초과의 MAb(시험한 MAb 중 100개 초과)가 약 50 pM인 원래 뮤린 Mab(C836)보다 더 큰 IL-13에 대한 친화도를 가졌다.
Lc 플러스 Hc 매트릭스 스크리닝 데이터에 기초하여, 선택된 Hc 변이체(SDM을 통해 수득)가 서열 번호 9의 L6 변이체 N92-, E93D와 쌍을 이루게 하고(서열 번호 25로 나타냄), 정제 및 추가의 분석을 위하여 생성 규모를 확대하였다. 이들 mAb를 바이아코어 분석에 의해 IL-13 R130Q로의 직접적인 결합에 대해 엄격히 시험하고, 포스포-STAT6 분석에서 이의 Rα1에 대한 IL-13의 결합을 억제하는 능력에 의한 활성의 중화에 대해 엄격히 시험하였으며, 이의 Rα2에 대한 결합으로부터 IL-13 R130Q를 억제하는 능력의 루미넥스(Luminex) 기반의 버젼에 의해 엄격하게 시험하였다. 500pg/㎖ b-야생형 IL-13을 사용한 IL-13Ra2에 대한 결합 억제 및 IC50 값을 도 2에 도시된 곡선을 기준으로 계산하였다. P-STAT6 분석에 대한 EC50 값과, Rα2 억제 루미넥스 분석에 대한 IC50 값을 표 9에 제시하였다.
[표 9]
Figure pct00019
따라서, 프레임워크 돌연변이를 갖는 표 7A에서의 mAb 후보물질에서 관찰되는 Lc6(서열 번호 9)내에서의 치환은 서열 번호 27에 대해 후술되는 변이체를 포함한다.
Figure pct00020
위치 지정 돌연변이유발을 사용하여, Hc2(서열 번호 20) CDR1(26GFSLSTYGMGVG37) 및 CDR3(100MGSDYDVWFDY110)내에서 변화를 갖는 부가의 변이체를 생성하였다. 높은 친화도 IL-13 결합을 생성하는 중쇄 가변 도메인의 변이체는 (서열 번호 28)의 변이체를 포함할 수 있다.
Figure pct00021
따라서, 서열 번호 28의 중쇄 가변 영역 및 상술된 변이체는 식 I에 나타낸 바와 같은 L-CDR3에서의 변이체를 포함하는 제2 항원 결합 도메인과 결합된 항체를 엔지니어링하는 데 사용될 수 있다.
Q-Q-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-P-Y-T (서열 번호 29),
여기서, Xaa1은 His, Gln 또는 Pro일 수 있고;
Xaa2는 Asn, Asp, Ser, Leu, Pro, Ile, Phe, Glu 또는 Val일 수 있으며;
Xaa3은 Glu, Asp, Gly, Ser, Ile, Tyr, Tryp, Asn, His, Val, Met, Arg, Leu, Phe, Pro이거나 부재일 수 있고;
Xaa4는 Tyr, Gly, Ser, Ala, Val, Phe, Thr, Glu이거나 부재일 수 있다.
마우스 모노클로날 항체, C836으로부터의 상보성 결정 영역(CDR)을 15개의 인간 경쇄 및 6개의 중쇄 항체 프레임워크에 적응화시켜, 높은 친화도로 인간 IL-13 R130Q 및 야생형 인간 IL-13과 결합하는 항체를 제공하였다. HFA 경쇄 2, 3, 6, 8, 14(서열 번호 5, 6, 9 및 17) 및 중쇄 2(서열 번호 20)로, 매우 요망되는 생활성 및 높은 친화도를 갖는 MAb를 생성하였다. 생성된 인간 프레임워크 적응화된 항체는 인간 환자에 투여된다면, 더 낮은 면역원성을 가지며, 이에 따라 이들의 완전한 뮤린이거나 또는 키메라인 대응물(counterpart)보다 더 긴 혈장 반감기를 제공하는 것으로 예상된다.
야생형 및 전장 마우스 mAb C836의 친화도(KD)가 약 50 pM인 것으로 결정되었으며, 바이아코어에 의해 측정된 마우스 V-영역-인간 C-영역 키메라(Lc16Hc7)의 친화도와 유사하다. C836 mAb로부터의 CDR의 인간 항체 프레임워크로의 적응화는 항원에 대한 결합 KD를 약 5-배로, 단순히 CDR-그라프트된 키메라에 대해 전형적인 약 250 pM까지 감소시켰다(표 6). 파지 Fab 라이브러리의 고효율 매트릭스 스크리닝 및 새로운 항체 사슬 및 일시적인 트랜스펙션을 위한 벡터 작제물의 드노보(de novo) 합성은 상대적인 결합에 대하여, 중쇄 및 경쇄 V-영역 조합체를 포함하는 수많은 Fab뿐 아니라 전장 MAb의 스크리닝을 가능하게 한다.
두번째 단계에서, 파지 Fab-라이브러리 및 위치 지정 돌연변이유발 둘 모두를 사용하는 SDR로 불리우는 선택적 잔기에 대한 변화(variegation)에 초점을 맞춤으로써 선택된 인간 프레임워크 적응화된 mAb의 결합 친화도를 성숙시켰다. 이들 노력으로부터, Hc2(서열 번호 20) 서열의 11개 변이체와 쌍을 이루는 단일 경쇄 서열을 갖는 mAb를 CHO 및 HEK293 세포에서 발현시켰으며, 바이아코어 분석에 의하여 IL-13 R130Q 및 야생형 IL-13에 대한 50 pM 미만의 결합 친화도가 나타났다(표 9). 이들 항체는 1) IL-13 R130Q 및 야생형 IL-13이 IL-13 수용체 Rα1에 결합하는 것을 억제함으로써 IL-13 작용을 중화시키며; IL-13 Ra1/IL-4 수용체 복합체를 통한 신호전달에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있는 STAT-6 전사 인자의 인산화를 억제하였고; 3) IL-13 R130Q 및 야생형 IL-13의 IL-13 수용체 Rα2에 대한 결합을 억제하였다.
생물물리학적 특징은 몇몇 종류가 PBS 중에서 100 ㎎/㎖ 초과의 용해도 및 인간 혈청 중에서 50 ㎎/㎖ 초과의 용해도를 나타내는 것을 보여주었다. 따라서, 이들 활성이 있는 엔지니어링된 mAb는 IL-13-매개의 질환의 치료에 사용하기 위한 치료 분자에서 통상적으로 관찰되는, 요망되는 특성과 일치하는 특성을 갖는다.
2B03(서열 번호 25)으로 명명된 경쇄와 서열 번호 26과 같은 Hc2 CDR 변이체를 결합시킴으로써 제조되는 mAb 외에, 표 9에 나타낸 서열 번호 20의 중쇄 변이체와 결합된 서열 번호 9 및 17의 다른 경쇄 변이체를 제조할 수 있다. 따라서, 다수의 높은 친화도의 IL-13 면역특이적 변이체 mAb는 본 명세서에서의 이러한 발견 및 교시에 기초하여 가능한 것이다. 예를 들어, 이들은 서열 번호 25 및 26에 기재된 변이체를 포함한다.
서열 번호 25 및 26의 가변 영역을 포함하는 Mab M1295로 나타낸 Hc 및 Lc 조합체는 치료 개발에 순응할 수 있는 중쇄 프레임워크를 갖기 때문에, 특히 관심있는 것이다. 중쇄 CDR 1 및 CDR3 내의 메티오닌의 제거(잔기 34 및 100)는 산화 기회를 감소시키며, 이들 서열이 치료 개발에 이상적이게 만든다. 감소된 메티오닌 함량을 갖는 항체는 산화에 대한 개선된 안정성을 나타낼 것으로 기대된다.
실시예 6: 항-IL-13 결합 도메인의 에피토프 및 파라토프 분석
C836(서열 번호 2 및 3을 포함함)에 관련된 Fab, CDR-이식 인간 프레임워크 적응 변이체(CDR-grafted human framework adapted variant) HFAL62(서열 번호 9 및 20을 포함함), 및 IL-13(서열 번호 1)에 결합된 V-영역 친화성 성숙 변이체(V-region affinity matured variant) M1295(서열 번호 25 및 26을 포함함)의 X-선 결정학을 사용하여 에피토프 맵핑을 수행하고 결과를 비교하였다.
C836 Fab의 His-표지 키메라 버전을 CHO 세포에서 발현시키고 친화성 및 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. M1295 및 HFAL62의 Fab 단편을 상응하는 mAb의 파파인 분해에 의해 제조하고 친화성 및 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 재조합 인간 IL-13은 R&D 시스템즈(R&D Systems)(Cat. No. 213-IL/CF)로부터 구매하였다. IL-13-Fab 복합체는 Fab와 과량의 IL-13을 1:1.2의 몰비로 혼합함으로써 제조하였다. 혼합물을 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하여 농축하고, 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 복합체를 형성하지 않은 화학종으로부터 분리하였다.
20℃에서 증기-확산 부유-방울(vapor-diffusion hanging-drop) 방법을 사용하여 결정화를 실행하였다. C836:IL-13의 결정은 20% PEG 3350, 0.2 M 소듐 타르트레이트, 0.1 M HEPES, pH 7.5에서 얻어졌다. HFAL62:IL-13 결정은 14% PEG 3350, 0.2 M 암모늄 타르트레이트, 0.1 M MES, pH 6.5에서 얻어졌다. M1295:IL-13 결정은 25% PEG 8K, 0.1 M 소듐 아세테이트, pH 4.5에서 얻어졌다. X-선 데이터 수집을 위하여, 20% 글리세롤로 보충된 상응하는 모액에 각 복합체의 결정 1개를 수 초 동안 침지시켰다. 새턴(Saturn) 944 CCD 검출기가 장착된 리가쿠 마이크로맥스(Rigaku MicroMax)(상표)-007HF X-선 발생기, 및 X-스트림(X-Stream)(상표) 2000 크라이오-쿨링(cryo-cooling) 시스템(텍사스주 우드랜드 소재의 리가쿠)을 사용하여 회절 데이터를 수집하여 처리하였다.
3개 복합체, C836:IL-13, HFAL62:IL-13 및 M1295:IL-13의 결정 구조를 각각 2.0 Å, 1.9 Å 및 2.8 Å 해상도에서 결정하고, 각각 22.4%, 18.6%, 및 19.7%의 결정학적 R-지수(crystallographic R-factor)로 정밀화하였다. 3개 구조 모두에서, 항체-항원 계면이 전자 밀도에서 명확하게 정의된다.
각각의 3개 Fab(C836, HFAL62 및 M1295)는 IL-13 폴리펩티드 쇄의 N- 및 C- 말단에 가까운 헬릭스 A 및 D의 표면에서 IL-13에 결합한다. 항체-항원 계면은 각각의 상호작용 분자상에서 약 600 Å2을 커버한다. 4 Å 한계(cut-off) 원자간 거리를 사용하여 접촉하는 잔기들을 정의한다. 이 정의를 사용하면, 이들 항체에 의해 인식되는 에피토프는 IL-13의 8개 잔기, 헬릭스 A로부터 3개(Arg10, Ile13, Glu14) 및 헬릭스 D로부터 5개 잔기(Leu100, Lys103, Phe106, Arg107, Glu108)를 포함한다. 접촉의 수에 기초하면, Arg10 및 Arg107이 에피토프의 주요 잔기인 것으로 보인다.
C836의 파라토프는 IL-13과 상호작용하는 12개 잔기를 포함하며(원자간 거리에 대해 4 Å 한계에 기초함), 이들은 L-CDR2를 제외한 각각의 6개 CDR 내에 존재한다. 파라토프는 L 쇄로부터의 3개 잔기(서열 번호 2의 Tyr32, His91, Asn92) 및 H 쇄로부터의 9개 잔기(서열 번호 3의 Tyr32, Trp54, Trp55, Asp56, Val58, Arg60, Asp103, Tyr104, Asp105)를 포함한다. 접촉의 수에 기초하면, 원리 인식 CDR은 H2 및 H3이다. 경쇄의 앵커 잔기(anchor residue)는 Tyr32이며, 이는 Arg10에 적층되어 IL-13의 Glu14에 수소 결합을 형성한다. L-CDR3과의 유일한 접촉은 Arg10(IL-13)과 His91의 주-쇄 카보닐기 사이의 수소 결합이다. L-CDR3의 잔기의 측쇄는 IL-13과 직접 상호작용하지 않는 것으로 보인다.
HFAL62 에피토프 및 파라토프 잔기는 C836에 대한 것들과 동일하다.
M1295는 L-CDR3(서열 번호 25) 내에 HFAL62와 비교하여 변경된 잔기를 포함하며, 여기서 잔기 Asn92-Glu93이 Asp92에 의해 대체되었다(즉, 1개의 잔기가 결실되고 1개가 돌연변이되었음). IL-13과 복합체를 이룬 M1295 및 HFAL62 결정 구조의 비교는, 다른 CDR에 유의적인 입체형태 변화(conformational change)가 일어나지 않았음을 나타낸다. L-CDR3 내의 결실이 더 짧은 루프를 유발함에 의해 이전에 Asn-Glu 쌍이 차지했던 공간을 도입된 Asp92 잔기가 점유하는 반면에, 양 옆의 잔기 His91 및 Tyr94는 대략적으로 동일한 위치에 있다. 이러한 변화는 IL-13과의 부가적 접촉을 감안하였다. 서열 번호 25의 LC Asp92는 주요 에피토프 잔기 Arg10(서열 번호 1)과 함께 염교를 형성한다. HFAL62에서는 잠재적 파트너(Glu93)가 Arg10을 향하고 있지 않기 때문에, 이 염교가 존재하지 않는다. 다른 새로운 접촉은 IL-13의 N-말단의 LC Asp92와 Ser6 사이의 수소 결합이다. Ser6은 HFAL62 또는 C836과 접촉되어 있지 않았으므로 이 상호작용은 에피토프를 확장시킨다. 전체적으로, M1295에 의해 결합된 IL-13 에피토프는 IL-13의 9개 잔기(Ser6, Arg10, Ile13, Glu14, Leu100, Lys103, Phe106, Arg107, Glu108)를 포함한다. M1295의 파라토프는 L 쇄로부터의 3개 잔기(Tyr32, His91, Asp92) 및 H 쇄로부터의 9개 잔기(Tyr32, Trp54, Trp55, Asp56, Val58, Arg60, Asp103, Tyr104, Asp105)를 포함한다.
실시예 7: 알라닌 스캐닝
IL-13에의 결합에 있어서 중요한 가변 도메인(들)의 잔기를 결정하기 위하여, C836 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 연구를 결정학에 부가하여 본 명세서에 기술한다.
59개 복합체에서 조사하여 특이성 결정 잔기(SDR: specificity determining residue)로서 기술된, 항원과 접촉하는 항체 가변 도메인의 잔기를 돌연변이 유발을 위해 선택하였다. 잔기는 C836 경쇄(서열 번호 2)의 27-36, 46-56 및 89-97, 및 중쇄(서열 번호 3)의 잔기 27-39, 49-60 및 100-111이었다. 1 ug/㎖에서 시작하여 일련의 3-배 희석을 사용하는 6개 농도에서, 실시예 2에 기술된 바와 같이 IL-13R-알파2 고체상 에세이로 변이체를 시험하였다. 활성을 야생형 Mab에 표준화하였다.
낮은 나노몰 농도의 항체에서 야생형 항체에 비해 IL-13R-알파2 결합이 어떻게 변화했는지, 또는 알라닌 치환에 의해 결합이 영향을 받지 않았거나 사실상 증진되었는지 여부에 기초하여, 잔기를 (중요도 순서로) IL-13에 대한 결합에 있어서 "결정적임(critical)", "중요함(important)", 또는 "무관함(irrelevant)"으로 분류하였다.
결합에 결정적임: 경쇄: Y32, Q89, Q90 및 H91. 중쇄: G33, H52, V58, R60, M100, G101, S102, D103, Y104, D105 및 W107.
결합에 중요함: 경쇄: K31, Y49, N92, E93 및 Y96. 중쇄: F27, L29, Y32, M34, G35, L50, I53, W54, D56 및 V106.
결합에 무관함: 경쇄: K27, S28, I29, S30, L33, S50, G51, S52, T53, L54, Q55, S56, Y94 및 P95. 중쇄: S28, S30, T31, W49, D57 및 K59.
전반적으로, 경쇄 잔기에 비해 중쇄는 결합에 참여하는 잔기(즉, 결합에 결정적임 또는 중요함으로 분류됨)를 더 많이 가지고 있었다. 이는 몇 개의 상이한 경쇄 프레임워크가 IL-13에 효과적으로 결합하는 IL-13 항체를 생성시킬 수 있다는 관찰을 뒷받침한다. 예를 들어, H2(서열 번호 20)와 조합된 L14(서열 번호 17), L6(서열 번호 9) 및 L3(서열 번호 6)의 조합은 약 250 pM의 유사한 Kd 값을 가진다. 반면에, 중쇄의 프레임워크 영역(서열 번호 3)에서는 32 및 31에서의 3개 돌연변이만이 Kd의 2-배 감소를 유발하였다(각각 250 pM에서 500 pM로).
알라닌으로 돌연변이된 51개 잔기 중에서 20개 잔기는 결합에 참여하는 잔기의 코어를 형성하고, 결정적인 잔기에 인접한 다른 15개 잔기는 결합에 있어서 중요한 것으로 밝혀졌다.
결정학 연구(실시예 6)으로부터의 증거와 함께 종합하면, 결합에 참여하는 것으로 결정된 잔기는 본 발명의 항체의 파라토프의 잔기와 더불어 활성 변이체를 유발하는 프레임워크에 대한 개질의 잠재성을 추가로 정의하는 데에 도움이 된다.
실시예 8: 인간화 항-IL-13 항체의 생체 활성
M1295를 완전 인간 IgG1 항체로 전환시키고, 알러지 기도 염증(allergic airway inflammation)의 랫트 모델에서 생물학적 활성을 평가하였다. 난 알부민(ova) 단백질로 감작시킨 후에 야기시킨(challenged) 노르웨이 브라운(Norway Brown) 랫트에서는 기도에 알러지 반응이 일어났으며, 이는 비선택성 무스카린 수용체 작용제인 메타콜린(MCh)에 의한 야기에 반응하는 폐 저항(lung resistance)의 변화에 의해 결정되는 기도 과민성(AHR: airway hyperresponsiveness)의 증가 및 폐로의 에오시노필 동원의 증가에 의해 나타났다. 알러지 반응의 야기 단계 중에 M1295 IgG1로 처리한 랫트는, 난 알부민에 대한 전신 감작화 후에, 기관지폐포 세척(BAL: bronchoalveolar lavage) 유체 내의 총 세포의 용량-의존적 감소를 보였다. 제0, 제14 및 제21일에, OVA 및 명반의 일련의 주사를 사용하여 48 마리의 랫트를 OVA에 감작시킴으로써, 지속성 염증 반응을 조성하였다. 구체적으로, 멸균 용액(0.9% NaCl) 내의 알루미늄 하이드록사이드(4.28 ㎎/㎖)와 혼합된 OVA(100 ㎎/㎖)의 용액 0.5 ㎖를 피하 주사하여 랫트를 감작시켰으며, 비-감작 대조군인 군 1은 제외하였고, 이는 동일한 프로토콜을 사용하여 0.5 ㎖의 멸균 0.9% NaCl 로 모의 처리하였다. 이어서, 제23, 제25 및 제28 실험일에, 군 1 대조군을 제외한 모든 동물을 기관내(IT: intratracheal) 점적주입에 의해 OVA(1 ㎎/㎏)로 야기시켜 기도에 ova-특이적 알러지 반응을 유발하였다.
연구를 위해 48 마리의 랫트를 8 마리 개체의 6개 군으로 분할하였다. 군 1은 PBS로 모의-감작 및 야기시키고 비히클로 처리하였다. 군 2는 ova로 감작시키고 비히클로만 처리하였다. 군 3은 ova로 감작시키고 OVA 야기(1 ㎎/㎏/용량, IT) 전일 및 당일에 부데소나이드로 처리하였다. 군 4-6은, 감작 단계 후에, 야기 단계 중에, 제21 연구일(최종 OVA-명반 주사 후의 오후)에 시작하여, 그리고 제27 연구일에, 정맥내 주사에 의해 상승 용량의 M1295 IgG1(1 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏ 및 10㎎/㎏)로 처리하였다.
제29일에, 동물은 메타콜린에 의한 야기에 반응하는 폐기능 검사를 받았다. 저항 및 순응의 기준선 측정 후에, 증가 용량의 메타콜린(Mch; 분무기(nebulizer) 내의 6, 12, 25, 50 및 100 ㎎/㎖)을 에어로졸에 의해 전달하고 폐 저항 및 순응을 측정하였다. 각 농도의 메타콜린에 대해 기도 저항을 계산하고, 모든 처리군에 대하여 평균 + SEM을 도시하였다.
동물을 안락사시키고 BAL 유체를 회수하여, 침윤 세포(infiltrating cell), 구체적으로 BAL로의 에오시노필 동원을 결정하였다. AHR 및 BAL로의 에오시노필 동원의 1차 종료점에 부가하여, H&E 염색 및 점액 생산의 평가를 포함하는 일상 조직학 분석을 위해 폐 조직 샘플을 수집하였다.
본페로니 다중 비교 포스트 검정(Bonferonni multiple comparisons post test)과 함께 2원 분산분석(two-way ANOVA)을 사용하여 MCh 유도성 기도 저항의 변화를 평가하였다. 적절한 다중 비교 검정과 함께 분산분석을 사용하여 BAL 세포 수, 항체 수준, 사이토카인 수준 및 병리학 점수의 변화를 만들었다. p<0.05인 값은 유의적인 것으로 간주된다.
염수-처리 ova-감작화 동물에 비교하여, M1295 IgG1로 처리한 랫트의 군에서는 에오시노필, 림프구, 대식세포 및 호중구 세포 수에 뚜렷한 용량-의존적 감소가 있었다. 에오시노필의 상대적 백분율이 뚜렷하게 감소하였으며, 그 수치는 염수-처리 ova-감작화 동물에 비교하여 M1295 IgG1의 모든 용량으로 처리한 동물에서 대략 50% 낮았다. 폐로의 세포 동원의 감소 및 에오시노필의 상대적 백분율의 감소가 통계적 유의성에 도달하지는 않았지만, 전반적인 경향은 랫트에서 M1295 IgG1의 생물학적 활성을 의미한다.
기도 과민성에 관련하여, 10 ㎎/㎏ M1295 IgG1로 처리한 동물은, 최종 폐 OVA 야기 24 시간 후에 반복된 MCh 야기 후의 피크 기도 저항(p < 0.01), 및 MCh에 의한 상승 야기 직전의 기준선 기도 저항(p < 0.05)에 있어서 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다.
알러지 반응 및 염증에 연계된 파라미터에 대한 용량-의존적 영향에 의해 결정되는 바와 같이, M1295 IgG1은 생물학적으로 활성임이 연구에 의해 확인된다.
실시예 9: 인간 질환의 치료를 위한 인간화 항-IL-13 항체의 용도
전임상 연구는, 천식, 아토피성 피부염 및 에오시노필-매개성 질환의 발병 기전에 연계된 기전상으로 적절한 종료점을 사용하는 인간 세포 기제의 시험관내 에세이에서 인간 IL-13의 M1295-매개성 중화의 기능적 효과를 입증한다. IL-13-매개성 STAT6 인산화의 저해, 세포 회귀 케모카인(cell homing chemokine) CCL2 및 CCL26의 IL-13-매개성 유도의 저해, 및 IL-13-매개성 CD23 조절의 저해에 의해 결정되는 바와 같이, M1295 및 관련 결합 영역을 포함하는 항체 단편의 기능적 효과가 결과로부터 확인된다.
아토피성 및 비-아토피성 질환에서 IL-13 경로의 역할을 평가하는 광범위한 공개 데이터에 부가하여, 상기 데이터는 IL-13이 중요한 면역 조절제이며 천식, 아토피성 피부염 및 에오시노필-매개성 질환에서 중심적 역할을 가지고 있음을 입증한다. 전임상 데이터는, IL-13의 길항 작용이 유형 II 염증 반응에 연계된 다운스트림 신호전달 사건의 감소를 유발할 것이라는 가설을 뒷받침하며, 이들 질환에 연계된 임상적 증상을 가진 환자에게 항-IL-13 요법 중재가 유익할 수 있다는 증거를 제공한다.
M1295 및 관련 결합 영역을 포함하는 항체 단편의 연구는, 천식을 가진 대상에게 잠재적으로 유효할 수 있는 용량을 포함하여 넓은 범위의 용량(0.1 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 3.0 ㎎/㎏ 및 10.0 ㎎/㎏)을 탐구할 것이다. 본 제1상 연구에서 평가할 용량의 범위는, 인간 IL-13 생체 활성의 시험관내 중화, 랫트 및 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)에서의 독성 및 약물 동태학 데이터, 및 인간 IL-13에 고친화성으로 결합하는 항-IL-13 mAb, IMA-638을 사용한 임상적 경험에 기초한다.
SEQUENCE LISTING <110> CENTOCOR ORTHO BIOTECH INC. SWANSON, Ronald V. CHI, Ellen RAGHUNATHAN, Gopalan ZHAO, Shanrong FRANSSON, Johan CORDIER, Wendy ALMAGRO, Juan C. HYUN, Linus GILES-KOMAR, Jill O'NEIL, Karyn T. CARTON, Jill M. ZHOU, Hong Mimi TEPLYAKOV, Alexey V. FENG, Yiqing <120> ENGINEERED ANTI- IL-13 ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES <130> CEN5229WOPCT <140> Unknown <141> Herewith <150> 61/090,472 <151> 2008-08-20 <150> 61/097,232 <151> 2008-09-16 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> NAME/KEY: VARIANT <222> LOCATION: 110 <223> OTHER INFORMATION: Xaa = Any Amino Acid <400> 1 Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu 1 5 10 15 Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met 20 25 30 Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg 50 55 60 Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser 65 70 75 80 Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys 85 90 95 Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Xaa Phe Asn 100 105 110 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> BINDING <222> (24)..(34) <223> CDR1 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<223> CDR2 <220> <221> BINDING <222> (100)..(110) <223> CDR3 <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Met Gly Ser Asp Tyr Asp Val Trp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized antibody light chain <220> <221> BINDING <222> (24)..(34) <223> CDR1 <220> <221> BINDING <222> (50)..(56) <223> CDR2 <220> <221> BINDING <222> (89)..(97) <223> CDR3 <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 108 <210> 26 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized antibody heavy chain <220> <221> BINDING <222> (26)..(37) <223> CDR1 <220> <221> BINDING <222> (52)..(67) <223> CDR2 <220> <221> BINDING <222> (100)..(110) <223> CDR3 <400> 26 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Leu Gly Ser Asp Tyr Asp Val Trp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> NAME/KEY: VARIANT <222> LOCATION: 38, 54, 91, 92, 93, 94 <223> OTHER INFORMATION: Xaa = Any Amino Acid <400> 27 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Xaa Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Xaa Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> NAME/KEY: VARIANT <222> LOCATION: 31, 34, 100, 106 <223> OTHER INFORMATION: Xaa = Any Amino Acid <400> 28 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Xaa Tyr 20 25 30 Gly Xaa Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Xaa Gly Ser Asp Tyr Asp Xaa Trp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> NAME/KEY: VARIANT <222> LOCATION: 3, 4, 5, 6 <223> OTHER INFORMATION: Xaa = Any Amino Acid <400> 29 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr Thr 1 5

Claims (47)

  1. IL-13 (서열 번호 1)의 에피토프에 결합하며, 상기 에피토프는 서열 번호 1의 10 위치의 아르기닌 및 107 위치의 아르기닌을 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열 번호 1의 6 위치의 세린, 13 위치의 아이소류신, 14 위치의 글루탐산, 100 위치의 류신, 103 위치의 라이신, 106 위치의 페닐알라닌 및 108 위치의 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기를 추가로 포함하는 단클론 항체.
  3. 경쇄 가변 영역을 포함하고, a) 10 위치의 아르기닌에서 IL-13과 상호작용하며 b) 서열 번호 1의 14 위치의 글루탐산과 결합을 형성하는 타이로신 잔기를 추가로 포함하는 파라토프(paratope)를 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제3항에 있어서, 상기 파라토프는 상기 경쇄 가변 영역 상에 히스티딘 잔기 및 아스파라긴 잔기를 추가로 포함하는 단클론 항체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 파라토프는 타이로신, 트립토판, 아스파르트산, 발린 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 파라토프 접촉 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 단클론 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 서열을 포함하며, 상기 타이로신은 서열 번호 2의 32 위치에 있고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3의 서열을 포함하며 상기 접촉 잔기는 32 위치의 타이로신, 54 위치의 트립토판 및 104 위치의 타이로신을 포함하는 단클론 항체.
  7. 경쇄 가변 영역을 포함하고, a) 10 위치의 아르기닌에서 IL-13과 상호작용하며 b) 서열 번호 1의 6 위치의 세린과 결합을 형성하는 아스파르트산 잔기를 추가로 포함하는 파라토프를 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 파라토프는 상기 경쇄 가변 영역 상에 타이로신 잔기 및 히스티딘 잔기를 추가로 포함하는 단클론 항체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 파라토프는 타이로신, 트립토판, 아스파르트산, 발린 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 파라토프 접촉 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 단클론 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 25의 서열을 포함하며, 상기 아스파르트산은 서열 번호 25의 92 위치에 있고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 26의 서열을 포함하며 상기 접촉 잔기는 32 위치의 타이로신, 54 위치의 트립토판 및 104 위치의 타이로신을 포함하는 단클론 항체.
  11. IL-13의 에피토프에 결합하는 것에 대하여 C863, HFAL62, 및 M1295로 이루어진 군으로부터 선택되는 단클론 항체와 경쟁하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, IL-13의 에피토프에의 결합에 대하여 경쟁하는 상기 항체는 서열 번호 29의 경쇄 CDR3(L-CDR3)을 포함하는 것인 단리된 단클론 항체.
  13. 제12항에 있어서, 서열 번호 29의 상기 L-CDR3은 하기 화학식 I로 나타내어지는 바와 같이 추가로 정의되는 단리된 단클론 항체:
    [화학식 I]
    --Q-Q-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-P-Y-T (서열 번호 29)
    (상기 식에서, Xaa1은 His, Gln, 또는 Pro일 수 있으며;
    Xaa2는 Asn, Asp, Ser, Leu, Pro, Ile, Phe, Glu, 또는 Val일 수 있고;
    Xaa3은 Glu, Asp, Gly, Ser, Ile, Tyr, Tryp, Asn, His, Val, Met, Arg, Leu, Phe, Pro이거나 존재하지 않을 수 있으며;
    Xaa4는 Tyr, Gly, Ser, Ala, Val, Phe, Thr, Glu이거나 존재하지 않을 수 있음).
  14. 제11항에 있어서, IL-13의 에피토프에의 결합에 대하여 경쟁하는 상기 항체는 서열 번호 28의 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
  15. 제11항에 있어서, IL-13의 에피토프에의 결합에 대하여 경쟁하는 상기 항체는 서열 번호 27의 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 것인 항체.
  16. 서열 번호 9의 가변 경쇄 및 그의 변이체와, 서열 번호 20의 가변 중쇄 및 그의 변이체를 포함하는 단리된 단클론 항체.
  17. 제16항에 있어서, 서열 번호 9의 가변 경쇄의 상기 변이체는 91 위치의 히스티딘, 92 위치의 아스파라긴, 93 위치의 글루탐산 및 94 위치의 타이로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서의 변화를 포함하는 단클론 항체.
  18. 제17항에 있어서, 91 위치의 히스티딘, 92 위치의 아스파라긴, 93 위치의 글루탐산 및 94 위치의 타이로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 잔기는 하기와 같이 상이한 아미노산으로 변화되거나 결실된 단클론 항체:
    Figure pct00022

    Figure pct00023

    Figure pct00024
  19. 제16항에 있어서, 서열 번호 20의 가변 중쇄의 상기 변이체는 31 위치의 트레오닌, 34 위치의 메티오닌, 100 위치의 메티오닌 및 106 위치의 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서의 변화를 포함하는 단클론 항체.
  20. 제19항에 있어서, 31 위치의 트레오닌, 34 위치의 메티오닌, 100 위치의 메티오닌 및 106 위치의 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 잔기는 하기와 같이 상이한 아미노산으로 변화되거나 결실된 단클론 항체:
    Figure pct00025
  21. 서열 번호 25의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  22. 제21항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역 및 중쇄 영역은 상응하는 경쇄 면역글로불린 불변 영역 및 중쇄 면역글로불린 불변 영역과 중쇄 경첩 영역에 융합된 단리된 항체.
  23. 제21항의 항체를 함유하는 약학 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 서열 번호 25 및 서열 번호 26의 변이체를 추가로 포함하며, 그러한 변이체는 IL-13 (서열 번호 1)의 에피토프에 결합하는 능력을 보유하고, 상기 에피토프는 서열 번호 1의 10 위치의 아르기닌 및 107 위치의 아르기닌을 포함하는 단리된 항체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 에피토프는 서열 번호 1의 6 위치의 세린, 13 위치의 아이소류신, 14 위치의 글루탐산, 100 위치의 류신, 103 위치의 라이신, 106 위치의 페닐알라닌 및 108 위치의 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기를 추가로 포함하는 단리된 항체.
  26. 인간화 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3의 중쇄로부터의 3개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR) 및 인간 억셉터 항체(acceptor antibody) 중쇄로부터의 인간 프레임워크(framework) 영역을 포함하며, 인간화 경쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 경쇄로부터의 3개의 상보성 결정 영역 및 인간 억셉터 항체 경쇄로부터의 인간 프레임워크 영역을 포함하고, 인간화 항체는 STAT6 시그널링(signaling)에 의해 측정할 때 THP-1 세포 상의 IL-13 수용체에 IL-13이 결합하는 것을 감소시키는, 인간화 중쇄 가변 영역 및 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간화 재조합 항체.
  27. 제26항에 있어서, (a) 야생형 IL-13 유도 Stat-6 인산화에 의해 측정할 때 인간 재조합 야생형 인간 IL-13이 인간 IL-13 수용체 알파 1 또는 적합한 동물 IL-13 수용체에 결합하는 것의 저해, (b) 인간 재조합 야생형 인간 IL-13이 인간 IL-13 수용체 알파 2 또는 적합한 동물 IL-13 수용체에 결합하는 것의 저해, (c) 염수 처리된 ova-감작 동물과 비교할 때 항체로 처리된 쥐의 군에서 호산구, 림프구, 대식세포 및 호중구 세포의 개수의 감소, 및 (d) 비특이적 대조 에이전트(agent)와 비교할 때 화학적으로 챌린징된(challenged) 동물에서의 기도 저항의 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는 IL-13 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 사실상 조정하는 것인 항체.
  28. 제26항에 있어서, 서열 번호 3의 서열, 서열 번호 20의 서열 및 서열 번호 26의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역으로부터의 CDR을 포함하는 항체.
  29. 제26항에 있어서, 서열 번호 2의 서열, 서열 번호 9의 서열, 서열 번호 14의 서열 및 서열 번호 26의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역으로부터의 CDR을 포함하는 항체.
  30. 플라즈몬 표면 공명(plasmon surface resonance) (비아코어(Biacore))에 의해 측정할 때 250 pM (0.250 × 10-9 M) 미만의 KD로 IL-13 변이체 R110Q에 결합하며 STAT6 시그널링에 의해 측정할 때 THP-1 세포 상의 IL-13R2알파1에 IL-13이 결합하는 것을 방지하고, Arg10, Ile13, Glu14를 포함하는 나선 A로부터의 잔기 및 Lys103, Phe106, Arg107, Glu108을 포함하는 나선 D로부터의 잔기에서 인간 IL-13과 접촉하는 것으로 나타날 수 있으며, 여기서, 원자간 거리는 4.0 Å을 초과하지 않는, 인간 IL-13에 면역특이적인 항원 결합 항체 단편.
  31. 제1항의 IL-13 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  32. 제31항의 단리된 핵산을 포함하는 핵산 벡터.
  33. 제31항의 단리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  34. 제1항의 IL-13 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하는 조성물.
  35. 유효량의 제1항의 항체를 함유하는 조성물과 접촉시키거나 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 IL-13 관련 병태를 진단 또는 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, IL-13 관련 병태는 천식인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 유효량이 상기 세포, 조직, 기관 또는 동물 1 ㎏당 0.001 내지 50 ㎎인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 접촉 또는 상기 투여가 비경구, 피하, 근내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골막내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피로부터 선택되는 적어도 하나의 방식에 의한 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 상기 (a)의 접촉 또는 투여 전에, 이와 동시에 또는 그 후에, 검출가능한 표지 또는 리포터, 항감염약, 심혈관(CV)계 약물, 중추신경계(CNS) 약물, 자율신경계(ANS) 약물, 기도 약물, 위장(GI)관 약물, 호르몬 또는 호르몬-자극 약물, 체액 또는 전해질 균형을 위한 약물, 혈액 약물, 항신생물제, 면역조절 약물, 영양제 제품, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제로부터 선택되는 유효량의 적어도 하나의 화합물 또는 폴리펩티드를 함유하는 적어도 하나의 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제1항의 IL-13 항체와의 접촉을 필요로 하는 환자의 세포, 조직 또는 기관과 제1항의 IL-13 항체의 접촉을 촉진하기에 적합한 의료 장치.
  41. 패키징(packaging) 재료와, 제1항의 적어도 하나의 IL-13 항체의 용액 또는 동결건조된 형태를 포함하는 용기를 포함하는, 인간용 의약품 용도 또는 진단 용도를 위한 제조 물품.
  42. 제41항에 있어서, 상기 용기가 비경구, 피하, 근내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골막내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 전달 장치 또는 시스템의 구성요소인 제조 물품.
  43. 회수가능한 양의 제1항의 적어도 하나의 단리된 포유류 IL-13 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 트랜스제닉(transgenic) 동물 또는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 제1항의 적어도 하나의 단리된 포유류 IL-13 항체를 생성하는 방법.
  44. 제43항의 방법에 의해 생성된 IL-13 항체.
  45. 나선 A로부터의 잔기 (Arg10, Ile13, Glu14) 및 나선 D로부터의 잔기 (Lys103, Phe106, Arg107, Glu108)를 포함하는 IL-13 에피토프 또는 그의 모방 펩티드를 사용하여 숙주를 면역화하는 방법.
  46. 제1항 내지 제22항 및 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항의 항체를 함유하는 약학 조성물.
  47. IL-13 매개 장애 치료용 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제22항 및 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항의 항-IL-13 항체의 용도.
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