JP2012506695A - 改変された抗ｉｌ−１３抗体、組成物、方法、及び使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）タンパク質又はその断片に対して免疫特異的である改変抗体、並びに、治療指示を含むその製造及び使用方法に関する。

Description

（関連出願）
本出願は、参照することにより本明細書に援用される２００８年９月１６日出願の米国出願第６１／０９７，２３２号、及び２００８年８月２０日出願の米国
出願第６１／０９０，４７２号に対する優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明は、ヒトインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）タンパク質又はその断片に対して免疫特異的である改変抗体、並びに治療指標（therapeutic indications）を含むその作製及び使用方法に関する。

ＩＬ−１３は、ＩＬ−４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ−２、及びマクロファージコロニー刺激因子を含む成長ホルモン様サイトカインのファミリーに属する、４つのα−へリックスを含む球状タンパク質である。ＩＬ−１３は、５２ｋＤａのサブユニットであるＩＬ−１３Ｒα１と１４０ｋＤａのサブユニットであるｐ１４０とで構成されるヘテロ二量体受容体に結合し、ＳＴＡＴ６を活性化させる。第２のＩＬ−１３受容体であるＲａ２も、存在することが知られている。Ｒａ１受容体は、ＩＬ−１３と結合した際、シグナル伝達カスケードの開始に関与する。Ｒａ２受容体は、Ｒａ１よりも高い親和性でＩＬ−１３と結合するが、その機能は未だ決定されていない。

喘息反応を経験する患者は、気道の炎症を引き起こす活性化ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球が増加している。活性化Ｔｈ２リンパ球は、気道の過敏性に関連する組織の損傷を引き起こす炎症を刺激するサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３）を分泌する。ＩＬ−１３は、マウスモデルにおいて喘息の主な要因であることが示されており、ヒトＩＬ−１３の一塩基多型変異体であるＲ１３０Ｑ（Ｇｒａｖｅｓ，等、２０００ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０５：５０６〜１３）は、喘息発現の重要な危険因子であることが示されている（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ等、２０００ Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：５４９〜５５９；Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．；Ｈｏｗａｒｄ等、２００１ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：３７７〜３８４；国際公開第０１２３４１０号）。マウスモデルにおいて、抗ＩＬ−１３中和Ｍａｂで処理すると、刺激された動物の喘息反応が阻害された。したがって、中和ＩＬ−１３は、患者の喘息及び気道狭窄の治療において有用であり得るという証拠が示された。

したがって、ＩＬ−１３介在疾患を軽減又は除去する治療に使用するためのヒトＩＬ−１３に対して特異的なヒト抗体を提供し、また既知の抗体又はその断片に対する改良を行う必要がある。

本明細書に記載及び請求される主題は、喘息、及び肺線維症、心血管病変、癌、皮膚病変、及び線維病変等が挙げられるが、これらに限定されない、ＩＬ−１３に関連する病態又は病状に苦しんでいる被験体を治療するのに有用である抗ＩＬ−１３抗体、及び組成物に関する。本発明は、ヒトＩＬ−１３受容体アルファ１に結合するヒトＩＬ−１３の野生型又は自然変異体の阻害、ヒトＩＬ−１３受容体アルファ２に結合するヒトＩＬ−１３の野生型又は自然変異体の阻害、ヒト腫瘍細胞のヒトＩＬ−１３依存性増殖の阻止又は抑制、ヒトＩＬ−１３依存性ＩｇＥ産生の阻害、組織の好酸球浸潤の低減が挙げられるが、これらに限定されない、インビトロ、インビボ、又はインサイチュにおけるＩＬ−１３の生物活性を遮断することができる抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体であって、ヒトＩＬ−１３上に特異的結合部位を有する抗体を提供する。宿主細胞において発現するための核酸をコードされ得る例示的な抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体のアミノ酸配列が提供される。

選択された結合断片から構築される結合ドメインを有する抗体又は抗体断片、並びに配列番号２７及び２８に記載のアミノ酸配列を含む指定の変異体が、本発明の範囲内に含まれる。本発明は、指定の組成物、及び配列番号２〜２９から選択される免疫グロブリンの可変ドメインにおける抗原結合に関与する残基を含むかかる組成物の調製に関する教示を提供する。これら結合ドメインは、所望の特性を有し、且つ特定のＩＬ−１３関連病態の治療に必要な生物活性を調節できる。１つの態様では、本発明は、配列番号２８に記載の重鎖可変領域、及び式（Ｉ）に係る軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む単離抗体である：
Ｑ−Ｑ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｐ−Ｙ−Ｔ（配列番号２９）（Ｉ）
（式中、Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、又はＰｒｏであってもよく；
Ｘａａ_２は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、又はＶａｌであってもよく；
Ｘａａ_３は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｙｐ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであってもよく、又は存在しなくてもよく；及び
Ｘａａ_４は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕであってもよく、又は存在しなくてもよい）。

特定の実施形態では、当該抗体は、配列番号２５及び２６に記載の結合ドメインを含む。

別の態様では、本発明は、配列番号２５及び２６を含む改変抗ＩＬ−１３抗体Ｍ１２９５、並びにＣ８６３と命名されたマウス−ヒトキメラ抗体（配列番号２及び３を含む）の結合により規定される、ヒト野生型ＩＬ−１３（配列番号１）上の共通エピトープに結合する抗体に関する。これらの抗体により認識されるエピトープとしては、ＩＬ−１３の８残基、へリックスＡの３残基（Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４）、及びへリックスＤの５残基（Ｌｅｕ１００、Ｌｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８）が挙げられ、この場合原子間距離は４．０Åを超えない。接触数に基づくと、Ａｒｇ１０及びＡｒｇ１０７がエピトープの重要な残基であると思われる。

更なる実施形態では、ワクチンの成分として抗原エピトープが提供される。配列番号１の１０、１３、１４、１００、１０３、及び１０６〜１０８残基を含む上記エピトープは、本発明の抗体により認識され、宿主を能動免疫してＩＬ−１３に対する抗体産生を誘発するのに有用である。産生される抗体は、ＩＬ−１３生物活性に関連する病態を治療又は予防することができる。

別の実施形態は、治療的に又は予防的に有効な量の本発明の抗体又は抗体の組み合わせを、かかる治療を必要としている被験体に投与することによる、ＩＬ−１３生物活性に関連する病態の治療又は予防に関する。１つの態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、喘息であると診断された患者に投与される。別の態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、アトピー性皮膚炎であると診断された患者に投与される。

本発明は、１つの態様では、本明細書に記載される抗ＩＬ−１３抗体の配列、ドメイン、一部、又は変異体をコードする単離核酸分子を提供する。更に、抗ＩＬ−１３抗体をコードする核酸配列にハイブリダイズする又は前記配列に相補的である核酸配列が意図される。本発明は更に、前記抗ＩＬ−１３抗体核酸分子を含む組換えベクター、かかる核酸及び／又は組換えベクターを含有する宿主細胞、並びにかかる抗体核酸、ベクター及び／又は宿主細胞の作製及び／又は使用方法をも提供する。本発明はまた、製薬上許容できる組成物として、好適な担体溶液又は剤を含む組成物中の、患者に投与することができる本ＩＬ−１３結合抗体のコード配列、ドメイン、一部、又は変異体を提供する。

本発明はまた、治療的に又は予防的に有効な量の抗体を投与することによる、ＩＬ−１３生物活性に関連する病態の治療又は予防に用いるための、本明細書に記載される抗体の生成、精製、及び包装方法に関する。本発明はまた、抗ＩＬ−１３抗体が検出可能且つ回収可能な量で発現する条件下で、本明細書に記載される宿主細胞を培養する工程を含む、宿主細胞中で抗ＩＬ−１３抗体を発現させる方法を提供する。

要約すると、本明細書に開示及び請求される主題は、以下の通りである。

ＩＬ−１３（配列番号１）のエピトープに結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、前記エピトープが、配列番号１の１０の位置のアルギニン及び１０７の位置のアルギニンを含み、且つ、配列番号１の６の位置のセリン、１３の位置のイソロイシン、１４の位置のグルタミン酸、１００の位置のロイシン、１０３の位置のリジン、１０６の位置のフェニルアラニン、及び１０８の位置のグルタミン酸からなる群から選択される残基を更に含んでもよい、前記単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
軽鎖可変領域を含むパラトープを含み、更にａ）配列番号１の１０の位置のアルギニンでＩＬ−１３と相互作用し、且つｂ）配列番号１の１４の位置のグルタミン酸と結合を形成するチロシン残基を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。前記パラトープは、前記軽鎖可変領域にヒスチジン残基及びアスパラギン残基を更に含んでもよく、またチロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、バリン、及びアルギニンからなる群から選択されるパラトープ接触残基を含む重鎖可変領域を更に含んでもよい。パラトープの軽鎖可変領域は、配列番号２を含んでもよく、前記チロシンは、配列番号２の３２の位置に存在し、前記重鎖可変領域は、配列番号３を含み、前記接触残基は、３２の位置にチロシン、５４の位置にトリプトファン、及び１０４の位置にチロシンを含む；
軽鎖可変領域を含むパラトープを含み、更にａ）配列番号１の１０の位置のアルギニンでＩＬ−１３と相互作用し、且つｂ）配列番号１の６の位置のセリンと結合を形成するアスパラギン酸残基を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、前記パラトープが、前記軽鎖可変領域上にチロシン残基及びヒスチジン残基を更に含む、前記単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。前記パラトープは、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、バリン、及びアルギニンからなる群から選択されるパラトープ接触残基を含む重鎖可変領域を更に含んでもよい。パラトープの軽鎖可変領域は、配列番号２５を含んでもよく、前記アスパラギン酸は、配列番号２５の９２の位置に存在し、前記重鎖可変領域は、配列番号２６を含み、前記接触残基は、３２の位置にチロシン、５４の位置にトリプトファン、及び１０４の位置にチロシンを含んでもよい；
Ｃ８６３、ＨＦＡＬ６２、及びＭ１２９５からなる群から選択されるモノクローナル抗体と、ＩＬ−１３のエピトープへの結合を競合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。前記モノクローナル抗体は、配列番号２９に記載の軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含み、配列番号２９に記載のＬ−ＣＤＲ３は、式（Ｉ）に示すように更に定義される：
式（Ｉ）−−Ｑ−Ｑ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｐ−Ｙ−Ｔ（配列番号２９）（式中、Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、又はＰｒｏであってもよく；Ｘａａ_２は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、又はＶａｌであってもよく；Ｘａａ_３は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｙｐ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであってもよく、又は存在しなくてもよく；及びＸａａ_４は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕであってもよく、又は存在しなくてもよい）。モノクローナル抗体は、配列番号２８に記載の重鎖可変領域及び／又は配列番号２７に記載の軽鎖可変領域を含んでもよい；
配列番号９に記載の可変軽鎖及びその変異体、並びに配列番号２０に記載の可変重鎖及びその変異体を含む単離モノクローナル抗体。配列番号９に記載の可変軽鎖の変異体は、９１の位置のヒスチジン、９２の位置のアスパラギン、９３の位置グルタミン酸、及び９４の位置のチロシンからなる群から選択される残基に変化を含む。前記残基は、出願時の出願の請求項１８の表に反映されているように、変化してもよく、又は欠失してもよい。配列番号２０に記載の可変重鎖の変異体は、３１の位置のスレオニン、３４の位置のメチオニン、１００の位置のメチオニン、及び１０６の位置のバリンからなる群から選択される残基に変化を含む。前記残基は、出願時の出願の請求項２０の表に反映されているように、変化又は欠失する；
配列番号２５に記載の軽鎖可変領域及び配列番号２６に記載の重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。前記抗体は、対応する軽鎖及び重鎖免疫グロブリン定常領域、並びに重鎖ヒンジ領域を更に含む。前記抗体、及び本明細書に記載される任意の他の抗体は、医薬組成物に調製され得る。前記単離抗体は、配列番号２５及び２６に記載の配列変異体を含んでもよく、かかる変異体は、ＩＬ−１３（配列番号１）のエピトープに結合する能力を保持し、前記エピトープは、配列番号１の１０の位置にアルギニン及び１０７の位置にアルギニンを含み、前記エピトープは、配列番号１の６の位置のセリン、１３の位置のイソロイシン、１４の位置のグルタミン酸、１００の位置のロイシン、１０３の位置のリジン、１０６の位置のフェニルアラニン、及び１０８の位置のグルタミン酸からなる群から選択される残基を更に含んでもよい；
ヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域を含む単離ヒト化組換え抗体であって、前記ヒト化重鎖可変領域が、配列番号３の重鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト受容器抗体（acceptor antibody）重鎖のヒトフレームワーク領域を含み、前記ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号２の軽鎖の３つの相補性決定領域及びヒト受容器抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域を含み；前記ヒト化抗体が、ＳＴＡＴ６シグナル伝達により測定したとき、ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１３のＩＬ−１３受容体への結合を低減する、前記単離ヒト化組換え抗体。前記抗体は、（ａ）野生型ＩＬ−１３誘導性Ｓｔａｔ−６リン酸化により測定したとき、ヒトＩＬ−１３受容体アルファ１又は好適な動物のＩＬ−１３受容体に対するヒト組換え野生型ヒトＩＬ−１３の結合を阻害する、（ｂ）ヒトＩＬ−１３受容体アルファ２又は好適な動物のＩＬ−１３受容体に対するヒト組換え野生型ヒトＩＬ−１３の結合を阻害する、（ｃ）生理食塩水処理されたオボアルブミンン感作（ova-sensitized）動物に比べて、抗体で処理されたラット群の好酸球、リンパ球、マクロファージ、及び好中球細胞数を減少させる、及び（ｄ）非特異的対照剤と比べて、化学的にアレルギー誘発された（challenged）動物における気道抵抗性を低下させる、からなる群から選択されるＩＬ−１３ポリペプチドの活性を実質的に調節する。前記抗体は、配列番号３、２０、及び２６からなる群から選択される重鎖可変領域、並びに配列番号２、９、１４、及び２６からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲを含んでもよい；
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）により測定したとき、２５０ｐＭ（０．２５０×１０^−９Ｍ）未満のＫ_Ｄを有するＩＬ−１３変異体Ｒ１１０Ｑに結合し、且つＳＴＡＴ６シグナル伝達により測定したとき、ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒ２アルファ１への結合を阻止する、ヒトＩＬ−１３に免疫特異的な抗原結合抗体断片であって、前記抗体が、Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４を含むへリックスＡの残基、及びＬｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８を含むへリックスＤの残基において、ヒトＩＬ−１３と接触することを示され得、この場合の原子間距離が４．０Åを超えない、前記抗原結合抗体断片；
請求項１に記載のＩＬ−１３抗体又は本明細書に開示及び請求される抗体のいずれかをコードする単離核酸、並びにかかる核酸を含むベクター、宿主細胞；
請求項１に記載のＩＬ−１３抗体又は本明細書に記載される任意の他の抗体を含む医薬組成物を含む組成物；
有効量（０．００１〜５０ｍｇ／キログラム）の本明細書に記載される抗体を含む組成物を接触させる又は投与する工程を含む、細胞、組織、器官、又は動物において、喘息を含むＩＬ−１３関連病状を診断又は治療する方法；
へリックスＡ（Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４）の残基、及びへリックスＤ（Ｌｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８）の残基を含むＩＬ−１３エピトープ、又はその模倣ペプチドを用いる宿主の免疫方法；並びに
ＩＬ−１３介在疾患を治療する薬剤を製造するための、出願時の請求項１〜２２及び２４〜３０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物、並びに出願時の請求項１〜２２及び２４〜３０のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−１３抗体の使用。

軽鎖（上方のアラインメント）及び重鎖（下方のアラインメント）について、移植されたマウスＣ８３６のＣＤＲ（枠内）をヒトに適応させるために用いられるヒトフレームワークライブラリから選択されるＶ領域のアラインメント。 Ｌ−ＣＤＲ３変異体（特定の）が重鎖変異体２Ｃ０２と対になり、ビオチン化ＩＬ−１３−ＷＴが５００ｐｇ／ｍＬで用いられた、Ｃ８６３のヒト化変異体を用いて生成された幾つかの高親和性ｍＡｂに対するＩＬ−１３Ｒ−アルファ２競合結合アッセイから得られたデータ。 好ましい抗体の構造を規定するための異なる番号付与スキームを反映した表。

詳細な説明
略語
ＣＤＲ＝相補性決定領域；ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着アッセイ；Ｆａｂ＝抗原結合断片；Ｈｃ＝抗体の重鎖；ＨＦＡ＝ヒトフレームワーク適応；ＨＶ：超可変領域；ＩＬ−１３変異体ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ（シグナルペプチドのメチオニン＃１から番号付け）又はＩＬ−１３ Ｒ１１０Ｑの成熟鎖；Ｌｃ＝抗体の軽鎖；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；Ｒａ１又はＲアルファ１＝ヒトＩＬ−１３受容体アルファ１；Ｒａ２又はＲアルファ２＝ヒトＩＬ−１３受容体アルファ２；ＳＤＲＵ特異性決定残基の使用；ＴＢＳＴ Ｔｗｅｅｎを含むトリス緩衝生理食塩水。

定義
抗体の「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部分」という用語は、本明細書で使用するとき、抗原（例えば、ＩＬ−１３）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを有する一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋（１又は複数）により結合している２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；抗体の単腕のＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片；ＶＨドメインから成るドメイン抗体又はｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６）；並びに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、特に、ＣＤＲ３（例えば、参照することにより本明細書に全文が援用される国際公開第０３／０２５０１９号を参照）が挙げられる。

抗原結合領域は、種々の用語を用いて定義される。用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、配列の可変性に基づいている（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０，１９７０）。６つのＣＤＲが存在し、３つは可変重鎖、即ちＶＨに存在し、典型的には、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、及びＨ−ＣＤＲ３と呼ばれ、３つのＣＤＲは可変軽鎖、即ちＶＬに存在し、典型的には、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、及びＬ−ＣＤＲ３と呼ばれる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋにより定義されたように構造が可変性である抗体可変ドメインの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）。６つのＨＶＲが存在し、３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に、３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に存在する。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保存されているＨＶを「カノニカル構造」と呼ぶ。抗原結合部位を形成する領域を説明する別の方法は、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃ等，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７：５５〜７７，２００３）により提案されており、これは免疫グロブリンのＶドメインとＴ細胞受容体との比較に基づいている（Ｌｅｆｒａｎｃ等，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７：５５〜７７，２００３）。抗原結合部位はまた、Ａｌｍａｇｒｏによれば「特異性決定残基の使用（ＳＤＲＵ）」に基づいて説明され得（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜４３，２００４）、ここでＳＤＲＵとは、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。記載され、請求される例示的抗体の結合領域の様々な定義間の対応を図３に表す。本明細書では、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け及び挿入欠失規則を用いた（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７）及びＣＤＲｓ、即ちＣＤＲ領域は、抗原結合に対するこれら残基の寄与又は潜在的寄与を考慮したＶＨ又はＶＬの直鎖状配列内の特定の位置として定義される。

更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、異なる遺伝子にコードされているが、それらは、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成している単一タンパク質鎖として（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９〜５８８３を参照）前記ＶＬ及びＶＨを作製することができる合成リンカーにより、組換え技術を用いて接合させることができる。かかる単鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来技術を用いて得られ、前記断片は、インタクトな抗体と同じ方法で利用のためにスクリーニングされる。

本明細書で使用するとき、「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離抗体は、ＩＬ−１３以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離抗体は、他の種のＩＬ−１３分子等の他の抗原に対して交差反応する場合がある。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合もある。

用語「モノクローナル抗体」、「Ｍａｂ」、又は「モノクローナル抗体組成物」は、一般的に、抗体が１種の抗体のみを分泌することができるハイブリドーマの産生物である、又は抗体がトランスフェクトーマにより産生される、又は抗体がハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、若しくはコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから組換え方法により作製及び単離される抗体である、又は抗体がヒト免疫グロブリン遺伝子、配列の全て又は一部の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製、又は単離されるような、抗体又は抗体の組成物であると理解される。

用語「ヒト化抗体」、「改変抗体（engineered antibody）」、「ヒトフレームワーク適応」、及び「ＨＦＡ」は、本明細書で使用するとき、ヒト起源の配列に由来する可変領域フレームワークを有する抗体を含むと意図される。更に、抗体が定常領域を含む場合、定常領域は、典型的には、ヒト配列、例えばヒト生殖系配列又はヒト生殖系配列の自然発生（naturally occurring）（例えば、アロタイプ）若しくは突然変異バージョン等に由来する。本発明のヒト化抗体は、ヒト配列にコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダム若しくは部位特異的突然変異誘発により、又はインビボにおける体細胞突然変異により導入された突然変異）を含んでもよい。

用語「インターロイキン−１３」又は「ＩＬ−１３」は、文脈的に他のことを指示している場合を除いて、配列番号１に示す成熟鎖により表されるヒトＩＬ−１３である。本発明は、ヒトＩＬ−１３上のアミノ酸残基に結合する抗体、特にヒト又はヒト化抗体であって、但し、これら残基がＩＬ−１３分子内に三次元エピトープを提示する抗体を提供し、本発明のモノクローナル抗体は、カニクイザル及びアカゲザルのＩＬ−１３又は他の種由来の他のＩＬ−１３ホモログを含む、非ヒト霊長類のＩＬ−１３と交差反応すると予測することができる。本発明の実施形態に係る抗体は、アミノ酸の１３０の位置のアルギニン残基がグルタミンにより置換されているＩＬ−１３の変異体に結合する。

本明細書において使用するとき、抗体の「高親和性」という用語は、１０^−８Ｍ以下、より好ましくは１０^−９Ｍ以下、更に好ましくは１０^−１０Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。本明細書で使用されるとき、用語「Ｋ_ｄｉｓ」又は「Ｋ_Ｄ」又は「Ｋ_ｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味すると意図する。「Ｋ_Ｄ」は、「オフ速度（（ｋ_ｏｆｆ）」又は「ｋ_ｄ」とも呼ばれる解離速度（ｋ_２）と、結合速度の速度（ｋ_１）、即ち「オン速度（ｋ_ｏｎ）」又は「ｋ_ａ」との比である。したがって、Ｋ_Ｄはｋ２／ｋ１又はｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ又はｋ_ｄ／ｋ_ａに等しく、モル濃度（Ｍ）として表わされる。結果として、Ｋ_Ｄが小さくなるほど、結合は強くなる。したがって、１０^−６Ｍ（又は１μＭ）のＫ_Ｄは、１０^−９Ｍ（又は１ｎＭ）に比べて弱い結合を表わす。

本明細書で使用するとき、「特異的結合」又は「免疫特異的結合」又は「免疫特異的に結合する」とは、所定の抗原への抗体の結合を指す。典型的には、抗体は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が１０^−７Ｍ以下で結合し、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又は別の非特異的ポリペプチド）に結合するＫ_Ｄに比べ、少なくとも２分の１のＫ_Ｄで、既定の抗原に結合する。語句「ＩＬ−１３を認識する抗体」及び「ＩＬ−１３に特異的な抗体」は、本明細書においては、「ＩＬ−１３に免疫特異的に結合する抗体」という用語と互換的に用いられる。

抗体−特性
本明細書に開示及び請求される主題は、ＩＬ−１３に結合し、好ましくは、インビボ、インビトロ、及び／又はインサイチュにおけるＩＬ−１３の活性又は結合に干渉する改変抗ＩＬ−１３抗体に関する。好ましい抗ＩＬ−１３抗体、その特定の部分、又は変異体はまた、ＩＬ−１３受容体のシグナル伝達、ＩＬ−１３受容体の上方又は下方制御、受容体のシグナル伝達、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはタンパク質合成、ＩｇＥを含むタンパク質放出、及び主要組織適合性複合体クラスＩＩ及びＣＤ２３の誘導に関連するＩＬ−１３活性等が挙げられるが、これらに限定されないＩＬ−１３活性又は機能を調節することができる。

改変抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む抗体の任意のクラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のサブクラス（アイソタイプ）を含んでもよい。改変抗体が細胞毒性を示すことが望ましいとき、定常ドメインは、通常、補体結合性定常ドメインであり、クラスは、典型的にはＩｇＧ_１である。かかる細胞毒性が望ましくないとき、定常ドメインは、ＩｇＧ_２クラスであってもよい。改変抗体は、２種以上のクラス又はアイソタイプの配列を含んでもよい。

所望により定常領域に結合している、改変軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸は、発現ベクターに挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドを確実に発現させる発現ベクター（１又は複数）における制御配列に機能的に連結される。かかる制御配列としては、シグナル配列、プロモータ、エンハンサ、及び転写終結配列が挙げられる（Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９（１９８９）；国際公開第９０／０７８６１号；Ｃｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１１４９（１９９２）を参照、これらは全ての目的のために、参照することにより本明細書に全文が援用される）。遺伝暗号が重複しているために、免疫グロブリン鎖、そのサブドメイン、又は断片をコードするＤＮＡセグメントは、自然発生したヒト核酸配列、かかる配列にハイブリダイズ可能な配列、又は前記抗体のアミノ酸配列をコードする全て人工的に作製された配列の部分から選択される多様な組成であってもよい。

本発明のヒトモノクローナル抗体は、例えば標準的なＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１３に対する結合について試験することができる。

１つの態様では、本発明の抗体は、インビトロ、インビボ、又はインサイチュにおけるＩＬ−１３介在生物活性を調節（好ましくは阻害）する、ＩＬ−１３特異的抗体、又はそのＩＬ−１３結合断片、その特定の部分、又は変異体を含み、以下の基準のうちの１つ以上を示す：
１．固相アッセイにおいて、ヒト野生型組換え又は精製ＩＬ−１３（配列番号１）、及び自然発生したＩＬ−１３変異体Ｑ１１０、又はその断片に結合する；
２．（表面プラズモン共鳴により測定したとき）０．２５ｎＭ未満の、ヒトＩＬ−１３野生型又は特異的変異体に対する見かけのＫ_ｄを有する；
３．ＩＬ−１３Ｒａ１特異的シグナル伝達事象である、野生型ＩＬ−１３誘導性Ｓｔａｔ−６リン酸化により測定したとき、ヒトＩＬ−１３受容体アルファ１又は非ヒト動物ＩＬ−１３受容体に対するヒト組換え野生型ヒトＩＬ−１３の結合を阻害する；
４．ヒトＩＬ−１３受容体アルファ２又は好適な非ヒト動物ＩＬ−１３受容体に対するヒト組換え野生型ヒトＩＬ−１３の結合を阻害する；
５．へリックスＡ（Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４）の残基、及びへリックスＤ（Ｌｅｕ１００、Ｌｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８）の５残基でＩＬ−１３と接触し、この場合の原子間距離は４．０Åを超えない。

６．ｐＨ ７．４においてＰＢＳに対して少なくとも１０〜１００ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、又は８０ｍｇ／ｍＬ等の溶解度を有する；
７．抗体が存在しない場合のある濃度のＩＬ−１３の存在下における増殖に比べて、ヒト腫瘍ＴＨＰ−１細胞の野生型ヒトＩＬ−１３依存性増殖の増殖を阻止又は抑制する；
８．抗体の不在下において同濃度のＩＬ−１３で刺激された新鮮（fresh）Ｂ細胞に比べて、新鮮ヒトＢ細胞標品におけるヒトＩＬ−１３野生型組換えヒトＩＬ−１３依存性インビトロＩｇＥ産生を阻害する；
９．ＩＬ−１３依存性バイオアッセイ又は固相結合アッセイで判定され得るように、組換えＩＬ−１３と同様の力価を有するネイティブ野生型ヒトＩＬ−１３に結合する。

本発明の別の態様では、結合ドメインの構造的特徴を用いて、ＩＬ−１３に対する結合等の本発明の抗体の機能的特性を保持する、構造的に関連したヒト抗ＩＬ−１３抗体を作製する。より具体的には、本明細書に開示される抗体及び変異体の１つ以上のＣＤＲ領域を、既知のヒトフレームワーク領域及びＣＤＲと組換え技術を用いて組み合わせて、本発明の更なる組換え技術により改変されたヒト抗ＩＬ−１３抗体を作製する。

例えば、上記特徴のうちの１つ以上を有するＩＬ−１３特異的抗体を作製するために用いられるアプローチの１つは、ＩＬ−１３のヒトＲ１３０Ｑ変異体（配列番号１）の成熟形で免役されたマウスから採取されたリンパ系組織のマウスハイブリドーマを作製することであった。免疫後、マウス抗ヒトＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑモノクローナル抗体が得られ、「Ｃ８３６」と命名された。重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号２及び３）のＣ８３６ ＣＤＲを、選択されたヒト重鎖及び軽鎖フレームワークにグラフトし、結合親和性を最適化した。具体的には、ヒトＩＬ−１３及び変異体ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑに対するこれらヒトフレームワーク適応（ＨＦＡ）抗体の結合親和性は、ランダム化及びファージディスプレイＦａｂライブラリからの選択又は部位特異的突然変異誘発による定方向突然変異により高まり、ヒトＩＬ−１３及び変異体ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ（「ＩＬ−１３ Ｒ１１０Ｑ」とも呼ばれる）に対して高い親和性で結合することができる重鎖及び軽鎖のパネルを生じさせる。本明細書に記載される親和性成熟した重鎖及び軽鎖の対合により、約５０ｐＭのオーダーであり得る改善されたＫ_Ｄ値、及びリン酸緩衝生理食塩水に１００ｍｇ／ｍＬを超す溶解度を有する完全抗体を構築できる。親和性成熟した抗体は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３アルファ１（Ｒα１）及びアルファ２（Ｒα２）受容体に対する結合をブロックする。抗体は、ヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類発現系で発現するとき、これらの特性を示す。

特に優れた特徴を受け入れる１つのｍＡｂは、Ｌｃ６のファージ介在成熟から得られた軽鎖（配列番号９）及びＨｃ２のＣＤＲにおける２つのメチオニンの部位特異的突然変異誘発により得られた重鎖（配列番号２０）を含む。このｍＡｂは、Ｍ１２９５と命名され、それぞれＬｃ及びＨｃ可変領域として配列番号２５及び２６を含み、対応する核酸配列によりコードされ得、また転写及び／又は翻訳に必要な成分を含む宿主細胞又は他の系で発現し得る。

本発明は、更に、ＩＬ−１３介在疾患を治療するために望ましい特性及び生物活性を有する配列番号２〜２８のいずれか１つから選択される可変ドメインを含む指定の組成物、及び組成物の調製方法を提供する。上述のように、１つの実施形態では、表２に示すように、Ｃ８３６抗体又は抗原結合断片の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲが用いられる。組換え抗体は、好ましくは、表２に示すようなＣ８３６の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域及びその変異体、及び配列番号２７〜２９の指定の領域の残基を含む。抗体は、Ｃ８３６のＣＤＲ２ドメインとその変異体を更に含み得る。更に、本発明の抗体は、Ｃ８３６のＣＤＲ１ドメインとその変異体を含み得る。本発明は、また、好ましいＣＤＲドメインと共に、（１）ヒト重鎖フレームワーク領域、及び（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域を含む抗ＩＬ−１３抗体を提供し得る。ヒトフレームワーク領域は、配列番号４〜２８のフレームワーク領域と実質的に同一である。しかし、好ましいＣＤＲ領域と組み合わせられた他のフレームワーク領域を用いて、対象の標的（例えば、ＩＬ−１３）に望ましい特性を有する抗体を得ることもできる。

更に、非限定的な例として、抗体若しくは抗原結合部分又は変異体は、配列番号１９〜２４の重鎖アミノ酸配列、及び／又は配列番号４〜１８の軽鎖アミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖の一部を含む抗原結合領域を有し得る。別の実施形態では、抗体若しくは抗原結合部分又は変異体は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖の一部を含む抗原結合領域を有し得る。かかる抗体は、組み換えＤＮＡ技術の従来技術を使用して重鎖又は軽鎖配列（１又は複数）をコードする核酸分子を調製及び発現させることによって、又は任意の他の適切な方法を使用することによって、従来技術を使用して、抗体の様々な部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク部分等）を化学的に連結させることにより調製し得る。

改変抗体のＣＤＲ１、２、及び／又は３ドメインは、本明細書に開示される特定のアミノ酸配列（１又は複数）から成り得る。更に、ＣＤＲ領域は、配列可変性に対して許容性を示し、且つ所望の結合及び生物学的特性を保持し得る。更に、別の実施形態では、改変抗体は、例えば、表２に示すように、Ｃ８３６の１つ以上のＣＤＲ、及び配列番号２〜２９の特定の位置における変異体と９０％、９５％、９８％、又は９９．５％同一であるＣＤＲを含み得る。免疫グロブリンのフレームワーク領域は、それが由来するヒト生殖系可変領域のフレームワーク領域と実質的に同一である、又は同一である。フレームワーク領域中のアミノ酸の多くは、抗体の特異性又は親和性にほとんど又は全く直接的に寄与しない。したがって、フレームワーク残基の多くの同類置換（conservative substitutions）は、得られるヒト化免疫グロブリンの特異性又は親和性を明らかに変化させることなしに、許容性を示し得る。フレームワーク領域は、免疫グロブリンの可変領域の標的（例えば、ＩＬ−１３）残基に接触する能力を保持しながら、本明細書に記載されるフレームワークの１つ以上と９０％、９５％、９８％、又は９９．５％同一であり得る。上記のように産生されたヒト化抗体の可変セグメントは、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に連結する。抗体は、軽鎖及び重鎖定常領域の両方を含む。重鎖定常領域は、通常、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、更にＣＨ４ドメインを含むことがある。

ＩＬ−１３抗体構造（又はその断片）はまた、ＩＬ−１３又はＩＬ−１３変異体と複合体を形成している改変ＩＬ−１３抗体の三次元結晶構造に従って定義することができる。ＩＬ−１３抗体のアミノ酸配列が変化している場合もあるが、それでもなお改変ＩＬ−１３抗体がＩＬ−１３エピトープに接触でき、ＩＬ−１３特異的抗体を中和する三次元結晶構造を保持する。好ましくは、抗体のフレームワーク領域は、免疫グロブリンの可変領域が、へリックスＡのＩＬ−１３の残基（Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４）及びへリックスＤの残基（Ｌｅｕ１００、Ｌｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８）に特異的に接触することが可能でありながら（この場合の原子間距離は４．０Åを超えない）、本明細書に記載されるフレームワークの１つ以上と９０％、９５％、９８％、又は９９．５％同一であり得る。

本明細書に記載されるＩＬ−１３抗体は、また、ＩＬ−１３への結合に関与するパラトープの点で定義することもできる。例えば、アミノ末端残基を「１」として番号付けした配列番号２のＬ鎖残基Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ９１、Ａｓｎ９２の軽鎖可変領域の残基、及びアミノ末端残基を「１」として番号付けした配列番号３のＨ鎖Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ５４、Ｔｒｐ５５、Ａｓｐ５６、Ｖａｌ５８、Ａｒｇ６０、Ａｓｐ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ａｓｐ１０５の９残基を含むパラトープ領域を有する抗体は、かかる改変抗体の特定の実施形態である。別の特定の実施形態は、Ｌ鎖Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ９１、Ａｓｐ９２（配列番号２５）の残基及び配列番号３のＨ鎖Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ５４、Ｔｒｐ５５、Ａｓｐ５６、Ｖａｌ５８、Ａｒｇ６０、Ａｓｐ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ａｓｐ１０５の残基を含む抗体である。

ＩＬ−１３への結合に加えて、上記のような改変抗体は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒ−アルファ１への結合を阻害する能力、及びＳＴＡＴ６を介したＩＬ−１３Ｒ−アルファ１シグナル伝達を阻止し、それによるインビボにおける細胞、組織、及び器官の関連性物活性をブロック又は低減する能力等の、本発明の抗体の他の機能的特性の保持について選択することもできる。

抗ＩＬ−１３抗体の作製及び試験方法
本発明の抗ＩＬ−１３抗体は、所望により、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術（ハイブリドーマ法）を含む種々の技術により作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター若しくはマカクザル等の他の適切な宿主動物を本明細書に記載したように免疫して、免疫に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産生し得るリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球をインビトロで免疫し、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成してもよい。

抗ＩＬ−１３抗体は、また、本明細書中に記載の及び／又は当該技術分野において既知であるヒト抗体レパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類等）の免疫により作製することもできる。ヒト抗ＩＬ−１３抗体を産生する細胞は、かかる動物から単離し、ハイブリドーマのような上記方法、又は当該技術分野において既知である他の方法等の好適な方法を用いて不死化させることができる。或いは、抗体をコードする配列は、クローニングし、好適なベクターに導入し、また本明細書に教示する方法及び当該技術分野において既知である方法により抗体の発現及び単離のために宿主細胞をトランスフェクトするために用いることができる。

生殖系構造にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を有するトランスジェニックマウスを使用することにより、正常ヒト免疫系が許容性を示すヒト自己抗原を含む種々の標的に対する高親和性完全ヒトモノクローナル抗体が単離される（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．等、米国特許第５，５６９，８２５号、同第６，３００，１２９号；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ等、米国特許第６，７１３，６１０号を参照）。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させ、内因性遺伝子によりコードされた、抗体を産生する動物の能力を除去することができる。更に、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）及びＭｅｄａｒｅｘ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）等の企業が、上記のような技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供する事業を行っている場合もある。

非ヒト起源から得られる抗体をヒト化することができる。例えば、ヒト化抗体は、従来技術を用いて（例えば、合成）化学的に接合された、又は遺伝子操作技術を用いて連続ポリペプチドとして調製された（例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡを発現させて、連続ポリペプチド鎖を産生することができる）、必須特異性を有するマウス等の非ヒト起源の免疫グロブリンに由来する部分と、ヒト起源の免疫グロブリンに由来する部分とを含み得る（例えば、キメラ免疫グロブリン）。ヒト化免疫グロブリンの別の例は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲと、ヒト起源の軽鎖及び／又は重鎖に由来するフレームワーク領域とを含む１つ以上の免疫グロブリン鎖を含むものである（例えば、フレームワークを変化させた又は変化していないＣＤＲ移植抗体）。フレームワーク適応プロセスは、国際公開第０８０５２１０８Ａ２号「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｕｓｅ Ｉｎ Ｈｕｍａｎ−Ａｄａｐｔｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」に本質的に記載されているように、ｍＡｂ Ｃ８３６と、ヒト生殖系データベース中の配列とのフレームワーク領域の類似性に基づいており、ここでフレームワークの長さは、親可変又はＶ領域の残基と一致する。全体で、１６個の軽鎖（ＬＣ）及び６個の重鎖（ＨＣ）フレームワークが、Ｃ８３６のＣＤＲと選択されたヒトフレームワークとを組み合わせることによりヒトフレームワーク適応であった。

１つの実施形態では、ヒト抗体は、ファージライブラリから選択され、この場合のファージは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含み、前記ライブラリは、例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、又はファージコートタンパク質の１つ以上に融合する対合している又はしていない抗体可変領域を示す幾つかの他の構造等のドメインに結合するヒト抗体を発現する。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該技術分野において確立されており、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、及び同第５，５７１，６９８号（Ｌａｄｎｅｒ等）；米国特許第５，４２７，９０８号、及び同第５，５８０，７１７号（Ｄｏｗｅｒ等）；米国特許第５，９６９，１０８号、及び同第６，１７２，１９７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等）；並びに米国特許第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、及び同第６，５９３，０８１号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等）を参照。

本発明の単離核酸は、当該技術分野においてよく知られているように、（ａ）組み換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はそれらの組み合わせを使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、当該技術分野において既知である方法を用いて配列決定される（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。ハイブリドーマを作製する場合、かかる細胞は、かかるＤＮＡ源として機能し得る。或いは、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリ等のコード配列及び翻訳産物が連結しているディスプレイ技術を用いると、結合剤及び核酸の選択が簡略化される。ファージ選択後、ファージから抗体をコードする領域を単離し、ヒト抗体を含む抗体全体又は任意の他の所望の抗原結合断片を作製するために用い、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主内で発現させることができる。商業的製造の場合、抗体をコードするＤＮＡを好適な宿主細胞にトランスフェクトし、安定なクローンを単離し、細胞株をマスター細胞バンクに広げる。

抗ＩＬ−１３抗体の使用方法
本発明はまた、当該技術分野において既知のように、又は本明細書に記載されているように、本発明の抗ＩＬ−１３抗体を用いて、細胞、組織、器官、動物、又は患者におけるＩＬ−１３関連疾患を調節又は治療するための方法を提供する。本発明は、線維症、新生物、代謝、免疫又は炎症関連疾患、心血管、感染、皮膚、又は神経疾患が挙げられるが、これらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者におけるＩＬ−１３関連疾患の調節又は治療方法を提供する。本明細書に開示される主題は、また、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、及び関連呼吸器疾患、並びに本明細書に記載される他のＩＬ−１３介在疾患が挙げられるが、これらに限定されない、ＩＬ−１３介在疾患の治療のための薬剤の製造における、本明細書に記載される抗ＩＬ−１３抗体の使用を含む。

インターロイキン１３（ＩＬ−１３）は、喘息、アトピー性皮膚炎、及びアレルギー性鼻炎のアトピー性三徴候を示すＩＩ型炎症反応に関連する。好酸球性食道炎（ＥＥ）、好酸球介在消化器疾患の発症機序におけるＩＬ−１３経路と関連づける証拠も出現している。更に、ＩＬ−１３は、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹患している非アトピー被験体、並びに全身性硬化症（ＳＳｃ）及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）を含む線維症患者でみられる炎症及び組織再構築の両方に関する非アトピー性疾患の病態に関連している。ＩＬ−１３を標的とする理論的根拠は、特定の疾患の部分集合におけるアトピー性及び非アトピー性反応が、ＩＬ−１３により駆動されていること、及びＩＬ−１３タンパク質の拮抗作用がかかる反応を抑止することである。

呼吸器疾患
本発明は、また、喘息、肺炎、肺膿瘍、吸気又は吸入物質により引き起こされる職業性肺疾患、並びに呼吸不全及び呼吸不全を導く病状又は原因が挙げられるが、これらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における気管支、肺、又は胸膜疾患を調節又は治療する方法を提供する。本発明は、また、機能亢進性気道疾患；閉塞性線維性細気管支炎；過敏性肺炎（外因性アレルギー性肺胞炎）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び薬物反応を含む肺の過敏性疾患；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、グッドパスチャー症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、特発性間質性肺疾患、例えば、特発性肺線維症及びサルコイドーシス；剥離性間質性肺炎；急性間質性肺炎；呼吸細気管支炎関連間質性肺疾患；気質性肺炎を伴う特発性閉塞性細気管支炎；リンパ球性間質性肺炎；ランゲルハンス細胞肉芽腫症；特発性肺ヘモジデリン沈着症；急性気管支炎；肺胞タンパク症；気管支拡張症；無気肺；嚢胞性線維症；及び肺腫瘍；並びに肺栓塞症を調節又は治療する方法を提供する。

新生物疾患
本発明はまた、白血病；急性白血病；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞性白血病；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；リンパ腫、特に非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、非悪性リンパ腫、バーキットリンパ腫；多発性骨髄腫；原発性疾患又は転移性疾患としての固形腫瘍；カポジ肉腫；直腸結腸癌；前立腺癌；精巣癌；腎細胞癌；中皮腫を含む肺癌；炎症性乳癌を含む乳癌；鼻咽腔癌；悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症；腺癌；扁平上皮細胞癌、特に頭頸部；肉腫、悪性黒色腫、特に転移性黒色腫；血管腫；転移性疾患；癌関連骨吸収；癌関連骨痛等が挙げられるが、これらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における悪性及び新生物疾患を調節又は治療するための方法を提供する。更に、本発明の抗体を用いて、下垂体、甲状腺、副腎、膵臓等の内分泌器官の一次性又は二次性腫瘍を治療し、それにより、また乳汁漏出症、低身長、巨人症及び末端肥大症、尿崩症、糖尿病、アジソン病、クッシング症候群、アルドステロン症、副腎機能障害、褐色細胞腫、酸塩基平衡異常、及びポルフィリン症等の関連疾患を改善、予防、又は回復させることができる。

免疫関連及び炎症性疾患
本発明はまた、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身発症若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ぶどう膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性脈管炎／ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、睾丸炎／精管切除逆転術、アレルギー性／アトピー疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎（湿疹）、食道炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植、器官移植拒絶反応、移植片対宿主病、全身性炎症反応症候群、敗血症症候群、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少熱、尿路性敗血症、髄膜炎球菌血症、外傷／出血、火傷、イオン化放射線曝露、急性膵炎、成人呼吸急迫症候群、関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症病状、クローン病、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、他のアトピー性疾患、過敏性反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱、多年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜炎、喘息、蕁麻疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、いずれかの器官又は組織の移植片拒絶反応、腎臓移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、膵臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、皮膚同種移植拒絶反応、軟骨移植拒絶反応、骨移植拒絶反応、小腸移植拒絶反応、胎児胸腺移植拒絶反応、副甲状腺移植拒絶反応、いずれかの器官又は組織の異種移植拒絶反応、同種移植拒絶反応、抗受容体過敏反応、グレーヴズ病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体媒介細胞毒症、ＩＩＩ型過敏反応、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器巨大症、内分泌障害、モノクローナル高ガンマグロブリン血症、及び皮膚変化症候群）、抗リン脂質症候群、天疱瘡、硬皮症、混合結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、脈管炎、ＭＩ心臓切開後症候群、ＩＶ型過敏性、接触皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植拒絶反応、細胞内器官による肉芽腫、代謝性又は特発性薬剤過敏性、ウイルソン病、血色素症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、糖尿病網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、カヘキシー、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性貧血性（hematophagocytic）リンパ組織球症、皮膚病状、乾癬、脱毛、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、中毒、子癇前症、抗ＣＤ３治療、サイトカイン治療、化学治療、放射線治療による炎症（例えば、無力症、貧血、カヘキシー等が挙げられるが、これらに限定されない）、慢性サリチル酸中毒等が挙げられるが、これらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における免疫関連疾患を調節又は治療する方法を提供する。

更に、抗ＩＬ−１３抗体、その断片又は変異体を用いて、好酸球介在炎症；好酸球介在食道炎、肺、気管支、肺胞、又は喘息関連炎症；例えば、好酸球性胃腸炎、胃又は腸の炎症等の疾患；特にＳＴＡＴ６介在シグナル伝達が、ＳＴＡＴ６介在胃腸炎及び好酸球性食道炎等において好酸球性炎症を引き起こす場合を治療することができる。

心血管疾患
本発明は、また、不整脈及び伝導障害；動脈性高血圧；動脈硬化；心臓腫瘍；心筋症；、冠動脈疾患；大動脈炎及び大動脈分枝閉塞；心内膜炎；肺浮腫；心膜炎；及び末梢、動脈、静脈及びリンパ系疾患；並びに弁障害に関連する又はこれらから生じる、細胞、組織、器官、動物、又は患者における心血管疾患を調節又は治療する方法を提供する。本発明はまた、心臓機能停止症候群、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、虚血性卒中、出血、再狭窄、糖尿病性動脈硬化性疾患（diabetic ateriosclerotic disease）、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心不全、肺性心、原発性肺性高血圧、心不整脈、灌流後症候群、心肺バイパス炎症反応、無秩序又は多源性心房頻拍、規則性狭ＱＲＳ頻脈、特殊不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、心筋貧血障害、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張性鬱血性心筋病、拘束型心筋症、大動脈及び末梢動脈瘤（aneuryisms）、大動脈解離、大動脈の炎症、閉塞性血栓血管炎、機能性末梢動脈障害、レイノー現象及び疾患、先端チアノーゼ、先端紅痛症、静脈血栓症、拡張蛇行静脈、動静脈フィステル、リンパ水腫、浮腫、不安定狭心症、アンギナ、再灌流障害、ポンプ後症候群、虚血−再灌流傷害等が挙げられるが、これらに限定されない細胞、組織、器官、動物、又は患者における心血管疾患を調節又は治療する方法を提供する。

神経系疾患
本発明はまた、脳脊髄液及びその循環；頭蓋内新生物及び腫瘍随伴症障害；神経系の感染（細菌、真菌、スピロヘータ、寄生虫、ウイルス、又はプリオン）；サルコイドーシス；脳血管疾患；頭蓋脳外傷；多発性硬化症及び同類（allied）脱髄性疾患；神経系の遺伝性及び発達障害；神経系の代謝性障害；アルコール、薬物、毒物及び他の化学物質による神経系の障害；脊髄疾患；並びに末梢神経及び筋肉疾患のうちの１つ以上の障害の原因又は続発症を含む神経系疾患を調節又は治療する方法を提供する。本発明はまた、神経変性疾患；多発性硬化症；偏頭痛；ＡＩＤＳ痴呆合併症；急性横断脊髄炎；錐体外路性及び小脳疾患（例えば、皮質脊髄系の損傷）；脳幹神経節の疾患又は小脳疾患；過剰運動性疾患（例えば、ハンチントン舞踏病及び老人性舞踏病）；薬剤誘発運動障害（例えばＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬剤により誘発される障害）；運動低下性運動障害（例えば、パーキンソン病）；進行性核上麻痺；小脳の構造損傷；脊髄小脳変性（例えば、脊髄運動失調）；フリードライヒ運動失調；小脳皮質変性；多発性全身変性（メンセル、デジェリン−トーマス、シ−ドラジェ、及びマカド−ジョゼフ）；全身性障害（レフサム病、無β−リポタンパク白血症（abetalipoprotemia）、運動失調毛細血管拡張症、及びミトコンドリア多系統性疾患）；脱髄核障害（例えば多発性硬化症）；急性横断脊髄炎；及び運動単位の障害（例えば神経原性筋肉萎縮症（前角細胞変性、例えば筋萎縮側索硬化症、乳児性脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症））；アルツハイマー病；ダウン症関連精神障害；びまん性レヴィー体疾患；レヴィー体性老年痴呆；ヴェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール依存症関連精神障害；クロイツフェルト−ヤコブ病等のプリオン性疾患；亜急性硬化性汎脳炎、ハレロルデン−スパッツ病；ボクサー痴呆等が挙げられるが、それらに限定されない細胞、組織、器官、動物、又は患者における神経系疾患を調節又は治療する方法を提供する。かかる方法は、所望により、抗ＩＬ−１３抗体又は特定部分又は変異体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、このような調節、治療又は療法を必要としている細胞、組織、器官、動物、又は患者に投与する工程を含んでもよい。

抗ＩＬ−１３抗体のその他の治療的使用
上述の症状及び疾患に加えて、本発明はまた、肝臓線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎が挙げられるが、これらに限定されない）；肺線維症（強皮症、特発性肺線維症が挙げられるが、これらに限定されない）、腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない）；皮膚線維症（強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷を含むがこれらに限定されない）；骨髄線維症；神経線維腫症；線維腫；腸線維症；並びに臓器移植又は移植を含む外科手術の結果としての線維性癒着といったような様々な病因の線維性症状を調節又は治療するための方法をも提供している。

本発明は、細胞、組織、器官、動物、又は患者において感染症を調節又は治療するための方法も提供し、急性又は慢性細菌感染、細菌、ウイルス及び真菌感染を含む急性及び慢性寄生又は感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌、溶血性尿毒症症候群、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、中毒性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、ニューモシスティス・カリニ肺炎、骨盤感染症、精巣炎／精巣上体炎（epidydimitis）、レジオネラ、ライム病、Ａ型インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群（hemaphagocytic syndrome）、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はまた、結膜炎、角膜潰瘍、円錐角膜、角膜実質炎、辺縁潰瘍性角膜炎、フリクテン性結膜炎、表在点状角膜炎、眼瞼炎、ブドウ膜炎、及び加齢性黄斑変性症が挙げられるが、これらに限定されない炎症、感染、又は線維性若しくは狭窄症症状に起因する眼の疾患を調節又は治療する方法を提供する。

抗ＩＬ−１３抗体の投与、抗ＩＬ−１３抗体を含む組成物、及びキット
本発明の単離モノクローナル抗体は、ＩＬ−１３のエピトープに結合し、インビトロ及び／又はインビボでＩＬ−１３阻害活性を示すが、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒ１アルファ及びＩＬ−１３Ｒ２アルファ受容体への結合を阻害することができる抗体又は抗原結合断片は、ヒト及び動物におけるＩＬ−１３関連病状を治療又は予防するための治療剤及び予防剤として好適である。

一般に、使用は、治療的に又は予防的に有効な量の、本発明の１つ以上のモノクローナル抗体又は抗原結合断片を、ＩＬ−１３活性が腫瘍成長、及び転移、又は強制呼気体積（ＦＥＶ）の低下等の喘息症状等の病的続発症を有することが知られている病状を呈している又はこれら病状にかかりやすい被験体に投与することを含む。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を含む、抗体の任意の活性型を投与することができる。

好ましくは、用いられる抗体は、ＭＡｂに対する免疫反応が、許容できないほど短い循環半減期を生じさせない、又は被験体において免疫反応を誘導するように、レシピエント種と適合する。好ましくは、投与されるＭＡｂは、被験体のＦｃ受容体への結合、及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機序の活性化等、幾つかの二次的機能を示す。

個体の治療は、治療的に有効な量の本発明の抗体を投与することを含み得る。抗体は、以下に記載のようなキットで提供されてもよい。抗体は、単独で又は別の治療薬、鎮痛剤、若しくは診断薬と混合して投与または用いることができる。ＩＬ−１３に結合できる抗体若しくはその断片、又はＩＬ−１３からレシピエント患者を保護することができる抗体を患者へ提供するときは、投与される剤の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、総合的な医学的状態、過去の病歴等の要因によって変動する。

好適な媒体並びにその製剤及び包装については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ ｓｔ ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ ４０ ａｎｄ ４１）に記載されている。更なる薬学的方法を使用して、作用の持続時間を制御することもできる。制御放出製剤は、化合物を複合体化する又は吸収するポリマーの使用を通して達成され得る。制御放出製剤により作用の持続時間を制御するための別の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、又はエチレン酢酸ビニルコポリマー等のポリマー物質の粒子に、本発明の化合物を組み込むことである。或いは、これらの剤をポリマー物質に組み込む代わりに、例えば、界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）−マイクロカプセル、又はコロイド状薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル、又はマクロエマルションに、これら物質を封入することも可能である。

一般的に、抗体の全身投与量を投与する場合、約１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（レシピエントの体重）の範囲の投与量の抗体をレシピエントに提供することが望ましいが、より少ない又はより多い投与量を投与してもよい。約１．０ｍｇ／ｋｇもの低投与量でも、一部の効果を示すことが予測される場合もある。好ましくは、約５ｍｇ／ｋｇが許容可能な投与量であるが、特に治療的使用では、最高約５０ｍｇ／ｋｇの投与量レベルも好ましい。或いは、１μｇ〜１００μｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、又は１ｇｍ〜１００ｇｍの範囲の量等、患者の体重を基準としない特定の量の抗体を投与してもよい。例えば、関節内（intrarticular）、気管支内、腹腔内、関節包内（intracapsular）、軟骨内（intracartilaginous）、洞内（intracavitary）、腔内（intracelial）、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（intraperitoneal）、胸膜内、前立腺内、肺臓内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、バッカル、舌下、鼻腔内、又は経皮手段等の身体部分又は腔に対して部位特異的投与を行ってもよい。

特に液体溶液又は懸濁液の形で非経口（皮下、筋肉、又は静脈内）又はその他のあらゆる投与に使用するため；特にクリーム及び座薬等が挙げられるが、これらに限定されない半固体形態で膣内又は直腸内投与で使用するため；錠剤又はカプセル等が挙げられるが、これらに限定されない形で、バッカル又は舌下投与のため；粉末、点鼻薬、若しくはエアロゾル、又は特定の薬剤等が挙げられるが、これらに限定されない形で経鼻的に；又は皮膚構造を修飾するか若しくは経皮パッチ内の薬物濃度を増大させるため化学的エンハンサを用いる、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布を可能にする剤（国際公開第９８／５３８４７号）又は電気穿孔等の一過的輸送経路を作り出すため若しくはイオントフォレシス等の皮膚を通して荷電薬物の移動性を増大させるための電界の印加、又はソノフォレシス等の超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号）を用いる、ゲル、軟膏、ローション、懸濁液又はパッチ送達系等が挙げられるが、これらに限定されない形で経皮的に投与するために、抗ＩＬ−１３抗体組成物を調製することができる（上述の刊行物及び特許は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。

類似のアプローチでは、本発明のモノクローナル抗体の別の治療的使用は、本モノクローナル抗体の１つに対して増加する抗イディオタイプ抗体を用いる患者の能動免疫である。エピトープの構造に類似する抗イディオタイプによる免疫は、能動的抗ＩＬ−１３反応を誘発し得る。

同様に、能動免疫は、ワクチンの成分として、１つ以上の抗原性及び／又は免疫原性エピトープを投与することにより誘導され得る。ワクチン接種は、予防的に又は治療的に、レシピエントがこの生物学的機能領域に対して保護抗体を生成できるのに十分な量を経口又は非経口的に投与することにより実施し得る。宿主は、純粋なペプチド断片、又は改変されたペプチドの抗原性／免疫原性ペプチドで能動免疫され得る。元来のタンパク質配列に対応していない１つ以上のアミノ酸を、元来のペプチド又は切頭型のペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に添加してもよい。かかる追加のアミノ酸は、ペプチドを別のペプチド、大きな担体タンパク質、又は支持体に結合させるのに有用である。これらの目的に有用なアミノ酸としては、チロシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、及びこれらの誘導体が挙げられる。別のタンパク質改変技術は、例えば、ＮＨ２−アセチル化又はＣＯＯＨ−末端アミド化を用いて、別のタンパク質又はペプチド分子又は支持体に、ペプチドを結合又は融合させる更なる手段を提供することもできる。免疫原性エピトープの実施形態は、ＩＬ−１３のへリックスＡの残基（Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４）、及びへリックスＤの残基（Ｌｅｕ１００、Ｌｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８）を包含するものである。抗原エピトープを含むペプチド又はタンパク質の特定の実施形態では、ペプチドは、Ｘ線結晶解析により示されているように、ＩＬ−１３又は変異体のＡｒｇ１０とＡｒｇ１０７との空間的結合に類似するミミトープを示す。

ＩＬ−１３の生物活性から保護することができる本発明の抗体は、ＩＬ−１３関連症状又は病態を減少、消散、又は寛解させるのに十分な量を被験体に付与することを意図する。剤の投与量、投与経路、及び投与スケジュールが、かかる反応を引き起こすのに十分である場合、その量は、症状を減少「させる」のに十分である又は「治療的に有効な量」であると言われる。抗体投与に対する反応は、被験体の罹患組織、器官、又は細胞を分析することにより、又は画像化技術により、又は組織サンプルのエクスビボ分析により、測定され得る。剤の存在が、レシピエント患者の生理に検出可能な変化をもたらす場合、その剤は生理学的に重要である。

本発明の抗体は、これら物質、又はその機能的誘導体が、製薬上許容できる担体媒体と混合により組み合わせられる、製薬上有用な組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化され得る。治療は、単回投与スケジュール、又は好ましくは、治療の一次過程が、１〜１０回別個に投与され、次いで反応を維持又は強化するのに必要な時間間隔で他の投与量を投与し（例えば第２の投与量を１〜４ヶ月間投与）、そして必要に応じて数ヶ月後次の投与（１又は複数）を行う、複数回投与スケジュールで行われ得る。好適な治療スケジュールの例としては、（ｉ）０、１ヶ月及び６ヶ月、（ｉｉ）０、７日、及び１ヶ月、（ｉｉｉ）０及び１ヶ月、（ｉｖ）０及び６ヶ月、又は疾患症状を低減する、又は疾患の重篤度を低下させると予測される所望の反応を誘発するのに十分な他のスケジュールが挙げられる。

本発明はまた、本発明を実施するために有用なキットを提供する。本キットは、上記抗体を収容する、又は上記抗体に関連してパッケージ化される第１の容器を含む。キットはまた、本発明を実施するために必要な又は便利な関連溶液を収容する、又はそれをパッケージ化する別の容器を含んでもよい。容器は、ガラス、プラスチック、又は箔で作製し得、またバイアル瓶、瓶、パウチ、管、袋等であり得る。キットはまた、本発明を実施する手順、第１の容器手段に収容されている試薬の量等の分析情報等の書面情報を含んでもよい。容器は、例えば、書面情報を伴う箱又は袋等の別の容器装置に入れられていてもよい。

本発明の更に別の態様は、生体サンプル中のＩＬ−１３を検出するためのキットである。キットは、ＩＬ−１３のエピトープに結合する１つ以上の抗体を保持している容器と、免疫学的複合体の存在又は不在が、サンプル中のＩＬ−１３の存在又は不在に関連するように、ＩＬ−１３に結合して免疫学的複合体を形成し、その免疫学的複合体の形成を検出する目的のために抗体を使用することに関する説明書とを含む。容器の例としては、複数のサンプル中のＩＬ−１３を同時に検出できる複数ウェルプレートが挙げられる。

本出願全体を通して引用された全ての参照文献（文献、発行済み特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の内容は、参照することにより本明細書に明示的に援用される。

本発明の他の特徴は、本発明を説明するために与えられ、本発明を限定することを意図するものではない例示的実施形態に関する以下の記載において明らかになるであろう。

実施例１．抗ＩＬ−１３抗体産生
配列番号１のＲ１１０Ｑ変異体である、ヒトＩＬ−１３の自然変異体Ｒ１３０Ｑに対して、マウスハイブリドーマＣ８３６を作製した。７２番及び７５番と命名された２匹の１２〜１４週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。７２番のマウスに、Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ａｃｃｕｒａｔｅ）内にて、腹腔内（ＩＰ）及び皮内（ＩＤ）注射により、ヒトＩＬ−１３Ｒ１３０Ｑを、週２回、３回、合計５０ｍｇ投与した。７５番のマウスは、マウスインターフェロン−ａ及びｂ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）それぞれ０．３３×１０^５ユニットずつと組み合わせて、５０ｍｇのＲ１３０Ｑを尾の付け根（ＢＯＴ）に皮下（ＳＱ）免疫した。２日目及び３日目に、インターフェロン−ａ及びｂ（１日目と同じ投与量）をマウスのＢＯＴに皮下注射した。５８日目及び８５日目に、１００ｍｇの抗マウスＣＤ４０アゴニストＭａｂ（Ｒ＆Ｄ）と組み合わせた５０ｍｇのＲ１３０Ｑを、ＳＱ ＢＯＴにより２回ブースター注射した。後眼窩穿刺により採取した血液から抗体力価をスクリーニングした。Ｒ１３０Ｑ固相ＥＩＡアッセイを実施して、抗Ｒ１３０Ｑ ＩｇＧに対する血清力価を評価した。

ＭａｔｔＡと命名された融合では、７２番のマウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１００ｍＬに希釈したＲ１３０Ｑ ５０ｍｇをＩＶブーストした。ＭａｔｔＢと命名された融合では、７５番のマウスに、抗マウスＣＤ４０アゴニスト５０ｍｇと組み合わせたＲ１３０Ｑ １５ｍｇをＳＱ ＢＯＴで最終ブーストした。最終ブースト注射の３日後、マウスを屠殺し、リンパ器官を無菌的に取り出し、小さな乳棒を用いて網目の細かい篩に通して脾臓及び／又はリンパ節をすりつぶし、温ＤＭＥＭですすぐことにより免疫性リンパ球を回収した。

固相ＥＩＡアッセイを用いて、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、９０１８）を用いてヒトＩＬ−１３の自然発生変異体（Ｒ１３０Ｑ）に対する特異的な抗体について、マウス血清をスクリーニングした。マウス血清を、１：５０希釈から始めて２倍ずつＰＢＳで段階希釈し、３７℃で１時間５０μＬ／ウェルにてインキュベートした。プレートを洗浄し、次いで３００ｎｇ／ｍＬ、５０ｍＬ／ウェルのビオチン化Ｒ１３０Ｑと共に、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼとコンジュゲート化しているストレプトアビジンをプローブとし、Ｈ_２０_２及びＯＰＤで呈色させた。自動プレート分光光度計を用いて、４９０ｎｍで吸光度を測定した。

非分泌Ｂａｌｂ／ｃマウス骨髄腫融合パートナーであるＦＯは、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１６４６）から購入した。ＭａｔｔＡ融合は、１：２の比のＦＯマウス骨髄腫細胞と生脾臓細胞とを用いて実施した。ＭａｔｔＢ融合では、脾臓及び膝窩／鼠径リンパ節（ＬＮ）のリンパ球をプールして、融合を実施した。融合は、１：１の比のマウス骨髄腫細胞（ＦＯ）と生リンパ球とを用いて実施した。融合した細胞をＨＡＴ培地（１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、及び１６μＭのチミジン）に再懸濁させ、２５×９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルでプレーティングし、７〜１０日間インキュベートした。

マウスリンパ球とマウス骨髄腫細胞との融合から生じたハイブリドーマを、成熟Ｒ１３０Ｑ（配列番号１のＩＬ−１３ Ｒ１１０Ｑ変異体）に結合する能力について、ＥＩＡにより評価した。陽性ウェルの細胞を２４ウェルプレートに移し、細胞数を増加させた後、細胞株を確実に均一にするために限界希釈によりサブクローニングした。Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ−ＩｓｏＳｔｒｉｐ，Ｄｉｐｓｔｉｃｋ Ｆｏｒｍａｔ（Ｒｏｃｈｅ）を、製造業者の説明書に従って使用して、アイソタイプを決定した。

Ｒ１３０Ｑ反応性ＭＡｂを、ＥＩＡを介してＭａｔｔＡ融合から１２個、及びＭａｔｔＢから３個決定した。１３個の抗体が、マウスＩｇＧ１／κであると同定され、１つがＩｇＧ２ａκ、１つがＩｇＧ１／λアイソタイプであると同定された。均質なハイブリドーマ細胞株にＣコード番号を割当て、それぞれのＭＡｂにＣＮＴＯ番号を割当てた（表１）。

マウスハイブリドーマの軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡを、室温ＰＣＲによりクローニングし、配列を決定した。ｃＤＮＡを、軽鎖及び重鎖をそれぞれ、ＣＭＶプロモータの制御下で、ＧＳ選択可能な遺伝子マーカーを含む、Ｌｏｎｚａ真核生物発現ベクターｐＥＥ１２．４及びｐＥＥ６．４に挿入した。クローニングした配列のＣ８３６ ｍＡｂをＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクトし、ハイブリドーマをから分泌される抗体に対してアッセイした。Ｖ領域のＣＤＲを以下（表２）、並びに軽鎖及び重鎖Ｖ領域の配列表（それぞれ配列番号２及び３）に示す。

クローニングした配列から発現させた精製ｍＡｂの活性は、ハイブリドーマＣ８３６からの馴化培地で観察された活性と同じであることが検証された。１５０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒ−アルファ２に対する結合阻害を評価するアッセイを用いて活性を測定した。

実施例２：ヒトフレームワーク適応（ＨＦＡ）ライブラリの作製
ｍＡｂ Ｃ８３６のヒト化プロセスは、２つの一般的なプロセス：１）フレームワーク適応；及び２）選択されたフレームワーク内に起因するところが大きい親和性成熟を含んでいた。更に、特定の残基を改変して、タンパク質安定性を促進した。

フレームワーク適応プロセスは、国際公開第０８０５２１０８Ａ２号「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｕｓｅ Ｉｎ Ｈｕｍａｎ−Ａｄａｐｔｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」に本質的に記載されているように、マウスｍＡｂ Ｃ８３６とヒト生殖系データベース中の配列間のフレームワーク領域の類似性に基づいており、ここでフレームワークの長さは、親可変又はＶ領域の残基と一致する。全体で、１６個の軽鎖（ＬＣ）及び６個の重鎖（ＨＣ）フレームワークは、表３（ＬＣ）及び表４（ＨＣ）に示されているように、選択されたヒトフレームワークとＣ８３６のＣＤＲを組み合わせることにより適応したヒトフレームワークであった。両表においては、ＣＤＲを下線により強調する。

軽鎖フレームワークＯ１２（配列番号５）、Ｌ６（配列番号９）、Ｌ１２（配列番号１１）、及びＬ１８（配列番号６）が、マウスＶ領域（配列番号２）に対して最も高い類似性を有する（図１の上方のアラインメント）。重鎖のＣＤＲでは、ヒトフレームワーク２−２６（配列番号２０）、及び２−０５（配列番号２１）が、マウスＶ領域（配列番号３）に対して最も高い類似性を有する（図１の下方のアラインメント）。

フレームワーク適応した重鎖のＶ領域を、当業者に既知の方法を用いてヒトＩｇＧ１のＣ−カッパ（軽鎖）及びＣＨ１〜ＣＨ３（重鎖）と融合させた。マウス−ヒトＩｇＧ１キメラコンストラクトも作製し（Ｍａｂ １６７）、そこではマウスＶＨ領域がＣＨ１ドメインでヒトＩｇＧ１に融合しており、マウスＶＬはヒトＣ−カッパドメインに融合し、合計でそれぞれ１６個の軽鎖及び７つの重鎖になった。

ヒトフレームワーク適応した軽鎖及び重鎖の合成を、Ｅｖａｎｓらに教示された方法に従って完全長コード配列に組み立てたポリヌクレオチド断片全体を化学的に合成することにより実施した。例えば、米国特許第６，５２１，４２７号及び同第６，６７０，１２７号を参照。合成した遺伝子を、ＣＭＶプロモータベクター、ｐＵＮＤＥＲに挿入し、配列を確認した。次いで、これらベクターを、バッチ一過性トランスフェクションで用いた又は以下に記載のように規模を変化させた。

＜小規模トランスフェクション及び発現。＞ ＨＦＡ変異体の発現は、ＨＥＫ２９３細胞を用いて、小規模で、各ＨＦＡ重鎖（Ｈｃ）と各ＨＦＡ軽鎖（Ｌｃ）を対合させるマトリクス形式で実施し、スクリーニングに利用可能な９０個のＨＦＡ ｍＡｂ（１５Ｌｃ×６Ｈｃ）を得た。親マウス−ヒトキメラＬｃ及びＨｃを対合させ、対照と同じ方法で発現させた。要約すると、ＨＥＫ２９３−Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、０．５ｍＬの成長培地を含む４８ウェルプレートに１．５×１０^６生細胞／ウェルでプレーティングし、各ＤＮＡ（Ｌｃ＋Ｈｃ）対をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体化し、ＤＮＡ−脂質複合体を２つ組のウェルに添加して、細胞をトランスフェクトした。２４時間後、培地、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する２９３ ＳＦＭ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を置換した。分泌された抗体を含有する上清を９６時間後に回収し、アッセイのために濾過した。

＜ＨＥＫ２９３−Ｅ又はＣＨＯ−Ｓ細胞のパイロット規模のトランスフェクション。＞ ＨＥＫ２９３−Ｅ細胞を、２００ｍＬの成長培地を含むＣｅｌｌｓｔａｃｋ ２−層容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、８．０×１０^４細胞／容器でプレーティングした。ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を、小規模トランスフェクション法に記載したように作製した。

ＣＨＯ−Ｓの培養では、トランスフェクションの日に、細胞を、２Ｌの振盪フラスコあたり５００ｍＬの培地の１ｍＬ当たり７．５×１０^５細胞になるように希釈した。ＤＮＡをＯｐｔｉ−Ｐｒｏ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２３０９）で希釈し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１６４４７）と混合した。ＤＮＡ Ｍａｘ複合体（１０ｍＬ）を細胞のフラスコに添加し、３７℃でインキュベートし、４日後に上清を回収した。

＜大規模（４〜５Ｌ）バイオリアクタ生成＞ トランスフェクションの前日、ヘッドスペースの酸素（Ｏ_２）がモニタされ、５０％に制御されており、重炭酸ナトリウムを用いてｐＨ７．２に制御されている、３７℃に維持されたＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＢｉｏＢｕｎｄｌｅバイオリアクタ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）内で、２．０×１０^５細胞／ｍＬで細胞を播種した。トランスフェクション時に、ｐＨを６．８に低下させた。ＤＮＡ−脂質複合体では、トランスフェクション１Ｌ当たり１．２５ｍｇの全ＤＮＡを５０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏで希釈した。同様に、１．２５ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍａｘトランスフェクション試薬を、トランスフェクション１Ｌ当たり５０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを希釈したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍａｘ試薬と混合し、室温で２０分間インキュベートした。全ＤＮＡ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍａｘ複合体（総体積１００ｍＬ）をバイオリアクタに添加した。トランスフェクション時、細胞は、典型的には、７．０×１０^５細胞／ｍＬであった。４日後、上清を回収した。

パイロット規模（０．３〜３．０ｍｇ）の精製は、ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓクロマトグラフィーシステムで行い、大規模（３ｍｇ以上）の精製は、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステムで行った。パイロット規模及び大規模調製の精製手順は同一であった。一過性トランスフェトされたＨＥＫ２９３−Ｅ又はＣＨＯ−Ｓ細胞の細胞上清を、遠心分離（３０分間、６０００ｒｐｍ）により透明にし、濾過した（０．２μｍのＰＥＳメンブレン、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。ＩｇＧの相対量を、Ｏｃｔｅｔ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で測定した。大規模（５〜２０Ｌ）でトランスフェクトしたサンプルを、ＬＶ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ（Ｐａｌｌ）濃縮器を用いて５倍に濃縮した。濃縮したサンプルをＰＢＳですすぎ、再度０．２μｍで濾過した。希釈した上清を、平衡化された（ＰＢＳ、ｐＨ ７）ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、樹脂１ｍＬ当たり約１０ｍｇのタンパク質という相対濃度でロードした。ロード後、カラムを洗浄し、タンパク質を０．１ＭのＮａ−酢酸（ｐＨ ３）１０カラム体積で溶出させた。溶出したタンパク質画分を、Ｔｒｉｓバッファに溶出することにより中和した。ピーク画分をプールし、濾過（０．２μｍ）し、ｐＨ ７のＰＢＳで、一晩４℃にて透析した。透析したタンパク質を濾過し（０．２μｍ）、タンパク質の濃度を、ＢｉｏＴｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ（商標）分光光度計を用いて、２８０ｎｍ及び３１０ｎｍの吸光度により測定した。必要に応じて、精製したタンパク質を、１０Ｋ ＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。精製したタンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ）により評価した。必要な場合、エンドトキシン濃度を、ＬＡＬアッセイ（Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，ＭＡ）により測定した。精製したタンパク質を４℃で保存し、次いで特異性及び活性試験に供した。

実施例３：抗ＩＬ−１３抗体を評価するためのアッセイ
ＩＬ−１３ Ｒ１１０Ｑ又はＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ（配列番号１）と呼ばれる単一アミノ酸突然変異を有するＩＬ−１３の自然発生変異体を、候補のスクリーニングに用いた。ＩＬ−１３変異体及び野生型タンパク質は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪから購入した。

＜抗原のビオチン化＞ ＩＬ−１３タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ，ＥＺ−ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（＃２１３３６）を用いて、４：１のモル比でビオチン化した。これを達成するために、ビオチン試薬を適切な体積のミリポア水に溶解させ、１０ｍＭの原液を得た。適切な体積のビオチン原液を、室温で２時間にわたってＰＢＳ（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５）中のＩＬ−１３変異体Ｒ１３０Ｑ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）２００−１３Ａ）に添加し、モル比を４：１にした。ビオチン化反応を１Ｍのエタノールアミン１ｍＬで室温にて２時間クエンチし、過剰の未反応ビオチンを、ＰＢＳを用いて４℃で一晩透析により除去した。アリコートを瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。ビオチン化ＩＬ−１３ｗｔ及び変異体をＯＤ_２６０により再定量した。ビオチン化ＩＬ−１３形態（「ｂ−」と記される）を、（ａ）ＩＬ−１３ Ｒα１に対する結合のための、ＴＨＰ−１細胞におけるＳＴＡＴ６の活性化、及び（ｂ）以下に記載のようなＥＬＩＳＡを介してＲα２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）におけるＩＬ−１３Ｒα２に対する結合により評価した。

＜参照抗体＞
幾つかの抗体を、参照抗体として用い、前記抗体としては、１）配列番号２及び３のＶ領域を含むｍＡｂ １６７、Ｃ８３６マウス／ヒトキメラ；２）ｍＡｂ ６２又はＦａｂ ６２（ＨＦＡ６２又はＨＦＡＬ６２）；３）配列番号９及び２０のＶ領域を含むＣ８３６ヒトフレームワークＬＣ６ＨＣ２；並びに４）ｍＡｂ ４４２、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照が挙げられる。複数の生物活性アッセイを用いて、抗ＩＬ−１３ ｍＡｂの結合特性についてスクリーニング及び定義し、それを以下に記載する。

＜ＩＬ−１３直接結合ＥＬＩＳＡ＞
黒色９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、０．１Ｍの炭酸塩−重炭酸塩コーティングバッファ中８μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃ捕捉抗体１００μＬと共に４℃で一晩インキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄し、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした。抗体（１００μＬ）試験サンプルを、アッセイバッファ（１％ ＢＳＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で１ウェル当たり７ｎｇ／ｍＬに希釈し、２時間振盪させながら室温でインキュベートした。洗浄後（５回）、アッセイバッファで９ｎｇ／ｍＬに希釈した１００μＬのビオチン化ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ抗原を、１時間にわたって振盪させながら室温で添加し、洗浄を繰り返した。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼとコンジュゲート化した二次抗体（１００μＬ）を添加し、ＴＢＳ−Ｔバッファで１μｇ／ｍＬに希釈し、３０分間にわたって振盪させながら室温でインキュベートした。洗浄後（５回）、室温に平衡化し、１０μＬのＡＰ基質：１００μＬのエンハンサ：８９０μＬのアッセイバッファの比で希釈した１００μＬのＢＭ化学発光基質を添加し、１０分間振盪させながらインキュベートした。蛍光を、特注「ＢＭ化学発光」プログラムを用いてＥｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒで読み取った。データを検出限界及び陽性対照ｍＡｂに正規化し、抗原結合率を得た。

＜Ｒアルファ２結合阻害アッセイ＞
Ｒアルファ２結合阻害アッセイでは、購入した可溶性ＩＬ−１３Ｒ−アルファ２をプレートに吸着させ、試験抗体がビオチン化ＩＬ−１３−Ｒ１３０Ｑの結合を阻止する能力について測定した。アッセイでは、ＩＬ−１３Ｒα２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートに、１００μＬ×３００ｎｇ／ｍＬ（ＤＰＢＳ（３０ｎｇ）で希釈）で吸着させ、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（５Ｘ、ＴＢＳＴ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）、総体積１００μＬのサンプル又は標準物質を２００ｎｇ／ｍＬの抗体５０μＬ、次いでアッセイバッファ（ＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡ）中８ｎｇ／ｍＬのｂ−Ｒ１３０Ｑ５０μＬを、振盪させながら室温で１時間にわたって各ウェルに添加した。洗浄後、ＴＢＳＴ中１μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼにコンジュゲート化した二次抗体１００μＬを添加し、振盪させながら０．５時間インキュベートした。洗浄後、室温に平衡化し、１部の基質Ａ対４部の基質Ｂの比で希釈した１００μＬのＢＭ ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質を、３０分間振盪させながら室温でインキュベートした。更に４５分間色を呈色させ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒを用いて蛍光を測定した。生データを、バックグラウンドウェル値を減じ、抗体を含まないビオチン化ＩＬ−１３−Ｒ１３０Ｑ（ｂＲ１３０Ｑで標識されたウェル）を０％阻害と設定することにより阻害率を算出することにより分析した。阻害率は、以下のように算出される：（１−（（抗体を含むサンプルの値）／（ビオチン化ＩＬ−１３−Ｒ１３０Ｑのみ））×１００％）。

＜Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）を用いたＩｇＧ定量＞
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（３−ＡＳ−０００４ ｖ１）は、改変ｍＡｂ及びＦａｂの定量で用いられるアッセイに基づく３８４ウェルの均質ビーズである。タンパク質サンプルをプロテインＡでコーティングされたアクセプタビーズ、抗カッパ軽鎖抗体、及びストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズに添加した。４つ全ての成分が複合体を形成するとき、アクセプタビーズ及びドナービーズは、ドナービーズが１つの酸素イオンをアクセプタビーズに移動させるのに十分近い距離に存在し、これによりアクセプタビーズにおいてシグナルが生じる。シグナルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで測定する。サンプルは、プレート上の既知の抗体の標準曲線を用いて定量した。用いた材料：３８４−ウェル、Ｗｈｉｔｅ Ｏｐａｑｕｅ、ＯｐｔｉＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、プロテインＡでコーティングされたアクセプタビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）、及びＴｗｅｅｎ−２０（Ｔｅｋｎｏｖａ）又はウシ血清アルブミン、Ｐｒｏｂｕｍｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むトリス緩衝生理食塩水。バックグラウンドを減じた。そして、全ての希釈液を各プレートの標準曲線にあてはめることにより濃度を決定する。

＜ホスホ−ＳＴＡＴ６アッセイを用いるＩＬ−１３Ｒ１アルファシグナル伝達＞
ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１３誘導性Ｓｔａｔ ６リン酸化のフローサイトメトリー測定は、フローサイトメトリー（ＦＣ）によるＩＬ−１３誘導性Ｓｔａｔ ６リン酸化（Ｐ−Ｓｔａｔ ６）の検出に基づいて抗体によるＩＬ−１３の中和活性を評価するための感受性アッセイである。このアッセイは、一次ヒトＢ細胞に基づくＰ−Ｓｔａｔ ６アッセイ（ＥＣ５０、５０００ｐｇ／ｍｌ）よりも高い感受性（ＥＣ５０、３３２ｐｇ／ｍｌ）を有する、ｒｈＩＬ−１３に対するＴＨＰ−１細胞の反応の迅速且つ定量的測定を可能にする。

ＴＨＰ−１細胞は、ＡＴＣＣ（ＴＩＢ−２０２（商標））から得、４〜６日に１回継代し、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で維持した。他の試薬としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−マウス抗−Ｐ−Ｓｔａｔ ６ ｍＡｂ（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（商標）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ヒト組換えＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）が挙げられる。アッセイのために、細胞を回収し、５×１０^５〜１×１０^６細胞／ｍＬ（新鮮完全培地）に再懸濁させた。試験試薬を、１０％ＦＢＳ：抗体を含むＲＰＭＩ−１６４０で、２ｍｇ／ｍＬから始めて２又は３倍ずつ８回希釈して段階希釈し、又は以下に示すように段階希釈した。培地のみ及び２５μＬの各抗体希釈液を９６ウェルプレートに移し、次いで２５μＬ／ウェル×２０ｎｇ／ｍＬ（０．５ｎｇ）のｒＩＬ−１３を移し、室温で１０分間放置した。ＩＬ−１３又は変異体の活性は、２ｎｇ／ｍＬから始めてＩＬ−１３を２又は３倍ずつ段階希釈することにより、又は指示するように、同様に試験することができる。

典型的なアッセイでは、ＴＨＰ−１細胞を、抗体及び／又はＩＬ−１３を収容しているウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートする。その後、細胞を、３分間遠心分離（４５０×ｇ）することによりペレット化し、上清を廃棄する。再懸濁させた細胞を、３７℃で１０分間にわたってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍバッファを添加することにより固定し、続いて洗浄し、冷９０％メタノールを用いて氷上で３０分間透過処理し（又は細胞を最高１ヶ月間−２０℃で保存してもよい）、再度ペレット化させた。細胞を、２０μＬのＡｌｅｘａ Ｆｕｒｏ−ａｎｔｉ−Ｐ−Ｓｔａｔ ６を含有する染色バッファ（１×ＰＢＳ、１％ ＦＢＳ、０．０９％ ＮａＮ_３）に再懸濁させることにより染色し、暗条件下で室温で１時間インキュベートする。次いで細胞を洗浄し、データを取得し分析するために、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（ＢＤ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のいずれかを用いてフローサイトメトリー（ＦＣ）分析用の染色バッファに再懸濁させる。Ｐ−Ｓｔａｔ６陽性ＴＨＰ−１細胞＝（Ｐ−Ｓｔａｔ ６の数＋ＴＨＰ−１細胞／ＴＨＰ−１細胞の総数）×１００。

＜Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ＞
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて親和性測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００光バイオセンサ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて実施した。バイオセンサ表面は、アミンカップリング化学反応のための製造業者の説明書を用いて、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を、ＣＭ−５ ｃｈｉｐ（Ｂｉａｃｏｒｅ）のカルボキシメチル化デキストラン表面にカップリングさせることにより調製した。約２０，０００ＲＵ（反応単位）の抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を、４つのフローセルそれぞれに固定化した。２５℃にて、ＰＢＳランニングバッファ（０．００５％の界面活性剤Ｐ２０及び３ｍＭのＥＤＴＡを含有）中で速度実験を実施した。このバッファを濾過し、使用前に少なくとも３０分間脱気した。ＩＬ−１３の３３ｎＭから０．０４６ｎＭへの段階希釈をランニングバッファ中で調製した。約２５０ＲＵの試験したｍＡｂを、センサチップのフローセル２、３、及び４で捕捉した。フローセル１は、参照表面として用いた。

ｍＡｂの捕捉に続いて、ＩＬ−１３を５０μＬ／分で３分間注入（結合相）し、次いでバッファーフロー（解離相）を１０分間注入した。チップ表面を、５０μＬ／分で１００ｍＭのＨ_３ＰＯ_４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７９６１）を１２秒間注入する２パルスにより再生した。回収したデータを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン３．２（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて加工した。先ず、アナライト注入の参照サブストラクション曲線からバッファ注入により生じたカーブを減じることにより、データのダブルリファレンスサブトラクション（double reference subtraction）を実施した。そして、データの速度分析を、１：１の結合モデルと全体的適合（global fit）を用いて実施した。各ｍＡｂの結果を、Ｋａ（オン速度）、Ｋｄ（オフ速度）、及びＫ_Ｄ（親和性定数）の形で報告した。

＜遠心限外濾過によるＰＢＳに対する抗体の溶解度の決定＞
室温における種々の抗体の溶解度を決定するために、限外濾過スピンカラムを用いて実験を行った。要約すると、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファ中の抗体製剤を、室温でＶｉｖａｓｐｉｎ−１５（１５ｍＬ）限外濾過スピンカラム（３０，０００ ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加した。スウィング型バケツロータを用いて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８０４Ｒ遠心分離器で、カラムを３０００×ｇで２０分間隔で回転させた。一旦体積が約２ｍＬにまで減少したら、上清をＶｉｖａｓｐｉｎ−４（４ｍＬ）カラム（３０，０００ ＭＷＣＯ）に移し、２０分間隔で４，０００×ｇで遠心分離した。サンプル体積が５００μＬまで減少した後、サンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ−５００カラムに移し、１５分間Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５Ｒ遠心分離器で１５，０００×ｇにて遠心分離した。これを、沈殿が見られるまで繰り返した。この時点で、遠心分離を停止させ、サンプルを一晩室温で保持して、平衡に達した。次の朝、サンプルを回転させて沈殿を除去し、適切に希釈しながらＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いてＡ２８０でタンパク質濃度を測定した。濃度が１００ｍｇ／ｍＬ超であった場合、プロセスを停止させた。沈殿が生じなかった場合、タンパク質濃度を、回転１回おきに測定した。タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬ超であることが見出された場合、遠心分離を停止させた。更に、本明細書に記載される抗体を更にスクリーニングして、特定の抗体を更なる開発のための理想的な候補にする特徴を同定した。これら抗体のスクリーニングに使用される方法は、米国特許出願第６１／０２２，３８５号に記載されている。

実施例４：抗ＩＬ−１３抗体のＨＦＡ変異体
各ＨＦＡ重鎖変異体と対合した各ＨＦＡ軽鎖変異体（実施例２、それぞれ、表４及び３）のマトリクストランスフェクションから生成された９０個の初期スクリーニングを行った。前記スクリーニングは、溶液中のビオチン化ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑに対する直接結合を測定し、１．１ｎＭのＭａｂ及び２ｎＭのｂ−ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑを用いてＩＬ−１３ Ｒ１３０ＱのＩＬ−１３Ｒα２への結合を阻害する能力を測定することにより行った。

組換えＭａｂサンプルの結合又は阻害活性を、配列番号２及び配列番号３を含むキメラｍＡｂ、Ｌｃ１６Ｈｃ７（ｍＡｂ １６７）の結合又は阻害活性と比較した。小規模トランスフェクションの未精製組織培養上清を用いてこれらのスクリーニングから得られたデータにより、どの変異体を発現、精製、及び更なる評価のためにスケールアップするべきかを決定した（表５）。選択したＨＦＡ ｍＡｂを、大規模にＨＥＫ２９３細胞で発現させ、精製した。それらを、Ｂｉａｃｏｒｅにより評価して、ＩＬ−１３変異体Ｒ１３０Ｑに対する結合親和性を決定した。

これらのデータに基づいて、親和性成熟についてＨＦＡ変異体Ｌｃ６Ｈｃ２及びＬｃ１４Ｈｃ２を選択した。

実施例５：抗ＩＬ−１３抗体の変異体の親和性成熟及び産生
既知の三次元構造の抗体−抗体複合体の研究により、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれるＣＤＲ内の抗原接触残基が明らかになった（Ｐａｄｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ ９：１３３〜９；Ａｌｍａｇｒｏ ２００４，Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜１４３）。リードＨＦＡ変異体の親和性を改善するために、タンパク質の抗原認識のために高頻度で用いられる４つのＳＤＲ、Ｌ−ＣＤＲ３の残基Ｈ９１、Ｎ９２、Ｅ９３、及びＹ９４のランダムライブラリを用いた。

ライブラリ構築用スカフォールドとしてファージミドＩＬ−１３−６２と命名されたＣＤＲ移植Ｌｃ６−ＶＢ＿Ｌｃ６（配列番号９）及び第２にファージミドＩＬ−１３−１４２と命名されたＬｃ１４ ＶＢ＿Ｌ１２（配列番号１７）を用いて、Ｌ−ＣＤＲ３変異体の２つのファージライブラリを作製した。両方のライブラリをＨｃ２（配列番号２０）と組み合わせ、Ｆａｂ断片としてクローニングした。配列番号９（Ｌｃ６）及び配列番号１７（Ｌｃ１４）におけるＬ−ＣＤＲ３の４つの残基（Ｈ９１、Ｎ９２、Ｅ９３、及びＹ９４）を、「ＮＮＫ」コドンを用いて最大限の多様性を導入してランダム化し、１．９×１０^５個の変異体の理論上の多様性を得た。親マウスＭａｂ、Ｃ８３６のＶ領域を有するファージミドも構築し、ＩＬ−１３−１６７と命名した。

Ｆａｂライブラリを、米国特許第６，４７２，１４７号（Ｓｃｒｉｐｐｓ）及び国際公開第２００９／０８５４６２号として公開された出願人の同時係属中の出願に記載されている通り、ｐＩＸファージディスプレイ系で構築した。ファージミドＩＬ−１３−６２は、ＩＬ−１３Ｌｃ６及びＩＬ−１３Ｈｃ２の可変領域を含むジシストロニック単位として発現した。ライブラリの構築は、既に記載されている方法（Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ １９：４１３〜４２２）と同様の方法を用いて行われた。親分子から個々のＮ末端及びＣ末端断片を捕捉するために、Ｎ末端領域（断片１）及びＣ末端領域（断片３）から構成されるネステッドＰＣＲにより３つの断片からライブラリを組み立てた。一旦作製されると、外側の断片を、それぞれのＳＤＲと標的とする内側断片（断片２）と混合した。断片２は、縮重オリゴから作製され、断片１と３とを橋渡しして完全長ライブラリ配列を作製するために用いられた。完全長配列をそれぞれ軽鎖ファージベクターにクローニングした。

ライブラリをビオチン化ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑに対してパニングした。要約すると、パニング前に、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）でブロッキングした。同様に、Ｌ−ＣＤＲ３ファージライブラリを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｔ）を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で１：１に希釈したＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒで、室温にて３０分間予備ブロッキングし、続いて予備吸着工程で、Ｌ−ＣＤＲ３ライブラリをブロッキングされた磁性ビーズと共にインキュベートして、非特異的結合剤を除去した。次いで、ビオチン化ＩＬ−１３変異体Ｒ１３０Ｑ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を、パニングの３回連続するラウンド用に、異なる濃度（１０ｎＭ〜０．０１ｎＭ）のファージライブラリに添加した。抗原結合ファージを、磁性ビーズを用いて捕捉し、指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ−１細胞、ＯＤ（６００ｎｍ）＝０．５を１ｍＬ添加することによりレスキューし、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ファージを産生し、パニングの次のラウンドのために準備した。Ｆａｂ−ｐＩＸをＴＧ−１コロニーの粗細菌細胞溶解物から産生した。

ハイスループット一点（１０ｎＭ）ＥＬＩＳＡを用いて、ファージパニングの試みから、変異体をランク付けした。ビオチン化ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ曲線に対する、ファージｐＩＸタンパク質上に提示した特定のＳＤＲＵ変異体Ｆａｂの結合を明らかにした。ＩＬ−１３−１６７より高いシグナルを有するクローン（マウス−ヒトキメラＦａｂより高い親和性の結合剤）を、ＦａｂをＭａｂに変換するために選択した。配列番号９及び２０に基づいてＩＬ−１３−６２ライブラリをランク付けしたデータを表７Ａに示し、ここでは少なくとも４０個のクローンが、マウス親配列Ｆａｂ（ファージ−Ｌｃ１６Ｈ７）よりＩＬ−１３に対する親和性が高かった。表７Ｂは、配列番号１７及び２０に基づいて、ＩＬ−１３−１４２ライブラリに相当するデータを示し、ここでは５３個のクローンがマウス親配列（Ｌｃ１６Ｈ７）よりも親和性が高かった。数個のクローンが、フレームワークに突然変異を含んでいた（上述の通り）。

＜ＦａｂのＭＡｂへの変換＞
制限的消化及びスクリーニング用ｐＵＮＤＥＲベクターへの挿入により、ＩＬ−１３−６２ライブラリから選択されたＦａｂ（表７Ａ）を完全長ｍＡｂに変換した。これらＬｃ６に基づく変異体を、ヒトＩｇＧ１重鎖を含むＨｃ２（配列番号２０）と対にし、粗上清及びＩＬ−１３を用いてＨＥＫ２９３細胞に小規模トランスフェクトすることにより再スクリーニングした（表８）。

ＩＬ−１３−６２ライブラリ（表７Ａ）及びＩＬ−１３−１４２ライブラリ（表７Ｂ）から得られた絶対ＩＬ１２Ｒａ２結合の結果は、アッセイが僅かに異なる条件で行われたため、シグナルの大きさの観点で直接比較することができない。１４２個のライブラリから得られた変異体は、Ｍａｂ形式で試験しなかった。

＜ＣＤＲの特定の残基を標的とする部位特異的突然変異誘発＞
ｐＩＸファージディスプレイ及びパニングがフレームワーク適応Ｃ８３６軽鎖の親和性成熟の方法として選択されたが、部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）もＬｃ６及びＨｃ２に対して用いた。ＳＤＭを用いて、ＳＤＲの特定の残基を、メチオニン及びシステインを除く全ての可能なアミノ酸にランダム化した。逆に、ＳＤＲ中の任意のメチオニン又はシステインを除去して、酸化を受けやすい残基の存在を避けた。したがって、Ｈｃ２（配列番号２０）のＭ３４及びＭ１００はＳＤＭにより変更され、これらの一点変異体を、更なる突然変異を含む配列と共に結合活性の増加についてスクリーニングした。

要約すると、Ｌｃ６−Ｈｃ２の約２００個の軽鎖変異体及び４００個の重鎖変異体が、ハイスループット部位特異的突然変異誘発により生じた。アッセイでは、各軽鎖変異体をＨｃ２配列と対にし、活性についてスクリーニングした（データは示さない）。同様に、ＩＬ−１３直接結合のスクリーニング、及びＩＬ−１３を用いたＲａ２結合競合アッセイのために各重鎖変異体をＬｃ６と対にした。このアプローチを用いて、軽鎖及び重鎖変異体の両方を有する幾つかの改善された抗体を同定した。多くの変異体が、元来のマウス抗体に対して改善を示し、他のものは、ＨＦＡのＶ領域Ｌ６（配列番号９）及びＨ２（配列番号２０）と比べて改善されていた。強化した軽鎖突然変異の一部は、ファージ変異体ライブラリ法から同定された陽性突然変異と同じ位置に存在した。更に、改善された活性を有する選択された重鎖変異体を、ファージ由来の軽鎖と組み合わせて、完全ＭＡｂを形成し、再試験した。これらの組み合わせの幾つかは、ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑに対する結合親和性が追加増強した。つまり、結合親和性は、元来のマウスＭａｂ（Ｃ８３６）で測定されたものよりも高く、ＨＦＡのＶ領域Ｌｃ６及びＨｃ２に比べて数倍高かった。これらＭＡｂを精製し、プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて結合親和性測定に供したところ、試験した（１００超を試験した）Ｍａｂのうち５０超が、約５０ｐＭであった元来のマウスＭａｂ（Ｃ８３６）より高いＩＬ−１３に対する親和性を有していた。

Ｌｃ＋Ｈｃマトリックススクリーニングデータに基づいて、選択されたＨｃ変異体（ＳＤＭから得られた）を配列番号９に記載のＬ６変異体Ｎ９２−、Ｅ９３Ｄ（配列番号２５として表される）と対にし、精製及び更なる分析のために産生をスケールアップした。これらｍＡｂを、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によりＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑに対する直接結合について、ホスホ−ＳＴＡＴ６アッセイにおいてＩＬ−１３のそのＲα１に対する結合を阻害する能力により中和活性について、及びＩＬ−１３ Ｒ１３０ＱのそのＲα２に対する結合を阻害する能力のＬｕｍｉｎｅｘに基づくバージョンにより厳格に試験した。ＩＬ−１３Ｒａ２に対する結合阻害は、５００ｐｇ／ｍＬのｂ−ｗｔ ＩＬ−１３を用い、ＩＣ_５０値は、図２に示すような曲線に基づいて算出した。Ｐ−ＳＴＡＴ６アッセイのＥＣ_５０値及びＲα２阻害ＬｕｍｉｎｅｘアッセイのＩＣ_５０値を表９に表す。

したがって、フレームワーク突然変異を有する、表７ＡのｍＡｂ候補に見出されたＬｃ６（配列番号９）の置換としては、配列番号２７について以下に記載される変異体が挙げられる。

部位特異的突然変異誘発を用いて、Ｈｃ２（配列番号２０）ＣＤＲ１（_２６ＧＦＳＬＳＴＹＧＭＧＶＧ_３７）及びＣＤＲ３（_１００ＭＧＳＤＹＤＶＷＦＤＹ_１１０）に変化を有する更なる変異体を作製した。ＩＬ−１３と高い親和性で結合する重鎖可変ドメインの変異体は、（配列番号２８）のものを含み得る。

したがって、配列番号２８に記載の重鎖可変領域、及び上記変異体を用いて、式Ｉに示すようなＬ−ＣＤＲ３の変異を含む第２の抗原結合ドメインと組み合わせて抗体を改変することができる。

Ｑ−Ｑ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｐ−Ｙ−Ｔ（配列番号２９）
式中、Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、又はＰｒｏであってもよく；
Ｘａａ_２は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、又はＶａｌであってもよく；
Ｘａａ_３は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｙｐ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであってもよく、又は存在しなくてもよく；および
Ｘａａ_４は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕであってもよく、又は存在しなくてもよい。

マウスモノクローナル抗体Ｃ８３６の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、１５個のヒト軽鎖及び６個の重鎖抗体フレームワークに適応させ、ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ及び野生型ヒトＩＬ−１３に高い親和性で結合する抗体を得た。ＨＦＡ軽鎖２、３、６、８、１４（配列番号５、６、９、及び１７）及び重鎖２（配列番号２０）は、非常に望ましい生物活性及び高親和性を有するＭＡｂを生成した。得られたヒトフレームワーク適応抗体は、ヒト患者に投与された場合低い免疫原性を有すると予測されるため、完全マウス又はキメラ対応物よりも長い血漿半減期をもたらす。

野生型、完全長マウスｍＡｂ Ｃ８３６の親和性（Ｋ_Ｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定したとき、約５０ｐＭであり、マウスＶ領域−ヒトＣ領域キメラ（Ｌｃ１６Ｈｃ７）と同程度であったことが見出された。Ｃ８３６ ｍＡｂのＣＤＲをヒト抗体フレームワークに適応させたことにより、抗原に対する結合Ｋ_Ｄが、約５分の１に低下して、約２５０ｐＭになり（表６）、これは単純なＣＤＲ移植キメラに典型的である。ファージＦａｂライブラリのハイスループットマトリックススクリーニング及び新規抗体鎖のデノボ合成、及び一過性トランスフェクションのためのベクター構築により、重鎖及び軽鎖Ｖ領域の組み合わせを含む、多数のＦａｂ、及び完全長ＭＡｂを、相対結合についてスクリーニングすることができた。

第２の工程では、選択されたヒトフレームワーク適応ｍＡｂの結合親和性が、ファージＦａｂライブラリ及び部位特異的突然変異誘発の両方を用いてＳＤＲと呼ばれる選択的残基への斑入り(variegation)に集中させることにより成熟した。これらの効果から、Ｈｃ２（配列番号２０）配列の１１の変異体と対合した単一軽鎖配列を有するｍＡｂは、ＣＨＯ及びＨＥＫ２９３細胞で発現し、Ｂｉａｃｏｒｅ分析により、ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ及び野生型ＩＬ−１３に対して５０ｐＭ未満の結合親和性を示した（表９）。これらの抗体は、１）ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ及び野生型ＩＬ−１３がＩＬ−１３受容体Ｒα１に結合するのを阻害することによりＩＬ−１３の機能を中和した；ＩＬ−１３ Ｒａ１／ＩＬ−４受容体複合体を介したシグナル伝達により活性化されることが知られているＳＴＡＴ−６転写因子のリン酸化を阻害した；及び３）ＩＬ−１３受容体Ｒα２に対するＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ及び野生型ＩＬ−１３の結合を阻害した。

生物物理学的特徴は、幾つかの種がＰＢＳに対して１００ｍｇ／ｍＬ超の溶解度、ヒト血清に対して５０ｍｇ／ｍＬ超の溶解度を示すことを示した。したがって、これらの活性改変ｍＡｂは、ＩＬ−１３介在疾患の治療に用いるための治療分子で典型的に見られる所望の特性と一致する特性を有する。

２Ｂ０３と命名された軽鎖（配列番号２５）と配列番号２６等のＨｃ２ ＣＲ変異体とを組み合わせることにより作製されたｍＡｂに加えて、表９に示すような配列番号２０に記載の重鎖変異体と組み合わせられた配列番号９及び１７の他の軽鎖変異体を調製することもできる。したがって、多数の高親和性ＩＬ−１３免疫特異的変異体ｍＡｂは、本明細書におけるこれらの発見及び教示に基づくことが可能である。例えば、これらとしては、配列番号２５及び２６に記載の変異体が挙げられる。

可変領域配列番号２６及び２６を含むＭａｂ Ｍ１２９５により表されるＨｃ及びＬｃの組み合わせは、治療的に開発しやすい重鎖フレームワークを有するものとして特に注目される。重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３におけるメチオニン（残基３４及び１００）の除去により、酸化の機会が減少し、これら配列は、治療的開発のために理想的になる。メチオニン含量の低下した抗体は、酸化に対する安定性の改善を示すため望ましい。

実施例６：抗ＩＬ−１３結合ドメインのエピトープ及びパラトープ分析
ＩＬ−１３（配列番号１）に結合している、Ｃ８３６（配列番号２及び３を含む）に関連するＦａｂ、ＣＤＲ移植ヒトフレームワーク適応変異体ＨＦＡＬ６２（配列番号９及び２０を含む）、及びＶ領域が親和性成熟した変異体Ｍ１２９５（配列番号２５及び２６を含む）のＸ線結晶解析を用いるエピトープマッピングを実施し、結果を比較した。

Ｈｉｓタグを付けた、Ｃ８３６ ＦａｂのキメラバージョンをＣＨＯ細胞内で発現させ、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。ＨＦＡＬ６２及びＭ１２９５のＦａｂ断片を、対応するｍＡｂのパパイン切断により調製し、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。組換えヒトＩＬ−１３は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号２１３−ＩＬ／ＣＦ）から購入した。ＩＬ−１３−Ｆａｂ複合体は、Ｆａｂと過剰なＩＬ−１３を１：１．２のモル比で混合することにより調製した。混合物を２０分間室温でインキュベートし、濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて非複合体化種から分離した。

結晶化は、２０℃で蒸気拡散懸滴法を用いて実施した。Ｃ８３６：ＩＬ−１３の結晶は、２０％のＰＥＧ ３３５０、０．２Ｍの酒石酸ナトリウム、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）から得た。ＨＦＡＬ６２：ＩＬ−１３結晶は、１４％のＰＥＧ ３３５０、０．２Ｍの酒石酸アンモニウム、０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ ６．５）から得た。Ｍ１２９５：ＩＬ−１３結晶は、２５％のＰＥＧ ８Ｋ、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）から得た。Ｘ線データの収集のために、各複合体の１つの結晶を数秒間、２０％グリセロールを添加した対応する母液に浸漬した。回折データを収集し、Ｓａｔｕｒｎ ９４４ ＣＣＤ検出器を備えるＲｉｇａｋｕ ＭｉｃｒｏＭａｘ（商標）−００７ＨＦ Ｘ−線発生器、及びＸ−Ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００クライオシステム（Ｒｉｇａｋｕ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を用いて加工した。

３つの複合体Ｃ８３６：ＩＬ−１３、ＨＦＡＬ６２：ＩＬ−１３、及びＭ１２９５：ＩＬ−１３の結晶構造は、それぞれ２．０Å、１．９Å、及び２．８Åの解像度で決定され、それぞれ２２．４％、１８．６％、及び１９．７％の結晶学的Ｒ係数に変換された。３つ全ての構造では、抗体−抗原界面は、電子密度で明確に定義される。

３つのＦａｂ（Ｃ８３６、ＨＦＡＬ６２、及びＭ１２９５）はそれぞれ、ＩＬ−１３ポリペプチド鎖のＮ−末端及びＣ−末端に近接するへリックスＡ及びＤの表面でＩＬ−１３に結合する。抗体−抗原界面は、相互作用分子それぞれの約６００Å^２を被覆する。接触している残基は、４Åカットオフ原子間距離を用いて定義される。この定義を用いて、これらの抗体により認識されるエピトープは、ＩＬ−１３の８残基、へリックスＡの３残基（Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４）及びへリックスＤの５残基（Ｌｅｕ１００、Ｌｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８）を含む。接触数に基づくと、Ａｒｇ１０及びＡｒｇ１０７がエピトープの重要な残基であると思われる。

Ｃ８３６のパラトープは、Ｌ−ＣＤＲ２を除く６つのＣＤＲそれぞれ内に存在するＩＬ−１３と相互作用する（４Åカットオフ原子間距離に基づく）１２残基を含む。パラトープは、Ｌ鎖３残基（配列番号２のＴｙｒ３２、Ｈｉｓ９１、Ａｓｎ９２）及びＨ鎖９残基（配列番号３のＴｙｒ３２、Ｔｒｐ５４、Ｔｒｐ５５、Ａｓｐ５６、Ｖａｌ５８、Ａｒｇ６０、Ａｓｐ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ａｓｐ１０５）を含む。接触数に基づくと、主な認識ＣＤＲはＨ２及びＨ３である。軽鎖におけるアンカー残基は、Ｔｙｒ３２であり、これはＡｒｇ１０に積み重ねられ、ＩＬ−１３のＧｌｕ１４と水素結合を形成する。Ｌ−ＣＤＲ３との唯一の接触が、Ａｒｇ１０（ＩＬ−１３）と主鎖カルボニル基のＨｉｓ９１との水素結合である。Ｌ−ＣＤＲ３における側鎖の残基は、ＩＬ−１３と直接相互作用しないように思われる。

ＨＦＡＬ６２エピトープ及びパラトープ残基は、Ｃ８３６と同一である。

Ｍ１２９５は、ＨＦＡＬ６２と比べてＬ−ＣＤＲ３（配列番号２５）に異なる残基を含み、ここでは残基Ａｓｎ９２−Ｇｌｕ９３がＡｓｐ９２により置換されている、即ち、１つの残基が欠失し、１つが突然変異している。ＩＬ−１３との複合体においてＭ１２９５とＨＦＡＬ６２と結晶構造の比較は、他のＣＤＲで生じる重大な構造変化を示さない。Ｌ−ＣＤＲ３における欠失により、ループが短くなり、その結果導入されたＡｓｐ９２残基が、以前はＡｓｎ−Ｇｌｕ対によって保持されていた空間を占め、一方隣接残基Ｈｉｓ９１及びＴｙｒ９４は、ほとんど同じ位置に存在する。これらの変化により、ＩＬ−１３との更なる接触が可能になる。配列番号２５のＬＣ Ａｓｐ９２は、重要なエピトープ残基Ａｒｇ１０（配列番号１）と塩橋を形成する。この塩橋は、ＨＦＡＬ６２には存在しない、なぜなら、潜在的パートナー（Ｇｌｕ９３）がＡｒｇ１０から離れた方向に向いているためである。別の新規接触は、ＬＣのＡｓｐ９２とＩＬ−１３のＮ末端のＳｅｒ６との間の水素結合である。この相互作用は、エピトープを伸長させる、その理由は、Ｓｅｒ６がＨＦＡＬ６２又はＣ８３６のいずれかと接触していないためである。全体で、Ｍ１２９５が結合しているＩＬ−１３エピトープは、ＩＬ−１３の９残基（Ｓｅｒ６、Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４、Ｌｅｕ１００、Ｌｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８）を含む。Ｍ１２９５のパラトープは、Ｌ鎖３残基（Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ９１、Ａｓｐ９２）及びＨ鎖９残基（Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ５４、Ｔｒｐ５５、Ａｓｐ５６、Ｖａｌ５８、Ａｒｇ６０、Ａｓｐ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ａｓｐ１０５）を含む。

実施例７：アラニンスキャニング
結晶解析に加えて、ＩＬ−１３に対する結合に重要な可変ドメイン（１又は複数）の残基を決定するための、Ｃ８３６の重鎖及び軽鎖可変領域のアラニンスキャニング突然変異誘発試験を本明細書に記載する。

５９個の複合体で調べられ、特異性決定残基（ＳＤＲ）として記載される抗原と接触している抗体可変ドメインの残基を、突然変異誘発のために選択した。残基は、Ｃ８３６軽鎖（配列番号２）の２７〜３６、４６〜５６、及び８９〜９７、及び重鎖（配列番号３）の２７〜３９、４９〜６０、及び１００〜１１１であった。変異体は、１μｇ／ｍＬから始めて３倍ずつ段階希釈した６種の濃度で、実施例２に記載のようにＩＬ−１３Ｒ−アルファ２固相アッセイで試験した。活性を、野生型Ｍａｂに対して正規化した。

ＩＬ−１３Ｒ−アルファ２の結合が、野生型抗体に対して低ナノモル濃度の抗体でどれ程変化するかに基づいて、又は結合がアラニン置換により影響を受けないか若しくは実際に強化されるかに基づいて、残基をＩＬ−１３への結合に対して「極めて重要」、「重要」、又は「重要ではない」に（重要度の順に）分類した。

結合に極めて重要：軽鎖：Ｙ３２、Ｑ８９、Ｑ９０、及びＨ９１。重鎖：Ｇ３３、Ｈ５２、Ｖ５８、Ｒ６０、Ｍ１００、Ｇ１０１、Ｓ１０２、Ｄ１０３、Ｙ１０４、Ｄ１０５、及びＷ１０７。

結合に重要：軽鎖：Ｋ３１、Ｙ４９、Ｎ９２、Ｅ９３、及びＹ９６。重鎖：Ｆ２７、Ｌ２９、Ｙ３２、Ｍ３４、Ｇ３５、Ｌ５０、Ｉ５３、Ｗ５４、Ｄ５６、及びＶ１０６。

結合に重要ではない：軽鎖：Ｋ２７、Ｓ２８、Ｉ２９、Ｓ３０、Ｌ３３、Ｓ５０、Ｇ５１、Ｓ５２、Ｔ５３、Ｌ５４、Ｑ５５、Ｓ５６、Ｙ９４、及びＰ９５。重鎖：Ｓ２８、Ｓ３０、Ｔ３１、Ｗ４９、Ｄ５７、及びＫ５９。

全体に、重鎖は、軽鎖残基に比べて結合に関与している（即ち、結合に対して極めて重要又は重要のいずれかに分類される）残基が多かった。これは、幾つかの異なる軽鎖フレームワークが、ＩＬ−１３に効率よく結合するＩＬ−１３抗体を産生し得るという観察結果を支持する。例えば、Ｈ２（配列番号２０）と組み合わせられたＬ３（配列番号６）、Ｌ６（配列番号９）、及びＬ１４（配列番号１７）の組み合わせは、約２５０ｐＭという類似のＫ_ｄ値を有する。対照的に、３２及び３１における重鎖（配列番号３）のフレームワーク領域における３つの突然変異のみが、それぞれ２５０ｐＭから５００ｐＭにＫ_ｄを２倍低下させた。

アラニンに突然変異した５１残基のうち２０残基が、結合に関与する残基のコアを形成し、極めて重要な残基に近接する他の１５残基が結合に重要であることが見出された。

結晶解析研究（実施例６）から得られた証拠と合わせて、結合に関与していると決定された残基は、本発明の抗体のパラトープの残基、及び活性変異体を生じさせるフレームワークに対する改変の可能性を更に定義するのを助ける。

実施例８：ヒト化抗ＩＬ−１３抗体の生物活性
Ｍ１２９５を完全ヒトＩｇＧ１抗体に変換し、アレルギー性気道炎症のラットモデルにおける生物活性について評価した。ノルウェーブラウンラットを感作し、次いでオボアルブミン（ｏｖａ）タンパク質でアレルギーを誘発させたところ、肺への好酸球性動員の増加により特徴付けられる気道のアレルギー反応が生じ、また、非選択性ムスカリン性受容体アゴニストであるメタコリン（ＭＣｈ）によるアレルギー誘発に対する反応の肺の抵抗性の変化により判定されるように、気道過敏性（ＡＨＲ）が増加した。Ｍ１２９５ ＩｇＧ１で処理したラットは、アレルギー反応の誘発相中、オボアルブミンへの全身感作後、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液が全細胞中において用量依存的に減少した。０、１４、及び２１日目、４８匹のラットを、一連のＯＶＡ及びミョウバン注射を用いてＯＶＡに感作し、炎症反応を延長させた。具体的には、ラットを、滅菌溶液（０．９％ ＮａＣｌ）中で水酸化アルミニウム（４．２８ｍｇ／ｍＬ）と混合したＯＶＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）溶液０．５ｍＬを皮下注射することにより感作したが、但し群１は、同じプロトコルを用いて滅菌０．９％ ＮａＣｌ０．５ｍＬで処理した偽の非感作対照とした。次いで、対照である群１を除く全ての動物を、実験の２３、２５、及び２８日目に、気管内（IT）注入により、ＯＶＡ（１ｍｇ／ｋｇ）でアレルギーを誘発させ、気道においてｏｖａ特異的アレルギー反応を誘発した。

研究のために、４８匹のラットを８個体ずつ６群に分けた。群１は、偽感作し、ＰＢＳでアレルギー誘発し、媒体で処理した。群２は、ｏｖａで感作し、媒体のみで処理した。群３は、ｏｖａで感作し、ＯＶＡによるアレルギー誘発（１ｍｇ／ｋｇ／投与、ＩＴ）前日及び誘発日にブデソニドで処理した。群４〜６は、感作相後、誘発相中、実験２１日目（最後のＯＶＡ−ミョウバン注射後の午後）から開始して、及び実験２７日目に、静脈内注射により、漸増用量のＭ１２９５ ＩｇＧ１（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。

２９日目に、動物をメタコリンによるアレルギー誘発に反応する肺機能試験に供した。抵抗性及びコンプライアンスの基準測定後、漸増用量のメタコリン（Ｍｃｈ；ネブライザ中６、１２、２５、５０、及び１００ｍｇ／ｍＬ）をエアロゾルを介して送達し、肺の抵抗性及びコンプライアンスを測定した。気道の抵抗性を、メタコリンの各濃度について算出し、平均＋ＳＥＭを全ての処理群についてプロットした。

動物を安楽死させ、浸潤性細胞、具体的にはＢＡＬへの好酸球動員を決定するためにＢＡＬ液を回収した。ＡＨＲの一次エンドポイント及びＢＡＬへの好酸球動員に加えて、肺組織サンプルをＨ＆Ｅ染色を含む通常の組織学的分析及び粘液産生の評価のために回収した。

ＭＣｈ誘導性気道抵抗性の変化は、試験後にＢｏｎｆｅｒｏｎｎｉ多重比較を行う2元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて評価した。ＢＡＬ細胞数、抗体量、サイトカイン量、及び病態スコアの変化を、適切な多重比較試験と共にＡＮＯＶＡを用いて行った。ｐ＜０．０５の値を有意であるとみなした。

Ｍ１２９５ ＩｇＧ１で処理したラット群における好酸球、リンパ球、マクロファージ、及び好中球細胞数は、生理食塩水処理されたｏｖａ感作動物に比べて、著しく用量依存的に減少した。好酸球の相対百分率は著しく減少し、生理食塩水処理されたｏｖａ感作動物に比べて、Ｍ１２９５ ＩｇＧ１の全ての用量で処理した動物で、数が約５０％減少した。肺への細胞動員の減少、及び好酸球の相対百分率の低下は、統計的に有意ではなかったが、全体の傾向は、ラットにおけるＭ１２９５ ＩｇＧ１の生物活性を示す。

気道過敏性について、１０ｍｇ／ｋｇのＭ１２９５ ＩｇＧ１で処理された動物は、生理食塩水処理されたｏｖａ感作動物に対して、最後の肺ＯＶＡアレルギー誘発の２４時間後に繰り返しＭＣｈでアレルギー誘発した後の最大気道抵抗性（ｐ＜０．０１）、及び、Ｍｃｈによる漸増誘発直前の基準気道抵抗性（ｐ＜０．０５）において統計的に有意な低下を示した。

この研究により、アレルギー反応及び炎症に関連するパラメータにおける用量依存的影響により決定したときＭ１２９５ ＩｇＧ１が生物的に活性であることが確認された。

実施例９：ヒト疾患を治療するためのヒト化抗ＩＬ−１３抗体の使用
前臨床試験は、喘息、アトピー性皮膚炎、及び好酸球介在疾患の病態に関連する機構的に明らかなエンドポイントを用いる、ヒト細胞に基づくインビトロアッセイにおいて、ヒトＩＬ−１３のＭ１２９５介在中和の機能的効果を明らかにする。結果は、ＩＬ−１３介在ＳＴＡＴ６リン酸化の阻害、細胞ホーミングケモカインＣＣＬ２及びＣＣＬ２６のＩＬ−１３介在誘導の阻害、及びＩＬ−１３介在ＣＤ２３調節の阻害により測定したとき、Ｍ１２９５及び関連結合領域を含む抗体断片の機能的効果を確認する。

このデータは、アトピー性及び非アトピー性疾患において、ＩＬ−１３経路の役割を評価する広い範囲の既に公開されているデータに加えて、ＩＬ−１３が、重要な免疫調節因子であり、喘息、アトピー性皮膚炎、及び好酸球介在疾患において中枢となる役割を果たしていることを示す。前臨床試験のデータは、ＩＬ−１３の拮抗作用が、ＩＩ型炎症反応に関連する下流のシグナル伝達事象を減少させるという仮説を支持し、抗ＩＬ−１３療法介入が、これら疾患に関連する臨床所見を有する患者において有益であり得るという証拠を提供する。

Ｍ１２９５及び関連結合領域を含む抗体断片の試験は、喘息の被験体において、潜在的に有用であり得る用量を含む、広範な用量（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、及び１０．０ｍｇ／ｋｇ）について調べる。このフェイズ１研究で評価される用量範囲は、ラット及びカニクイザルにおけるヒトＩＬ−１３生物活性のインビトロ中和、毒性、及び薬物動態データ、並びに高親和性でヒトＩＬ−１３に結合する抗ＩＬ−１３ ｍＡｂであるＩＭＡ−６３８を用いた臨床試験に基づく。

Claims (47)

1. ＩＬ−１３（配列番号１）のエピトープに結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、前記エピトープが配列番号１の１０の位置のアルギニン、及び１０７の位置のアルギニンを含む、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
2. 前記エピトープが、配列番号１の６の位置のセリン、１３の位置のイソロイシン、１４の位置のグルタミン酸、１００の位置のロイシン、１０３の位置のリジン、１０６の位置のフェニルアラニン、及び１０８の位置のグルタミン酸からなる群から選択される残基を更に含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 軽鎖可変領域を含むパラトープを含み、更にａ）配列番号１の１０の位置のアルギニンでＩＬ−１３と相互作用し、且つｂ）配列番号１の１４の位置のグルタミン酸と結合を形成するチロシン残基を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
4. 前記パラトープが、前記軽鎖可変領域にヒスチジン残基及びアスパラギン残基を更に含む、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
5. 前記パラトープが、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、バリン、及びアルギニンからなる群から選択されるパラトープ接触残基を含む重鎖可変領域を更に含む、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
6. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２を含み、前記チロシンが、配列番号２の３２の位置に存在し、前記重鎖可変領域が、配列番号３を含み、及び前記接触残基が、３２の位置のチロシン、５４の位置のトリプトファン、及び１０４の位置のチロシンを含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
7. 軽鎖可変領域を含むパラトープを含み、更にａ）配列番号１の１０の位置のアルギニンでＩＬ−１３と相互作用し、且つｂ）配列番号１の６の位置のセリンと結合を形成するアスパラギン酸残基を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
8. 前記パラトープが、前記軽鎖可変領域にチロシン残基及びヒスチジン残基を更に含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
9. 前記パラトープが、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、バリン、及びアルギニンから成る群から選択されるパラトープ接触残基を含む重鎖可変領域を更に含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
10. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２５を含み、前記アスパラギン酸が、配列番号２５の９２の位置に存在し、前記重鎖可変領域が、配列番号２６を含み、及び前記接触残基が、３２の位置のチロシン、５４の位置のトリプトファン、及び１０４の位置のチロシンを含む、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
11. Ｃ８６３、ＨＦＡＬ６２、及びＭ１２９５からなる群から選択されるモノクローナル抗体と、ＩＬ−１３のエピトープに対する結合を競合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
12. ＩＬ−１３のエピトープに対する結合を競合する前記抗体が、配列番号２９に記載の軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む、請求項１１に記載の単離モノクローナル抗体。
13. 前記配列番号２９に記載のＬ−ＣＤＲ３が、以下の式（Ｉ）により更に定義される、請求項１２に記載の単離モノクローナル抗体：
    式（Ｉ）−−Ｑ−Ｑ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｐ−Ｙ−Ｔ（配列番号２９）
    （式中、Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、又はＰｒｏであってもよく；
    Ｘａａ_２は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、又はＶａｌであってもよく；
    Ｘａａ_３は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｙｐ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであってもよく、又は存在しなくてもよく；及び
    Ｘａａ_４は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕであってもよく、又は存在しなくてもよい）。
14. ＩＬ−１３のエピトープに対する結合を競合する前記抗体が、配列番号２８に記載の重鎖可変領域を含む、請求項１１に記載の抗体。
15. ＩＬ−１３のエピトープに対する結合を競合する前記抗体が、配列番号２７に記載の軽鎖可変領域を更に含む、請求項１１に記載の抗体。
16. 配列番号９に記載の可変軽鎖及びその変異体、並びに配列番号２０に記載の可変重鎖及びその変異体を含む単離モノクローナル抗体。
17. 前記配列番号９に記載の可変軽鎖の変異体が、９１の位置のヒスチジン、９２の位置のアスパラギン、９３の位置のグルタミン酸、及び９４の位置のチロシンからなる群から選択される残基における変化を含む、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
18. ９１の位置のヒスチジン、９２の位置のアスパラギン、９３の位置のグルタミン酸、及び９４の位置のチロシンからなる群から選択される前記残基が、以下のように異なるアミノ酸に変化している又は欠失している、請求項１７に記載のモノクローナル抗体：
    。
19. 前記配列番号２０に記載の可変重鎖の変異体が、３１の位置のスレオニン、３４の位置のメチオニン、１００の位置のメチオニン、及び１０６の位置のバリンからなる群から選択される残基における変化を含む、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
20. ３１の位置のスレオニン、３４の位置のメチオニン、１００の位置のメチオニン、及び１０６の位置のバリンからなる群から選択される前記残基が、以下のように異なるアミノ酸に変化している又は欠失している、請求項１９に記載のモノクローナル抗体：
    。
21. 配列番号２５に記載の軽鎖可変領域及び配列番号２６に記載の重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
22. 前記軽鎖可変及び重鎖領域が、対応する軽鎖及び重鎖免疫グロブリン定常領域、並びに重鎖ヒンジ領域に融合する、請求項２１に記載の単離抗体。
23. 請求項２１に記載の抗体を含む医薬組成物。
24. 配列番号２５及び配列番号２６に記載の変異体を更に含み、かかる変異体が、ＩＬ−１３（配列番号１）のエピトープに結合する能力を保持し、前記エピトープが、配列番号１の１０の位置のアルギニン及び１０７の位置のアルギニンを含む、請求項２２に記載の単離抗体。
25. 前記エピトープが、配列番号１の６の位置のセリン、１３の位置のイソロイシン、１４の位置のグルタミン酸、１００の位置のロイシン、１０３の位置のリジン、１０６の位置のフェニルアラニン、及び１０８の位置のグルタミン酸からなる群から選択される残基を更に含む、請求項２４に記載の単離抗体。
26. ヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域を含む単離ヒト化組換え抗体であって、前記ヒト化重鎖可変領域が、重鎖配列番号３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト受容器抗体重鎖のヒトフレームワーク領域を含み、前記ヒト化軽鎖可変領域が、軽鎖配列番号２の３つの相補性決定領域及びヒト受容器抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域を含み、前記ヒト化抗体が、ＳＴＡＴ６シグナル伝達により測定したとき、ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１３のＩＬ−１３受容体への結合を低減する、前記単離ヒト化組換え抗体。
27. 前記抗体が、（ａ）野生型ＩＬ−１３誘導性Ｓｔａｔ−６リン酸化により測定したとき、ヒトＩＬ−１３受容体アルファ１又は好適な動物のＩＬ−１３受容体に対するヒト組換え野生型ヒトＩＬ−１３の結合を阻害する、（ｂ）ヒトＩＬ−１３受容体アルファ２又は好適な動物のＩＬ−１３受容体に対するヒト組換え野生型ヒトＩＬ−１３の結合を阻害する、（ｃ）生理食塩水処理されたオボアルブミン感作動物に比べて、抗体で処理されたラット群の好酸球、リンパ球、マクロファージ、及び好中球細胞数を減少させる、及び（ｄ）非特異的対照剤と比べて、化学的にアレルギー誘発された動物における気道抵抗性を低下させる、からなる群から選択されるＩＬ−１３ポリペプチドの少なくとも１つの活性を実質的に調節する、請求項２６に記載の抗体。
28. 配列番号３、２０、及び２６からなる群から選択される重鎖可変領域のＣＤＲを含む、請求項２６に記載の抗体。
29. 配列番号２、９、１４、及び２６からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲを含む、請求項２６に記載の抗体。
30. 表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）により測定したとき、２５０ｐＭ（０．２５０×１０^−９Ｍ）未満のＫ_ＤでＩＬ−１３変異体Ｒ１１０Ｑに結合し、且つＳＴＡＴ６シグナル伝達により測定したとき、ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒ２アルファ１への結合を阻止する、ヒトＩＬ−１３に免疫特異的な抗原結合抗体断片であって、前記抗体が、Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４を含むへリックスＡの残基、及びＬｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８を含むへリックスＤの残基において、ヒトＩＬ−１３と接触することを示され得、この場合の原子間距離が４．０Åを超えない、前記抗原結合抗体断片。
31. 請求項１に記載のＩＬ−１３抗体をコードする単離核酸。
32. 請求項３１に記載の単離核酸を含む、核酸ベクター。
33. 請求項３１に記載の単離核酸を含む、原核又は真核宿主細胞。
34. 請求項１に記載のＩＬ−１３抗体と、製薬上許容できる担体又は希釈剤とを含む組成物。
35. 有効量の請求項１に記載の抗体を含む組成物を接触させる又は投与する工程を含む、細胞、組織、器官、又は動物におけるＩＬ−１３関連病状を診断又は治療する方法。
36. 前記ＩＬ−１３関連病状が喘息である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記有効量が、前記細胞、組織、器官又は動物１キログラム当たり０．００１〜５０ｍｇである、請求項３５に記載の方法。
38. 前記接触又は前記投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺臓内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、バッカル、舌下、鼻腔内、又は経皮から選択される少なくとも１つの方式による、請求項３５に記載の方法。
39. 検出可能な標識又はリポーター、抗感染薬、循環器（ＣＶ）系薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、呼吸器薬、胃腸（ＧＩ）管薬、ホルモン又はホルモン刺激薬、体液又は電解質平衡薬、血液製剤、抗新生物薬、免疫調節薬、栄養製品、サイトカイン、又はサイトカイン拮抗薬から選択される、少なくとも１つの化合物又はポリペプチドの有効量を含む少なくとも１つの組成物を、前記（ａ）接触又は投与の、前、同時、又は後に投与することを更に含む、請求項３５に記載の方法。
40. それを必要としている患者の細胞、組織、又は器官と、請求項１に記載のＩＬ−１３抗体との接触を促進するのに好適である医療機器。
41. 請求項１に記載の少なくとも１つのＩＬ−１３抗体の、溶液又は凍結乾燥形態を含む、容器及び包装材を含む、ヒトの製薬又は診断用途向けの製造品（article of manufacture）。
42. 前記容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺臓内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、バッカル、舌下、鼻腔内、又は経皮的送達デバイス又は系の構成要素である、請求項４１に記載の製造品。
43. 請求項１に記載の少なくとも１つの単離された哺乳動物ＩＬ−１３抗体を産生する方法であって、前記抗体を回収可能な量で発現し得る宿主細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は植物細胞を提供すること、を含む前記方法。
44. 請求項４３に記載の方法により生成される、ＩＬ−１３抗体。
45. へリックスＡ（Ａｒｇ１０、Ｉｌｅ１３、Ｇｌｕ１４）の残基、及びへリックスＤ（Ｌｙｓ１０３、Ｐｈｅ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０８）の残基を含むＩＬ−１３エピトープ、又はその模倣ペプチドを用いる宿主の免疫方法。
46. 請求項１〜２２及び２４〜３０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
47. ＩＬ−１３介在疾患を治療する薬剤を製造するための、請求項１〜２２及び２４〜３０のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−１３抗体の使用。