JP3280376B2

JP3280376B2 - 多価抗原結合性蛋白質

Info

Publication number: JP3280376B2
Application number: JP51036491A
Authority: JP
Inventors: キング，デビッド，ジョン; マウンテン，アンドリュー; オーウェンズ，レイモンド，ジョン; ヤラントン，ジョフリィ，トーマス
Original assignee: セルテックリミテッド
Priority date: 1990-06-11
Filing date: 1991-06-11
Publication date: 2002-05-13
Anticipated expiration: 2017-05-13
Also published as: AU654134B2; GB9202853D0; JPH05502039A; WO1991019739A1; US5864019A; AU7983191A; EP0486652A1; GB9012995D0; GB2250995A; GB2250995B; CA2064829A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、多価抗原結合性蛋白質およびその製造方法
に関する。本発明はとくに、ただしそれに限定されるも
のではないが、このような多価抗原結合性蛋白質の製造
のための組換えDNA技術の使用に関するものである。

発明の背景最近は、抗体およびそのフラグメントに大きな興味が
寄せられている。完全な抗体分子が４個のポリペプチド
鎖、すなわち２個の重鎖と２個の軽鎖からなることはよ
く知られている。各軽鎖は、２個のドメインから構成さ
れ、Ｎ−末端ドメインは可変部またはVLドメインとして
知られ、Ｃ末端ドメインは定常部またはCLドメインとし
て知られている。各重鎖は、抗体のクラスにより、４個
または５個のドメインから構成されている。そのＮ−末
端ドメインは可変部またはVHドメインとして知られてい
る。次のドメインは第一定常部またはCH1ドメインとし
て知られている。各重鎖の次の部分は蝶番部として知ら
れ、これは第二、第三、そして場合により第四の定常部
ドメイン、もしくはそれぞれCH2、CH3およびCH4ドメイ
ンに続いている。

組み立てられた形の抗体では、VLおよびVHドメインは
互いに会合して抗原結合部位を形成する。CLとCH1ドメ
インも互いに会合し、１個の重鎖と１個の軽鎖を会合状
態に保持する。２個の重−軽鎖ヘテロダイマーは、一部
は２個の重鎖のCH2、CH3およびCH4ドメインの相互作用
により、一部は２個の重鎖上の蝶番部の間の相互作用に
より、相互に会合している。

各蝶番部には、少なくとも１個の、多くの場合数個の
システイン残基がある。組み立てられた形の抗体では、
重鎖中のシステイン残基は。蝶番部のシステイン残基と
の間にジスルフィド結合を形成できるように配置され、
２個の重−軽鎖ヘテロダイマーを互いに共有結合させ
る。結局、組み立てが完成した抗体は、２個の抗原結合
部位を有するという点で、二価であるといえる。

抗体の蝶番部におけるジスルフィド結合を緩和な還元
によって切断すると、１個の重−軽鎖ヘテロダイマーか
らなる一価の抗体が生成することは、かなり以前から知
られていた。

抗体をある種の蛋白分解酵素で処理すると、様々な抗
体フラグメントの産生を生じることもまたかなり以前か
ら知られていた。たとえば、各蝶番部のＮ−末端側の近
傍で抗体が切断されると、２個の抗体結合フラグメント
（Fab）と１個の定常部フラグメント（Fc）が生成す
る。各Fabフラグメントは、VHおよびCH1ドメインのみか
らなり先端を欠く重鎖に会合した軽鎖から構成されてい
る。Fc部分は、重鎖の残りのドメインが互いに蝶番部に
よって保持された構成になっている。

また、抗体は、蝶番部のＣ−末端側の近傍で切断する
こともできる。これによって、Ｆ（ab′）_２フラグメン
トとして知られたフラグメントが生成する。これは、CH
1ドメインがまだ蝶番部に結合していることを除けば、
主として２個のFabフラグメントから構成されている。
したがって、Ｆ（ab′）_２フラグメントは、蝶番部によ
って互いに結合した２個の抗原結合部位を有する二価の
フラグメントである。

消化条件を注意深くコントロールすれば、抗体を、VL
とCLドメインおよびVHとCH1ドメインの間で切断するこ
とも可能なことが明らかにされている。これにより、Fv
フラグメントとして知られている２個のフラグメントが
産生する。各Fvフラグメントは、互いに会合したVLドメ
インおよびVHドメインからなる。各Fvフラグメントは、
抗原結合に関しては、一価である。

さらに最近になって、組換えDNA技術の使用による抗
体またはそのフラグメントの製造に大きな興味がもたれ
るようになった。特許文献は、この領域の開示によって
満ち溢れている。組換えDNA技術は、天然の抗体の再現
だけではなく、新しい抗体の製造にも使われてきた。た
とえば、現在では、ある種からの可変部ドメインを他の
種からの定常部ドメインに連結させたキメラ抗体の製造
も可能になっている。

また、抗原結合活性を担うVHおよびVLドメイン内の領
域（通常、相補性決定部位と呼ばれ）を異なる抗原と結
合できるような配列に変化させたCDR−グラフト抗体の
製造も可能である。抗体のCDR−グラフティングは、ヒ
トの抗体の本質的な性質を変えないで、ヒト抗体への、
たとえばマウスモノクローナル抗体からの特異性の移入
を可能にする点で、有用な操作である。これは、抗体の
in vivoでの使用が所望される場合に有利である。

比較的最近、Fvフラグメントを組換えDNA技術で製造
することに興味がもたれるようになった。たとえば、組
換えDNA技術によるFvフラグメントの製造は、Skerra
＆ Pluckthun〔１〕（参考文献の一覧表は本文の末尾
に添付する）によって示唆されている。Fv産生組換え宿
主細胞の製造については、公告国際特許出願第WO 89/0
2465およびWO 89/09825に記載されている。

Fvフラグメントは、Fabフラグメントや完全な抗体に
比べてサイズが小さいことから、in vivo診断や治療に
とくに有用であろうことが想定される。これは、抗原性
がより少なく、組織への浸透性がより優れていると考え
られるという意味である。とくに、癌組織への浸透、し
たがって癌部位への細胞毒薬剤または診断標識の運搬が
可能であろうことが想定される。

しかしながら、Fvフラグメントには、抗原結合に関し
て一価であるという欠点がある。大部分の天然に生じる
抗体は多価であり、すなわち多数の抗原決定基をもって
いる。したがって、１分子当たり唯一の抗原結合部位し
かもたないFvフラグメントのこのような抗原への結合
は、二価の完全抗体やＦ（ab′）_２フラグメントに比較
して弱い。これは、たとえば細胞表面抗原の標的化にお
けるFvフラグメントの有用性を低減させる。

発明の要約本発明によれば、第一のFvフラグメントがさらに少な
くとも１個のFvフラグメントと、Fvフラグメントを互い
に結合させるが、蛋白質が隣接する抗原決定基に結合で
きるように空間を置いて保持させる結合構成部によっ
て、結合されている多価抗原結合性蛋白質が提供され
る。

Fvフラグメントを互いに結合させる結合構成部はその
特徴としてＦ（ab′）_２フラグメントや完全抗体分子の
場合のようにCL、CH1および重鎖蝶番部からなるもので
はない。

発明の詳細な説明２個のFvフラグメントは互いに、共有結合または非共
有結合のいずれによって結合されていてもよい。結合構
成部は２つの機能を果たすことが重要である。第一に、
それはFvフラグメントを結びつけて維持しなければなら
ない。第二に、それはFvフラグメントを互いに空間を置
いて維持しなければならない。これが行われないと、抗
原結合性蛋白質を組み立てることはできない。前者が達
成されても、フラグメントが接近しすぎると、結合部位
に立体障害を生じ、その結果、抗原結合性蛋白質が抗原
結合活性をもつことの邪魔になる。

結合構成部は、２つの要素、スペーサーポリペプチド
配列、有利にはVHおよびVLドメインの一方の一端におけ
る配列、ならびに結合構成部からなることが好ましい。
スペーサーポリペプチド配列は、ドメインの有利にはVH
ドメインのＣ−末端における配列である。一般に、スペ
ーサーポリペプチド配列は、長さが、約３〜16、好まし
くは約７〜12、とくに約10個のアミノ酸残基になるよう
にするが、使用するFvフラグメントおよび結合構成部の
残部によっては、もっと短いまたは長い配列も使用でき
る。

また、結合構成部は、Fvフラグメントが相互の関係を
容易に変えれるように、十分柔軟性であることが好まし
い。すなわち、結合構成部は、大きな不溶性のアミノ酸
残基や強固なヘリックスを形成するアミノ酸の配列から
なるものではないことが好ましい。結合構成部のアミノ
酸残基は、比較的小さく、可溶性のアミノ酸残基である
ことが好ましい。

スペーサーポリペプチド配列は、そのＣ−末端または
その近傍に、結合ユニットの付着に使用できる１個また
は２個以上の結合可能な残基を有する。結合可能な残基
とは、たとえば、システイン、リジン、グルタミン酸ま
たはアスパラギン酸残基である。これらの場合、結合ユ
ニットは、結合可能な残基との反応のために、チオー
ル、カルボキシルまたはアミノ基を含有することが好ま
しい。

結合ユニットは、特別に設計された化学化合物、たと
えばチオール基間を架橋する1,6ビスマレイミドヘキサ
ン、またたとえば、アスパラギン酸またはグルタミン酸
残基が連結できる多数のリジン残基を含有する環状ポリ
ペプチドであってもよい。後者の場合、環状ポリペプチ
ドの各反応性残基にVH−VLダイマーを連結することによ
り、多価抗原結合性蛋白質を製造することが可能であ
る。また、トリ、テトラ、またはさらに多官能性のマレ
イミドリンカーを使用して、トリ、テトラ、またはさら
に多価生成物を得ることもできる。このような多価マレ
イミドリンカーは、本願と同日に出願された“Chemical
Compound"と題する本発明者らの英国特許出願に記載
されている。また、多価蛋白質は、多官能性支持体構
造、たとえばポリマービーズにVH−VLダイマーを連結す
ることによっても製造できる。

また、結合ユニットは、非共有的結合たとえば静電的
結合もしくは他の結合を可能にする分子であってもよ
い。たとえば、結合ユニットは、ビオチン−ストレイプ
アビジン複合体から構成されてもよい。ビオチン分子は
スペーサーポリペプチドによって１つのFvフラグメント
に結合する。ストレプトアビジン分子はスペーサーペプ
チドによって他のFvフラグメントに結合する。この２つ
のFvフラグメントを混合すると、ビオチンとストレプト
アビジンの非共有結合的会合が起こり、二価の抗原結合
性蛋白質が形成される。他の非共有結合的会合分子対が
ビオチン−ストレプトアビジン複合体に代えて使用可能
であろうことは容易に理解できる。

スペーサーポリペプチドは、直接、結合ユニットを形
成するポリペプチドに導かれることが好ましい。たとえ
ば、結合ユニットとして、第二の蛋白質またはそれ自体
に対して既知の親和性を有する蛋白質を含有させること
も可能である。この場合には、Fv中の連鎖の一つをスペ
ーサー配列に融合したFvポリペプチド配列とし、続いて
スペーサー配列を蛋白質配列に融合させることができ
る。また、結合ユニットは、互いに共有結合できる残
基、たとえばリジン、システインまたはアスパラギン酸
もしくはグルタミン酸残基に富んだペプチド配列とする
こともできる。結合ユニットは、システイン酸残基に富
んでいることが好ましい。

組み立てられた抗体中には、VHドメインをCH1ドメイ
ンに連結するポリペプチド配列のあることが知られてい
る。同様にVLおよびCLドメインを連結するこのような連
結配列がある。一般に、これらの連結配列は、長さがア
ミノ酸残基約５個である。これらの連結配列の一つを、
スペーサーポリペプチド配列の少なくとも部分として使
用することが好ましい。場合によっては、スペーサー配
列として連結配列のみを用いることも可能である。

結合ユニットは、抗体蝶番部のコア部分とすることが
有利である。抗体の蝶番部は、プロリンおよびシステイ
ン残基に富んだコア部分を有するポリペプチド配列から
なることが知られている。コア部分のＮ−末端およびＣ
−末端側には、システイン残基間の連結に直接関与しな
いが、蝶番部に隣接するCH1またはCH2ドメインの部分で
もないポリペプチド配列がある。

抗体蝶番部のコア部分はそれだけで結合ユニットとし
て使用できる。また、結合ユニットは、多数の同一のコ
ア単位および／またはその部分を順次配列した形であっ
てもよい。

スペーサー単位の一部分が連結配列によって形成され
る場合は、スペーサー配列の残部は蝶番部のＮ−末端部
で形成されることが好ましい。

すなわち、現時点で好ましい本発明の多価抗原結合性
蛋白質は、そのＣ−末端に連結配列と抗体蝶番部が付着
したVHドメインからなるものである。VHドメインはVLド
メインと会合し、VH−VLヘテロダイマーは、蝶番部シス
テイン残基との間に形成されるジスルフィド結合によっ
て同様のVH−VLヘテロダイマーと連結する。

抗体の連結配列および蝶番部配列に基づく、とくに好
ましい結合構成部は、以下に示すような配列を有するも
のである（慣用の一文字アミノ酸記号を使用してい
る）。

ASTKGESKYG/PPCPSAP ASTKGERK/CCVECPPCP ASTKGELKT/PLGTTHTCPRCP（EPKSCDT PPPCRCP）_ｎ（ｎ＝０〜３）斜線は、スペーサー配列と蝶番部コア部分の間の大体
の境界を示している。このような配列の適当な類縁体お
よび変位体も本発明の範囲内に包含されるものである。

本発明の多価抗原結合性蛋白質は、この蛋白質中のVH
−VLヘテロダイマーが同一の場合には、唯一の特異性の
みをもつが、また、多重特異性をもたせることもできる
ことは容易に理解できよう。多重特異性抗原結合性蛋白
質は、たとえば、第一の所望の抗原が細胞表面にはわず
かしか存在しないが、第２の所望の抗原と組合わさって
いるような場合に有用である。単一特異性の蛋白質を使
用したとすると、抗原への結合活性の高い結合をうるこ
とは不可能であるかもしれない。しかしながら、細胞表
面に第二の抗原の存在が知られていたとして、抗原結合
性蛋白質をこの２つの抗原に対する二重特異性とするこ
とが可能であるとすれば、所望の標的細胞に対して高い
結合活性で結合することが保証される。

VHまたはVLドメインは、天然配列でも、改変配列で
も、またCDR−グラフト配列であってもよい。たとえ
ば、VHおよびVLドメインは、ヒトフレームワーク領域と
非ヒト（たとえば、マウスモノクローナル）CDRからな
るものであってもよい。また、たとえば、VHおよび／ま
たはVLドメインには、VHおよびVLドメイン間の架橋を可
能にするために、特定の改変残基、たとえばシステイ
ン、リジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基を
含有させることもできる。本発明は、このような変種の
配列を有する多価抗原結合性蛋白質も包含する。

さらに、本発明の多価抗原結合性蛋白質または少なく
ともその部分は、組換えDNA技術の使用によって製造す
るのが最善であることも理解すべきである。たとえば、
この蛋白質の各ドメインは、別個に、宿主細胞中で発現
させることができる。一つのドメインは、本質的に単に
天然のドメインであるのみでよい（上述のように、配列
の変化はあってもよいが）。他方のドメインは、一端
に、少なくともスペーサー配列を有することが好まし
く、スペーサー配列と結合ユニット配列を有することが
とくに好ましい。

VHおよびVLドメインポリペプチドは、単一の宿主細胞
中で共発現させるのが有利である。これらのドメインを
コードする遺伝子は、別個の、ただし適合性のあるベク
ター上にあっても、また同一のベクター上にあってもよ
い。適当な宿主細胞が選択されれば、２個のドメインは
正しく会合し、ついでVH−LVヘテロダイマーが集合し
て、二価または多価抗原結合性蛋白質が形成される。

発現時に２個のドメインが正しく会合しないか、また
VH−VLヘテロダイマーが集合しない場合には、二価また
は多価抗原結合性蛋白質の形成を起こさせる適当な工
程、たとえば変性および再生またはジスルフィド結合の
部分還元および再酸化を行うことが必要になる。

また、とくに好ましい実施態様においては、２個の可
変部ドメイン（VHおよびVL）はペプチドによって連結し
て、一つのベクターにより単一の宿主中で発現される単
一鎖ポリペプチド、すなわち、単一鎖Fv（scFv）を形成
させる。

本発明の他のとくに好ましい態様においては、以下の
各項が提供される。

（ａ）その一端、好ましくはそのＣ−末端において、ス
ペーサーポリペプチド配列と融合した抗体可変部ドメイ
ン、好ましくはVHドメイン（ｂ）さらに、スペーサー配列の、可変部ドメインから
遠位の末端の融合したポリペプチド配列からなる結合ユ
ニットを有する（ａ）に記載のポリペプチド配列（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチド配
列の、組換えDNA技術の使用による製造方法、および、（ｄ）二価（またはさらに多価）の抗原結合性蛋白質
の、組換えDNA技術の使用による製造方法において、（ｉ）上記（ａ）に記載のポリペプチド配列をコード
する遺伝子を調製し、（ii）工程（ｉ）で調製された遺伝子によつてコード
される可変部ドメインに対して相補性の可変部ドメイン
をコードする遺伝子を調製し、（iii）同一のベクターまたは別個のベクター上のい
ずれかで、２個の遺伝子により宿主細胞を形質転換し、
ついで（iv）上記遺伝子によってコードされるポリペプチド
を、好ましくは所望の二価（またはさらに多価）の抗原
結合性蛋白質が正しく集合される条件下に発現させる各工程からなる方法上記工程（iv）における条件が、正しい集合体を誘導
するように調整できない場合には、発現されたポリペプ
チドから所望の二価（またはさらに多価）の抗原結合性
蛋白質を組み立てるための工程（ｖ）の実施が必要にな
る。

本発明を実行するためには、広範囲の細胞系、ベクタ
ーおよび組換えDNA操作を使用できることを理解すべき
である。熟練者には、通常の知識および本技術分野で一
般的に入手できる材料を用いて必要な操作を行うことは
容易であろう。しかしながら本発明に関しては、細菌と
くに大腸菌宿主細胞の使用が好ましい。

本発明の多価抗原結合性蛋白質は、とくに、in vivo
診断または治療に使用できる。

すなわち、本発明はまた、診断的または治療的機能エ
フェクター分子、原子または他の種を結合させた本発明
の多価抗原結合性蛋白質も包含する。

たとえば、この蛋白質には、癌のin vivo診断または
治療のために、放射性標識または放射性細胞毒性原子も
しくは金属、または細胞毒性種たとえばリシン鎖を付着
させることができる。診断的または治療的機能エフェク
ター種は蛋白質に任意の適当な位置で結合させることが
できるが、結合構成部、スペーサーポリペプチドまたは
好ましくは結合ユニットに結合させることが好ましい。
本発明の蛋白質は、それらの血流からの比較的速やかな
クリアランスと、癌のような特定の部位をラベルした場
合に達成される比較的高いシグナル対ノズル比を合わせ
もつ点で、in vivo診断の目的にとくに適していると考
えられる。

したがって、本発明はまた、本発明の蛋白質の有効量
を医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と配合
してなる、in vivo用の診断的または治療的組成物も包
含する。

さらに、本発明は、本発明の蛋白質の有効量をヒトま
たは動物対象に投与することからなる診断または治療方
法を包含する。

次に、本発明を、例示のみの目的で、添付の図面を参
照しながら説明する。

図面の簡単な説明図１は、与えられた順序に融合された、リーダー配列
（アミノ酸残基１〜19）、B72.3VHドメイン（アミノ酸
残基20〜114）、および結合構成部（アミノ酸残基115〜
132）からなるポリペプチド鎖をコードするヌクレオチ
ド配列、およびそのアミノ酸配列を示し、図２は、ベクターpRO73およびpRO78のプラスミド図で
あり、図３は、発現プラスミドを分析したSDS−PAGEゲルの
写真であり、図４は、Fv、単一鎖Fv、およびFab生成物によるB72.3
の結合を比較したELISA結合アッセイの結果のグラフを
示し、図５は、プラスミドpRO97のB72.3単一鎖Fv蝶番部（sc
Fvhinge）構築体の蝶番部短縮型をコードするヌクレオ
チド配列、およびそのアミノ酸配列を示し、図６は、scFvhinge、ジスルフィド連結ダイマーおよ
び架橋ダイマーの、還元および非還元の両条件下におけ
るSDS−PAGEゲルのオーオラジオグラフを示し、図７は、モノマーscFvhinge、酸化scFvhingeダイマー
および化学的に架橋したscFvhingeダイマーによるB72.3
の結合を比較したELISA結合アッセイの結果のグラフを
示し、図８は、完全長scFvhinge生成物およびプラスミドpRO
97からののscFvhinge蝶番部短縮型について、モノマー
およびダイマー架橋ミックスの両者を比較したSDS−PAG
Eゲルの結果を示し、図９は、図８に示した蛋白質についてのELISA結合ア
ッセイのグラフを示し、図10は、図８に示した蛋白質についての生物学的分布
の検討結果を示すヒストグラムであり、図11は、精製scFvhingeトリマーをダイマーおよびモ
ノマーと比較したSDS−PAGEゲルの結果を示し、図12は、scFvhingeモノマー、ダイマーおよびトリマ
ー生成物を比較したELISA結合アッセイの結果のグラフ
を示し、図13は、scFvhingeモノマー、ダイマーおよびトリマ
ー種の腫瘍局在の生物学的分布の検討結果を示すヒスト
グラムであり、図14は、scFvhingeテトラマーの形成を示す還元SDS−
PAGEゲルである。

発明の実施例例１二価B72.3Fv生成物本発明の二価抗原結合性蛋白質の例を以下に記載する
ように作成した。

ベクターの構築腫瘍結合抗体B72.3のFvフラグメントの構築および発
現は、国際特許出願WO/09825に記載されている。B72.3
のVHドメインをコードする遺伝子をEcoR I/Bg IIフラグ
メントとして単離した。以下の配列： 1. GGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTC 2. GACCCCGGTTCCGTGGTGAGAGTGTCAGAGGAGT 3. CTCAGCTTCCACCAAGGGCGAGTCCAAATATGGTCC 4. CGAAGGTGGTTCCCGCTCAGGTTTATACCAAGGGGGT 5. CCCATGCCCATCAGCCCCATGATG 6. ACGGGTAGTCGGGGTACTACTTAA を有する３対のオリゴヌクレオチドを互いにリゲート
し、配列： ASTKGESKYGPPCPSAP を有する結合構成部をコードするBg II/EcoR I遺伝子セ
グメントを製造した。

オリゴヌクレオチド１、３および５はセンス鎖をコー
ドし、オリゴヌクレオチド２、４および６はアンチセン
ス鎖をコードする。

VH−コードおよび結合構成部−コードフラグメントを
一緒に、発現ベクターpEE6.hCMV〔２〕の唯一のEcoR I
部位にリゲートし、pRO71を得た。このベクターは、図
１に示したヌクレオチドを有し、そこに示したアミノ酸
配列をコードする遺伝子を含有する。コードされたアミ
ノ酸配列は、リーダー配列（アミノ酸残基１〜19）、B7
2.3VHドメイン（アミノ酸残基20〜114）および結合構成
部（アミノ酸残基115〜132）からなる。結合構成部は、
ヒトIgG1由来の連結配列が完全ヒトIgG4蝶番部に連結し
ている。

この遺伝子は、以下VHinge遺伝子と呼び、それによっ
てコードされるポリペプチドをVH1ingeポリペプチドと
呼ぶ。

B72.3のVLドメインを第二のhCMVプロモーターととも
にコードする遺伝子は、ベクターpRO18からBg III/BamH
Iフラグメントとして得られた。pRO18は、WO89/09825
に記載されている、B72.3VLドメインをコードする遺伝
子を、予めhCMVプロモーターの５′末端のHind III部位
をBg IIIに変えて修飾した発現ベクターpEE6.hCMV
〔２〕にクローニングすることにより作成された。この
Bg III/BamH Iフラグメントを、第二のhCMVプロモータ
ーとともに、ベクターpRO71の唯一のBamH I部位に導入
して、ベクターpRO72が得られた。選択可能マーカー
（グルタミンシンテターゼ）をベクターpRO72に添加す
ると、ベクターpRO73が生成した。この最後に挙げたベ
クターを図２に図式的に示す。

他のベクター、標識pRO45を生成させた。このベクタ
ーは、VHinge遺伝子の代わりにのB72.3VHドメインのみ
をコードする遺伝子が存在するほかは、ベクターpRO73
に相当する。

CHO細胞中での一過性発現ベクターpRO45およびpRO73を、CHO細胞中での一過性
発現によって試験した。ベクターpRO73からのVLポリペ
プチドと会合したVHingeポリペプチド、ならびにベクタ
ーpRO45からのVHポリペプチドおよびVLポリペプチドの
合成および分泌を、発現生成物を³⁵S−メチオニン（100
μCi/10⁶/ml,48時間）で生合成的に標識して検定した。
細胞上澄液を、B72.3VHおよびVLドメインに対する抗血
清による免疫沈降に付した。

VHingeおよびVLフラグメントの両者はCHO細胞上澄液
中に、還元SDS−PAGEによりそれぞれ16kDおよび12kDポ
リペプチドとして検出された。VHingeポリペプチドの、
非修飾VH対照（14kD）と比較したサイズの増大は、VHド
メインのＣ−末端上の結合構成部の17残基によって与え
られた余分の長さに一致した。

これらの結果は、VHingeポリペプチドを包含するFv構
築体が、CHO細胞によって完全な形で発現されたことを
示している。

大腸菌細胞内での発現組換えFvフラグメントが、大腸菌内で比較的大量に合
成、分泌されることは明らかにされている〔１〕。した
がって、天然のB72.3シグナル配列（残基１〜19）をコ
ードするVHinge遺伝子の部分を除去し、原核生物蛋白質
ompAからの部分で置換した。ompAシグナル配列をオリゴ
ヌクレオチドから組み立て、クローニングベクターpSK
に導入して、プラスミドpSKompAを得た。リーダー配列
を欠くB72.3VHドメインをコードする遺伝子は、pRO37か
ら得て、オリゴヌクレオチドアダプターを用いてompAリ
ーダーに融合し、プラスミドpSKompAB72.3VHを得た。同
様にして、B72.3VLドメインをompAリーダーに融合し
て、プラスミドpSKompAB72.3VLを得た。シグナル配列を
欠くB72.3VHinge配列は、pRO71からEcoR V−EcoR Iフラ
グメントとして得られ、pSKompAB72.3VH中のB72.3VH配
列の均等体として置換に使用し、ベクターpRO76を生成
させた。

ついで、pRO76からompAVHingeフラグメントを単離
し、発現ベクターpTQ9KanB72.3VLの唯一のEcoR I部位に
ブラント末端クローニングを行った。この得られたベク
ターpRO78は、図２に図式的に示した。

プラスミドpTQKanB72.3VLは、pSKompAVLからのB72.3o
mpAVL遺伝子を、予めカナマイシン抵抗性遺伝子を導入
したベクターpTQ9〔３〕に導入して構築した。

ベクターpRO78では、IPTGの添加によってVHingeおよ
びVL遺伝子の発現が誘導される。したがって、大腸菌XL
1 Blue細胞を、細胞密度がA₆₀₀＝約0.5になるまで増殖
させた。この細胞培養液にIPTGを1mMになるように加え
て発現を誘導した。

ベクターpRO78から発現したポリペプチドを細菌細胞
の上澄液から次のように精製下。ウシ顎下腺ムチンをシ
アノーゲンブロミド活性化Sepharoseにカップリングさ
せてムチン−Sepharoseを調製した。ついで、ムチン−S
epharoseカラムに充填し、0.1Mクエン酸および2M KSCN
で前洗浄し、PBSで平衡化した。

誘導細胞からの培養上澄液を限外濾過で10倍に濃縮
し、ムチン−Sepharoseカラムに適用した。PBSで洗浄
後、発現したポリペプチドを0.1Mクエン酸pH2でカラム
から溶出した。溶出物質はPBSに透析した。精製物質
は、ついで、0.1M酢酸／クエン酸、2mM EDTA,pH6.0緩
衝液で予め平衡化し、ウシ血清アルブミンでプレブロッ
クしたP19（Sephdex Ｇ−25）カラムを通過させて脱塩
した。SDS−PAGE分析により（図３）、精製物質はVHing
eおよびVL両ポリペプチドを含むことが明らかにされ
た。これらのポリペプチドのVHingeおよびVLとしての同
定はアミノ末端配列決定によって行われ、確認された。

チオール滴定実験によれば、VHingeポリペプチドの蝶
番部におけるシステイン残基は酸化されていた。したが
って、VHingeポリペプチドを、4.5mMβ−メルカプトエ
チルアミンを用いて37℃で30分間、部分還元して、蝶番
部に遊離チオール基を再生させた。二価抗原結合性蛋白
質の生成を可能にする酸化は、2.2倍モル過剰にジチオ
ピリジンを加えて一夜インキュベートすることにより達
成された。

最終反応混合物の還元および非還元両条件におけるSD
S−PAGEでの分析によれば、VHingeおよびVLポリペプチ
ドは会合してダイマーを形成し、ダイマーは所望の二価
抗原結合性蛋白質を形成するように組み立てられている
ことが明らかであった。

会合VHinge−VLポリペプチドは、部分還元生成物を架
橋剤1,6−ビスマレイミドヘキサンとインキュベートす
ると、二価抗原結合性蛋白質に不可逆的に架橋された。

これらの結果は、図３に示す。図３中、パネル（ａ）
は非還元条件下に行われた実験を示し、す。パネル
（ａ）は還元条件下に行われた実験を示す。マークされ
ていないトラックは分子量マーカーを示し、その分子量
はkDでマークの左側に示した。トラック１および４はマ
ークのFvフラグメントである。トラック１および４はB7
2.3抗体のFvフラグメントである。トラック２および５
は化学的に架橋した、二価抗原結合性蛋白質であり、
る。トラック３および６はジスルフィド結合二価抗原結
合性蛋白質である。

例２単一鎖Fv（scFv）ダイマー蛋白質の製造および分析前例における二価Fv生成物の製造に用いられた２本鎖
ヘテロダイマーに加えて、単一鎖Fv（scFv）生成物も、
二価および多価生成物の製造に使用した。これに続いて
比較実験を行った（その詳細は示していない）。その実
験ではモノマーB72.3 ２本鎖ヘテロダイマーFv,scFvお
よびFab生成物が、例１と実質的に同様にして大腸菌内
で作成された。これらの３種の生成物のB72.3抗原に対
する結合活性をELISAアッセイで比較した。得られた結
果は図４に示す。この結果はscFvおよびFab生成物が匹
敵する結合活性を有し、すべての場合で２本鎖ヘテロダ
イマーFvよりも有意に良好であった。とくに、２本鎖ヘ
テロダイマー生成物の結合活性は低濃度で著名に低下
し、これは多分、ヘテロダイマーの解離によるものと考
えられた。このため、その後の実験はscFv生成物につい
て実施した。

1.scFvhingeの構築および発現単一鎖Fvの遺伝子の構築 B72.3の単一鎖Fvをコードする遺伝子を、ompA−VL−1
5アミノ酸リンカーVH構造と次のようにして集合させ
た。プラスミドpSKompAB 72.3VLを、Hind IIIおよびEc
oR Iで二重消火し、最大のフラグメントをゲル精製した
プラスミドpSKompA−B72.3VHを、Pvu IIおよびEcoR Iで
二重消化し、VHドメインのＮ−末端３個のアミノ酸を除
く全配列をコードする約3200bpフラグメントをゲル精製
した。以下に配列を示す２つのオリゴヌクレオチドは合
成した。

これらのオリゴヌクレオチドは、配列（gly gly gl
y gly ser）×３の15アミノ酸ペプチドリンカーによ
って互いに連結されたVLのＣ−末端とVHのＮ−末端を再
構築するために設計された。これらのオリゴヌクレオチ
ドは、アニーリングし、２つの精製はフラグメントとリ
ゲートさせた。リゲーション混合物を、大腸菌XL1 Blu
e株のコンピーテント細胞にトランスフォームし、以下
に示すようなVLのHind III部位に対して位置５′からVH
のPvu IIに対して位置３′までの正しい配列をもつDNA
配列によってクローンを同定した。

ompA−VL−リンカーVH配列を有するXhol−EcoR Iフラ
グメントを、これらのクローンの一つから、Sal Iおよ
びEcoR Iで二重消化した発現ベクターpTQ9kanにサブク
ローニングした。得られたプラスミドは、pQ9KSCFv3と
命名した。

単一鎖Fv−hingeプラスミドの構築および発現プラスミドpQ9KSCFv3を、Sfi IおよびBsaH IIで二重
消化し、小さい方のフラグメントをpRO77からの同等の
フラグメントで置換し、Ｃ−末端上の17アミノ酸hinge
配列とVHドメインをもつ、単一鎖Fv変異体を包含するプ
ラスミドpRO93を生成させた。この単一鎖Fvhingeポリペ
プチドを大腸菌株XL1 Blueで発現させて、IPTG誘発培
養液の上澄液から未変異Fvhingeフラグメントについて
記載したと同様に回収した。を二価単一鎖分子の製造に必要な蝶番部／リンカー配列
の長さを検討するために、第二の短縮蝶番型単一鎖Fv−
蝶番部構築体を作成した。この構築体には、ヒトIgG4
（Cys→Ala）配列を、ヒトCH1重鎖IgGCH1ドメインのＮ
−末端由来の５アミノ酸スペーサー要素を用いないで直
接、B72.3VHのＣ−末端に融合させた。この構築体の配
列を図５に示す。

以下に記載するように、ポリメラーゼ連鎖反応〔４〕
を用いて、修飾単一鎖Fv−蝶番部を構築した。鋳型とし
て、プラスミドpSKompAB72.3VHを用い、PCRにより、以
下の隣接オリゴヌクレオチドプライマーで、フラグメン
トを発生させた。

得られたフラグメントをXho1およびEcoR Iで制限切断
し、ベクターpSKにクローン化して、プラスミドpRO94を
得た。Xho1−EcoR Iフラグメントをこのプラスミドから
回収し、pTq9ベクターにクローン化して、プラスミドpR
O96を製造した。この新しいB72.3VHinge配列をSfi I/Bs
sH II制限部位によって単一鎖Fvベクターに挿入し、プ
ラスミドpRO97を発生させた。

pRO97プラスミドを大腸菌XL1 Blue株で発現させ、単
一鎖Fv−蝶番部ポリペプチドを、未変異体fv−蝶番部フ
ラグメントに関連して記載したと同様にして、IPTG誘導
培養液の細胞上清から精製した。

同じアプローチが、VHまたはVLドメインのＣ−末端に
結合させることができる他の蝶番部／リンカー配列の製
造に使用できた。この方法で以下の変異体が製造された
（アミノ酸変化には下線を付した）。

ASTKGESＴYGPPCPSAP ASTＴGESKYGPPCPSAP ASTＴGESＴYGPPCPSAP 2.scFvhingeの精製 B72.3scFvhinge生成物をムチン−Sepharose上アフィ
ニティ−クロマトグラフィーを用いて大腸菌培養上清か
ら精製した。ウシ顎下線ムチンは、標準方法により、CN
Br−活性化Sepharose4Bに、30mg/ml Sepharoseでカッ
プリングさせた。カラムは2Mチオシアン酸カリウムおよ
び0.1Mクエン酸で前洗浄し、PBS中に平衡化した。大腸
菌上清を遠心分離および濾過で澄明化し、pHを７以上に
調整した。プロテアーゼインヒビターのカクテルを培養
上清に加え、scFvhingeの蛋白分解を防止した。このカ
クテルの組成は、EDTA（1mM）、アプロチニン（５μg/m
l）、ロイペプチン（１μg/ml）、パパタチンＡ（１μg
/ml）、ベンズアミジン（1mM）、アンチパイン（１μg/
ml）およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（1m
M）であった。サンプルをカラムに負荷し、ついでPBSで
洗浄し、0.1Mクエン酸pH2で溶出した。カラムは再使用
の前に2Mチオシアン酸カリウムで洗浄した。精製scFvhi
ngeはカラムから溶出したならば直ちにpHを７に調整
し、限外濾過によって濃縮した。

scFvhinge生成物のムチン−Sepharose上での精製は、
これらの条件下にscFvhingeが定量的に結合し、溶出す
ることから、効率的であるである。この方法で精製した
scFvhingeの純度は通常95％以上で、精製蛋白質の大部
分はモノマーの形であった。

3.scFvhingeダイマーの形成精製scFvhingeを、2mM EDTA含有pH7のリン酸緩衝食
塩溶液に緩衝剤交換を行い、ジチオスレイトールを20mM
になるように添加し、ついで室温で１時間インキュベー
トして部分還元した。この操作は、蝶番部に遊離のチオ
ールを発生させるルーチンな方法で、フォールディング
したVHおよびVLドメインの内部ジスルフィド結合を切断
することはない。4,4′−ジチオジピリジンで滴定し、
標準分光測定検定法〔５〕を用いて遊離チオール数をチ
ェックし、還元されたscFvhingeはダイマー種の製造に
使用した。ジスルフィド連結ダイマーは、還元型scFvhi
ngeを2.2倍モル過剰の4,4′−ジチオジピリジンと室温
で一夜インキュベートすると生成した。ダイマー物質を
ついで、DuPont Zorbox GF−250カラムを0.2Mリン酸
緩衝液pH7.0で流したHPLCゲル濾過によって精製し、未
反応モノマーを除去した。化学的に架橋したダイマー
は、還元型scFvhingeを2.2倍モル過剰の1,6−ビスマレ
イミドヘキサンと室温で一夜反応させて製造した。架橋
ダイマーは、この場合もゲル濾過HPLCで精製され、残っ
たscFvhingeが除去された。

scFvhingeダイマーの分析ダイマーのSDS−PAGE分析により、ダイマーが期待さ
れた分子量約56kDaを示すことが明らかにされ、これは
¹²⁵Iによる標識時にも維持された（図６参照）。ELISA
フォーマットを用いた抗原結合アッセイでは、ダイマー
種（ジスルフィドおよび化学的架橋）の抗原結合能は、
それ自体Fab′標準品に比べて完全な抗原結合活性をも
つことが示されたscFvhingeに比較して、有意に改善さ
れたことが明らかにされた（図７）。

同様にpRO97によって製造されたscFvhingeの短縮蝶番
型についても、完全長のscFvhinge生成物について上述
した精製、ダイマー種の調製および試験を行った。得ら
れた結果を図８（完全長および短縮蝶番型の両者につい
てのscFvhingeモノマーおよび架橋ミックスによるダイ
マーの還元SDS−PAGEの結果を示す）および図９（同じ
生成物についてのELISA結合アッセイの結果）に示す。

完全長scFvhingeダイマーがin vivoにおいて腫瘍を
標的化する能力を、マウスジェノグラフ実験で試験し
た。scFvhingeおよびダイマー種（ジスルフィドおよび
化学的架橋）を、標準方法によりBolton Bunter試験を
用い、¹²⁵Iで比活性約0.1μCi/μｇに標識した。この方
法による標識では免疫活性は維持された。側腹部に皮下
LS174T腫瘍をもつヌードマウスを１群４匹として、適
宜、７μｇのscFvhingeモノマーまたはダイマー種（ジ
スルフィドおよび化学的架橋）を注射し、各群の動物を
所定の時間に屠殺して生物学的分布を測定した。生物学
的分布は、血液、筋肉、大腿部、肺臓、肝臓、脾臓、腎
臓、結腸および腫瘍のサンプルを採集し、秤量し、7M水
酸化カリウムに溶解し、LKB1270型ガンマーカウンター
でカウントした。結果は組織1gあたりの注射用量に対す
る平均百分率±標準偏差で表した。

生物学的分布の分析結果から、scFvダイマー種はscFv
hingeモノマーに比較してより効率的に腫瘍に結合し、
その結果、より高い腫瘍：血液比を示した（図10）。

トリマーscFvhingeの形成および分析上述のように製造し、上述したのと同じ条件下に還元
した完全長scFvhingeを、トリマレイミドリンカー（CT5
57）とインキュベートしてトリマーに架橋した。CT557
の調製については、同日出願の係属中の本発明者らの英
国特許出願“Chemical compound"に記載されている。P
BS/EDTA,pH7.0中、還元型scFvhingeをCT557とともに、s
cFvhinge:CT557＝6:6.1のモル比で、一夜室温において
インキュベートした。この操作では、Bakerbond Abx.
上混合様式イオン交換を用いて精製し、SDS−PAGE分析
した結果から判断してトリマーの形成が認められた。ト
リマーの粗製混合物を0.1M酢酸ナトリウムpH5.5に対し
て透析し、同じ緩衝液で平衡化したAbxカラムに適用し
た。同じ緩衝液で洗浄したのち、1M硫酸アンモニウムを
含有する100mM酢酸ナトリウムpH6.7で溶出した。精製さ
れたトリマーをついでPBCに透析して、さらに分析に付
した。

SDS−PAGEでは、精製トリマーに相当する約85kDa（図
11）のバンドが認められ、ELISA抗原結合アッセイで
は、トリマーがダイマーおよびモノマーのいずれよりも
効率的に抗原に結合することが明らかにされた（図1
2）。この抗原への結合能の上昇はin vivoでも認めら
れた。マウスLS174Tジェノグラフトモデルによる生物学
的分布の実験では、ダイマーおよびモノマーのいずれよ
りもscFvhingeトリマーの腫瘍への局在レベルは高かっ
た（図13）。

scFvhingeテトラマーの形成上述したのと同じ方法で製造された還元型scFvhinge
を用いて、scFvhingeテトラマーを製造した。還元型scF
vhingeをついでテトラマレイミドリンカー（CT558）
と、scFvhinge:CT558＝8:8.1のモル比で、一夜室温にお
いてインキュベートした。CT558の調製については、同
日付出願の係属中の本発明者らの英国特許出願“Chemic
al Compound"に記載されている。scFvhingeテトラマー
の形成はSDS−PAGE分析によって証明された（図14）。

本発明を以上、例示だけの目的で説明したが、本発明
の範囲から逸脱することなく、本技術分野の熟練者によ
れば、本発明には多くの修飾および改変が自明であろ
う。

参考文献一覧表［１］ Skarra,A.and Pluckthun,A.,Science,240,1038
−1041,1988. ［２］ Stephans,P.E.and Cockett,M,I.,Nuc.Acids.Re
s.,17,7110,1989. ［３］ Stark,M.J.,Gene,51,255−267,1987. ［４］ PCR Technology:Principles and Applications
for DNA Amplification（ed.H.A.Erlich）,Macmillan
1989. ［５］ Lyons,A.,King,D.J.,Owems,R.J.,Yarranton,G.
T.,Millican,A.,Whittle,N.R.,and Adair,J.R.,（199
0）,Protein Engineering,３,703−708.

フロントページの続き (72)発明者マウンテン，アンドリューイギリス国アールジー11 ３ディーユーバークシャー，ウオーキンガム，オールドウオーキンガムロード，セントマイクルコッテッジス４ (72)発明者オーウェンズ，レイモンド，ジョンイギリス国アールジー９１エスエィチオックスフォードシャー，ヘンリー ― オン ― テームズ，ハミルトンアベニュー 23 (72)発明者ヤラントン，ジョフリィ，トーマスイギリス国アールジー11 ５エヌジェイバークシャー，エヌアール．リーディング，ウィンナーシュ，シャーウッドロード８ (56)参考文献国際公開88／9344（ＷＯ，Ａ１) 国際公開88／1649（ＷＯ，Ａ１) 欧州特許出願公開338745（ＥＰ，Ａ１) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．211, Ｎｏ．４，Ｆｅｂ 1990，ｐ．943−958 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．85，Ａｕｇ 1988，ｐ．5879−5883 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｄｅｃ 1986，ｐ．1041−1043 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 1/00 - 19/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原結合性蛋白質であって、（ａ）３または４つのVHドメイン；（ｂ）それぞれのVHドメインのＣ−末端に結合したスペ
ーサーポリペプチド；（ｃ）それぞれのスペーサーポリペプチドのＣ−末端に
結合した、結合性残基を有する結合ポリペプチド；およ
び（ｄ）それぞれのVHドメインに結合して抗原結合性Fvフ
ラグメントを形成しているVLドメインからなり、該結合ポリペプチドは結合性残基を介して架
橋しており、該Fvフラグメントは抗原決定基に結合でき
るように空間を置いてそれぞれ保持されている、上記抗
原結合性蛋白質。
【請求項２】それぞれの結合ポリペプチドは抗体ヒンジ
のコア部分からなり、ジスルフィド結合により架橋して
いる請求項１記載の抗原結合性蛋白質。
【請求項３】結合性残基は、システイン、リシン、グル
タミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選ばれる
請求項１記載の抗原結合性蛋白質。
【請求項４】それぞれのスペーサーポリペプチドはマレ
イミド部分に結合しており、VH−CH1ポリペプチド鎖お
よびVL−CLポリペプチド鎖からなる群より選ばれる請求
項１記載の抗原結合性蛋白質。
【請求項５】スペーサーポリペプチドは、更に抗体ヒン
ジ領域のＮ−末端部分を含む請求項４記載の抗原結合性
蛋白質。
【請求項６】スペーサーポリペプチドは、のアミノ酸配列からなる群より選ばれる請求項１記載の
抗原結合性蛋白質。
【請求項７】結合ポリペプチドは、のアミノ酸配列からなる群より選ばれる請求項１記載の
抗原結合性蛋白質。
【請求項８】一つ抗原特異性のみを有する請求項１記載
の抗原結合性蛋白質。
【請求項９】複数の抗原特異性を有する請求項１記載の
抗原結合性蛋白質。
【請求項１０】一つあるいはそれ以上のFvフラグメント
が、１本鎖Fvである請求項１記載の抗原結合性蛋白質。
【請求項１１】抗原結合性蛋白質であって、（ａ）トリマレイミドまたはテトラマレイミドからなる
群より選ばれるマレイミド部分からなる結合ユニット；（ｂ）該結合ユニットにおけるそれぞれのマレイミド部
分に、そのＣ−末端が結合したスペーサーポリペプチ
ド；および（ｃ）それぞれの該スペーサーポリペプチドに、ペプチ
ド結合により、それぞれのそのＣ−末端が結合した３ま
たは４つのVHドメインからなり、それぞれのVHドメインはVlドメインに結合し
て抗原結合性Fvフラグメントを形成し、該Fvフラグメン
トは抗原決定基に結合できるように空間を置いてそれぞ
れ保持されている、上記抗原結合性蛋白質。
【請求項１２】マレイミド部分に結合したそれぞれのス
ペーサーポリペプチドは、３から16個のアミノ酸残基の
長さを有する請求項11記載の抗原結合性蛋白質。
【請求項１３】マレイミド部分に結合したそれぞれのス
ペーサーポリペプチドは、７から12個のアミノ酸残基の
長さを有する請求項12記載の抗原結合性蛋白質。
【請求項１４】マレイミド部分に結合したそれぞれのス
ペーサーポリペプチドは、10個のアミノ酸残基の長さを
有する請求項13記載の抗原結合性蛋白質。
【請求項１５】マレイミドに結合したそれぞれのスペー
サーポリペプチドは、VH−CH1ポリペプチド鎖およびVL
−CLポリペプチド鎖からなる群より選ばれる請求項11記
載の抗原結合性蛋白質。
【請求項１６】一つ抗原特異性のみを有する請求項11記
載の抗原結合性蛋白質。
【請求項１７】複数の抗原特異性を有する請求項11記載
の抗原結合性蛋白質。
【請求項１８】一つあるいはそれ以上のFvフラグメント
が、１本鎖Fvである請求項11記載の抗原結合性蛋白質。
【請求項１９】モノ特異的抗原結合性蛋白質であって、（ａ）トリマレイミドまたはテトラマレイミドからなる
群より選ばれるマレイミド部分からなる結合ユニット；（ｂ）該結合ユニットにおけるそれぞれのマレイミド部
分に結合したスペーサーポリペプチド；および（ｃ）それぞれの該スペーサーポリペプチドに、ペプチ
ド結合により、それぞれのそのＣ−末端が結合した３ま
たは４つのVHドメインからなり、それぞれのVHドメインはVlドメインに結合し
て抗原結合性Fvフラグメントを形成し、該Fvフラグメン
トは抗原決定基に結合できるように空間を置いてそれぞ
れ保持されている、上記抗原結合性蛋白質。
【請求項２０】モノ特異的抗原結合性蛋白質であって、（ａ）３または４つのVHドメイン；（ｂ）それぞれのVHドメインのＣ−末端に結合したスペ
ーサーポリペプチド；（ｃ）それぞれのスペーサーポリペプチドのＣ−末端に
結合した、結合性残基を有する結合ポリペプチド；およ
び（ｄ）それぞれのVHドメインに結合して抗原結合性Fvフ
ラグメントを形成しているVLドメインからなり、該結合ポリペプチドは結合性残基を介して架
橋しており、該Fvフラグメントは抗原決定基に結合でき
るように空間を置いてそれぞれ保持されている、上記抗
原結合性蛋白質。