TW201734037A - 多重專一性分子 - Google Patents

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麥可 羅斯 路克
菲爾 安東尼 詹寧斯
安東尼 賽門 羅伯特斯
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Abstract

本文之揭示內容係關於多重專一性分子，其等能夠同時結合至少二種不同的目標抗原或表位。該等分子包含至少一個與第一目標抗原或表位結合之結合功能域分子(BDM)，該BDM係經修飾以與異源性目標選擇性結合，與為和第二目標抗原或表位結合之抗體或其抗原結合片段或非抗體蛋白質或胜肽之藥理活性蛋白質或胜肽耦合，該等BDM係與該藥理活性蛋白質或胜肽內出現之多肽之C端耦合。

Description

多重專一性分子
本文之揭示內容係關於多重專一性分子，其等能夠同時結合至少二種不同的目標抗原或表位。該等分子包含至少一個與第一目標抗原或表位結合之結合功能域分子(BDM)，該BDM係經修飾以與異源性目標選擇性結合，與為和第二目標抗原或表位結合之抗體或其抗原結合片段或非抗體蛋白質或胜肽之藥理活性蛋白質或胜肽耦合，該等BDM係與該藥理活性蛋白質或胜肽內出現之多肽之C端耦合。
以引用方式納入納入
所有於本文中引用或參考之文獻、與所有在於本文中引用之文獻中引用或參考之文獻、加上於本文中或於任何以引用方方式納入本文中之文獻中提及之任何產品之任何製造商之指引、描述、產品說明書、與產品表單皆特此以其等之完整內容以引用方式納入本文中。
本申請案根據澳洲專利申請案編號2016900708與澳洲專利申請案編號2016900709(其等之完整內容係以引用方式納入於本文中)主張優先權。
序列表之參照
電子呈送之序列表之完整內容係為所有目的以其之完整內容以引用方式納入。
已開發出一些重組蛋白質作為治療劑。然而，已知蛋白質於其等之未經修飾形式於活體內被腎過濾、網狀內皮系統中之細胞清除機制、或蛋白分解性降解快速地移除(Francis(1992)Focus on Growth Factors 3：4-11)。已開發出種種蛋白質與胜肽之修飾以增加治療性蛋白質之穩定性、循環時間與生物活性(參見Francis(1992)Focus on Growth Factors 3：4-10)。然而，於所屬技術領域中對於允許如此治療性蛋白質於活體內存留更久之機制存在有需求。
治療性單株抗體以及與抗體相關的產品(諸如抗體融合蛋白質、抗體片段、與抗體-藥物共軛物(於以下一起被稱為抗體產品))已漸漸變成生物醫藥市場內之首要產品種類。今日，抗體產品被核准用於治療各種各樣之疾病，包括一些癌症、多發性硬化症、氣喘與類風溼性關節炎(僅列舉一些)。
儘管抗體藥物開發領域有此最近之空前成功，對某些疾病目標缺乏效力已促使去尋找新策略以開發更有效之抗體藥物。一種用以改善抗體之效力之方法係去開發同時與二種目標結合之似抗體蛋白質結構(即雙專一性物)。正常之抗體僅可結合一個專一目標(即其具有一種專一性)。 雙專一性物大體而言係一種經設計之蛋白質，其係由二種不同的抗體或似抗體片段(稱為似抗體支架)構成，其等被融合在一起以使得該雙專一性物可同時與二種不同類型之目標結合(即二種專一性)。大部分的似抗體支架大體而言係自抗體之片段構築或自可與專一目標結合(與抗體類似)之似抗體蛋白質製造。雙重專一性抗體允許更有效能之抗體藥物，其可被設計成會使免疫效應細胞(諸如T細胞)改向並活化之以專一性地殺死腫瘤；與多種目標結合並實現多種致病性途徑；與一個目標細胞或蛋白質上之多個位置結合以增加專一性或誘發協同性誘發；以及瞄準在本質上係異質之腫瘤。
目前，一個利用現存技術且被執行以產生雙專一性抗體產品之重要區別物係將種種似抗體支架融合在一起以產生雙專一性物之一般方法。此類型之雙專一性物具有一些顯著的缺點：首先，藉由將二或多個似抗體支架融合在一起而創造之雙專一性物之小尺寸大體而言係明顯低於腎閾且典型會顯示非常短之血液循環半生期，其範圍在數分鐘至數小時。如此短的半生期使每日之給藥間隔或透過持續灌注成為必須，其可能導致超過藥物之毒性閾值。此外，第二，許多似抗體支架對於其等之目標之親和力係不充分的，而此係由於其等之單價天性(即其等僅具有一個抗原結合位置，相較於具有二個的抗體)。完整之抗體以兩個抗原結合位置結合，改善整體結合強度(稱為結合功效)，其相較於單價似抗體支架給予某種優點。
目前，僅有數目有限之可產生呈完整IgG之形式之雙專一性抗體產品之方法。大體而言，此等方法設計抗體主鏈以允許二個具有不同的專一性之不同的親本抗體結合在一起以形成具有與不同目標結合之複數 臂之單一IgG(即卡妥索單抗(Catumaxomab))。此完整抗體方法相較於融合較小之片段具有某些優點，然而，雖然此類型之完整IgG雙專一性方法迴避於小型片段雙專一性物中所見之半生期問題，其並未解決喪失結合性之問題，而此係因為對於每個目標而言雙專一性物只有一臂與之結合。
因此，所屬技術領域中對於以下者有需求：協助改善現存治療性蛋白質與抗原結合性分子之治療效力及/或半生期之改善如此分子之方法。此外，所屬技術領域中對於以下者有需求：克服於目前之雙專一性抗體方法與其等之應用中所見之缺點之方法。
本文之揭示內容係基於用於改善蛋白質或胜肽(包括抗體或免疫球蛋白抗原結合片段)之一或多個特徵之方法。更明確言之，本文之揭示內容係基於藉由使差的治療性蛋白質(例如治療性抗體)轉變成多重專一性形式來改善其之方法。使該蛋白質或胜肽與至少一個於本文中描述之結合功能域分子(BDM)耦合提供雙專一性或多重專一性分子，因此憑藉利用該蛋白質與該BDM之不同結合目標(即抗原或表位)而允許該分子與不同的目標結合。因此，該蛋白質或胜肽之一或多個特徵可被改善，包括治療效力、半生期、免疫銜接、結合性、細胞穿透力及/或容忍性。該等分子因此提供傳統雙專一性抗體外之另外的選項。
較佳地，被該BDM結合之目標抗原或表位與被該蛋白質或胜肽結合之目標抗原或表位不同。例如，該蛋白質可與於細胞或組織上出現之目標抗原或表位結合且該BDM可與於免疫調節細胞(諸如細胞毒性T 細胞)或蛋白質上之目標抗原或表位結合以幫助殺死細胞、或與於人類血清白蛋白(HSA)上之目標抗原結合以使得該蛋白質或胜肽之半生期可被延長。
藉由利用該蛋白質或胜肽與該BDM與其等之目標之同時結合，該蛋白質或胜肽之治療效力可藉由利用該BDM與之結合之目標之官能而促升。藉由使另外的BDM與該蛋白質或胜肽耦合，該蛋白質或胜肽可被轉變成雙專一性物、三專一性物或甚至多專一性物。尤其，該等BDM之較小尺寸、結合親和力特徵與溶解度使得其等為用於改善差的治療性蛋白質或胜肽之效力(例如促進身體之天然免疫機制以摧毀腫瘤細胞)之理想之劑。
本文之揭示內容因此提供能夠與二或多種不同的目標抗原或表位結合之多重專一性分子，該分子包含：(i)至少一個與第一目標抗原或表位結合之結合功能域分子(BDM)，該BDM包含似V功能域(VLD)支架或由VLD支架組成，其內含有三個暴露之結合環(BL)且其中該三個BL中之至少二者相較於其等之支架中的相對應天然序列係經修飾或置換以與異源性目標抗原或表位選擇性結合；與(ii)藥理活性蛋白質或胜肽，其係與第二目標抗原或表位結合之抗體或其抗原停留片段或非抗體蛋白質或胜肽；其中該至少一個BDM係與該藥理活性蛋白質或胜肽內出現之多肽之C端耦合。
於一個實例中，該藥理活性蛋白質與其之天然目標抗原或表位結合。
較佳地，該等表位係在分開的抗原上。
於一個實例中，該第一與第二目標抗原係不同的。於一個實例中，該第一與第二目標抗原係相同的但該分子與該目標抗原上之不同的表位結合。於一個實例中，該第一與第二目標表位係不同的。
於一個實例中，該分子係雙專一性物。於一個實例中，該分子係三專一性物。
於一個實例中，該分子包含一、二、三、四或五個BDM(或其多聚體，例如BDM二聚體)。於另一個實例中，該分子包含一對或二對BDM，其中於該對中之該等BDM係完全相同的。於一個實例中，一、二或三個BDM(或其多聚體，例如二聚體)係與該非抗體蛋白質或胜肽耦合。
於一個實例中，該分子包含最少二個BDM，或至少一對BDM，其中各BDM(或BDM對)與不同的目標抗原或表位結合。於另外的實例中，各BDM(或BDM對)與和該藥理活性蛋白質或胜肽與之結合之目標抗原或表位不同之目標抗原或表位結合。
於另一個實例中，二、四、六、或八個BDM係與該全長抗體耦合，其中該分子與至少二個不同的目標抗原或表位結合。於一個實例中，該分子與二個不同的目標抗原或表位結合。於另一個實例中，該分子與三個不同的目標抗原或表位結合。於另一個實例中，該分子與四個不同的目標抗原或表位結合。
於一個實例中，該醫藥活性蛋白質係全長抗體或免疫球蛋白其抗原結合片段。於另一個實例中，該蛋白質係非抗體蛋白質或胜肽。
於一個實例中，該非抗體蛋白質或胜肽係選自由以下者所組 成之群組：凝血因子、抗運載蛋白(anticalin)、類毒素、膠原結合蛋白、人類血清結合蛋白(例如人類血清白蛋白，HSA)、腫瘤壞死因子(TNF)-α受體結合蛋白、整聯蛋白結合蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)或其擬似物、促紅血球形成素(EPO)或其擬似物、C4結合蛋白、尿激酶受體拮抗劑、淋巴激素、細胞介素、護骨素(osteoprotegerin，OPG)、或選自計畫性細胞死亡1蛋白質(PD1)、計畫性死亡配體1(PD-L1)、NKG2D、與第I類MHC多肽相關之序列A(MICA)、與第I類MHC多肽相關之序列B(MICB)、UL16結合蛋白(ULBP)之蛋白質之細胞外功能域。
於一個實例中，該凝血因子係因子VIII或因子IX。
於一個實例中，該類毒素係肉毒桿菌類毒素。
於一個實例中，該淋巴激素係IL-2或其擬似物或GM-CSF或其擬似物。
於一個實例中，該細胞介素係G-CSF或其擬似物或幹細胞因子(SCF)或其擬似物。
於一個實例中，該分子包含一個與該非抗體蛋白質耦合之BDM。於一個實例中，BDM與非抗體蛋白質之比率係1：1。
於一個實例中，該至少一個BDM係與抗體重鏈多肽之C端耦合。於一個實例中，該至少一個BDM係與兩個抗體重鏈多肽之C端耦合。
於一個實例中，該至少一個BDM係與抗體輕鏈多肽之C端耦合。於一個實例中，該至少一個BDM係與兩個抗體輕鏈多肽之C端耦合。
於一個實例中，該至少一個BDM係與所有抗體重鏈與輕鏈多肽之C端耦合。
於一個實例中，該至少一個BDM係與抗體重鏈多肽之CH1、CH2或CH3功能域之C端耦合。
於一個實例中，該至少一個BDM係與抗體Fc之C端耦合。
於一個實例中，至少一個BDM係與以下者耦合：(i)抗體輕鏈多肽之C端；(ii)各個抗體輕鏈多肽之C端；(iii)抗體重鏈多肽之C端；(iv)各個抗體重鏈多肽之C端。
根據本文之揭示內容之全長抗體或免疫球蛋白抗原結合片段本身可為單專一性或雙專一性。於單專一性抗體之例子中，其意謂該抗體透過對該目標抗原或表位共有相同之專一性之互補重鏈與輕鏈可變功能域(即一對VH/VL)與單一目標或表位結合。雙專一性抗體在Y形抗體分子之各臂上包含一個VH/VL對，其中各VH/VL與不同的目標抗原或表位結合。
全長抗體包含二個重鏈與二個輕鏈，各形成一對。因此，於一個實例中，抗體鏈與BDM之比率係4：2。於一個實例中，該分子包含與抗體耦合之四個BDM(即在各上輕鏈一個BDM且在各重鏈上一個BDM)。於一個實例中，抗體鏈與BDM之比率係4：4。於一個實例中，該分子包含與抗體耦合之六個BDM。於一個實例中，抗體鏈與BDM之比率係4：6。於另一個實例中，該分子包含與抗體耦合之八個BDM。於另一個實例中，抗體鏈與BDM之比率係4：8。於另一個實例中，抗體鏈與BDM之比率係4：2n，其中n係介於1與5間之數字，包括1與5。
於一個實例中，該免疫球蛋白抗原結合片段係選自由Fab、 F(ab’)2、Fab’、scFv、二-scFv、或經化學連接之F(ab’)2所組成之群組。
於一個實例中，該分子包含與免疫球蛋白抗原結合片段耦合之單一BDM。於一個實例中，免疫球蛋白抗原結合片段鏈與BDM之比率係2：1。於一個實例中，免疫球蛋白抗原結合片段鏈與BDM之比率係2：2。於另一個實例中，BDM之鏈可與該抗原結合片段耦合，其中免疫球蛋白抗原結合片段鏈與BDM之比率係2：n，其中n亦介於1與16間之數字。於另一個實例中，n係介於1與14間、介於1與12間、介於1與10間、介於1與8間、介於1與4間、或2、或1之數字。
本文之揭示內容考慮一些其中該至少一個BDM可與全長抗體耦合之不同組態，例如：(i)至少一個BDM係與抗體之重鏈多肽之CH3功能域C端耦合；(ii)至少一個BDM係與輕鏈多肽之CH1功能域之C端耦合；(iii)至少一個BDM係與重鏈多肽之CH3功能域之C端耦合並與輕鏈多肽之CH1功能域之C端耦合；(iv)至少一個BDM係與兩個重鏈多肽之CH3功能域之C端耦合；或(v)至少一個BDM係與兩個輕鏈多肽之CH1功能域之C端耦合。
關於免疫球蛋白抗原結合片段，BDM可與該免疫球蛋白片段之重鏈或輕鏈之C端耦合。於另一個實例中，BDM可與該免疫球蛋白片段之重鏈與輕鏈兩者之C端耦合。於另一個實例中，該BDM可與該免疫球蛋白片段(例如Fab)之輕鏈及/或重鏈之恆定功能域(例如CH1)耦合。
例如：(i)至少一個BDM係與Fab之輕鏈多肽之恆定區域之C端耦合； (ii)至少一個BDM係與Fab之重鏈多肽之CH1之C端耦合；或(iii)至少一個BDM係與該輕鏈多肽之恆定區域之C端及Fab之重鏈多肽之CH1之C端耦合。
根據本文之揭示內容之BDM較佳包含內含有三個暴露之結合環(BL)之支架或係由其組成。該支架可選自由含似免疫球蛋白(似Ig)功能域之超家族成員、似V功能域、i-體、VNAR或VHH所組成之群組。
於一個實例中，該經暴露之BL序列相較於天然BL序列係經修飾或置換以提供具有對異源性目標抗原或表位之選擇性結合之經改變之結合環。此等結合環分別被稱為BL1、BL2與BL3，如於圖1A中闡明的。該等BL係與抗體可變區域之CDR1、CDR2與CDR3區域類似。
於一個實例中，BL1與BL3相較於天然BL序列係經修飾或置換。於另一個實例中，BL1、BL2與BL3相較於天然BL序列係經修飾或置換。
於另一個實例中，該BDM支架與人類免疫球蛋白可變區域功能域具有少於約20%序列一致性、該支架具有二或多個經改變之BL且展現對異源性目標抗原或表位之選擇性結合。
該含似Ig功能域之超家族成員可選自由以下者所組成之群組：似V功能域(VLD)、C-set功能域、ThyOx家族成員多肽、T細胞受體、CD2、CD4、CD8、第I類MHC、第II類MHC、CD1、細胞介素受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、激素受體、生長激素受體、促紅血球形成素受體、干擾素γ受體、泌乳素受體、NCAM、VCAM、ICAM、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、纖維接合素、生腱蛋白、與含I-set功能域多肽或其等之功能性片段。
根據本文之揭示內容之BDM支架可選自由似V功能域(VLD)、C1 set功能域或C2 set功能域所組成之群組。與該蛋白質或胜肽耦合之BDM之組合亦被考慮。作為闡明，一個BDM可係VLD且另一個BDM可係C set功能域。
於一個實例中，該BDM支架包含天然VLD或相較於天然VLD具有改變之結合環(即經修飾之BDM)之VLD之細胞外部分或係由其組成，其中該VLD係來自選自由以下者所組成之群組之蛋白質：ACAN、ADORA3、ALCAM、JAML、AMIGO1、AXL、basigin、BCAM、BTNL2、3、8、9或10、嗜乳脂蛋白(butyrophilin，BTN)、細胞黏著分子(CAM)、CD2、CD4、CD7、CD8、CD28、CD33、CD48、CD79、CD80、CD83、CD86、CD101、CD112、CD226、CD274、CD276、CD300、與癌胚抗原相關之細胞黏著分子(CEACAM)、CRTAM、CTLA4、CXADR、C10orf54、ERMAP、ESAM、FAM187A、FCAMR、F11R、GPA33、玻尿酸與蛋白聚糖連接蛋白(HAPLN)、HAVCR1、HEPACAM、HHLA2、HSPG2、ICOS、IGHA、IGSF、JAM2、JAM3、KDR、KIRREL、LY6G6F、MCAM、MOG、MPZ、MXRA8、NCA、NCR2、NCR3、NPHS1、PD1、PDCD1、PIGR、PILR、PSG、PTGFRN、PVR、鈉通道次單元蛋白質(SCN)、SEMA3D、Siloadhesin蛋白(SIGLEC)、訊號調節蛋白(SIRP)、SLAMF6、SLAMF7、TIGIT、TIMD4、TREM、TREML、VCAN、VPREB、VSIG、VSTM、與VTCN1。
於一個實例中，該BDM支架包含天然C-set功能域(C1-set或C2-set功能域)或相較於天然C-set功能域具有經改變之結合環之C-set功能域(即經修飾之C-set功能域)之細胞外部分或係由其組成，其中該C-set 功能域係來自選自由以下者所組成之群組之蛋白質：AZGP1；basigin、B2M；CEACAM1、3、4、5、6、7、8；CD1A；CD1B；CD1C；CD1D；CD1E；DMA；DQB2；DRB1；ELK2P1；FCGRT；HFE；HHLA2；HLA-A；HLA-B；HLA-B35；HLA-B57；HLA-C；HLA-CW；HLA-Cw；HLA-D；HLA-DMA；HLA-DMB；HLA-DOA；HLA-DOB；HLA-DP；HLA-DPA1；HLA-DPB1；HLA-DQA1；HLA-DQA2；HLA-DQB1；HLA-DQB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB2；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRw12；HLA-Dw12；HLA-E；HLA-F；HLA-G；HLA-G2.2；HLA-H；HLAC；IGHA1；IGHA2；IGHD；IGHE；IGHG1；IGHG2；IGHG3；IGHG4；IGHM；IGHV4-31；IGKC；IGKV1-5；IGKV2-24；IGL@；IGLC1；IGLC3；IGLL1；IGLV2-14；IGLV3-21；IGLV3-25；IGLV4-3；MICA；MICB；MR1；SIRPA；SIRPB1；SIRPG；SNC73；TAPBP；TAPBPL；TRBC1；TRBV19；TRBV21-1；TRBV3-1；TRBV5-4；TRBV7-2；micB、CD2、CD4、CD80、VCAM與ICAM。
於一個實例中，該BDM支架包含整個天然似Ig功能域或相較於天然似Ig功能域具有經改變之結合環(即經修飾之似Ig功能域)之似Ig功能域或其部分或係由其組成，其中該似Ig功能域係選自由以下者所組成之群組：ThyOx家族成員多肽、T細胞受體、CD2、CD4、CD8、第I類MHC、第II類MHC、CD1、細胞介素受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、激素受體、生長激素受體、促紅血球形成素受體、干擾素γ受體、泌乳素受體、NCAM、VCAM、ICAM、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、纖維接合素、生腱蛋白、與含I-set功能域多肽或其等之功能性片段。
術語「經修飾之VLD」、「經修飾之C-set功能域」、等等用 於本文中係關於BDM，其中所暴露之結合環之至少二者且較佳為三者皆被改變以提供對異源性目標抗原或表位之結合。該改變可藉由胺基酸取代或置換整個個別結合環或其部分來達成。於該結合環中之經改變之胺基酸序列賦予對除被未經改變之含似Ig功能域支架結合者以外之目標抗原之選擇性結合活性。該等胺基酸改變可於核酸或多肽水平使用所屬技術領域中已知之方法製造。
VLD或C-set功能域可涵蓋與異源性目標抗原或表位結合之BDM。經修飾之VLD或C-set功能域亦可包含一或多個改變該BDM對其之天然目標之親和力之修飾。該對天然目標之親和力相較於天然VLD或C-set功能域可係增加或減少。
於一個實例中，該經修飾之BDM包含與天然VLD或Cset功能域之序列至少約60%、70%、75%、80%、85%、87%、90%、或95%一致之序列或係由其組成。
所屬技術領域中具有通常知識者會熟習選擇適當之異源性結合環序列以提供該BDM與所欲之目標抗原之結合。如此實例包括該等於US 7,166,697(其完整內容係藉由引用方式納入本文中)中描述者。
於另一個實例中，該BDM包含相較於相對應天然VLD或C-set功能域蛋白包含介於5與30個胺基酸取代、介於5與20個胺基酸取代、介於5與15個胺基酸取代、介於5與10個胺基酸取代、或至多達5個胺基酸取代之整個VLD蛋白或C-set功能域蛋白或其部分或係由其組成。於另一個實例中，該BDM非係於US 7,094,874中描述之CLTA-4 VLD突變分子L104EA29Y或L104E。
於某些實例中，該經修飾之BDM包含一個異源性BL序列。於另一個實例中，該經修飾之BDM包含二個異源性BL序列。於又另一個實例中，該BDM包含三個異源性BL序列。
於特別之實例中，該BDM係包含CTLA4、CD28或ICOS之細胞外部分或由其組成之VLD支架。於另一個實例中，該VLD支架係人類CTLA4之細胞外部分。於另一個實例中，該BDM VLD包含於以下者提出之序列或係由其組成： (SEQ ID NO：1)。
於一個實例中，位於位置31之丙胺酸(A)係以酪胺酸(Y)取代。於一個實例中，位於位置56之甲硫胺酸(M)係以蘇胺酸(T)置換。
於另一個實例中，該BDM VLD支架係由對應於SEQ ID NO：1之殘基1至25、34至54、60至96與106至126之架構序列組成。
於另一個實例中，該BDM支架包含與SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1之殘基1至25、34至54與60-107與116至136有至少約70%序列一致性、或至少75%、80%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%98%或99%一致性之序列或係由其組成。
於另一個實例中，天然BDM支架之單一之暴露之結合環、二個暴露之結合環或三個暴露之結合環皆可藉由胺基酸取代、添加或刪除、及/或藉由對一或多種物理特徵(例如大小、形狀、電荷、疏水性、等等)之任何改變來修飾。
於另一個實例中，天然人類CTLA-4 VLD序列之暴露之結合環(BL1)序列ASPGKATE(SEQ ID NO：2)或ASPGKYTE(SEQ ID NO：7)、及/或暴露之環(BL2)序列MMGNE(SEQ ID NO：3)及/或暴露之結合環(BL3)序列ELMYPPPYY(SEQ ID NO：4)係經藉由胺基酸取代、添加或刪除或以異源性序列置換來修飾。
於一個實例中，該位於SEQ ID NO：1之位置26至33、及/或位置55至59及/或位置98至105之胺基酸殘基係經修飾或置換。
於另一個實例中，該位於SEQ ID NO：1之位置27至33、及/或位置54至62及/或位置98至106之胺基酸殘基係經修飾或經異源性序列置換。
於另一個實例中，修飾天然人類CTLA-4 VLD之功效係徹底破壞該VLD對CD80與CD86之天然親和力。
於一個實例中，該BDM VLD支架包含以下序列或係由其組成： (SEQ ID NO：5) 其中X、X與X係任何胺基酸殘基且n係介於5與15間之數字且數字1、2與3指示其結合環區域。更明確言之，1、2與3分別對應於該BDM之BL-1、BL-2與BL-3。
於一個實例中，該BDM VLD支架包含以下序列或係由其組成： (SEQ ID NO：6) 其中X、X與X係任何胺基酸殘基且n係介於5與15間之數字且數字1、2、與3指示其結合環區域。更明確言之，1、2與3分別對應於該BDM之BL-1、BL-2與BL-3。
於一個實例中，該BDM之BL-1、BL-2與BL-3分別包含ASPGKATE(SEQ ID NO：2)或ASPGKYTE(SEQ ID NO：7)、MMGNE(SEQ ID NO：3)與ELMYPPPYYL(SEQ ID NO：9)或係由其等組成，其中該BDM與B7-1結合。
於一個實例中，該分子之BDM之BL-1、BL-2與BL-3分別包含TVSWVDME(SEQ ID NO：10)、WNGRW(SEQ ID NO：11)與QLDPSWGYYWQGYE(SEQ ID NO：12)或係由其等組成，其中該BDM與抑硬素(sclerostin)結合。
於一個實例中，該BDM VLD包含以下序列或係由其組成：KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMTGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPSPDSN(SEQ ID NO：13)，其中該BDM與B7-1結合。
於另一個實例中，該BDM VLD包含以下序列或係由其組成： (SEQ ID NO：14)，其中該BDM與 抑硬素結合。
於另一個實例中，該BDM之BL-1、BL-2與BL-3係分別以抗體之CDR1、CDR2與CDR3序列置換。自其該等CDR序列衍生之抗體可衍生自任何物種。於一個實例中，該抗體係衍生自人類。於另一個實例中，該抗體係衍生自家畜，例如貓、狗、兔、天竺鼠或馬。
於一個實例中，該至少一個BDM可以單體形式或二聚體形式存在於該分子中。於另一個實例中，該至少一個BDM可由一系列連接在一起之BDM單體組成。
因此，術語「BDM」用於本文中係意欲包括呈單體形式之BDM。於一個實例中，該BDM係二聚體。該二聚體可透過於該等CTLA4單體之柄部(各柄部對應於將其VLD連結至其跨膜區域之約10個殘基)中之半胱胺酸殘基(Cys120)間之二硫鍵來形成。供選擇地，該二聚體可藉由連接單體單元來形成。於一個實例中，一系列(或菊鍊)之單體BDM可被連接在一起。例如，介於2與16個BDM單體可以似菊鍊排列頭尾連結。於另一個實例中，介於2與14個、介於2與12個、介於2與10個、介於2與8個、或介於2與4個BDM被頭尾連結。
BDM單體之連接可例如藉由使用共價或非共價鍵或藉由使用如於本文中進一步描述的短胜肽連接子來達成。可利用於本文中論及之連接方法學之任一者以將該等BDM單體連接在一起。供選擇地，鄰接的BDM單體可被直接地融合在一起。
於一個實例中，該BDM係可溶的。本文之揭示內容之BDM 支架之「溶解度」與正確折疊的單體功能域之產生有關。溶解度可例如藉由高效能液相層析術(HPLC)評估。例如，可溶的單體BDM會在HPLC層析圖上引起單一峰，而不可溶的(例如多聚性或聚集性)BDM會引起複數個峰。
該至少一個BDM與該藥理活性蛋白質之耦合可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知之方法達成。耦合可例如藉由使用連接子、藉由直接融合、藉由共軛或藉由共價或非共價鍵結來達成。
於一個實例中，該藥理活性蛋白質與該至少一個BDM之耦合係藉由胜肽連接子達成。所屬技術領域中已知之任何適合的胜肽連接子可被利用於本文之揭示內容中。於一個實例中，該連接子包含序列(SGGGG)nS(SEQ ID NO：15)，其中n係2至8、或3至6或3至4之任何數字。於一個實例中，該連接子包含序列SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)或SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17)或係由其組成
於另一個實例中，該藥理活性蛋白質與該至少一個BDM之耦合係在不使用連接子下達成。
於一個實例中，該分子能夠與該第一、第二及/或視需要地第三目標抗原同時結合。
於另一個實例中，該分子能夠同時與B7-1-Fc及抑硬素結合。
於另一個實例中，該藥理活性蛋白質或胜肽與該至少一個BDM專一性地與其等各自之目標抗原結合。於另一個實例中，該分子與表現被該分子之個別BDM與醫藥活性蛋白質部分辨識之二或多種不同的目標抗原或表位之細胞選擇性地結合但不與僅僅表現該等目標抗原或表位之一 者之細胞結合。
本文之揭示內容亦提供包含與藥理活性蛋白質或胜肽耦合之BDM支架之多肽。於一個實例中，該多肽進一步包含連接子。於一個實例中，該連接子包含序列(SGGGG)nS，其中n係2至8、或3至6或3至4之任何數字。於一個實例中，該連接子包含以下序列或係由其組成：SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)或SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17)。
本文之揭示內容亦提供選自包含以下者之任一者之序列或由其等所組成之群組之多肽：SEQ ID NO：5、6、13、14、19、21、22、23、24、25、27、28或29之任一者之序列。較佳地，該多肽係經分離的。於一個實例中，本文之揭示內容之多肽包括多肽標籤。適合的標籤之實例包括(但不限於)p97分子、myc、六-his標籤、flag、E7。
於一個實施方式中，根據本文之揭示內容之分子係核酸。本文之揭示內容亦提供編碼本文之揭示內容之多肽(尤其係SEQ ID NO：5、6、13、19、21、22、23、24、25、27、28或29之任一者之多肽)之核酸。核酸可包含DNA或RNA或兩者。
於一個實例中，該分子包含於以下提出之BDM VLD之核酸序列或係由其組成： (SEQ ID NO：30) 其中N1係編碼第一結合環之核苷酸之長度、N2係編碼第二結合環之核苷酸之長度且N3係編碼第三結合環之核苷酸之長度。於一個實例中，N1、N2與N2係介於15與45個核苷酸。於一個實例中，N1係介於15與24個核苷酸。N2係15個核苷酸且N3係介於30與45個核苷酸。N係任何核苷酸(A、C、T、G)。
於一個實例中，該核酸係於表現構築體中提供，於該構築體中該核酸係可操作地連接至啟動子。如此表現構築體可呈載體，例如質體。於一個實例中，該表現構築體可係雙順反子表現構築體。本文之揭示內容亦考慮用於該抗體或免疫球蛋白抗原結合片段之重鏈與輕鏈之分開之表現構築體。例如，一個載體可包含編碼該免疫球蛋白輕鏈與BDM VLD之核酸且另一者其包含碼免疫球蛋白重鏈之核酸或反之亦然。
該核酸可進一步包括一個部分(例如FLAG)以幫助純化與鑑認。用於在各種各樣之不同宿主細胞中選殖與表現多肽之系統係已知的且如於本文中進一步描述的。
本文之揭示內容亦提供以於本文中描述之核酸轉形之宿主細胞。適合的宿主細胞包括細菌、哺乳類動物細胞、酵母菌、苔蘚(苔蘚植物)、與桿狀病毒系統。
本文之揭示內容亦提供用於製造本文之揭示內容之多肽分子之方法，其包含在使該多肽之表現成為可能之條件下培養本文之揭示內 容之宿主細胞並視需要地回收該多肽。取決於宿主細胞之選擇，該多肽可經醣化或未經醣化。
本文之揭示內容亦提供用於製造包含至少一個與藥理活性蛋白質耦合之BDM VLD之多重專一性分子之方法，該方法包含：(i)提供編碼BDM VLD序列之核酸，其中該VLD之三個BL中之至少二者係經修飾或經異源性序列置換；(ii)提供編碼藥理活性蛋白質或胜肽之核酸；與(iii)視需要地提供編碼連接子序列之核酸；(iv)於適合的載體中表現該等核酸序列；(v)回收經表現之蛋白質。
本文之揭示內容亦提供用於製造包含至少一個與抗體耦合之BDM VLD之多重專一性分子之方法，該方法包含：(i)提供編碼抗體輕鏈序列或其部分之核酸；(ii)提供編碼抗體重鏈序列或其部分之核酸；(iii)提供編碼BDM VLD序列之核酸，其中該VLD之三個BL中之至少二者係經修飾或經異源性序列置換；(iv)於一或多個適合的載體中表現該等核酸序列；與(v)回收經表現之蛋白質。
於根據該方法之一個實例中，該抗體重鏈係由全長序列組成。於根據該方法之另一個實例中，該抗體重鏈係由可變區域與至少CH1區域組成。於另一個實例中，該抗體重鏈係由可變區域與至少CH1與CH2區域組成。
於根據該方法之一個實例中，不存在連接子序列且該藥理活性蛋白質或胜肽與BDM VLD之核酸序列係連續的。於另一個實例中，不存在連接子序列且該等編碼該抗體重鏈及/或輕鏈與BDM序列之核酸序列係連續的。
該抗體核酸序列可進一步包含鉸鏈區域。
本文之揭示內容亦提供一或多個包含一或多個於本文中描述之核酸序列之載體。於一個實例中，該載體包含編碼如於本文中描述之藥理活性蛋白質與該BDM VLD之核酸序列且視需要地包含編碼該連接子之核序列。於一個實例中，該(等)載體包含編碼如於本文中描述之抗體輕鏈或重鏈之核酸序列與編碼BDM VLD之核酸序列且視需要地包含編碼該連接子之核酸序列。於另一個實例中，該(等)載體包含編碼如於本文中描述之抗體重鏈與輕鏈兩者之核酸序列與編碼BDM VLD之核酸序列且視需要地包含編碼該連接子之核酸序列。
本文之揭示內容亦提供宿主細胞，其含有於本文中描述之載體或含有一或多個於本文中描述之核酸序列。
本文之揭示內容亦提供藉由於本文中描述之方法製造之多重專一性分子。
本文之揭示內容之分子可以組成物之形式提供。因此，於另一個實施方式中，本文之揭示內容提供包含於本文中描述之多重專一性分子加上醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑之醫藥組成物。該組成物可以醫藥品之形式提供。於一個實例中，該組成物係供用於治療失調。於另一個實例中，該組成物係用於抗老化或作為化妝品。
於另一個實例中，該分子可以一個劑標記以幫助偵測。
本文之揭示內容之組成物亦可以具有供根據一個特殊治療適應症使用之用法說明之套組之形式提供。
本文之揭示內容亦提供如於本文中描述之多重專一性分子之用途，其用於偵測該分子之一或多個部分與之結合之一或多個目標抗原。
序列表之解釋
SEQ ID NO：1人類天然CTLA4支架(細胞外功能域)之序列
SEQ ID NO：2 CTLA4之暴露之結合環1之序列
SEQ ID NO：3 CTLA4之暴露之結合環2之序列
SEQ ID NO：4 CTLA4之暴露之結合環3之序列
SEQ ID NO：5 BDM VLD支架之序列
SEQ ID NO：6 BDM VLD支架之序列
SEQ ID NO：7結合環1序列
SEQ ID NO：8訊號胜肽序列
SEQ ID NO：9結合環3序列
SEQ ID NO：10結合環1序列
SEQ ID NO：11結合環2序列
SEQ ID NO：12結合環3序列
SEQ ID NO：13 B7-1結合性VLD支架之序列
SEQ ID NO：14抑硬素結合性VLD支架之序列
SEQ ID NO：15連接子序列
SEQ ID NO：16連接子序列
SEQ ID NO：17連接子序列
SEQ ID NO：18抗溶菌酶IgG1重鏈之序列
SEQ ID NO：19藉由連接子與B7-1結合性VLD耦合之抗溶菌酶IgG1重鏈之序列
SEQ ID NO：20抗溶菌酶IgG κ輕鏈之序列
SEQ ID NO：21藉由連接子與B7-1結合性VLD耦合之抗溶菌酶IgG κ輕之序列
SEQ ID NO：22藉由連接子與B7-1結合性VLD耦合之抗溶菌酶Fab κ輕鏈之序列
SEQ ID NO：23藉由連接子與B7-1結合性VLD耦合之抗溶菌酶Fab重鏈之序列
SEQ ID NO：24具有C端組胺酸與myc標籤之抗溶菌酶Fab重鏈之序列
SEQ ID NO：25融合至抗抑硬素VLD之抗溶菌酶IgG1重鏈之序列
SEQ ID NO：26融合至人類血清白蛋白之C端之B7-2結合性VLD之序列
SEQ ID NO：27融合至人類血清白蛋白之N端之B7-2結合性VLD之序列
SEQ ID NO：28融合至人類血清白蛋白之N端與C端兩者之B7-2結合性VLD之序列
SEQ ID NO：29融合至人類血清白蛋白之C端之CD3結合性VLD之序列
SEQ ID NO：30 BDM VLD支架之核苷酸序列。
圖1提供(A)天然人類CTLA4 VLD支架之序列之示意圖，該示意圖顯示其之架構序列與結合環1、2與3之序列所在之位置(稱為BL1、BL2與BL3)。B顯示於該CTLA4 VLD中之結合環置換之位置，其中BL1係以Xn1稱呼、BL2係以Xn2稱呼且BL3係以Xn3稱呼，其中X係任何胺基酸且n係介於5與15間之數字。C顯示抑硬素人類VLD支架之序列，其中其結合環區域之序列被加底線。
圖2顯示根據本文之揭示內容之一個實例之抗體-VLD雙專一性分子之示意圖。該抗體通過其之重鏈與輕鏈V功能域與目標A結合。接附至該抗體重鏈之C端CH3恆定功能域之VLD與目標B結合。該雙專一性物可與目標A與B兩者個別或同時結合。
圖3顯示根據本文之揭示內容之一個實例之抗體-VLD雙專一性分子之示意圖。該抗體通過其之重鏈與輕鏈V功能域與目標A結合。VLD係接附於其之輕鏈之各恆定功能域(恆定輕，CL)之C端並與目標B結合。該雙專一性物可與目標A與B兩者個別或同時結合。
圖4顯示根據本文之揭示內容之一個實例之抗體-VLD三專 一性分子之示意圖。該抗體通過其之重鏈與輕鏈V功能域與目標A結合。VLD係接附至各輕鏈恆定功能域(CL)與重鏈恆定功能域(CH3)之C端。該三專一性物可與目標A與B及C個別或同時結合或於該三個目標之組合(例如目標A與B或目標A與C或目標B與C)中與之結合。
圖5顯示根據本文之揭示內容之一個實例之Fab-VLD雙專一性分子之示意圖。其之Fab通過其之重鏈與輕鏈V功能域與目標A結合。VLD係接附至其之重鏈恆定功能域(CH1)之C端並與目標B結合。該雙專一性物可與目標A與B兩者個別或同時結合。
圖6顯示根據本文之揭示內容之一個實例之Fab-VLD雙專一性分子之示意圖。其之Fab通過其之重鏈與輕鏈V功能域與目標A結合。VLD係接附至其之輕鏈恆定功能域(CL)之C端並與目標B結合。該雙專一性物可與目標A與B兩者個別或同時結合。
圖7顯示根據本文之揭示內容之一個實例之Fab-VLD三專一性分子之示意圖。其之Fab通過其之重鏈與輕鏈V功能域與目標A結合。一個VLD係接附至其之輕鏈恆定功能域(CL)之C端並與目標B結合且一個VLD係接附至其之重鏈恆定功能域(CH1)之C端並與目標C結合。該三專一性物可與目標A與B與C個別或同時結合或於該三個目標之組合(例如目標A與B或目標A與C或目標B與C)中與之結合。
圖8顯示在非還原條件下親本D1.3 Fab與雙專一性及三專一性變體之表現(SDS PAGE)。D1.3 Fab係抗溶菌酶Fab；D1.3 FabVLDx1(HC)係具有融合至其之重鏈之CH1功能域之VLD之抗溶菌酶Fab；D1.3 Fab-VLDx1(LC)係具有融合至其之輕鏈之CL功能域之VLD之抗溶菌酶 Fab；D1.3 Fab-VLDx2(HC+LC)係具有融合至其之重鏈之CH1功能域與輕鏈之CL功能域之VLD之抗溶菌酶Fab。
圖9顯示在還原條件下親本D1.3 Fab、其雙專一性與三專一性變體之SDS PAGE表現分析。D1.3 Fab係抗溶菌酶Fab；D1.3 FabVLDx1(HC)係具有融合至其之重鏈之CH1功能域之VLD之抗溶菌酶Fab；D1.3 VLDx1(LC)係具有融合至其之輕鏈之CL功能域之VLD之抗溶菌酶Fab；D1.3 VLDx2(HC+LC)係具有融合至其之重鏈之CH1功能域與輕鏈之CL功能域之VLD之抗溶菌酶Fab。
圖10顯示雙專一性物[IgG VLDx2(HC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對B7.1-Fc之第二結合之BLitz®分析。該雙專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]重鏈之B7-1結合性VLD。曲線1係D1.3抗溶菌酶抗體對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線2係D1.3抗溶菌酶抗體對溶菌酶之結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。曲線3係雙專一性物-D1.3 IgG-VLDx2(HC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線4係雙專一性物-D1.3 IgG-VLDx2(HC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。此感應圖(sensogram)展示對溶菌酶及B7-1-Fc之同時雙重目標結合。
圖11顯示雙專一性物[IgG VLDx2(LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對B7-1-Fc之第二結合之BLitz®分析。該雙專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]輕鏈之B7-1結合性VLD。 曲線1係D1.3抗溶菌酶抗體對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線2係D1.3抗溶菌酶抗體對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。曲線3係雙專一性物-D1.3 IgG-VLDx2(LC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線4係雙專一性物-D1.3 IgG-VLDx2(LC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。該感應圖展示對溶菌酶及B7-1-Fc之同時雙重目標結合。
圖12顯示三專一性物[IgG VLDx4(HCLC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對B7-1-Fc之第二結合之BLitz®分析。該三專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]重鏈與輕鏈兩者之B7-1結合性VLD。曲線1係D1.3抗溶菌酶抗體對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線2係D1.3抗溶菌酶抗體對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。曲線3係三專一性物D1.3 IgG-VLDx4(HCLC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線4係三專一性物-D1.3 IgG-VLDx4(HCLC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。該感應圖展示對溶菌酶及B7-1-Fc之同時雙重目標結合。
圖13顯示展示B7-1-Fc相較於雙專一性物被三專一性物結合增加之BLitz®分析。相等數目之抗體、雙專一性與三專一性分子在接附至生物感應器表面之經生物素標記溶菌酶上被捕捉接著添加緩衝劑或B7-1-Fc (於點1)以展示相較於該雙專一性物該三專一性物之增加的結合能力。曲線1係用於構築該雙專一性物與三專一性物之D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]。所結合之抗體係伴隨於點1之單獨緩衝劑之注射顯示。曲線2係D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]，其係伴隨於點1之B7-1-Fc之注射顯示於點2，B7-1-Fc係以緩衝劑置換。曲線3係具有融合至其之抗體CL鏈之VLD之雙專一性D1.3抗溶菌酶抗體[雙專一性物-D1.3 IgGVLDx2(LC)]。所捕捉之雙專一性物被顯示與於點1注射之B7-1-Fc結合。於點2，B7-1-Fc係以緩衝劑置換。曲線4係具有融合至其之抗體CH與CL鏈之VLD之三專一性D1.3抗溶菌酶抗體[三專一性物-D1.3 IgG-VLDx4(HC+LC)]。所捕捉之雙專一性物被顯示與於點1注射之B7-1-Fc結合。於點2，B7-1-Fc係以緩衝劑置換。
圖14顯示被疊在一起之一系列之SPR結合感應圖，其等顯示雙專一性物[IgG VLDx2(HC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對一濃度系列之B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)之第二結合。該雙專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]重鏈之B7-1結合性VLD。
圖15顯示被疊在一起之一系列之SPR結合感應圖，其等顯示雙專一性物[IgG VLDx2(LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對一濃度系列之B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)之第二結合。該雙專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]輕鏈之B7-1結合性VLD。
圖16顯示被疊在一起之一系列之SPR結合感應圖，其等顯示三專一性物[IgG VLDx4(HC+LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記 溶菌酶之最初結合接著對一濃度系列之B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)之第二結合。該三專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]重鏈與輕鏈兩者之B7-1結合性VLD。
圖17顯示重疊之SPR結合感應圖，其等顯示雙專一性物[Fab-VLDx1(HC)]對溶菌酶之結合接著一濃度系列之B7-1Fc(25、12.5、6.25、3.125、1.56μg/ml)之同時結合。該雙專一性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]重鏈之B7-1結合性VLD。
圖18顯示重疊之SPR結合感應圖，其等顯示雙專一性物[Fab-VLDx1(LC)]對溶菌酶之結合接著一濃度系列之B7-1Fc(25、12.5、6.25、3.125、1.56μg/ml)之同時結合。該雙專一性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]輕鏈之B7-1結合性VLD。
圖19顯示重疊之SPR結合感應圖，其等顯示三專一性物[FabVLDx2(HC+LC)]與溶菌酶之結合接著一濃度系列之B7-1-Fc(25、12.5、6.25、3.125、1.56μg/ml)之同時結合。該三專一性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]重鏈與輕鏈兩者之B7-1結合性VLD。
圖20顯示以由針對雙專一性與三專一性抗體-VLD分子與B7-1-Fc之結合之SPR分析測定之RMAX(最大能力)之百分比測定之結合化學計量。
圖21顯示以由針對雙專一性與三專一性Fab-VLD分子與B7-1-Fc之結合之SPR分析測定之RMAX之百分比測定之結合化學計量。
圖22顯示被疊在一起之一系列之SPR結合感應圖，其等展示三專一性物[IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)]與經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物 素標記溶菌酶之最初結合接著與B7-1-Fc和抑硬素之相繼及同時結合。該三專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]重鏈之抑硬素(Scl)結合性VLD與融合至其之輕鏈之B7-1結合性VLD。僅僅B7-1-Fc之曲線係該三專一性物之感應圖，其顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合接著B7-1-Fc之添加。該感應圖展示與溶菌酶及B7-1-Fc之同時雙重目標結合。僅僅抑硬素之曲線係三專一性物之感應圖，其顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合接著抑硬素之添加。該感應圖展示與溶菌酶及抑硬素之同時雙重目標結合。B7-1-Fc與抑硬素曲線係該三專一性物之感應圖，其顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合接著B7-1-Fc之添加、與再接著抑硬素之添加。該感應圖展示與溶菌酶及B7-1-Fc及抑硬素之同時三目標結合。
注射三專一性物：IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)被添加至感應器表面之點。曲線顯示IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合。
注射緩衝劑1：IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)自固定在生物感應器表面上之溶菌酶之解離
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc被添加之點。曲線顯示B7-1Fc對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)之結合。
注射緩衝劑2：B7-1-Fc之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示B7-1-Fc自仍與固定在生物感應器表面上之溶菌酶接附之IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)之解離
注射抑硬素：第三分析物抑硬素被添加之點。曲線顯示抑硬素對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)之結合，而IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)仍同時結合B7-1-Fc。
注射緩衝劑3：抑硬素之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示抑硬素自仍與固定在生物感應器表面上之溶菌酶接附之IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)之解離。
圖23顯示展示三專一性物[Fab VLDx2(B7-HC)(Scl-LC)]與經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著與B7-1-Fc和抑硬素之相繼及同時結合之BLitz®結合分析。該三專一性物具有一個融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]輕鏈之抑硬素結合性VLD與一個融合至其之重鏈之B7-1結合性VLD。曲線顯示該三專一性物對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合接著B7-1-Fc之添加。該結合曲線展示與溶菌酶及B7-1-Fc之同時雙重目標結合。抑硬素被添加以展示與溶菌酶及B7-1-Fc及抑硬素之同時三目標結合。
添加三專一性物：Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)被添加至感應器表面之點。
曲線顯示Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合。
添加B7-1-Fc：B7-1-Fc被添加之點。曲線顯示B7-1-Fc對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之Fab VLDx2(B71-HC)(Scl-LC)之結合。
添加抑硬素：抑硬素被添加之點。曲線顯示抑硬素對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之Fab VLDx2(B71-HC)(Scl-LC)之結合而Fab VLDx2(B71-HC)(Scl-LC)仍同時結合B7-1-Fc。
添加緩衝劑：抑硬素係以緩衝劑置換之點。
圖24顯示顯示展示三專一性物[Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)]與經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著與B7-1-Fc和抑硬素之相繼及同時結合之BLitz®結合分析。該三專一性物具有一個融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]重鏈之抑硬素結合性VLD與一個融合至其之輕鏈之B7-1結合性VLD。曲線顯示該三專一性物對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合接著B7-1-Fc之添加。該結合曲線展示與溶菌酶及B7-1-Fc之同時雙重目標結合。抑硬素被添加以展示與溶菌酶及B7-1-Fc及抑硬素之同時三目標結合。
添加三專一性物：Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)被添加至感應器表面之點。曲線顯示Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合。
添加B7-1-Fc：B7-1-Fc被添加之點。曲線顯示B7-1-Fc對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)之結合。
添加抑硬素：抑硬素被添加之點。曲線顯示抑硬素對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)之結合而Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)仍同時結合B7-1-Fc。
添加緩衝劑：抑硬素係以緩衝劑置換之點。
圖25顯示根據本文之揭示內容之一個實例之與VLD耦合之蛋白質(一般表現)之示意圖。該蛋白質與目標A結合。VLD係接附至該蛋白質多肽之C端並與目標B結合。該雙專一性物可與目標A與B兩者個別或同時結合。
圖26顯示使用抗His辣根過氧化酶(HRP)之經純化人類血清白蛋白(HAS)-VLD融合蛋白質之西方墨點轉漬分析與偵測。第1道係具有融合至其之C端之VLD之HSA；第2道係具有融合至其之N端之VLD之HSA；第3道係具有融合至其之N端與C端兩者之VLD之HSA。
圖27顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示HSA-VLD融合蛋白質與B7-2-Fc之結合之分析。曲線1對應於呈接附至HSA之C端之B7-2結合性VLD之HSA-VLD融合蛋白質。曲線2對應於具有接附至HSA之N與C端兩者之B7-2結合性VLD之VDL-HSA-VLD構築體。點1對應於緩衝劑之添加。
圖28顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示HSA-VLD與CD3之結合之分析。所顯示之曲線對應於該分子與CD3de之結合。點1對應於緩衝劑之添加。
圖29顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示HSA-VLD融合蛋白質與抗HSA親和體(affibody)及B7-2-Fc之結合之分析。所顯示之曲線對應於該分子與抗HSA親和體之結合。點1、2與3對應於緩衝劑之添加。
一般
於本說明書通篇，除非明確地另外陳述或前後文要求另外者，提及一個單一步驟、物質之組成物、步驟之群組或物質之組成物之群組應被理解成涵蓋一個與複數個(即一或多個)該等步驟、物質之組成物、步驟之群組或物質之組成物之群組。
所屬技術領域中具有通常知識者會領會到本文之揭示內容容許該等具體描述者以外之變化與修飾。應瞭解本文之揭示內容包括所有如此變化與修飾。本文之揭示內容亦包括於此說明書中個別或共同地提及或指出之步驟、特徵、組成物與化合物之所有者、以及該等步驟或特徵之任二或多者之任何及所有組合。
本文之揭示內容之任何實例或實施方式應被理解成準用於本文之揭示內容之任何其他實例，除非明確地另外陳述。
除非明確地另外定義，於本文中使用之所有技術與科學術語應被理解成具有與所屬技術領域中(例如，於細胞培養、分子遺傳學、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學、與生物化學中)具有通常知識者所通常瞭解者相同之意義。
除非另外指出，於本文之揭示內容中利用之重組蛋白質、細胞培養、與免疫技術係標準程序，對所屬技術領域中具有通常知識者而言係廣為人知。如此技術係在諸如以下者之來源中之文獻通篇中描述與解釋：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)、J.Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港實驗室出版社(1989)、T.A.Brown(編者),Essential Molecular Biology：A Practical 15 Approach，第1及2冊，IRL Press(1991)、D.M.Glover與B.D.Hames(編者),DNA Cloning：A Practical Approach，第1-4冊，IRL Press(1995與1996)、與F.M.Ausubel等人(編者),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包含迄今之所有更新)、Ed Harlow與David Lane(編者)Antibodies：A Laboratory Manual，冷泉港實驗室，(1988)、 與J.E.Coligan等人(編者)Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons(包含迄今之所有更新)
於本文中可變區域及其部分、免疫球蛋白、抗體及其片段之描述與定義可藉由於以下者中之討論進一步澄清：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest，國家衛生研究院，貝什斯達，Md.,1987與1991、Bork等人，J Mol.Biol.242,309-320,1994、Chothia與Lesk J.Mol Biol.196：901-917,1987、Chothia等人Nature 342,877-883,1989及/或或Al-Lazikani等人，J Mol Biol 273,927-948,1997
術語「及/或」，例如「X及/或Y」應被理解成意謂「X與Y」或「X或Y」且應被理解成對於兩者皆之意義或對於任一者之意義提供明確之支持。
用於本文中，「一(a)」或「一(an)」意謂「至少一個」或「一或多個」，除非前後文暗示其他者。
於本說明書通篇，字詞「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變體會被理解成暗示包含所陳述之元件、整數或步驟、或元件、整數或步驟之群組，但不排除任何其他元件、整數或步驟、或元件、整數或步驟之群組。
所選定義
用於本文中之胺基酸序列中之字母「x」係意欲指示二十種標準胺基酸之任一者可被置於此位置，除非明確地指明其他者。
用於本文中，「一致性」意謂當二或多個序列被排比以使序 列吻合最大化(即考慮到間隙與插入)時於該等序列中於相對應位置之完全相同之核苷酸或胺基酸殘基之百分比。一致性可藉由已知方法輕易地計算，該等方法包括但不限於該等於以下者中描述者：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.，牛津大學出版社，紐約，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press，紐約，1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.、與Griffin,H.G.,eds.,Humana Press，新澤西，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Acadcmic Press,1987；與Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.與Devereux,J.,eds.,M Stockton Press，紐約，1991；與Carillo,H.、與Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48：15 1073(1988)。用於測定一致性之方法係經設計以於所測試之序列間給出最大之吻合。此外，用於測定一致性之方法被編成公眾可得之電腦程式。用於測定二序列間之一致性之電腦程式方法包括(但不限於)GCG套裝程式(Devereux,J.、等人，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、與FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)與Altschul等人Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1997))。BLAST X程式係公眾可得自NCBI與其他來源(BLAST手冊，Altschul,S.、等人，NCBI NLM NIH貝什斯達，Md.20894；Altschul,S.、等人，J.MoI.Biol.215：403-410(1990)。
術語「序列一致性」用於本文中意謂在排比本文之揭示內容之多肽之序列與討論中之序列後有關於此等二個序列中之較長者之殘基數目之配對上完全相同殘基之百分比。一致性係藉由完全相同殘基之數目除以殘基之總數並將結果乘以100來測量。因此，二序列間之一致性典型會 以百分比表現。
術語「免疫球蛋白」係關於一個多肽之家族，該等多肽保有抗體分子之免疫球蛋白折疊特徵，其含有二個β褶板且通常含有保留之二硫鍵。Ig超家族之成員包括抗體、T細胞受體分子與類似者、ICAM分子(其等涉及細胞黏著)、受體分子，諸如涉及細胞內之傳訊之PDGF受體。較佳地，本發明係關於抗體。
「似免疫球蛋白功能域」係關於一種於具有多樣之功能之蛋白質(包括(例如)細胞外基質蛋白質、肌肉蛋白質、免疫蛋白質、細胞表面受體與酵素)中找到之β三明治摺疊結構模體。似Ig功能域成員已被區分成種種超家族，包括(例如)免疫球蛋白、第III類纖維接合素與鈣黏蛋白超家族。其他含有該似Ig功能域結構模體之超家族包括(例如)PKD功能域、β-半乳糖苷酶/葡萄醣醛酸酶功能域、轉麩醯胺酸酶二C端功能域、似放射黃質素(actinoxanthin)、似CuZn過氧化物歧化酶、似CBD9、核片層蛋白A/C球狀尾部功能域、格形蛋白連接物附加物功能域、整聯蛋白功能域、似PapD、紫色酸性磷酸酶N端功能域、似過氧化物還原酶、硫醇：二硫化物互變蛋白DsbD N端功能域與invasin/intimin細胞黏著片段超家族之成員。無論重要序列一致性，似Ig功能域結構相似性係於不同超家族之成員間維持。該術語係意欲包括各超家族內與跨各超家族之似Ig功能域成員。因此，術語「含似免疫球蛋白(似Ig)功能域超家族」係意欲關於此等超家族之任一者內之含似Ig功能域成員多肽以及其他所屬技術領域中已知者。關於不同的含似Ig功能域超家族之描述可(例如)於Clarke等人，Structure Fold.Des.7：1145-53(1999)中與於結構資料庫(諸如URL pdb.weizmann.ac.il/scop/data/scop.b.c.b.html)內找到。
術語「抗體」可包括所有種類，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或次種類，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1與IgA2，無論是衍生自任何天然會製造抗體之物種或藉由重組DNA技術創造，無論是自血清、B細胞，融合瘤、轉染瘤(transfectoma)、酵母菌或細菌分離或合成地製造。術語「抗體」涵蓋單株抗體、多株抗體、人類抗體、人化抗體、嵌合抗體、靈長類化抗體或類人化(synhumanized)抗體。術語「人類抗體」係關於含有人類來源之序列(除了可能之非人類CDR區域)且於人類中具有最小之致免疫性之抗體。
術語「全長抗體」用於本文中係意欲關於一種呈其實質上完整無缺之形式之抗體，其與抗體之抗原結合片段相反。其可經分離或重組。特別地，完整抗體包括該等具有重鏈與輕鏈包括Fc區域者。恆定功能域可為野生型序列恆定功能域(例如人類野生型序列恆定功能域)或其胺基酸序列變體。該抗體蛋白質包含由複數個多肽鏈(例如一個包含輕鏈可變區域(VL)之多肽與一個包含重鏈可變區域(VH)之多肽)構成之可變區域。抗體亦包含恆定功能域，其等中之一些可被佈置成恆定區域，其包括恆定片段或可結晶片段(Fc)(於重鏈之實例中)。VH與VL交互作用以形成包含能夠專一性地與一個或一些密切相關之抗原結合之抗原結合區域之Fv。該抗體與抗原之結合交互作用可以與互補決定區域(CDR)之一或多個胺基酸殘基之分子間接觸表明。大體而言，來自哺乳類動物之輕鏈係κ輕鏈或λ輕鏈且來自哺乳類動物之重鏈係α、δ、ε、γ、或μ。抗體可係任何類型(例如、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、與IgY)、種類(例如、IgG1、 IgG2、IgG3、IgG4、IgA1與IgA2)或次種類。該抗體可係人類、人化、或嵌合抗體。於又另一個實例中，該抗體係鮫、駱駝科、貓或大抗體。
術語「免疫球蛋白抗原結合片段」用於本文中係意欲關於一種抗體之片段，該片段包括具有互補決定區域(CDR)之輕鏈可變區域與重鏈可變區域。該術語涵蓋Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、二-scFv、或經化學連接之F(ab’)2。
術語「Fab被理解成係關於一種抗體之區域，其結合抗原且係由其之重鏈與輕鏈之各者之一個恆定功能域與一個可變功能域構成。
術語「互補」係關於形成同源對之免疫球蛋白功能域。例如，抗體之VH與VL功能域係互補的，二VH功能域並非互補的且二VL功能域並非互補。
術語「功能域」係關於一種折疊之蛋白質結構，其獨立於該蛋白質之剩下的部分保有其之三級結構。
術語「CDR」或「互補決定區域」係意欲意謂抗體或抗體片段內之重鏈與輕鏈多肽兩者之可變區域內找到的非連續性抗原組合位置(其與抗原結合)。此等特殊之區域已被以下者描述：Kabat等人，J.Biol.Chem.252：6609-6616(1977)；Kabat等人，美國衛生與人群服務部，“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；與MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，其中該定義包括當彼此比較時重疊之胺基酸殘基或胺基酸殘基之子集。無論如何，於本文中定義與使用，應用該等定義之一以提及抗體或接枝抗體或其之變體之CDR係意欲落入該術語之範圍。
「結合功能域分子(BDM)」係關於一種單體功能域，其與抗體之可變重(VH)鏈或可變輕(VL)鏈具有類似之結構特徵。此等類似之結構特徵包括BL(結合環)序列，其等係以與抗體可變功能域中與特定抗原結合之互補決定區域(CDR)類似之方式起作用之表面多肽環結構或區域。該BDM支架係由內含之一個架構序列與三個BL序列組成。於本文中之BDM並非抗體可變功能域。BDM支架係於本文中描述，包括例如CTLA-4、lipocallin、纖維接合素、ICOS與CD28。
「BL序列」係表面多肽環結構或區域，其以與抗體可變功能域中與特定抗原結合之互補決定區域(CDR)類似之方式起作用。三個抗原結合環序列(於本文中分別稱為BL-1、BL-2與BL-3)出現在該BDM中且其等座落於提供該等環序列所需之三度空間構形之支架序列內。天然BL序列可以一或多個可被接枝至該支架上之相對應抗體CDR置換。多樣性可被引入該BDM之BL位置內，此係藉由隨機化該支架之特定環之胺基酸序列，例如藉由引入NNK密碼子接著藉由使用(例如)展示技術選擇所欲之結合特徵。此機制係類似於高親和力抗原專一性抗體之天擇。
術語「結合專一性」於蛋白質、多肽或胜肽之前後文中係關於該蛋白質或胜肽及/或BDM與其之個別的目標抗原或表位結合之能力，其係依賴在該目標抗原或表位上特殊之結構(例如抗原決定位或表位)之存在。例如，蛋白質及/或BDM辨識一個特定蛋白質結構並與之結合而非廣泛地辨識蛋白質並與其等結合。舉例而言，若蛋白質與表位「A」結合，含有表位「A」之分子(或自由未經標記之「A」)之存在於含有經標記「A」與該蛋白質之反應中會減少與該蛋白質結合之經標記「A」之量。該術語亦 應被理解成包括與目標抗原「專一性地結合」之藥理活性蛋白質或胜肽及/或BDM。術語「專一性地結合(specifically binds或binds specifically)」應被理解成意謂本文之揭示內容之藥理活性蛋白質(或在抗體之例子中為其抗原結合功能域)或胜肽及/或BDM更頻繁地、更快速地、以更長的持續期間及/或以更大的親和力與特殊之目標抗原反應或聯結(相較於其與替代的天然目標抗原之結合)。提及「結合」對術語「專一性結合」提供明確之支持且反之亦然。典型地，該術語係用於描述一個部分(即本文中之蛋白質或BDM)對給定目標抗原之親和力。於一些情況下，在毒性可能係問題時，有低親和力結合可係所欲的。於其他情況下，具有高親和力結合以最小化與其他目標抗原之交叉作用性可係所欲的。於一個實例中，該結合係於本文中定義之專一性結合。
術語「選擇性結合」係於本文之其他部分更詳細描述。
術語該分子(即該蛋白質或BDM)之一個部分對所選目標之「結合親和力」或「親和力」可被測量。術語「親和力」係關於二個劑之可逆結合之平衡常數且係以解離常數(Kd)或平衡解離常數(KD)表現。
用於本文中，術語「結合性」係關於二或多個劑組成之複合物於稀釋後對解離之抗性。
術語「抗原」用於本文中意謂一種物質，而該藥理活性蛋白質或胜肽或BDM與其結合。抗原典型會包含一或多個抗原性表位，其等被該BDM或蛋白質或胜肽辨識。該蛋白質抗原可係可溶性蛋白質或膜結合性蛋白質。可溶性蛋白質之實例包括(但不限於)轉錄因子、抗體、生長因子、血液蛋白質(例如白蛋白)、或藥物(例如類固醇、醫藥藥物、等等)。 膜結合性蛋白質之類型包括生長因子受體、腫瘤標記、細胞表面標記、或介導至細胞內之運輸之標記(例如運鐵蛋白)、或Fc受體。其典型係關於一種物質，其能夠於活體內引發免疫反應。其可係多肽、蛋白質、核酸(例如DNA、RNA或DNA與RNA之組合)或其他分子。
用於本文中，術語「表位」(同義詞「抗原決定位」)應被理解成意謂蛋白質(或抗體或免疫球蛋白抗原結合片段之抗原結合功能域)與其結合或本文之揭示內容之BDM與其結合之區域。習用地，該術語係關於一種被免疫球蛋白VH/VL對結合之結構。表位定義抗體或似抗體功能域(例如BDM)之最小結合位置。此術語並不必然限於蛋白質及/或該分子之BDM與之接觸之特定殘基或結構。例如，此術語包括分別與該抗體或免疫球蛋白抗原結合片段之CDR或該BDM之BL序列接觸之跨區域胺基酸，與此區域外之5-10個(或更多個)或2-5個或1-3個胺基酸。於一些實例中，該表位包含一系列之不連續之胺基酸，其等當多肽折疊時位於另一者之附近且(例如)與另一個多肽聯結，即「構形性表位」。該術語包括該等由線性胜肽序列構成者(即「連續性」)或該等由非連續的胺基酸序列構成者(即「構形性」或「不連續性」)。
術語「目標」用於本文中係關於抗原或表位。於某些實例中，該目標係關於細胞表面蛋白質(例如受體)或病毒外套蛋白質。於其他實例中，該目標係分泌之蛋白質。
用於本文中，於抗體或免疫球蛋白抗原結合片段之前後文中之術語「抗原結合功能域」應被理解成意謂抗體或免疫球蛋白抗原結合片段之區域，其能夠專一性地與抗原(更具體言之，出現在抗原上之表位) 結合。於抗體中，該抗原結合功能域對應於VH與VL。於該VH與VL區域內者為與該表位接觸之CDR。
術語「位置(position)」或「位置(positions)」用於本文中意謂於本文中描寫之胺基酸序列內之胺基酸位置，典型係從該序列之左邊或5’端算起。術語「相對應」用於本文中於BDM之胺基酸序列位置之前後文中係關於胺基酸參考天然或「野生型」BDM序列之位置。較佳地，該等位置會係分別對應於天然BDM序列中之BLS1、及/或BLS2及/或BLS3之胺基酸。
用於本文中，術語「天然序列」係意欲關於一種序列，其與衍生自自然之相對應多肽具有相同的胺基酸序列。因此，「天然BDM」係關於具有與衍生自自然之相對應多肽之胺基酸序列相同之胺基酸序列之多肽。如此天然序列多肽可藉由重組或合成方法製造。
術語「蛋白質」應被理解成包括單一連續與不分支之多肽鏈，即藉由胜肽鍵連接之一系列之連續的胺基酸或彼此共價或非共價連接之一系列之多肽鏈(即多肽複合物)。例如，該系列之多肽鏈可使用適合的化學物或二硫化鍵共價連接。非共價鍵之實例包括氫鍵、離子鍵、凡得瓦爾力、與疏水性交互作用。
術語「胜肽」用於本文中被理解成係關於一短鏈(典型約50個胺基酸或更少)之藉由胜肽(醯胺)鍵連接之胺基酸單體。
術語「分離的」用於本文中係關於一種多肽、抗體、蛋白質、等等，其已被鑑認並自其之天然環境之組份或從該處其已被製造之環境分開及/或回收。其之天然環境之污染物組份係會干擾該多肽之治療用途之物 質，且可包括(例如)酵素、激素、與其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。於一個實例中，該多肽會被純化(1)至大於80%、85%、90%、95%、或99%以重量計，如由勞立法測定的，(2)至足以藉由使用轉杯式定序儀(spinning cup sequenator)獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，及/或(3)至均勻，其係按照SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或銀染色。術語「分離的多肽」於其範圍內包括於在重組細胞原位內之多肽，因為該多肽天然環境之至少一種組份不會出現。大體而言，該多肽之分離會包括至少一個純化步驟。
術語「重組體」應被理解成意謂人工遺傳重組之產物。重組多肽亦涵蓋藉由人工重組方法表現之多肽，當該多肽係於細胞、組織或對象(例如於其中該多肽被表現者)中時。
術語「偵測(detect)」或「偵測(detecting)」用於本文中係就定量性水平與定性性水平、以及其等之組合來理解。其因此包括所關注之分子之定量性、半定量性與定性性測量。
用於本文中，術語「對象」應被理解成意謂任何動物(包括人類)，例如哺乳類動物。例示性對象包括但不限於人類與非人類靈長類動物。例如，該對象係人類。術語「對象」亦意欲包括非人類對象，諸如(例如)倉鼠、大鼠、兔、貓、狗與馬。
結合功能域分子(BDM)
本文之揭示內容之結合功能域分子(BDM)較佳含有蛋白質支架，其具有三個暴露之結合環(BL)。該等BL可被改變，即透過胺基 酸取代來置換或修飾以賦予該BDM對給定目標抗原之結合專一性。本文之揭示內容之BDM支架可選自由含似免疫球蛋白(似Ig)功能域超家族成員、i-體、VNAR或VHH所組成之群組。
該含似Ig功能域之超家族成員可選自由以下者組成之群組：似V功能域(例如VLD)，諸如CTLA-4、C-set功能域、ThyOx家族成員多肽、T細胞受體、CD2、CD4、CD8、第I類MHC、第II類MHC、CD1、細胞介素受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、激素受體、生長激素受體、促紅血球形成素受體、干擾素γ受體、泌乳素受體、NCAM、VCAM、ICAM、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、纖維接合素、生腱蛋白、與含I-set功能域多肽或其等之功能性片段。
根據本文之揭示內容之BDM之實例包括lipocalin、蛋白質A衍生性分子，諸如蛋白質A之Z功能域(親和體，SpA)、親和體、adnectin(例如纖維接合素)或錨蛋白重複蛋白(DARPin)。
本文之揭示內容之BDM具有以下優點：於該支架功能域結構以及接受廣大範圍之異源性結合環序列之能力兩者之方面係穩定的且模組化的。此外，該BDM支架可從人類來源輕易地獲得，使得當用作為人類治療物時其等之致免疫性可忽略。該BDM支架亦可被輕易地構築成含有或省略天然發生之多醣鏈。
異源性結合環序列至該BDM支架中之連結可藉由(例如)化學、生物化學或重組方法執行。
較佳地，本文之揭示內容之BDM係關於一種除了如由B細胞製造之人類抗體以外之分子。本文之揭示內容之BDM分子亦意欲排除大 於互補決定區域(CDR)之抗體片段。因此，大於約50、75、100或110個胺基酸之人類抗體可變區域片段不被術語BDM涵蓋。此外，BDM不包括抗體可變區域，諸如dAb、VH-VH或VL-VL結構。
術語「支架」係意欲意謂一種支持性多肽架構，其被用於組織、定向與攜帶賦予對給定目標之結合專一性之異源性結合環或經改變之胺基酸序列。支架可於結構上與賦予結合專一性之胺基酸序列分開。支架之結構上可分開之部分可包括各種各樣之不同的結構模體，包括(例如)β三明治摺疊、β褶板、α螺旋、β桶形、捲曲螺旋與其他所屬技術領域中已知之多肽二級與三級結構。本文之揭示內容之支架亦會含有一或多個於胺基酸序列上可改變而不會實質上減少該支持性架構結構之穩定性之區域。例示性之可被改變之區域包括連結β三明治摺疊或β褶板之二股之結合環節段。
本文之揭示內容之BDM支架較佳展現少於約50%之與人類免疫球蛋白可變重鏈或輕鏈序列之胺基酸一致性。大體而言，該支架會展現(例如)少於約45%、約40%、約30%、約20%、約15%、或約10%之相較於人類免疫球蛋白可變重鏈或輕鏈胺基酸序列之胺基酸序列一致性。
可被改變之支架之殘基於本文中被稱為外部結合環或結合環序列(於本文中分別被設計成BL-1、BL-2與BL-3)。賦予二級或三級結構特徵之殘基可被保持、修飾或保留，只要該支架之整體結構被維持。所屬技術領域中具有通常知識者知道或可測定哪些殘基於多肽支架之結構穩定性上起作用以及此等殘基可被修飾至何種程度。
於一個實例中，該BDM支架係似V功能域(VLD)蛋白質。
VLD典型與抗體或T細胞受體之該等有區別，因為其等不具有連結在一起以成為Fv類型分子之傾向。VLD係於以下者中討論：The Leucocyte Antigen Facts Book 1993,Eds Barclay等人，Academic Press，倫敦；與CD Antigens 1996(1997)Immunology Today 18,100-101、與Arlene H Sharpe與Gordon J Freeman,(2002)Nature Reviews Immunology 2,116-126，其等之完整內容係以引用方式納入本文中。
本文之揭示內容之標的所屬技術領域中具有通常知識者可例如藉由實施Uniprot資料庫(www.uniprot.org)之搜尋來輕易地決定適合用於本文中之適當之含VLD蛋白質。
含VLD蛋白質(諸如CTLA-4)可提供替代性架構以用於開發對目標分子具有高親和力之新穎結合部分。衍生自此等新穎部分之單功能域似V結合分子係可溶的且因此係所欲的。含有VLD之適合的新穎部分之實例係CTLA-4、CD28與ICOS(Hutloff A等人，(1999)Nature 397(6716)：263-6)。
細胞毒性T淋巴球相關性抗原4(CTLA-4)與同源性細胞表面蛋白質CD28及ICOS係於免疫反應期間涉及T細胞調節。CTLA-4係主要且短暫地在經活化T細胞之表面上表現之44kDa同元二聚體，於該處其與抗原呈現細胞上之CD80與CD86表面抗原交互作用以達成免疫反應之調節(Waterhouse等人(1996)Immunol Rev 153：183-207、van der Merwe等人(1997)J Exp Med 185(3)：393-403)。
CD28係一個44kDa同元二聚體，其主要於T細胞上表現且(與CTLA-4類似)和於抗原呈現細胞上之CD80與CD86表面抗原交互作 用以達成免疫反應之調節(Linsley等人(1990)J Immunol 182(5)：2559-63)。目前之理論建議CTLA-4與CD28間對可用配體之競爭控制免疫反應之水平，例如於基因剔除小鼠中CTLA-4之基因刪除造成經活化T細胞之大量過度增殖(Waterhouse等人(1995)Science 270(5238)：985-8)。
各CTLA-4單體次單元係由N端細胞外功能域、跨膜區域與C端細胞內功能域組成。該細胞外功能域包含N端似V功能域(VLD；基於與免疫球蛋白超家族之同源性預測分子量大約14kDa)與使該VLD與該跨膜區域連結之約10個殘基之柄部。該VLD包含分別對應於BL-1、BL-2與BL-3之表面環(Metzler WJ等人(1997)Nat Struct Biol 4(7)：527-31)，其與CD80及/或CD86結合。人類CTLA-4之序列先前已被測定(US 5,434,131；US 5,844,095；US 5,851,795)。
對CTLA-4之結構與突變研究建議與CD80與CD86之結合係透過自A’GFCC’似V β股及亦自BL-3中之高度保留之MYPPPYY序列形成之VLD表面發生。CTLA-4單體間之二聚化係透過二個柄部中之半胱胺酸殘基(Cys120)間之二硫鍵發生，該二硫鍵造成二個細胞外功能域之拴接，但無任何似V功能域間之明顯直接連結(Metzler WJ等人(1997)Nat Struct Biol 4(7)：527-31)。二聚化似乎專門對增加對配體之結合性有貢獻。
CD278或ICOS(可誘發性T細胞共刺激物)係一種免疫檢查點蛋白質，其係由ICOS基因編碼。其係於經活化之T細胞上表現。該蛋白質屬於CD28與CTLA-4細胞表面受體家族。其形成同元二聚體並於傳訊、免疫反應及細胞增殖之調節扮演一個角色。
人類CTLA4、CD28與ICOS之序列可於公眾可使用之資料 庫上得到。
CTLA-4之人類序列可以UniProt參考號P16410得到。CTLA-4之細胞外功能域對應於該序列之位置36-161(其中該CTLA-4具有126個胺基酸之總長)。胺基酸殘基1-35對應於其訊號胜肽。
CD28之人類序列可以UniProt參考號P10747得到。其細胞外功能域對應於該序列之位置19-152。
ICOS之人類序列可以UniProt參考號Q9Y6W8得到。其似Ig VLD對應於該序列之位置30-132。
於一個實例中，該BDM係免疫球蛋白C-set功能域蛋白，更佳係C1-set功能域蛋白。C-set功能域係典型的類似抗體恆定功能域之似Ig功能域且幾乎僅僅於涉及免疫系統之分子(包括第I與II類主要組織相容性複合物(MHC)複合物分子)中及種種T細胞受體中找到。
本文之揭示內容之標的所屬技術領域中具有通常知識者可輕易地確定適合用於本文中之含有C-set功能域之蛋白質。例如，對uniprot資料庫(www.uniprot.org)之搜尋顯露超過300種人類蛋白質。
諸如basigin之蛋白質含有C-set功能域(Xiao-Ling Yu等人(2008)JBC vol 283(26)：18056-18065)。C-set功能域之其他實例包括ROR1細胞外功能域、CEA家族成員，諸如CEACAM1-8。
BDM可使用已知之挑選及/或突變誘發方法使之親和力成熟。親和力成熟之BDM可具有為起始BDM之二倍、五倍、十倍、二十倍、三十倍或更大之親和力。表觀親和力可藉由諸如ELISA或其他所屬技術領域中具有通常知識者所熟悉之技術(例如表面電漿子共振技術)之方法測 定。
i-體係一種人類來源之單一功能域似抗體分子。i-體之架構類似來自鮫之單功能域抗體且因此與鮫抗體共有有利的生物物理及靶向特徵。其等係於例如US 7,977,071中描述。
VNAR(可變新抗原受體)係關於一種單可變區域功能域片段，其衍生自鮫免疫球蛋白新抗原受體抗體(IgNAR)。其等係於例如Griffiths K等人(2013)antibodies 2(1)：66-81中描述。
VHH(重鏈之可變功能域)功能域或奈米體(nanobody)係關於一種衍生自駱駝科抗體之單一單體可變抗體功能域。其等係於(例如)Harmsen MM與HJ De Haard(2007)Appl Microbiol Biotechnol.77(1)：13-22中描述。
該BDM與該分子之藥理活性蛋白質部分之結合專一性可被利用以允許該分子與一或多種不同的目標抗原或表位，較佳係至少二種不同的目標抗原或表位結合。於一個實例中，該蛋白質具有對第一目標抗原之結合專一性且該至少一個BDM具有對於第二目標抗原之結合專一性。
於複數個BDM係與一個蛋白質耦合之實例中，該蛋白質可具有對第一目標抗原之結合專一性，且該BDM可具有對第二目標抗原之結合專一性，且一個另外的BDM(若存在)可具有對第三目標抗原之結合專一性。於其中該蛋白質係抗體或免疫球蛋白抗原結合片段之其他實例中，該抗體或抗原結合片段可具有對第一目標抗原之結合專一性，且BDM(或若例如各重鏈或各輕鏈上存在一個BDM則為BDM對)可具有對第二目標抗原之結合專一性，且一個另外的BDM(或BDM對)可具有對第三目標 抗原之結合專一性。
本文之揭示內容之分子可與至少一種目標抗原、至少二種不同的目標抗原、至少三種不同的目標抗原、至少四種不同的目標抗原或至少五種不同的目標抗原結合。
較佳地，該分子與一種目標抗原、二種不同的目標抗原或三個不同的目標抗原結合。種種非限制性實例被考慮，包括：(i)該蛋白質或胜肽與第一目標抗原結合，該第一目標抗原係與該BDM所結合之第二目標抗原相同或不同；(ii)該抗體或免疫球蛋白抗原結合片段與第一目標抗原結合，該第一目標抗原係與該BDM所結合之第二目標抗原相同；(iii)該抗體或免疫球蛋白抗原結合片段與第一目標抗原結合，該第一目標抗原係與該BDM所結合之第二目標抗原不同；(iv)該抗體或免疫球蛋白抗原結合片段與第一目標抗原結合，一個BDM與第二目標抗原結合，該第二目標抗原係與該第一目標抗原相同，且一個另外的BDM與第三目標抗原結合，該第三目標抗原係與該第一與第二目標抗原不同；(v)該抗體或免疫球蛋白抗原結合片段與第一目標抗原結合，一個BDM與另一個BDM分別與第二與第三目標抗原結合，其中該第二與第三目標抗原可係相同或不同，但其中該第二與第三目標抗原係與該第一目標抗原不同；(vi)該抗體或免疫球蛋白抗原結合片段與第一目標抗原結合，一個BDM與第二目標抗原結合，且一個另外的BDM與第三目標抗原結合，其中該第一、第二與第三目標抗原係不同的。
咸會領會到當二或多個BDM被連接在一起時，可被該分子結合之有效目標之數目可增加。
BDM之產生
如於本文中顯示的，於該BDM功能域(例如CTLA-4)中以抑硬素或CD3之異源性結合環序列置換一或多個結合環結構造成使用細菌表現系統之可溶性單體未經醣化之結合分子之產生。該似V功能域因此提供用於構築可溶性單功能域分子之基本架構，其中該分子之結合專一性可藉由修飾結合環結構來設計。
該BDM之架構殘基可根據於駱駝科抗體中出現之結構特徵修飾。駱駝重鏈免疫球蛋白因為由單一VH功能域組成而與慣例抗體結構不同。
於暴露之架構殘基之許多非慣例取代(主要為本質上由疏水性變成極性)減少疏水性表面，同時維持內部β褶板架構結構(Desmyter等人(1996)Nat Struct Biol 3：803-811)。於三個結合環內，數個結構特徵補償抗原結合表面(通常由VL功能域提供)之喪失。雖然BL2環與其他VH功能域並非差異很大，BL1與BL3採取非標準構形，其於長度方面係極度相異的。例如，H1環可含有2-8個間之任何數目之殘基(相較於在Ig分子中通常為五個)。然而，展現最大之變化者係BL3：於17個被報導之駱駝抗體序列中，此區域之長度於7與21個殘基間變化(Muyldermans等人(1994)Protein Eng 7：1129-1135)。第三，許多駱駝科VH功能域具有使BL1與BL3相互連結(於駱駝之例子中)及使CDR-1與CDR-2相互連結(於美洲駝之 例子中)之二硫連接(Vu等人1997)。此結構特徵之功能似乎係環穩定性之維持與提供輪廓更明顯的(與平面有區別的)環構形，其允許與抗原內之口袋結合及給予增加之表面積兩者。然而，並非所有的駱駝科抗體皆具有此二硫鍵，暗示其並非絕對結構需要。
此等上述特徵已使駱駝科V功能域能夠於活體內以可溶性分子存在與具有足夠高之親和力以對各種各樣之目標抗原形成有效之免疫反應。
用於產生並挑擇對目標分子具有新穎之結合親和力之單VLD分子之方法已於US 7,166,697中描述，其之完整內容係以引用方式納入。該方法涉及應用對於衍生自免疫球蛋白超家族之成員之似V功能域而言係廣為人知的分子演化技術。該方法可涉及產生噬菌體或核糖體展示文庫以篩選大量之經突變似V功能域。
絲狀fd噬菌體基因組被工程設計以使得噬菌體於其等之表面上展示由噬菌體內所含之DNA編碼之蛋白質，諸如似Ig蛋白質(Fab)(Smith，1985；Huse等人，1989；McCafferty等人，1990；Hoogenboom等人，1991)。蛋白質分子可被展示在Fd噬菌體之表面上，共價地與由基因III或較不常見地由基因VIII編碼之噬菌體外套蛋白質耦合。將抗體基因插入基因III外套蛋白質中給出每噬菌體3-5個重組蛋白質分子之表現，位於末端。相反地，將抗體基因插入至基因VIII中具有展示每噬菌體顆粒約2000個複本之重組蛋白質之潛力，然而此係多價系統，其可遮蔽單一所展示蛋白質之親和力。亦使用Fd噬粒(phagemid)載體，因為其等可被輕易地從於Fd-噬菌體之表面上展示功能性似Ig片段切換成於大腸桿菌中分泌可溶 性似Ig片段。與基因III外套蛋白質之N端融合之經噬菌體展示之重組蛋白質係藉由策略性地置於二個蛋白質基因間之琥珀密碼子成為可能。於大腸桿菌之琥珀抑制子品系中，所得之Ig功能域-基因III融合物變得被固定於噬菌體外套中。
可將基於蛋白質親和力之挑選程序應用至任何高親和力結合試劑，諸如抗體、抗原、受體與配體(參見(例如)Winter與Milstein,(1991)Nature 349：293-299，其之完整內容係以引用方式納入本文中)。因此，於噬菌體上展示之最高親和力結合蛋白之挑選係與編碼該蛋白質之基因之回收連結。Ig展示性噬菌體可以與ELISA或固相放射免疫分析類似之方式藉由與和珠粒共價地耦合或吸附至塑膠表面之同源結合伙伴結合來親和力挑選。雖然幾乎任何塑膠表面皆會吸附蛋白質抗原，一些商業產品被特別調配用於此目的，諸如Nunc免疫管。
核糖體展示文庫涉及於無細胞轉譯系統中重新合成並於核糖體之表面上展示多肽以用於挑選目的(Hanes與Pluckthun,(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94：4937-4942；He與Taussig,(1997)Nucl Acids Res 25：5132-5134)。「無細胞轉譯系統」包含核糖體、蛋白質合成所需之可溶性酵素(通常與該等核糖體來自相同的細胞)、轉送RNA、腺嘌呤核苷三磷酸、鳥糞嘌呤核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸再生系統(諸如磷烯醇丙酮酸與丙酮酸激酶)、與合成由外源性mRNA編碼之蛋白質所需之鹽及緩衝劑。可使多肽之轉譯在維持完整無缺之聚核糖體之條件(即核糖體、mRNA分子與所轉譯之多肽被聯結在單一複合物中者)下發生。此有效地導致所轉譯之多肽之「核糖體展示」。
對於挑擇，所轉譯之多肽(與相對應核糖體複合物聯結)係與目標分子混合，該目標分子係與基質(例如Dynabead)結合。該目標分子可係任何所關注之化合物(或其之一部分)，諸如DNA分子、蛋白質、受體、細胞表面分子、代謝物、抗體、激素或病毒。展示所轉譯之多肽之核糖體會結合該目標分子且此等複合物可被挑擇且其mRNA可使用RT-PCR再擴增。
雖然有數種修飾結合分子之替代性方法，用於所有所展示之蛋白質之一般方法遵照一種模式，其中個別的結合性試劑係藉由對其等之同源受體之親和力自展示文庫挑選。編碼此等試劑之基因係藉由一些活體內與試管內突變策略之任一者或組合經修飾並構築成一個新基因池以用於展示與選擇最高親和力結合分子。
BDM二聚體
於一個實例中，該分子之BDM部分係BDM單體之二聚體。二聚體形式可天然地發生或透過藉由使用連接子促進而發生。例如，於該BDM係CTLA-4 VLD之情況，二聚化可透過其二個柄部中之半胱胺酸殘基(Cys120)間之二硫鍵發生(若此等序列被保有)。
供選擇地，可使用連接子以將BDM單體(例如CTLA-4單體)耦合在一起。亦可使用相同之原則以將一些BDM單體串接在一起以形成一串。該連接子可促進增強之可撓性及/或減少任何二個單體間之立體阻礙。該連接子可係出自天然來源。
其他可使用之連接子類型係該等於以下進一步描述者，包括 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n連接子。
CTLA-4之可溶形式之試管內表現
人類CTLA-4分子之細胞外功能域與似V功能域(VLD)皆尚未於細菌細胞中成功地以可溶性單體表現，據推測係由於所表現之蛋白質之聚集(Linsley PS等人，(1995)J.Biol.Chem 270：15417-24)。於大腸桿菌中細胞外N端功能域(Met1至Asp124，包含Cys120)之表現造成二聚性28kDa MW蛋白質之生產，於該蛋白質中二個CTLA-4似V功能域係藉由於Cys120之二硫連接連結。於Val114之截斷移除此等半胱胺酸且係意欲去使呈可溶性單體形式之14kDa VLD之表現成為可能。然而，產物聚集且結論為疏水性位置(其正常被醣化遮蔽)現被暴露且造成聚集(Linsley PS等人，(1995)J.Biol.Chem 270：15417-24)。
已有一些於真核生物表現系統(即CHO細胞與酵母菌巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris))中單體經醣化CTLA-4細胞外功能域被成功地表現之報導(Linsley PS等人，(1995)J.Biol.Chem 270：15417-24；Metzler WJ等人(1997)Nat Struct Biol 4(7)：527-31；Gerstmayer B等人(1997)FEBS Lett 407(1)：63-8)。於此等真核生物表現系統中之醣化被推定係於該VLD中之二個N連接之醣化位置(Asn76與Asn108)發生。然而，高產量僅已針對編碼融合至Ig-CH2/CH3功能域之CTLA-4 VLD之基因(其製造具有接附至一個Fc次單元之2個CTLA-4 VLD之二聚體重組蛋白質)之表現描述(WO 95/01994與AU 16458/95)。AU 60590/96描述具有MYPPPY表面環中之第一個酪胺酸(Y)之單一胺基酸置換之CTLA-4 VLD之突變形式，其保有與修 飾對天然CD80與CD86配體之親和力。AU 60590/96描述呈於真核生物細胞中表現之重組CTLA-4/Ig融合蛋白質之CTLA-4 VLD之較佳之可溶形式且並未解決於原核生物表現系統中之聚集問題。EP 0757099A2描述CTLA-4突變分子之使用，例如BL序列中之突變之改變對配體結合性之功效。
B7-1(CD80)蛋白質與B7-2(CD86)蛋白質
B7蛋白質係在經活化抗原呈現細胞(APC)上找到之周邊膜蛋白質，其當與T細胞上之CD28或CD152(CTLA-4)表面蛋白質配對時，可產生共刺激性訊號或共抑制性訊號以分別增強或減少該APC與該T細胞間之MHC-TCR訊號之活性。不但於經活化之APC上出現，B7亦於T細胞上找到。
B7蛋白質包含一些家族成員，其包括B7-1、B7-2、B7DC、B7-H1至B7-H7。B7-1蛋白質亦被稱為CD80且與CD28及CTLA-4(細胞毒性T淋巴球關連性蛋白4)結合。人類序列之UniProt參考號係P33681。
於一個實例中，該BDM與B7-1人類蛋白質結合。於一個實例中，該BDM與B7-2蛋白質結合。
抑硬素
抑硬素係一種被分泌之醣蛋白，及具有C端似半胱胺酸結功能域及與骨成形性蛋白(bone morphogenic protein，BMP)拮抗劑之DAN(以差示篩選來挑選之於神經胚細胞瘤基因中畸變之基因(differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma))家族之序列相似性。抑硬 素係由骨細胞製造且具有骨骼形成之抗同化功效。人類序列之UniProt參考號係Q9BQB4。
於一個實例中，該BDM與抑硬素人類蛋白質結合。
藥理活性蛋白質
於本文之揭示內容中完成之蛋白質之類型係該等為藥理上有活性者。如此蛋白質包括如於本文中描述之抗體(例如全長抗體)或免疫球蛋白抗原結合片段或非抗體蛋白質。
術語「藥理上有活性」意謂一種物質，其被測定為具有影響醫學參數或疾病狀態或造成涉及免疫反應之細胞之活化之活性。該蛋白質可為促效劑蛋白質、拮抗劑蛋白質或擬似物。該蛋白質亦可係治療性抗體。
術語「擬似物」或「促效劑」係關於具有可與天然蛋白質(例如EPO或G-CSF)相比之生物活性之蛋白質(或胜肽)。
適用於根據本文之揭示內容之例示性蛋白質包括(但不限於)凝血因子、抗運載蛋白、類毒素、人類血清白蛋白、膠原結合蛋白、TNF-α受體結合蛋白、整聯蛋白結合蛋白、VEGF或其擬似物、EPO或其擬似物、C4結合蛋白、尿激酶受體拮抗劑、淋巴激素、細胞介素、護骨素(OPG)、或選自計畫性細胞死亡1蛋白質(PD1)、計畫性死亡配體1(PD-L1)、NKG2D、與第I類MHC多肽相關之序列A(MICA)、與第I類MHC多肽相關之序列B(MICB)、UL16結合蛋白(ULBP)之蛋白質之細胞外功能域。
凝血因子係所屬技術領域中已知的，實例包括因子VIII與 因子IX，其等與血友病有關。
於一個實例中，該類毒素係肉毒桿菌類毒素。該類毒素可為A型肉毒桿菌或B型肉毒桿菌。肉毒桿菌類毒素之合成形式亦被考慮。
於一個實例中，該淋巴激素係IL-2或GM-CSF或其擬似物。
於一個實例中，該細胞介素係G-CSF或其擬似物或幹細胞因子或其擬似物。
於一個實例中，該蛋白質係與和人類血清白蛋白結合之BDM耦合已使得該蛋白質之半生期於活體內相較於相同BDM不存在之相同蛋白質被延長。
抗體
於某些實例中，該多重專一性分子包含全長抗體。於一個實例中，該抗體係經人化抗體。於另一個實例中，該抗體係人類抗體。於另一個實例中，該抗體係嵌合抗體。
術語「經人化抗體」應被理解成係關於一個嵌合抗體之次種類，其具有衍生自來自非人類物種之抗體之抗原結合位置或可變區域與基於人類抗體之結構及/或序列之剩下的抗體結構。於經人化抗體中，抗原結合位置大體而言包含被接枝至人類抗體之可變區域之適當架構區域(FR)上之來自非人類抗體之互補決定區域(CDR)與來自人類抗體之剩下的區域。抗原結合位置可係野生型(即與非人類抗體所具有者完全相同)或藉由一或多個胺基酸取代修飾。於一些實例中，人類抗體之FR殘基係以相對應非人類殘基置換。一般而言，經人化抗體會包含至少一個且典型為二個 可變功能域之實質上所有者，其中其CDR區域之所有或實質上所有者係對應於非人類免疫球蛋白所具有者且其FR區域之所有或實質上所有者係人類免疫球蛋白共通序列所具有者。
本文之揭示內容之經人化抗體亦會含有免疫球蛋白恆定區域(Fc)，典型係人類免疫球蛋白所具有者(Jones等人，(1986)Nature,321：522-525；Riechmann等人，(1988)Nature,332：323-329；與Presta，(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596)。
用於人化非人類抗體或其之部分(例如可變區域)之方法係所屬技術領域中已知的。人化實質上可按照Winter與同事之方法(Jones等人，Nature,321：522 525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323 327(1988))；Verhoeyen等人Science,239：1534 1536(1988))或於US5225539或US5585089描述之方法執行。其他用於人化抗體之方法不被排除。
術語「人類抗體」用於本文中係關於具有衍生自或對應於於人類中(例如於人類生殖系列或體細胞中)找到之序列之可變區域(例如VH、VL)及視需要之恆定區域之抗體。「人類」抗體可包括未被人類序列編碼之胺基酸殘基，例如藉由試管內隨機或定點突變引入之突變(尤其係涉及保守性取代之突變或於小數目之該抗體之殘基，例如於1、2、3、4、5或6個該抗體之殘基，例如於1、2、3、4、5或6個構成該抗體之一或多個CDR之殘基之突變)。此等「人類抗體」不需實際上由人類製造，反之，其等可使用重組方法製造及/或自包含編碼人類抗體恆定及/或可變區域之核酸(例如如於以上描述者)之基因轉殖動物(例如小鼠，其中內源性免疫球蛋白基因已被部分或完全地失活)分離。人類抗體可使用種種所屬技術 領域中已知之技術(包括噬菌體展示文庫)製造(例如如於US5885793中描述者)。
辨識所選表位之人類抗體亦可使用稱為「導向性挑選(guided selectionion)」之技術產生。於此方法中，使用所選非人類單株抗體(例如小鼠抗體)以引導辨識相同表位之完全人類抗體之挑選(例如如於US5,565,332中描述的)。
經人化免疫球蛋白(包括經人化抗體)已藉由遺傳工程設計構築。大部分先前已描述之經人化免疫球蛋白已包含與特定人類免疫球蛋白鏈(即接受體或接受者)之架構完全相同之架構與三個來自非人類(供體)免疫球蛋白鏈之CDR。人化亦可包括一些標準，按其等經人化免疫球蛋白鏈之架構中數目有限之胺基酸被鑑認並挑選為與位於該等在供體中而非在接受體中之位置之胺基酸相同，以增加包含該經人化免疫球蛋白鏈之抗體之親和力。
對用於人類治療而言，經人化抗體相較於小鼠或嵌合抗體大體而言具有至少三個潛在優點。因為抗體之效應部分係人類，咸相信其與人類免疫系統之其他部分交互作用較佳(例如藉由補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)更有效率地摧毀其目標細胞)。此外，人類免疫系統不應把經人化抗體之架構或恆定區域辨識成外來，且因此對如此所注射抗體之抗體反應應小於對完全外來小鼠抗體或部分外來嵌合抗體者。最後，已知小鼠抗體於人類循環中會具有遠比人類抗體之半生期短之半生期。據推測，經人化抗體可具有較類似於天然發生之人類抗體之半生期，允許給予較小與較低頻率之劑量。
咸會領會到任何與所欲之目標結合之全長抗體可被用於本文之揭示內容中。於一個實例中，該全長抗體在與該BDM耦合前被進一步親和力成熟。
於另一個實例中，該全長免疫球蛋白係非人類免疫球蛋白。於一個實例中，該免疫球蛋白係小鼠、大鼠、倉鼠、貓、狗、馬或母牛免疫球蛋白。
可使用慣例方法以製備抗體。例如，藉由使用胜肽或全長目標蛋白質，可使用標準方法製造多株抗血清或單株抗體。哺乳類動物(例如小鼠、倉鼠、或兔)可以於哺乳類動物中引發抗體反應之胜肽之致免疫形式致免疫。用於賦予增強之對胜肽之致免疫性之技術包括共軛至載體或其他所屬技術領域中廣為人知之技術。例如，該蛋白質或胜肽可於佐劑之存在下投予。致免疫之進程可藉由偵測血漿或血清中之抗體力價來監視。可以免疫原作為抗原來使用標準ELISA或其他免疫分析程序以評估抗體之水平。於致免疫後，可獲得抗血清且可(若所欲)自血清分離多株抗體。
該抗體可於細胞培養物、噬菌體、或種種動物中產生，該等動物包括但不限於母牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、綿羊、狗、貓、猴、黑猩猩、猿。因此，有用於本文之揭示內容之抗體典型係哺乳類動物抗體。可使用噬菌體技術以分離初級抗體或以產生具有經改變之專一性或結合性特徵之變體。如此技術於所屬技術領域中係例行且廣為人知的。於一個實例中，該抗體係藉由所屬技術領域中已知之重組方法製造者。例如，重組抗體可藉由以包含編碼該抗體之DNA序列之載體轉染宿主細胞來製造。可使用一或多種載體以轉染於該宿主細胞中表現至少一個VL 與一個VH區域之DNA序列。抗體產生與製造之重組方法之例示性描述包括：Delves,Antibody Production：Essential Techniques(Wiley,1997)；Shephard、等人，Monoclonal Antibodies(牛津大學出版社，2000)；與Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(Academic Press,1993)。
針對效應功能修飾該抗體以增強該抗體於活體內之有效性可能係所欲的。例如，半胱胺酸殘基可被引入至Fc區域中，藉此允許於此區域中之鏈間二硫鍵形成。由此產生之抗體可具有改善之內化能力及/或增加之補體介導性細胞殺死與抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人，(1992)J.Exp Med.,176：1191-1195與Shopes,(1992)J.Immunol.,148：2918-2922。
抗體片段
抗體片段包含完整之抗體之部分且可包括完整之抗體之抗原結合區域或可變區域。適合用於本文之揭示內容之抗體片段之實例包括Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、二-scFv、或經化學連接之F(ab’)2。於一特殊之實例中，該抗體片段係Fab。
Fv係關於含有完整抗原辨識與結合位置之抗體片段。此區域係由呈緊密非共價連結之一個重鏈可變功能域與一個輕鏈可變功能域之二聚體組成。因為呈此組態，所以各可變功能域之三個CDR交互作用以定義於該VH-VL二聚體之表面上之抗原結合位置。共同地，該等六個CDR賦予該抗體片段抗原結合性專一性。
Fab片段含有Fv且亦含有輕鏈之恆定功能域與重鏈之第一 恆定功能域(CH1)。Fab片段與Fab’片段之不同處在於添加一些殘基於重鏈CH1功能域之羧基端包括來自抗體鉸鏈區域之一或多個半胱胺酸。F(ab’)2片段被製造成於其等間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab’片段之對。
經化學連接之F(ab’)2係藉由將二個不同的Fab’片段配對在一起而形成之雙專一性分子，該等Fab’片段各具有不同的結合專一性。用於自抗體片段產生雙專一性抗體之技術已於文獻中描述。例如，雙專一性抗體可使用化學連接製備。Brennan等人(1985)Science 229：81描述一種程序，其中完整的抗體被蛋白分解性切裂以產生F(ab’)2片段。此等片段於二硫醇錯合劑亞砷酸鈉之存在下被還原以穩定鄰位之二硫醇並預防分子間二硫形成。所產生之Fab’片段接著被轉變成硫代硝苯甲酸(TNB)衍生物。Fab’-TNB衍生物之一接著係藉由以巰乙胺還原來再轉變成Fab’-硫醇並與等莫耳量之其他Fab’-TNB衍生物混合以形成該雙專一性抗體。
多重專一性分子之製造
本文之揭示內容亦提供用於製造本文之揭示內容之多重專一性分子之方法。
該等分子之表現可係於原核生物或真核生物細胞中。原核生物最常由種種品系之細菌代表。該等細菌可係革蘭氏陽性或革蘭氏陰性。典型地，革蘭氏陰性細菌(諸如大腸桿菌)係較佳者。亦可使用其他微生物品系。
編碼該等分子之序列可被選殖入被設計成用於在原核生物細胞(諸如大腸桿菌)中表現外來序列之載體中。此等載體可包括一般使 用之原核生物控制序列，其於本文中被定義成包括用於轉錄起始之啟動子，視需要地加上操作子、以及核糖體結合位置序列，包括該等一般使用之啟動子，如β內醯胺酶(青黴素酶)與乳糖(lac)啟動子系統(Chang、等人，(1977)Nature 198：1056)、色胺酸(trp)啟動子系統(Goeddel、等人，(1980)Nucleic acids Res.8：4057)與λ衍生性PL啟動子與N基因核糖體結合位置(Shimatake、等人，(1981)Nature 292：128)。
如此表現載體亦會包括複製起點與可篩選標記，諸如β內醯胺酶或新黴素磷酸轉移酶基因(其賦予對抗生素之抗性)，以使得該載體可於帶有該質體之細菌與細胞中複製當於諸如胺苄青黴素或康黴素之抗生素之存在下生長時可被篩選。
抗體於諸如大腸桿菌與酵母菌之單細胞生物中之表現已於所屬技術領域中被充分建立。關於回顧，參見例如André Frenzel等人(2013)Front Immunol 4：217。於培養中於真核生物細胞中之表現亦以用於製造於本文中描述之雙專一性分子之選項為所屬技術領域中具有通常知識者所知，關於最近之回顧，參見(例如)Raff、M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4：573-576；Trill J.J.等人(1995)Curr.Opinion Biotech 6：553-560。
用於達成此等目標之分子選殖技術係所屬技術領域中已知的並於(例如)以下者中描述：Ausubel等人，(編者),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括所有迄今之更新)或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港實驗室出版社(1989)。各種各樣之選殖與試管內擴增方法係適合用於構築重組核酸。製造重組抗體之方法亦於所屬技術領域中已知，參見(例 如)US4816567或US5530101。
用於在各種各樣之不同宿主細胞中選殖與表現多肽之系統係廣為人知的。適合的宿主細胞包括細菌、哺乳類動物細胞，酵母菌與桿狀病毒系統。適合的宿主細胞包括細菌、哺乳類動物細胞、酵母菌與桿狀病毒系統。於所屬技術領域中可得之用於表現異源性多肽之哺乳類動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、人類胚胎腎臟細胞，嬰兒倉鼠腎臟細胞，NSO小鼠黑色素瘤細胞與許多其他者。適合的宿主會基於例如以下者之考量來選擇：其等與所選載體之相容性、其等之分泌特徵、其等正確地折疊蛋白質之能力、與其等之發酵需求、以及由欲表現之DNA序列編碼之產物對宿主之毒性、與表現產物之純化之容易性。
於分離後，該核酸被可操作地插入連接至表現構築體或表現載體中之啟動子以用於進一步選殖(DNA之擴增)或以用於在無細胞系統中或在細胞中表現。載體可係質體、病毒，例如「噬菌體、或噬粒，按適合者。
為製造本文之揭示內容之載體構築，編碼於本文中描述之抗體輕鏈序列、重鏈序列、與連接子序列與BDM序列之核酸序列係藉由標準方法選殖入適合的載體中。
於一些實例中，該BDM會被選殖至該抗體輕鏈序列之C端。於一些實例中，該BDM會被選殖至該抗體重鏈序列之C端。於一些實例中，該BDM會被選殖至該抗體輕鏈序列之N端。於一些實例中，該BDM會被選殖至該抗體重鏈序列之N端。於一些實例中，BDM會被選殖至該抗體輕鏈序列之N端與C端兩者。於一些實例中，BDM會被選殖至該抗體重 鏈序列之N端與C端兩者。於一些實例中，BDM會被選殖至該抗體輕鏈序列與重鏈序列兩者之N端與C端兩者。於一些實例中，編碼該抗體重鏈或輕鏈與BDM之核酸序列係於一個載體中提供且其他抗體鏈係於另一個載體上提供。於其他實例中，編碼抗體輕鏈序列、連接子序列與BDM序列之核酸序列被選殖至一個載體中且編碼抗體重鏈序列、連接子序列與BDM序列之核酸序列被選殖至另一個載體中。供選擇地，可使用雙順反子載體，藉此抗體輕鏈與重鏈兩者皆在相同之載體上表現。於某些實例中，重鏈與輕鏈編碼序列(其等之一亦會包括該BDM)可位於單一載體上，例如於相同載體中之二個表現匣中。
編碼該等分子之核酸序列亦可被插入至經設計以用於在真核生物宿主中表現外來序列之載體中。該載體之調節元件可根據特殊之真核生物宿主變化。
有用之表現載體(例如)可由染色體、非染色體與合成性DNA序列之節段組成。適合的載體包括SV40之衍生物與已知之細菌質體，例如大腸桿菌質體col El、Pcr1、Pbr322、Pmb9及其等之衍生物、諸如RP4之質體；噬菌體DNA，例如噬菌體λ之為數眾多之衍生物，例如NM989、與其他噬菌體DNA，例如M13與絲狀單股噬菌體DNA；酵母菌質體，諸如2u質體或其之衍生物；有用於真核生物細胞之載體，諸如有用於昆蟲或哺乳類動物細胞之載體；衍生自質體與噬菌體DNA之組合之載體，諸如已經修飾以利用噬菌體DNA或其他表現控制序列之質體；與類似者。
編碼該等分子之核酸序列可併入至真核生物宿主細胞之基因組內並隨著宿主基因組複製而複製。供選擇地，帶有該等核酸序列之載 體可含有允許染色體外複製之複製起點。
用於本文中，術語「啟動子」應以其之最廣的脈絡理解且包括基因組基因之轉錄調節序列，包括TATA盒或起始子元件，其對於精確之轉錄起始係所需的，伴隨或不伴隨改變核酸之表現之另外的調節元件(例如，上游活化序列、轉錄因子結合位置、增強子與緘默子)，例如對發育性及/或外部刺激反應，或以組織專一性之方式。於此前後文中，術語「啟動子」亦係用於描述重組、合成性或融合核酸、或衍生物，其賦予、活化或增強其可操作地連接之核酸之表現。例示性啟動子可含有額外複本之一或多個特殊調節元件以進一步增強該核酸之表現及/或改變該核酸之空間表現及/或時間表現。
用於本文中，術語「可操作地連接至」意謂相較於核酸放置啟動子以使得該核酸之表現被該啟動子控制。
許多用於細胞內表現之載體係可得的。其等之載體組份大體而言包括(但不限於)以下者之一或多者：訊號序列、編碼蛋白質之序列(例如衍生自本文中所提供之資訊)、增強子元件、啟動子、多腺苷酸化序列與轉錄終止序列。所屬技術領域中具有通常知識者會察覺到適合用於表現蛋白質之序列。例示性訊號序列包括原核生物分泌訊號(例如pelB、鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp、或熱穩定性腸毒素II)、酵母菌分泌訊號(例如反轉酶前導子、α因子前導子、或酸磷酸酶前導子)或哺乳類動物分泌訊號(例如單純泡疹gD訊號)。
於哺乳類動物細胞中有活性之例示性啟動子包括細胞巨大病毒立即早期啟動子(CMV-IE)、人類延伸因子1-α啟動子(EF1)、小型 細胞核RNA啟動子(U1a與U1b)、α肌凝蛋白重鏈啟動子、猴病毒40啟動子(SV40)、勞斯氏肉瘤病毒啟動子(RSV)、腺病毒主要晚期啟動子、β肌動蛋白啟動子；包含CMV增強子/β-肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子或其之活性片段之雜合調節元件。有用之哺乳類動物宿主細胞系之實例係以SV40轉形之猴腎臟CV1品系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎臟品系(次選殖以於懸浮培養物中生長之293或293細胞；嬰兒倉鼠腎臟細胞(BHK，ATCC CCL 10)；或中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。
用於將分離的核酸或包含其之表現構築體引入至宿主細胞中以供表現的方法對所屬技術領域中具有通常知識者而言係已知的。用於給定細胞之技術依賴已知的成功技術。用於將重組DNA引入至細胞中之方法包括微注射、由DEAE-聚葡萄醣介導之轉染、由脂質體介導之轉染，諸如藉由使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)及/或cellfectin(Gibco,MD,USA)、PEG介導性DNA攝取、反轉錄病毒轉導、電穿孔與微粒轟擊，諸如藉由使用塗覆DNA之鎢或金顆粒(Agracetus Inc.,WI,USA)以及其他。
引入後可接著引起或允許從核酸之表現，例如藉由於供表現之條件下培養宿主細胞。
本文之揭示內容亦提供一種方法，其包含於表現系統中使用如以上陳述之構築體以表現該抗體或免疫球蛋白抗原結合片段鏈與BDM。
本文之揭示內容亦提供重組宿主細胞，其包含一或多個於本文中描述之核酸序列。用於製造該蛋白質之宿主細胞可於各種各樣之培養基中培養，取決於所使用之細胞類型。諸如Ham's F10(Sigma)、最低之必須培養基((MEM)，(Sigma)、RPM1-1640(Sigma)、與Dulbecco氏經修改 Eagle氏培養基((DMEM)、Sigma)之商業上可得之培養基係適合用於培養哺乳類動物細胞。用於培養其他於本文中討論之細胞類型之培養基係所屬技術領域中已知的。
可將各種各樣之宿主/表現載體組合用於表現本文之揭示內容之核酸序列。有用之表現載體(例如)可由染色體、非染色體與合成性DNA序列之節段組成。適合的載體包括SV40之衍生物與已知細菌質體，例如大腸桿菌質體col El、Perl、Pbr322、Pmb9與其等之衍生物、質體，諸如RP4；噬菌體DNA，例如為數眾多之噬菌體之衍生物，例如NM989、與其他噬菌體DNA，例如M13與絲狀單股噬菌體DNA；酵母菌質體，諸如2u質體或其之衍生物；有用於真核生物細胞之載體，諸如有用於昆蟲或哺乳類動物細胞之載體；衍生自質體與噬菌體DNA之組合之載體，諸如已經修飾以利用噬菌體DNA或其他表現控制序列之質體；與類似者
亦於本文中提供者係重組宿主細胞，其包含一或多個於本文中描述之多核苷酸。
各種各樣之表現控制序列(控制與其操作性地連接之核酸序列之表現之序列)之任一者可於此等載體中利用以表現該等核酸序列。如此有用之表現控制序列包括(例如)SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒之早期或晚期啟動子、lac系統、tip系統、TAC系統、TRC系統、LTR系統、噬菌體λ之主要操作子與啟動子區域、fd外套蛋白質之控制區域、3-磷酸甘油酸激酶或其他解糖酵素之啟動子、酸性磷酸酶之啟動子(例如Pho5)、酵母菌交配因子之啟動子、與其他已知控制原核生物或真核生物細胞或其等之病毒之基因之表現之序列、與種種其等之組合。
所屬技術領域中具有通常知識者會無須過度實驗就能夠選擇適當的載體、表現控制序列、與宿主以實現所欲之表現而無偏離本文之揭示內容之範圍。例如，於選擇載體，宿主必須需被考慮，因為該載體必須於其中起作用。該載體之複本數目、控制該複本數目之能力、與任何其他由該載體編碼之蛋白質(諸如抗生素標記)之表現亦會被考慮。所屬技術領域中具有通常知識者可選擇適當的載體、表現控制序列、與宿主以實現所欲之表現而無偏離本申請案之範圍。例如，於選擇載體，宿主被考慮，因為該載體必須於其中起作用。該載體之複本數目、控制該複本數目之能力、與任何其他由該載體編碼之蛋白質(諸如抗生素標記)之表現亦可被考慮。
本文之揭示內容提供編碼如於本文中描述之多肽之分離的多核苷酸(核酸)、含有如此多核苷酸之載體、與用於轉錄及轉譯如此多核苷酸成多肽之宿主細胞及表現系統。
本文之揭示內容亦提供呈如本文之其他處描述之質體、載體、轉錄或表現匣之形式之構築體，其包含至少一個如上之多核苷酸。
本文之揭示內容亦提供宿主細胞，其含有一或多個如於本文中揭示之多核苷酸。
在藉由表現來製造後，該分子可使用任何適合的技術分離及/或純化。於本文中描述之編碼性核酸分子與載體可以以下者提供：經分離及/或純化，例如自其等之天然環境，以實質上純的或均質的形式，或(於核酸之例子中)不含或實質上不含除了編碼具有所需功能之多肽之序列以外之核酸或基因來源。核酸可包含DNA或RNA且可係完全或部分合成性。
對於在啤酒釀母菌中表現該等核酸序列，可使用來自內源性酵母菌質體之複製起點2μ環。(Broach,(1983)Meth.Enz.101：307)。供選擇地，可使用來自酵母菌基因組能夠促進獨立複製之序列(參見(例如)Stinchcomb等人，(1979)Nature 282：39)；Tschemper等人，(1980)Gene 10：157；與Clarke等人，(1983)Meth。Enz。101：300)。
用於酵母菌載體之轉錄控制序列包括用於合成解糖酵素之啟動子(Hess等人，(1968)J.Adv.Enxyme Reg.7：149；Holland等人，(1978)Biochemistry 17：4900)。其他所屬技術領域中已知之啟動子包括於CDM8載體中提供之CMV啟動子(Toyama與Okayama,1990)FEBS 268：217-221)；用於3-磷酸甘油酸激酶之啟動子(Hitzeman等人，(1980)J.Biol.Chem.255：2073)、與該等用於其他解糖酵素者。
該等多肽之表現可藉由所屬技術領域中已知之方法偵測。例如，該等分子可藉由考馬斯染色SDS-PAGE凝膠與使用和抗體、免疫球蛋白抗原結合片段或BDM結合之抗體之免疫轉漬偵測。蛋白質回收可使用標準蛋白質純化方法(例如親和力層析術或離子交換層析術)執行以產生實質上純的產物(R.Scopes於：“Protein Purification,Principles and Practice”，第三版，Springer-Verlag(1994))。
本文之揭示內容亦提供製造本文之揭示內容之多重專一性分子之方法，該方法包含以下步驟：(i)提供一或多個包含編碼該蛋白質(例如抗體)與BDM之多核苷酸之載體；(ii)以該載體轉形哺乳類動物宿主細胞(例如CHO)；(iii)在有助於將該等蛋白質自該宿主細胞分泌至培養基中之條件下培養步 驟(b)之宿主細胞；與(iv)回收步驟(iii)之被分泌之蛋白質。
於一個實例中，該方法包含：(i)提供編碼該多重專一性分子之重鏈之第一載體；(ii)提供編碼該多重專一性分子之輕鏈之第二載體；與(iii)以該等第一與第二載體轉形哺乳類動物宿主細胞(例如CHO)。
合成性生產
編碼本文之揭示內容之多肽之核酸可被合成性地製備，除了選殖地製備外或並非選殖地製備。該核酸可被設計成具有對於該多肽部分(例如免疫球蛋白與BDM)為適當之密碼子。一般而言，若該序列會被用於表現，咸會選擇對於意欲之宿主較佳之密碼子。一般而言，若該序列會被用於表現，咸會選擇對於該意欲之宿主較佳之密碼子。完整之多核苷酸可自藉由標準方法製備之重疊之寡核苷酸集合並集合成完整之編碼序列。參見(例如)Edge,Nature,292：756(1981)；Nambair等人，Science,223：1299(1984)；Jay等人，J.Biol.Chem.,259：6311(1984)。
蛋白質之分離
用於分離多肽之方法係所屬技術領域中已知及/或於本文中描述的。
在多肽被分泌至培養基之情況中，來自如此表現系統之上清液可首先使用商業可得之蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超過濾單元)濃縮。上述步驟之任一者中可包括蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)以抑制蛋白質水解且可包括抗生素以預防附加性污染物之生長。供選擇地，或此外，可(例如)使用連續離心自表現該多肽之細胞過濾上清液及/或分開其。
自該宿主細胞製備之多肽可使用(例如)以下者來純化：離子交換、羥磷石灰層析術、疏水性交互作用層析術、凝膠電泳、透析、親和力層析術(例如蛋白質A親和力層析術或蛋白質G層析術)、或任何上述者之組合。此等方法於所屬技術領中係已知的且係於(例如)WO99/57134或Ed Harlow與David Lane(編者)Antibodies：A Laboratory Manual，冷泉港實驗室，(1988)中描述。
於一些實例中，本文之揭示內容之多肽係與異源性胺基酸序列(諸如例如訊號序列或親和力標籤)融合，而無影響其生物活性(即與其之目標之結合)。
所屬技術領域中具有通常知識者亦會查知多肽可經修飾以包括親和力標籤以幫助純化或偵測，例如聚組胺酸標籤，例如六組胺酸標籤、或流行性感冒病毒血球凝集素(HA)標籤、或猴病毒5(V5)標籤、或FLAG標籤、或麩胱甘肽S轉移酶(GST)標籤。所得之多肽接著係使用所屬技術領域中已知之方法(諸如親和力純化)來純化。例如，包含六his標籤之多肽係藉由以下者純化：使包含該多肽之樣本與固定在固體或半固體撐體上之專一性地結合六his標籤之鎳-氮基三醋酸(Ni-NTA)接觸、洗滌該樣本以移除未結合之蛋白質、與隨後洗提所結合之蛋白質。
該藥理活性蛋白質與BDM之耦合
根據本文之揭示內容之藥理活性蛋白質或胜肽與至少BDM之耦合可化學連接(Brennan等人(1985)Science 229：81)或化學耦合(Shalaby等人(1992)J Exp Med 175：217-225)或基因融合製備。
此外，蛋白質(例如抗體)與BDM間之融合或連接可藉由常見共價或離子鍵、蛋白質融合、或異雙功能性交互連接子(例如碳二亞胺、戊二醛、與類似者)達成。亦可使用常見惰性連接子序列(例如胜肽連接子)，其簡單地提供該蛋白質與BDM間所欲量之空間。如此連接子之設計對所屬技術領域中具有通常知識者係廣為人知的且係於例如US 8,580,922；US 5,525,491；與US 6,165,476中描述。
可將種種耦合或交聯劑用於共價共軛蛋白質。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳二亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫雙(2-硝苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二亞醯胺(oPDM)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、與4-(N-順丁烯二亞醯胺基甲基)環己-1-甲酸磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基-SMCC)(參見(例如)Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med 160 1686、Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 8648)。其他方法包括該等於Paulus(1985)Behring Ins Mitt No 78,1 18-132、Brennan等人(1985)Science 229 81-83與Glennie等人(1987).J Immunol 39 2367-2375)中描述者。
該連接子可促進增強之可撓性、及/或減少任二個蛋白質間之立體位阻。該連接子可來自天然來源，諸如被測定為以隨機捲曲存在於一個蛋白質之二個功能域間之序列。一個例示性連接子序列係於RNA聚合 酶α次單元之C端與N端功能域間找到之連接子。其他天然發生之連接子之實例包括於1CI及LexA蛋白質中找到之連接子。
於連接子內，其胺基酸序列可基於該連接子之如憑經驗地判定或如藉由建模顯露之較佳特徵變化。於選擇連接子之考慮包括該連接子之可撓性、該連接子之電荷、與於天然發生之子單元中該連接子之一些胺基酸之存在。該連接子亦可經設計以使得該連接子中之殘基接觸DNA，藉此影響結合親和力或專一性，或以與其他蛋白質交互作用。於一些實例中，特別是在子單元間必須跨越較長的距離時或在該等功能域必須被維持在特殊之組態下時，該連接子可視需要地含有另外的經折疊功能域。
於一些實例中，較佳者係連接子之設計涉及功能域之佈置，其要求該連接子跨越相對短之距離，較佳係少於約10埃(Å)。然而，於某些實施方式中，連接子跨越至多達約50Å或更長之距離。
術語「胜肽連接子」係關於一種短胜肽片段，其連結或耦合該多重專一性分子之多肽之蛋白質與BDM部分。該連接子較佳係由藉由胜肽鍵連接在一起之胺基酸構成。例如，該胜肽連接子可包含小型胺基酸殘基或親水性胺基酸殘基(例如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、脯胺酸、天門冬胺酸、天門冬醯胺酸、等等)。例如，該等胜肽連接子係具有長度為至少5個胺基酸、或長度為約5個至約100個胺基酸、或長度為約10個至50個胺基酸、或長度為約10個至15個胺基酸之胺基酸序列之胜肽。
於一個實例中，該連接子係由大部分之非空間位阻性胺基酸(諸如甘胺酸與丙胺酸)構成。因此於另一個實例中，該連接子係聚甘胺酸、聚丙胺酸或聚絲胺酸。
所屬技術領域中具有通常知識者會領會到許多一般使用之胜肽連接子可用於本文之揭示內容之實施方式中。於某些實施方式中，該短胜肽連接子可包含重複單元以增加該連接子之長度。例如，二、三或四重複連接子。於一個實例中，該連接子包含式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n或包含式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n Ser，其中n係3至6之數字。
於一個實例中，該連接子包含或係由以下序列組成：SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)或SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17)。
非胜肽連接子亦為可能。例如，可使用烷基連接子，諸如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s=2-20。此等烷基連接子可進一步以任何非空間位阻性基團(諸如低碳數烷基(例如C1-C6)、低碳數醯基、鹵素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基)取代。一個例示性非胜肽連接子係具有100至5000kD，較佳為100至500kD之分子量之PEG連接子。
其他適用之連接子之實例包括GSTVAAPS、TVAAPSGS或GSTVAAPSGS或如此連接子之多聚體。其他實例包括(TVSDVP)n(GS)m，其中n=1且m=1或其中n=2與m=1或其中n=2與m=0。
於另一個實例中，該連接子係GS。
分析多肽活性
本文之揭示內容之蛋白質(或胜肽)與BDM部分可根據已知方法藉由種種方式分析。此等分析可包括功能分析(例如細胞殺死分析、cAMP或鈣流量分析)或結合分析(例如ELISA或競爭分析)。
所利用之功能分析之類型會取決於該多肽之蛋白質或胜肽與BDM部分所結合之目標。
亦可利用半生期分析。如此方法係所屬技術領域中已知的。二個一般用於測定蛋白質之半生期之方法係放射性短暫標記分析與環己亞醯胺追蹤(Zhou P(2004)Methods Mol.Biol.284：67-77。
測量結合親和力
表位之結合可藉由常見藉由常見抗原結合分析(諸如ELISA)、藉由基於螢光之技術(包括FRET)、或藉由諸如表面電漿子共振(其測量分子之質量)之技術測量。抗原結合蛋白(例如BDM)對抗原或表位之專一性結合可藉由包括(例如)以下者之適合的分析測定：Scatchard分析及/或競爭性結合分析，諸如放射免疫分析(RIA)、酵素免疫分析，諸如ELISA與三明治競爭分析。
可使用諸如表面電漿子共振分析之競爭分析以測定已經工程設計以與特殊之目標結合之BDM是否能夠與該特殊之目標結合。用於闡明，BDM可經工程設計以與幹細胞因子受體(CSFR或c-kit受體)結合與經測試其與天然配體(c-kit)之結合競爭之能力。用於測定經修飾之BDM競爭對目標之結合之能力以及測定其解離常數(KD)之試管內競爭分析於所屬技術領域中係已知的。
該多肽之蛋白質或BDM部分與其等個別之目標間之交互作用之結合親和力或解離常數(KD)可藉由一些所屬技術領域中已知之方法測量。如此方法包括(但不限於)螢光滴定、競爭ELISA、量熱方法，諸 如等溫滴定量熱法(ITC)與表面電漿子共振(BIAcore)或生物-層(Bio-layer)干涉法(例如Blitz系統(ForteBio)。
一個較佳之表面電漿子共振分析係BIAcore，其係所屬技術領域中已知的。
大部分結合部分具有範圍在低微莫耳每公升(10-6)至毫微莫耳每公升(10-7至10-9)之KD值。大體而言，高親和力結合部分被視為係在低毫微莫耳每公升範圍(10-9)且極高親和力結合部分被視為係在微微莫耳每公升(10-12)範圍。
分別之部分與其之目標間之複合物形成係被諸如以下者之許多不同的因子影響：分別之結合伙伴之濃度、競爭者之存在。所使用之緩衝劑系統之pH與離子強度、與用於測定KD之實驗方法(例如，螢光滴定、競爭ELISA或表面電漿子共振)或甚至是用於評估實驗數據之數學演算法。
因此，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言以下者係明顯的：KD值可於某個實驗範圍內變化，取決於用於測定特殊之免疫球蛋白或BDM對給定目標之親和力之方法與實驗設置。此意謂於所測量之KD值可能存在有微小的誤差或容許範圍，取決於該KD值是否係藉由表面電漿子共振(Biacore)、藉由競爭ELISA或藉由「直接ELISA」測定。
於一個較佳之實例中，該KD值係藉由使用對固定之目標之表面電漿子共振分析(例如使用BIAcore表面電漿子共振(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)來測定。
親和力可比該蛋白質或該BDM對不相關之胺基酸序列之親 和力大至少1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍、或大至少1000倍、或更多。蛋白質或BDM對目標(例如蛋白質抗原)之親和力可係(例如)約100毫微莫耳每公升(nM)至約0.1nM、約100nM至約1微微莫耳每公升(pM)、或約100nM至約1毫微微莫耳每公升(fM)或更大。
於一個實例中，該蛋白質具有以KD測量約200nM或更小、約100nM或更小、約50nM或更小、約25nM或更小、約10nM或更小、約5nM或更小、約1nM或更小或約0.5nM或更小之親和力。
於一個實例中，該BDM具有以KD測量約200nM或更小、約100nM或更小、約50nM或更小、約25nM或更小、10nM或更小、約5nM或更小、約1nM或更小或約0.5nM或更小之親和力。
生物-層干涉法係用於測量分子互動組內之生物分子交互作用之無標記技術。其係分析自二個表面(生物感應器尖端上之固定蛋白質之層與內部參考層)反射之白光之干涉圖形之光學分析技術。任何於與生物感應器尖端結合之分子之數目之改變皆造成於干涉圖形之變動，其可被即時測量。
於溶液中固定在生物感應器尖端表面之配體與分析物間之結合產生在於生物感應器尖端之光學厚度之增加，其造成波長變動(△λ)，其係生物層之厚度之改變之直接度量。交互作用係以即時測量，提供監視結合專一性、締合與解離之速率、或濃度之能力，有精確性與正確性。
只有與生物感應器結合或自生物感應器解離之分子可變動干涉圖形並產生一個反應輪廓。未結合之分子、周遭之培養基之折射率之改變、或流率之改變不會影響干涉圖形。此係一個生物-層干涉法之獨特的特徵且延伸其之能力以在用於蛋白質-蛋白質交互作用、定量、親和力、與動力學之應用之粗樣本中執行。
目標
根據本文之揭示內容之目標較佳係抗原。該抗原可選自蛋白質、聚糖、脂質、脂蛋白質或核酸。該蛋白質可係人類蛋白質、非人類蛋白質(例如靈長類動物、犬、貓、等等)、病毒蛋白質、酵母菌蛋白質、細菌蛋白質、藻類蛋白質、植物蛋白質或原生動物蛋白質。該蛋白質可係可溶性蛋白質或膜結合性蛋白質。可溶性蛋白質之實例包括(但不限於)轉錄因子、抗體、生長因子、血液蛋白質(例如白蛋白)、或藥物(例如類固醇、醫藥藥物、等等)。膜結合性蛋白質之類型包括生長因子受體、腫瘤標記、或介導至細胞內之運輸之標記(例如運鐵蛋白)、或Fc受體。
該核酸目標可係DNA、RNA或DNA與RNA之組合。
更明確言之，該目標係存在於該抗原上之表位。所屬技術領域中具有通常知識者會領會到抗原可包含一些獨特的表位，其等各自會被蛋白質(例如抗體)或BDM辨識。
本文之揭示內容之多肽可與不同的目標結合。於一個實例中，該不同的目標係二或三個不同的抗原。各個抗原可存在於不同的細胞上。於另一個實例中，該多肽可與相同抗原上之二或三個不同的目標(例 如表位)結合。較佳地，蛋白質所結合之目標係與該BDM所結合之目標不同。
根據本文之揭示內容之「目標抗原」可係蛋白質、胜肽、醣蛋白、多醣、聚糖、脂質、脂蛋白質或核酸。根據本文之揭示內容之目標抗原可被分泌或係膜結合性。如此抗原可衍生自細菌、哺乳類動物(人類與非人類)、真菌、藻類、原生動物來源。該蛋白質可係人類蛋白質、非人類蛋白質(例如靈長類動物、犬、貓、等等)、病毒蛋白質、酵母菌蛋白質、細菌蛋白質、藻類蛋白質、植物蛋白質或原生動物蛋白質。
為相同之對於「第一目標抗原」、「第二目標抗原」、等等之提及會被理解成意謂該藥理活性蛋白質與該至少一個BDM部分與相同抗原結合但可與存在於該抗原上之不同表位結合。
為不同之對於「第一目標抗原」、「第二目標抗原」、等等之提及會被理解成意謂該藥理活性蛋白質部分與該至少一個BDM部分與不同抗原且因此存在不同細胞上之不同表位結合。
(i)細菌抗原
該抗原可衍生自細菌，包括(但不限於)幽門螺旋桿菌、肺炎披衣菌、沙眼披衣菌、溶尿尿漿菌(Ureaplasma urealyticum)、肺炎黴漿菌、葡萄球菌屬物種、金黃色葡萄球菌、鏈球菌屬物種、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、糞腸球菌、腦膜炎雙球菌、淋病雙球菌、炭疽桿菌、沙氏桿菌屬物種、傷寒沙氏桿菌、霍亂弧菌、鼠疫巴氏桿菌、銅綠假單胞菌、曲桿菌屬物種、空腸曲桿菌、芽胞梭菌屬物種、難養芽胞梭菌、分枝 桿菌屬物種、結核分枝桿菌、螺旋體屬物種、疏螺旋體屬物種、Burgdorferi氏疏螺旋體、鉤端螺旋體屬物種、杜氏嗜血桿菌、白喉桿菌、百日咳博德氏桿菌、副百日咳博德氏桿菌(Bordetella parapertussis)、支氣管敗血性博德氏桿菌、流行性感冒嗜血桿菌、大腸桿菌、志賀桿菌屬物種、艾利希體屬物種、與立克次體屬物種。
(ii)病毒抗原
該抗原可係衍生自病毒，包括(但不限於)流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、呼吸道融合病毒、艾司坦氏-巴爾氏病毒、鼻病毒、脊髓灰白質炎病毒、柯薩奇病毒、伊科病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒、水痘帶狀疱疹病毒、疱疹病毒(人類與動物)、單純泡疹病毒、小病毒(人類與動物)、細胞巨大病毒、肝炎病毒、人類乳頭狀瘤病毒、α病毒、黃病毒、布尼亞病毒、狂犬病病毒、沙狀病毒、絲狀病毒、HIV 1、HIV 2、HTLV-1、HTLV-II、FeLV、牛LV、FeIV、犬瘟熱病毒、犬接觸傳染性肝炎病毒、貓杯狀病毒、貓鼻氣管炎病毒、TGE病毒(豬)、與口蹄疫。
(iii)腫瘤抗原
該目標抗原可係腫瘤相關性抗原。如此腫瘤相關性抗原包括(但不限於)MUC-1與其之胜肽片段、蛋白質MZ2-E、多形性上皮黏蛋白、葉酸結合蛋白LK26、MAGE-1或MAGE-3與其之胜肽片段、人類絨毛膜促性腺激素(HCG)與其之胜肽片段、癌胚抗原(CEA)與其之胜肽片段、α 胎蛋白(AFP)與其之胜肽片段、胰臟癌胚抗原與其之胜肽片段、CA 125、15-3、19-9、549、195與其之胜肽片段、前列腺專一性抗原(PSA)與其之胜肽片段、前列腺專一性膜抗原(PSMA)與其之胜肽片段、鱗狀細胞癌抗原(SCCA)與其之胜肽片段、卵巢癌抗原(OCA)與其之胜肽片段、胰臟癌相關性抗原(PaA)與其之胜肽片段、Her1/neu與其之胜肽片段、gp-100與其之胜肽片段、突變K-ras蛋白與其之胜肽片段、突變p53與其之胜肽片段、非突變p53與其之胜肽片段、經截斷表皮生長因子受體(EGFR)、嵌合蛋白質p210BCR-ABL、端粒酶與其之胜肽片段、存活素與其之胜肽片段、Melan-A/MART-1蛋白與其之胜肽片段、WT1蛋白與胜肽片段、LMP2蛋白與胜肽片段、HPV E6 E7蛋白與胜肽片段、個體遺傳型蛋白與胜肽片段、NY-ESO-1蛋白與胜肽片段、PAP蛋白與胜肽片段、癌症睪丸蛋白與胜肽片段、與5T4蛋白與胜肽片段。
其他哺乳類動物抗原
該目標抗原可係存在於位於心臟、血液系統、肺臟、腸、胃、直腸、前列腺、甲狀腺、肝臟或食道內之細胞上之抗原或表位。該目標抗原可係存在於經分泌蛋白質上之抗原或表位。經分泌蛋白質之實例包括(但不限於)激素、酵素、毒素與抗微生物劑、胜肽。供選擇地，該抗原或表位係存在於非膜結合性蛋白質上。
選擇性結合
於一個實例中，相較於僅僅表現該等目標抗原之一者之細 胞，該分子可與表現該多重專一性分子之不同目標抗原之二或多者之細胞選擇性結合。
如此細胞選擇性可藉由以下者達成：滴定該雙專一性物或三專一性物上之各個部分(例如蛋白質或BDM)之結合親和力，以使得各個個別的部分與其之目標之結合在缺乏其他該雙專一性物或三專一性物所結合之目標下不足以使表現該目標之細胞之螢光活化性細胞分選(FACS)或免疫螢光標記或細胞殺死成為可能，但其中該等弱結合部分之組合促使該雙專一性物或三專一性物之充分結合以使共表現該等相關目標分子之細胞相較於僅僅表現一個如此目標之細胞之選擇性結合成為可能，以使得選擇性FACS分選、免疫螢光標記或細胞殺死可被達成。
組成物
當與醫藥上可接受之載劑或賦形劑組合時，本文之揭示內容之多重專一性分子可被用作為組成物。如此醫藥組成物係有用於活體內投予至一個對象。
醫藥上可接受之載劑對於被投予之患者而言係生理上可接受的且保有其與之一起投予之分子之治療特徵。醫藥上可接受之載劑與其等之調配係於(例如)Remington’pharmaceutical Sciences 18th edn.Ed.A Gennaro,Mack Publishing Co.,Easton PA 1990)中一般地描述。一個例示性載劑係生理食鹽水。語詞「醫藥上可接受之載劑」用於本文中意謂一種醫藥上可接受之材料、組成物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封膠囊材料，其涉及自一個器官或身體之部分之投予位置攜帶 或運輸該多肽至另一個器官或身體之部分。各載劑在與該調配物之其他成分相容且對患者非有害之意義上必須係可接受的。
該醫藥上可接受之賦形劑可包括防腐劑或冷凍保存劑。
醫藥組成物可被調配成與特定投予途徑(全身性或局部性)相容。
於一個實例中，於本文中描述之組成物可被口部地、非經腸地、藉由吸入噴霧、吸附、吸收、外用地、直腸地、鼻部地、頰部地、陰道地、室內地、經由呈含有常見非毒性醫藥上可接受之載劑之劑量調配物之經植入儲器、或藉由任何其他便利之劑量形式投予。術語「非經腸」用於本文中包括皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、鞘內、室內、胸骨內、與顱內注射或灌注技術。
用於將分子製備成適合用於投予至一個對象之形式(例如醫藥組成物)之方法係所屬技術領域中已知的且包括(例如)如於Remington's Pharmaceutical Sciences(18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990)與美國醫典：國家處方集(Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1984)中描述之方法。
本文之揭示內容之醫藥組成物係特別有用於非經腸投予，諸如靜脈內投予或投予至體腔或器官或關節之內腔中。該用於投予之組成物一般會包含多肽溶解於醫藥上可接受之載劑(例如水性載劑)之溶液。可使用各種各樣之水性載劑，例如經緩衝鹽水與類似者。該組成物可含有接近生理條件所需之醫藥上可接受之輔助物質，諸如pH調整劑與緩衝劑、毒性調整劑與類似者，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉與類 似者。本文之揭示內容之蛋白質於此等調配物中之濃度可廣範圍地變化，且主要會基於流體體積、黏性、體重與類似者根據所選之特殊投予模式與患者之需要來選擇。例示性載劑包括水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液、與5%人類血清白蛋白。亦可使用非水性媒劑，諸如混合之油與油酸乙酯。亦可使用脂質體作為載劑。該媒劑可含有小量之增強等滲性與化學穩定性(例如緩衝劑、防腐劑或添加劑)之添加劑。
於調配後，本文之揭示內容之多肽會以與該劑量調配物相容之方式且以治療上/預防上有效之量投予。調配物係以各種各樣之劑量形式輕易地投予，該等劑量形式諸如以上描述之可注射溶液之型式，但其他醫藥上可接受之形式亦被考慮，例如錠劑、丸劑、膠囊或其他用於口部投予之固體、栓劑、子宮托、鼻部溶液或噴霧、氣溶膠、吸入劑、脂質體形式與類似者。亦可使用醫藥之「緩慢釋放」膠囊或組成物。緩慢釋放調配物大體而言被設計成在長期時間期間給予恆定藥物水平且可用於遞送本文之揭示內容之化合物。
對於靜脈內投予，適合的載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。該載劑可係含有(例如)以下者之溶劑或分散介質：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、與液體聚乙二醇、與類似者)、與適合的其等之混合物。流動性可藉由(例如)以下者維持：使用諸如卵燐脂之塗層、於分散液之例子中維持所需之顆粒大小與使用表面活性劑。抗細菌劑與抗真菌劑包括(例如)對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、酚、抗壞血酸與乙汞硫柳酸鈉。可於該組成物中包括等張劑，例如糖、多元醇，諸如甘露糖醇、山梨糖醇、與氯化 鈉。所得之溶液可被包裝以以其本身使用或被凍乾；該經凍乾製劑之後可於投予前與無菌溶液結合。
醫藥上可接受之載劑可含有穩定、增加或延遲吸收或清除之化合物。如此化合物包括(例如)碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、或聚葡萄醣；低分子量蛋白質；減少胜肽之清除或水解之組成物；或賦形劑或其他穩定劑及/或緩衝劑。延遲吸收之劑包括(例如)單硬脂酸鋁與明膠。亦可使用清潔劑以穩定或以增加或減少該醫藥組成物之吸收，包括脂質體載劑。為保護其免於消化，該化合物可與組成物複合以給予其對酸性及酵素性水解之抗性，或該化合物可複合在適當之抗性載劑(諸如脂質體)中。保護多肽免於消化之方法係所屬技術領域中已知的(參見(例如)Fix(1996)Pharm Res.13：1760 1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48：119 135；與U.S.Pat.No.5,391,377，其等描述用於口部遞送治療劑之脂質組成物)。
可使用生物可降解生物相容的聚合物，諸如乙烯/醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚羥乙酸、膠原、聚原酸酯(polyorthoester)、與聚乳酸。用於製備如此調配物之方法對所屬技術領域中具有通常知識者而言係已知的。該等材料亦可自Alza Corporation與Nova Pharmaceuticals,Inc商業地獲得。脂質體懸浮液(包括使用抗體或病毒外套蛋白質靶向細胞或組織之脂質體)亦可被用作為醫藥上可接受之載劑。此等可根據所屬技術領域中已知之方法製備，例如如於U.S.Pat.Nos.4,235,871；4,501,728；4,522,811；4,837,028；6,110,490；6,096,716；5,283,185；5,279,833；Akimaru(1995)Cytokines Mol.Ther.1：197 210；Alving(1995)Immunol.Rev.145：5 31；與Szoka(1980)10 Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467)中描述的。能夠持續遞送包括胜肽之小型 分子之生物可降解的微球或膠囊或其他生物可降解的聚合物組態係所屬技術領域中已知的(參見(例如)Putney(1998)Nat.Biotechnol.16：153 157)。
本文之揭示內容之分子可於微胞內併入(參見(例如)Suntres(1994)J.Pharm.Pharmacol.46：23 28；Woodle(1992)Pharm.Res.9：260 265)。該分子可被接附至脂質單層或雙層之表面。例如，分子可被接附至含有醯肼-PEG-(二硬脂醯基磷脂醯基)乙醇胺脂質體(參見(例如)Zalipsky(1995)Bioconjug.Chem.6：705 708)。供選擇地，可使用任何脂質膜之形式，諸如平面脂質膜或完整細胞(例如紅血球)之細胞膜。脂質體與含脂質調配物可以任何方式(包括(例如)靜脈內、跨皮(參見(例如)Vutla(1996)J.Pharm.Sci.85：5 8)、跨黏膜、或口部投予)遞送。
本文之揭示內容之組成物可與其他如本文中所提供之治療部分或成像/診斷部分組合。治療部分及/或成像部分可以分開之組成物或以共軛之部分提供。連接子可視需要包含在共軛部分中且已於本文之其他部分描述。
於本文中揭示之分子亦可被調配成免疫脂質體。含有該多肽之脂質體係藉由諸如於以下者描述之所屬技術領域中已知之方法製備：Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,77：4030(1980)；與U.S.Pat.Nos.4,485,045與4,544,545。具有增強之循環時間之脂質體係於U.S.Pat.No.5,013,556中揭示。
用於活體內投予之調配物係無菌的。滅菌可輕易地藉由通過無菌過濾膜過濾來實現。
本文之揭示內容之組成物可與其他治療劑(例如化學治療 劑)一起投予。化學治療劑係所屬技術領域中已知的且包括細胞毒性藥物與細胞生長抑制性藥物。非限制性實例包括太平洋紫杉醇、順鉑、胺甲喋呤、多柔比星(doxorubicin)、氟達拉濱(fludarabine)、等等。取決於欲治療之病況，亦考慮其他治療劑。
本文之揭示內容之一個實施方式考慮使用本文之揭示內容之醫藥組成物之任一者以製造用於治療失調之醫藥品。醫藥品可被包裝在具有適當之標籤之適合的醫藥包裝內，其中該標籤係用於指示於一個對象中治療失調。
標記與偵測
本文之揭示內容提供於本文中描述之以一個劑標記之分子。於一實例中，該劑係成像/可偵測部分。於另一個實例中，該劑係治療性部分。用於標記多肽之方法會係所屬技術領域中具有通常知識者所熟悉的。
術語「標記」或「經標記」係意欲去涵蓋藉由將可偵測物質耦合耦合(即物理地連接)至該蛋白質或BDM而直接標記該蛋白質(例如抗體)或BDM、以及藉由與被直接地標記之另一個試劑之反應性間接地標記。該術語亦包括共價或非共價耦合。
於一個實例中，該分子可以毒素、放射性核種、與鐵相關之化合物、染料、成像劑或螢光標記或化學治療劑標記。
供選擇地，該分子可以可偵測標記(諸如放射性核種、與鐵相關之化合物、染料、成像劑或用於免疫偵測目標抗原之螢光劑)標記。
放射性標記之非限制性實例包括)例如)32P、33P、43K、52Fe、57Co、64Cu、67Ga、67Cu、68Ga、71Ge、75Br、76Br、77Br、77As、81Rb/81MKr、87MSr、90Y、97Ru、99Tc、100Pd、101Rh、103Pb、105Rh、109Pd、111Ag、111In、113In、119Sb、121Sn、123I、125I、127Cs、128Ba、129Cs、131I、131Cs、143Pr、153Sm、161Tb、166Ho、169Eu、177Lu、186Re、188Re、189Re、191Os、193Pt、194Ir、197Hg、199Au、203Pb、211At、212Pb、212Bi與213Bi。
各種各樣之放射性核種係可用於製造經放射性共軛之蛋白質。實例包括(但不限於)低能放射性核種(例如適合用於診斷目的)，諸如13C、15N、2H、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、111In、與類似者。例如，該放射性核種係γ、光子、或正電子發射性放射性核種，其具有適合用於允許於投予之間之經過時間後之活性或偵測以及定位至成像位置之半生期。本文之揭示內容亦涵蓋高能放射性核種(例如用於治療性目的)，諸如125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re與188Re。此等同位素典型地產生高能α粒子或β粒子，其等具有短的路徑長度。如此放射性核種殺死其等靠近之細胞、例如該共軛物已接附或已進入至之贅生物細胞。其等對非局部性細胞有很小的功效或無功效且實質上係非致免疫性。供選擇地，高能同位素可藉由熱照射一個否則會穩定之同位素產生，例如如於硼中子捕捉治療(Guan等人，1998)。其他可為適合的同位素係於以下者中描述：Carter.(2001)Nature Reviews Cancer 1,118-129、Goldmacher等人(2011)Therapeutic Delivery 2；397-416、Payne(2003)Cancer Cell 3,207-212、Schrama等人，(2006)Nature Rev.Drug Discov.5,147-159、Reichert等人(2007)Nature Reviews Drug Discovery 6；349-356。
毒素包括任何對細胞有害(例如殺死)之劑。其他與製備抗體免疫毒素共軛物有關之技術係於例如US 5,194,594中提供且可被用於本文之揭示內容中。毒素之非限制性實例包括(例如)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、想思子素A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-sarcin、桐油樹(Aleurites fordii)蛋白質、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸蛋白質(PAPI、PAPII、與PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、gelonin、mitogellin、局限麴菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、enomycin、新月毒素、產氣莢膜芽胞梭菌磷脂酶C(PLC)、牛胰臟核糖核酸酶(BPR)、抗病毒蛋白質(PAP)、想思子素、眼鏡蛇毒因子(CVF)、gelonin(GEL)、皂草素(Saporin，SAP)viscumin。
與鐵相關之化合物之非限制性實例包括(例如)磁性氧化鐵顆粒、三價鐵或二價鐵顆粒、Fe203與Fe304。與鐵相關之化合物及標記多肽、蛋白質與胜肽之方法可(例如)於U.S.專利案4,101,435與4,452,773、以及U.S.公開申請案20020064502與20020136693中找到，其等之每一者特此以其等之完整內容以引用方式納入。
於某些實例中，該分子可被標記至細胞毒素或其他細胞增殖抑制化合物，以將該劑之遞送定位至腫瘤細胞。例如，該劑可選自由劑、酵素抑制劑、增殖抑制劑、溶胞劑、DNA或RNA合成抑制劑、膜滲透性修改劑、DNA代謝物、氯乙硫醚衍生物、蛋白質製造抑制劑、核糖體抑制劑、凋亡誘發劑、與神經毒素所組成之群組。
於一個實例中，如於本文中描述之分子包含一或多個可偵測 標記以幫助偵測及/或分離。例如，該多肽包含螢光標記，諸如(例如)螢光素(FITC)、5,6-羧基甲基螢光素、德克薩斯紅(Texas red)、硝基苯并-2--1,3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹磺醯氯、玫瑰紅、4'-6二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、與花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5與Cy7、螢光素(5-羧基螢光素-N-羥基琥珀醯亞胺酯)、玫瑰紅(5,6-四甲基玫瑰紅)。此等螢光劑之吸收與放射最大值分別係：FITC(490nm；520nm)、Cy3(554nm；568nm)、Cy3.5(581nm；588nm)、Cy5(652nm：672nm)、Cy5.5(682nm；703nm)與Cy7(755nm；778nm)。
於某些實例中，該分子可與有用於成像腫瘤之劑耦合。如此劑包括：金屬；金屬螯合劑；鑭系元素；鑭系元素螯合劑；放射性金屬；放射性金屬螯合劑；正電子放出性核種；微氣泡(用於超音波)；脂質體；被封微膠囊於脂質體或奈米球中之分子；單晶氧化鐵奈米化合物；磁共振成像對比劑；光吸收、反射及/或散射劑；膠態顆粒；螢光團，諸如近紅外光螢光團。於許多實例中，如此第二官能性/部分會係相對大的，例如大小係至少10amu，且於許多實例中大小可係至少50、100或250amu。於某些實例中，該第二官能性係螯合金屬之螯合物部分，例如對於放射性金屬或順磁性離子之螯合劑。於其他實例中，其係對於有用於放射性治療或成像程序之放射性核種之螯合劑。
供選擇地，或此外，該分子可以(例如)諸如以下者之磁性或順磁性化合物標記：鐵、鋼、鎳、鈷、稀土物質、釹-鐵-硼、二價鐵-鉻-鈷、鎳-二價鐵、鈷-鉑、或亞鐵酸鍶。
於另一個實例中，該分子係與「受體」(諸如鏈黴抗生物素 蛋白)共軛以用於細胞預靶向，其中該共軛物被投予至患者，接著使用清除劑自循環移除未結合之共軛物並接著投予與治療劑(例如放射性核苷酸)共軛之「配體」(例如抗生物素蛋白)。
例示性治療劑包括(但不限於)抗血管生成劑、抗新血管生成及/或其他血管形成劑、抗增殖劑、促凋亡劑、化學治療劑、抗有絲分裂劑(例如抗有絲分裂劑奥里斯他汀(Auristatin)，(MMAF/MMAE根據Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,1-6)或治療性核酸。
可用作為本文中之劑之化學治療劑包括細胞毒性藥物與細胞生長抑制藥物。化學治療劑可包括該等對細胞具有其他功效(諸如將經轉形狀態逆轉成經分化狀態)者或該等抑制細胞複製者。有用於本發明之已知之細胞毒性劑之實例係於例如Goodman等人，“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第六版，A.B.Gilman等人，eds./Macmillan Publishing Co.紐約，1980列舉。此等包括紫杉烷，諸如太平洋紫杉醇與多烯紫杉醇；氮，諸如甲基二(氯乙基)胺、黴法蘭(melphalan)、尿嘧啶芥子與氯芥苯丁酸；伸乙亞胺衍生物，諸如沙奧特帕(thiotepa)；磺酸烷酯，諸如硫酸布他卡因(busulfan)；亞硝基尿素，諸如環己亞硝(lomustine)、司莫司汀(semustine)與鏈尿佐菌素(streptozocin)；三氮烯，諸如達卡巴仁(dacarbazine)；葉酸類似物，諸如胺甲喋呤；嘧啶類似物，諸如氟尿嘧啶、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)與阿紮立平(azaribine)；嘌呤類似物，諸如巰基嘌呤與硫鳥糞嘌呤；長春花屬生物鹼，諸如長春花鹼與長春新鹼；抗生素，諸如放線菌素、道諾黴素、多柔比星(doxorubicin)、與絲裂黴素；酵素、鉑配位錯合物，諸如順鉑；經取代之尿素，諸如羥基尿素；甲基肼衍生物，諸如丙卡 巴肼(procarbazine)；腎上腺皮質抑制劑，諸如米托坦(mitotane)；激素與拮抗劑，諸如腎上腺皮質類固醇(普賴蘇(prednisone))、助孕素(羥基助孕酮己酸鹽、醋酸鹽與megestrol醋酸鹽)、動情素(二乙基二苯乙烯雌酚與乙炔雌二醇)、與雄性素(睾固酮丙酸鹽與氟羥甲基睪酮)。
於一個實例中，如於本文中描述之多重專一性分子係與另一個蛋白質(例如人類血清白蛋白或HSA)進一步共軛或連接。於另一個實例中，該非抗體蛋白質係HSA。
該分子亦可與治療劑或脂質體(例如含藥物脂質體)共軛或連接。
亦可使用干擾蛋白質合成之藥物；如此藥物對所屬技術領域中具有通常知識者係已知的且包括嘌呤黴素、環己亞醯胺、與核糖核酸酶。
此外，本文之揭示內容考慮其他標記，諸如生物素接著鏈黴抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶(AP)、辣根過氧化酶。
本文之揭示內容之分子可經修飾以含有另外的非蛋白質性部分，其係所屬技術領域中已知的且可輕易獲得。例如，適合用於衍生該蛋白質之部分係生理上可接受之聚合物，例如水可溶性聚合物。水可溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、或聚丙二醇(PPG)。
用途
於一個實例中，本文之揭示內容之分子可用於帶有該蛋白質(或胜肽)及/或BDM與其結合之表位之所欲之抗原之親和力純化或偵測。
本文之揭示內容亦提供偵測該多肽之蛋白質與BDM之一或兩者與其結合之目標之方法。如此方法可(例如)利用如於以上描述之可偵測標記之使用。於一個實例中，不同的標記可被利用於該蛋白質與該BDM以鑑認該被結合之目標是否係被該蛋白質或該BDM結合者。
可利用各種各樣之形式以測定一個樣本是否含有與該蛋白質或胜肽及/或BDM結合之目標(例如蛋白質)。如此形式之實例包括(但不限於)酵素免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、西方墨點轉漬分析與酵素連接免疫吸附分析(ELISA)。
於一個形式中，該多肽可被用於諸如西方墨點轉漬或免疫螢光技術之方法中以偵測目標。
該蛋白質(或胜肽)或BDM與其結合之多肽或目標抗原可被固定在固體撐體上。供選擇地，該多重專一性分子可與固體撐體結合。適合的固相撐體或載劑包括任何能夠結合抗原(即目標)或免疫球蛋白或BDM之撐體。廣為人知之撐體或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚葡萄醣、尼龍、澱粉酶、天然與經修飾纖維素、聚丙烯醯基醯胺、輝長石、與磁鐵礦。所屬技術領域中具有通常知識者會知道許多其他適合用於結合該蛋白質、BDM或目標抗原的載體，且會能夠改造如此撐體以用於本文之揭示內容。例如，目標蛋白質可於聚丙烯醯基醯胺凝膠電泳上跑膠並固定至固相撐體(諸如硝基纖維素)上。該撐體可接著以適合的緩衝劑洗滌然後以經可偵測標記之多肽處理。該固相撐體可接著以緩衝劑洗滌第二次以移除未結合之多肽。該固體撐體上經結合標記之量可接著藉由常用方式偵測。
於一個實例中，本文之揭示內容之分子可被用作為醫藥品。
本文之揭示內容之多重專一性分子之優點
關於非抗體蛋白質，將該BDM加至如此蛋白質可協助增加該蛋白質之穩定性、循環時間及/或生物活性。例如，可使因子VIII蛋白質與和人類血清白蛋白結合之VLD耦合以使得該蛋白質之半生期增加。此對於患有血友病之對象具有在以較低頻率給藥之方面之明顯優點。
關於抗體，根據本文之揭示內容之分子提供相較於基於雙專一性抗體之治療劑之優點。用於改善抗體之一或多個特徵(例如差的治療性抗體)之簡單且效率高的方法係去使一或多個與特定治療目標結合之單結合功能域分子(BDM)與對所關注之目標有專一性之抗體或免疫球蛋白抗原結合片段接附。
使用此雙專一性方法之優點係：簡單且高度有效率之雙專一性抗體產生；該方法可應用於任何抗體序列；親本抗體保有其原本之結合位置與專一性；親本抗體保有原本之結合性；親本抗體保有其原本之結構與功能且對於挑選應用而言抗體介導性效應功能被保留；包括血清半生期之抗體藥動學被保留；該雙專一性產物無縫地併入至現存IgG生產程序(諸如製造、純化、調配與所有其他基於標準IgG程序之程序)中。
於挑選應用，由於基於抗體Fab片段之雙專一性物相較於完整抗體之較小的分子量、於血流中較短的半生期與改善的分子量對結合位置比率，其等亦會係所欲的。
作為一個實例，傳統上已以完整抗體處理之毒性物質之中和 可以Fab更有效地處理。由於抗體相較於毒性物質(典型地少於1kDa)之相對地大的分子量(150kDa)，需要大量的抗體以化學計量地與毒素結合。由於於本文中描述之雙專一性或三專一性Fab給予複數個結合位置，該雙專一性物或三專一性物可以較低的劑量使用。Fab相較於抗體之小尺寸使毒性物質-Fab複合物透過腎臟快速地排出。再次地，用於產生基於Fab之雙專一性物之高效率且簡單的方法係使與特定目標結合之BDM接附至對所關注之目標有專一性之現存Fab。
套組
本文之揭示內容亦提供包含於本文中描述之多重專一性分子加上供使用之用法說明之套組。於該組成物被凍乾之情況下，該套組可含有其他溶液之製劑以復水該等製劑。該用法說明可於「印刷品」上，該「印刷品」(例如)於在該套組內或貼在該套組上之紙或硬紙板上、或於固定至該套組或包裝材料之標籤上、或接附至含有該套組之組份之小瓶或管。
此外，該套組可進一步包括本文中所提供之其他部分之任一者，諸如(例如)化學治療劑。
該套組可進一步包括用於本文中所提供之分析(例如ELISA分析)之組份。
該套組可進一步包括明確說明(例如)產物描述、投予之模式與治療之適應症之標記。該標記或包裝插入物可包括適當之書面用法說明。
所屬技術領域中具有通常知識者會領會到可對以上描述之實施方式作為數眾多之變化及/或修飾，而無偏離本文之揭示內容之廣泛一般性範圍。本文之實施方式因此應於所有方面皆被視為係闡明性且非係限制性。
實施例1 抗體雙專一性與三專一性分子之產生 i)載體產生
CTLA-4 BDM之基因構築與選殖係藉由標準且被充分描述之技術且進一步係如於US 7,166,697中先前描述的。該CTLA-4 BDM係獲自文庫(Geneart)。基因文庫1696327係使用合成性同義寡核苷酸集合，其目標為於對應於結合環區域之DNA序列中含有不同的取代。
於此等實施例中使用之CTLA-4序列包含天然序列之C端修飾，其中該天然序列PEPCPDSDGSTG係以PEPSPDSN置換。此等序列不含有允許該BDM維持單體形式之C端Cys殘基。
製造編碼以下者之核酸構築體：融合至B7-1結合性CTLA-4似V功能域序列之抗溶菌酶IgG1重鏈序列(被稱為D1.3 IgG-VLDx2(HC))與融合至B7-1結合性似V功能域序列之抗溶菌酶IgG κ輕鏈序列(被稱為D1.3 IgG-VLDx2(LC))。該VLD係透過Gly-Ser連接子序列分別與該抗體重(H)或輕(L)鏈耦合。所有的DNA構築體皆藉由限制分析與DNA定序確認並藉由標準且為人熟知之技術測試重組蛋白質之表現。
此等構築體之序列係於以下顯示。抗原結合性環係於有關處加底線：
B7-1結合性似V功能域(VLD)之序列(SEQ ID NO：13) VLD之結合環被加底線。
連接子序列(SEQ ID NO：16)SGGGGSGGGGSGGGGS
連接子序列(SEQ ID NO：17)SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
用於抗體-VLD融合物之抗溶菌酶IgG1重鏈序列(SEQ ID NO：18)
藉由連接子與B7-1結合性VLD耦合之抗溶菌酶IgG1重鏈之序列(D1.3 IgG-VLDx2(HC))(SEQ ID NO：19) VLD之結合環被加底線。
抗溶菌酶IgG κ輕鏈(SEQ ID NO：20)
以21aa Gly-Ser連接子與B7-1結合性VLD耦合之抗溶菌酶IgG κ輕鏈(被稱為D1.3 IgG-VLDx2(LC))(SEQ ID NO：21) VLD之結合環被加底線。
以21aa Gly-Ser連接子與B7.1結合性VLD耦合之抗溶菌酶Fab κ輕鏈(被稱為D1.3 Fab-VLDx1(LC)(SEQ ID NO：22) VLD之結合環被加底線。
以21aa Gly-Ser連接子與B7.1結合性VLD耦合之抗溶菌酶Fab重鏈(被稱為D1.3 Fab-VLDx1(HC)(SEQ ID NO：23) VLD之結合環被加底線。
抗溶菌酶Fab重鏈(具有C端His6與myc標籤)(SEQ ID NO：24)
ii)雙專一性與三專一性分子之製造
將編碼抗體-VLD或Fab-VLD序列之個別重鏈與輕鏈選殖入表現載體pcDNA3.4(Thermo Fisher)中。該載體係於大腸桿菌細胞(來自Agilent Technologies之Electro Ten Blue)中製造/擴增。
根據本文之揭示內容之雙專一性與三專一性分子之示意圖經由圖解於圖2-4針對抗體-VLD分子顯示並於圖5-7針對Fab-VLD分子顯示。
圖2顯示藉由以下者創造之根據一個實例之抗體-VLD雙專 一性分子[D1.3 IgG-VLDx2(HC)]之示意圖：耦合目標專一性VLD(例如與目標B結合者)與抗溶菌酶IgG1抗體重鏈之各恆定重(CH3)鏈序列之末端。該抗體分子通過該抗體重鏈與輕鏈可變區域與目標A結合且通過該重鏈上之VLD與目標B結合。
圖3顯示藉由以下者創造之根據一個實例之抗體-VLD雙專一性分子[D1.3 IgG-VLDx2(LC)]之示意圖：耦合目標專一性VLD(例如與目標B結合者)與抗溶菌酶IgG1抗體輕鏈之各恆定輕(CL)鏈序列之末端。該分子通過該抗體重鏈與輕鏈可變區域與目標A結合且通過該輕鏈上之VLD與目標B結合。
圖4顯示藉由以下者創造之根據一個實例之抗體-VLD三專一性分子D1.3 IgG-VLDx4(LC+HC)之示意圖：耦合目標專一性VLD(例如與目標B結合者)與重鏈與輕鏈兩者，其中VLD係與末端CL序列耦合且亦與重鏈CH3序列之末端耦合。該分子通過該抗體重鏈與輕鏈可變區域與目標A結合、通過該輕鏈上之VLD與目標B結合且與通過和目標B結合者相同之VLD或不同之VLD與目標C結合。該三專一性物可與目標A、B與C個別或同時結合或與該三個目標之組合(例如目標A與B或目標A與C或目標B與C)結合。
圖5顯示根據本文之揭示內容之一個實例之雙專一性Fab-VLD分子(D1.3 Fab-VLDx1(HC))之示意圖。於此示意圖中，該雙專一性物係藉由以下者創造：融合目標專一性VLD(例如於此實例中該VLD對目標B有專一性)與和目標A結合之Fab之恆定區域(CH1)序列之末端(例如於此實例中該Fab對目標A有專一性)。該雙專一性可與目標A與B 兩者個別或同時結合。
圖6顯示根據本文之揭示內容之一個實例之雙專一性Fab-VLD分子(D1.3 Fab-VLDx1(LC))之示意圖。於此示意圖中，該雙專一性物係藉由以下者創造：融合目標專一性VLD(例如於此實例中該VLD對目標B有專一性)與和目標A結合之Fab之CL序列之末端(例如於此實例中該Fab對目標A有專一性)。該雙專一性物可與目標A與B兩者個別或同時結合。
圖7顯示根據本文之揭示內容之三專一性物Fab-VLD分子(D1.3 Fab-VLDx2(LC+HC))之示意圖。於此示意圖中，該三專一性物係藉由以下者創造：融合目標專一性VLD(例如於此實例中該VLD對目標B有專一性)與Fab CL序列之末端以及融合第二目標專一性VLD(例如於此實例中該VLD對目標C有專一性)和與目標A結合之Fab CH3序列之末端(例如於此實例中該Fab對目標A有專一性)。該三專一性物可與目標A與B與C個別或同時結合或與該三個目標之組合(例如目標A與B或目標A與C或目標B與C)結合。
細菌之載體轉形係根據標準技術使用2ng之DNA使用電穿孔勝任細胞系(例如ElectroTen-Blue Cell，Stratagene Cat #200159)執行。
於載體擴增後，DNA係使用Qiagen HiSpeed質體Maxi套組(Cat # 12663)或Qiafilter質體Mega套組(Cat # 12281)萃取與製備。DNA於無核酸酶純水中洗提。
iii)將DNA轉染入哺乳類動物細胞中以用於蛋白質表現
生存力>95%之~2x106 Expi293個細胞/mL哺乳類動物細胞之轉染係使用Expi293表現系統(ThermoFisher Science)執行。雙專一性或三專一性DNA載體係以1：3比率之HC：LC DNA製備。將DNA加熱至65℃共5min並允許其冷卻至室溫，之後添加Opti-MEM I(Life Technologies Cat #31985070)與ExpiFectamine 293試劑(ThermoFisher Cat # A14525)並於室溫下培養共30min。將該轉染複合物加至細胞並於37℃，5% CO2下以120rpm培養。於大約4-5日後收穫含蛋白質之上清液。
測定獲自使用Expi293表現系統之轉染之抗體-VLD和Fab-VLD親本抗溶菌酶D1.3抗體、雙專一性與三專一性變體之蛋白質表現水平分別於表1與2顯示。該抗體或Fab與溶菌酶結合且該VLD與B7.1結合。
iv)純化
將ProsepA純化用於純化該等雙專一性及三專一性分子。以5倍管柱體積之PBS/Tris(2mM Tris，pH 8)平衡ProsepA管柱。將pH 8之含有該雙專一性分子之經轉染細胞上清液裝載至該管柱上並以10倍管柱體積之PBS，2mM Tris，pH 8洗滌該管柱。以0.1M甘胺酸pH 3洗提蛋白質。以1M Tris，pH 8將所洗提之蛋白質流份中和至~pH 7。並根據標準方法透析。
藉由SDS PAGE測定該等變體之蛋白質表現水平。自30ml通過親和力層析術純化之表現培養物獲得數值(未顯示)。
實施例2 Fab分子之表現
藉由SDS PAGE在非還原與還原條件下分析於非理想標準Expi293表現系統中表現之親本D1.3 Fab、與其之雙專一性物及三專一性變體之表現。自30ml通過親和力層析術純化之表現培養物獲得數值。親本Fab係D1.3 Fab，雙專一性物係D1.3 Fab-VLDx1(HC)(其係D1.3 Fab加上融合 至D1.3 Fab之CH序列之末端之VLD)與D1.3 Fab-VLDx1(CL)(其係D1.3 Fab加上融合至D1.3 Fab之CL序列之末端之VLD)。三專一性物係D1.3 Fab-VLDx2(HC+LC)(其係D1.3 Fab加上融合至D1.3 Fab之CH序列與CL序列之末端兩者之VLD。在非還原條件下之結果係於圖8中顯示。在還原條件下之結果係於圖9中知道。分析指出適當之重鏈與輕鏈融合係在所預期之大小範圍。
實施例3 雙專一性與三專一性分子之結合之評估
經純化之雙專一性與三專一性分子之結合特性係使用ForteBio Blitz生物感應器使用標準化學與試劑界定其特徵。
使用經親和力層析術純化之抗體、抗體-VLD雙專一性及抗體-VLD三專一性分子以及商業可得之溶菌酶(Sigma Aldrich cat# L4919)與B7-1-Fc(R&D Systems Cat # 140-B1)。使用鏈黴抗生物素蛋白捕捉性表面(SA Sensor ForteBio cat# 18-5019，或Sensor Chip SA、GE Cat# BR-1000-32)以捕捉經生物素標記溶菌酶。使該等抗體、抗體-VLD雙專一性與抗體-VLD三專一性分子通過在生物感應器表面上捕捉之目標以產生結合感應圖(即第一專一性)。對於相同的目標，於解離階段期間，使B7-1-Fc通過已結合之抗體、抗體-VLD雙專一性與抗體VLD三專一性分子(即第二專一性)以展示第二結合交互作用。
圖10顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示雙專一性物[IgG VLDx2(HC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之結合接著對B7.1-Fc之第二結合之初步分析。該雙專一性物具有與D1.3抗體[D1.3 IgG] 重鏈耦合之B7-1結合性VLD。曲線1係用於構築該雙專一性物之D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]之感應圖。該抗體被顯示與對固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線2係用於構築該雙專一性物之D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]之感應圖。該抗體被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。曲線3係具有與其抗體恆定重(CH)鏈耦合之VLD之雙專一性D1.3抗溶菌酶抗體[雙專一性物-D1.3 IgG-VLDx2(HC)]之感應圖。該雙專一性物被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線4係具有與其抗體CH鏈耦合之VLD之雙專一性D1.3抗溶菌酶抗體[雙專一性物-D1.3 IgG-VLDx2(HC)]之感應圖。該雙專一性物被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。
圖11顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示雙專一性物[IgG VLDx2(LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之結合接著對B7-1-Fc之第二結合之初步分析。該雙專一性物具有與D1.3抗體[D1.3 IgG]輕鏈耦合之B7-1結合性VLD。曲線1係用於構築該雙專一性物之D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]之感應圖。該抗體被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線2係用於構築該雙專一性物之D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]之感應圖。該抗體被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。曲線3係具有與其抗體恆定輕(CL)鏈耦合之VLD之雙專一性D1.3抗溶菌酶抗體[雙專一性物-D1.3 IgG-VLDx2(LC)]之感應圖。該雙專一性物被 顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線4係具有與其抗體CL鏈耦合之VLD之雙專一性D1.3抗溶菌酶抗體[雙專一性物-D1.3 IgG-VLDx2(LC)]之感應圖。該雙專一性物被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。
圖12顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示三專一性物[IgG VLDx4(HC+LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之結合接著對B7-1-Fc之第二結合之初步分析。該三專一性物具有與D1.3抗體[D1.3 IgG]重鏈與輕鏈兩者耦合之B7-1結合性VLD。曲線1係用於構築該雙專一性物之D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]之感應圖。該抗體被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線2係用於構築該雙專一性物之D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]之感應圖。該抗體被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。曲線3係具有與其抗體CH與CL鏈耦合之VLD之三專一性D1.3抗溶菌酶抗體[三專一性物-D1.3 IgG-VLDx4(HCLC)]之感應圖。該三專一性物被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加緩衝劑。曲線4係具有與其抗體CH與CL鏈耦合之VLD之三專一性D1.3抗溶菌酶抗體[三專一性物-D1.3 IgG-Imx4(HC+LC)]之感應圖。該三專一性物被顯示與固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合，接著於點1添加B7-1-Fc。B7-1-Fc係於點2以緩衝劑置換。
圖13顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示相較於雙專一性分子三專一性分子之增加的結合之初步分析。此圖展示該三專一性物 相較於該雙專一性物對B7-1-Fc之增加的結合水平。相等數目之抗體、雙專一性與三專一性分子在接附至生物感應器表面之經生物素標記溶菌酶上被捕捉接著添加緩衝劑或B7-1-Fc(於點1)以展示相較於該雙專一性物該三專一性物之增加的結合能力。曲線1係用於構築該雙專一性物與三專一性物之D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]。所結合之抗體係伴隨於點1之單獨緩衝劑之注射顯示。曲線2係D1.3抗溶菌酶抗體[D1.3 IgG]，其係伴隨於點1之B7-1-Fc之注射顯示於點2，B71-Fc係以緩衝劑置換。曲線3係具有融合至其之抗體CL鏈之VLD之雙專一性物D1.3抗溶菌酶抗體[雙專一性物-D1.3 IgG-VLDx2(LC)]。所捕捉之雙專一性物被顯示與於點1注射之B7-1-Fc結合。於點2，B7-1-Fc係以緩衝劑置換。曲線4係具有融合至其之抗體CH與CL鏈之VLD之三專一性D1.3抗溶菌酶抗體[三專一性物-D1.3 IgG-VLDx4(HCLC)]。所捕捉之雙專一性物被顯示與於點1注射之B7-1-Fc結合。於點2，B7-1-Fc係以緩衝劑置換。
實施例4 以表面電漿子共振(SPR)測定之分子對B7.1-Fc之結合親和力
此節中之結合分析係於Biacore X100 SPR儀器(GE)上使用標準化學與試劑執行。濃度系列曲線已被疊在一起且所有的數據皆以減去來自不含有溶菌酶之參考表面之反應後之反應單位(RU)呈現。
圖14顯示雙專一性物[IgG VLDx2(HC))]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之結合接著對一濃度系列之B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)之第二結合，係藉由SPR分析測定，而濃度系列之SPR結合感應圖被疊在一起。該雙專一性物具有融合至D1.3抗 體[D1.3 IgG]重鏈之B7-1結合性VLD，如於圖2中闡明的。
注射雙專一性物：係IgG VLDx2(HC)被添加至感應器表面之點。曲線顯示IgG VLDx2(HC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合。
注射緩衝劑1：IgG VLDx2(HC)之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示IgG VLDx2(HC)自固定在生物感應器表面上之溶菌酶之解離。
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc被以所具體指明之濃度(50、25、12.5、6.25、3.125、1.56與0uμg/ml)添加之點。曲線顯示B7-1-Fc對與仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之IgG VLDx2(HC)之結合。
注射緩衝劑2：B7-1-Fc之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示B7-1-Fc自仍與固定在生物感應器表面上之溶菌酶接附之IgG VLDx2(HC)之解離。
圖15顯示雙專一性物[IgG VLDx2(LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之結合接著對一濃度系列之B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μug/ml)之第二結合，係以SPR分析測定，而濃度系列之SPR結合感應圖被疊在一起。該雙專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]輕鏈之B7-1結合性VLD，如於圖3中闡明的。
注射雙專一性物：IgG VLDx2(LC)被添加至感應器表面之點。曲線顯示IgG VLDx2(LC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合。
注射緩衝劑1：IgG VLDx2(LC)之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示IgG VLDx2(LC)自固定在生物感應器表面上之溶菌酶之解離。
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc被以所具體指明之濃度(50、25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)添加之點。曲線顯示B7-1-Fc對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之IgG VLDx2(LC)之結合。
注射緩衝劑2：B7-1-Fc之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示B7-1-Fc自仍與固定在生物感應器表面上之溶菌酶接附之IgG VLDx2(LC)之解離。
圖16顯示三專一性物[IgG VLDx4(HC+LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之結合接著對一濃度系列之B7-1-Fc(於25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)之第二結合，係藉由SPR分析測定，而濃度系列之SPR結合感應圖被疊在一起。該三專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]重鏈與輕鏈兩者之B7-1結合性VLD，如於圖4中闡明的。
注射三專一性物：IgG VLDx4(HC+LC)被添加至感應器表面之點。曲線顯示IgG Imx4(HCLC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合。
注射緩衝劑1：IgG VLDx4(HC+LC)之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示IgG VLDx4(HC+LC)自固定在生物感應器表面上之溶菌酶之解離
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc被以所具體指明之濃度(25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)添加之點。曲線顯示B7-1-Fc對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之IgG VLDx4(HC+LC)之結合。注射緩衝劑2：B7-1-Fc之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示B7-1-Fc自仍接附至固定在生物感應器表面上之溶菌酶之IgG VLDx4(HC+LC)之解離
經純化之Fab、Fab-VLD雙專一性與三專一性分子之結合特性亦使用表面電漿子共振(SPR)界定特徵。
圖17顯示被疊在一起之一系列之SPR結合感應圖，其展示雙專一性物[Fab-VLDx1(HC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對一濃度系列之B7-1-Fc(25、12.5、6.25、3.125、1.56與0ug/ml)之第二結合。該雙專一性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]重鏈之 B7-1結合性VLD，如於圖5中闡明的。
注射雙專一性物：Fab-VLDx1(HC)被添加至感應器表面之點。曲線顯示Fab-VLDx1(HC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合。
注射緩衝劑1：Fab-VLDx1(HC)之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示Fab-VLDx1(HC)自固定在生物感應器表面上之溶菌酶之解離
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc被以所具體指明之濃度(25、12.5、6.25、3.125、1.56與0ug/ml)添加之點。曲線顯示B7-1-Fc對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之Fab-VLDx1(HC)之結合。
注射緩衝劑2：B7-1-Fc之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示B7-1-Fc自仍與固定在生物感應器表面上之溶菌酶接附之Fab-VLDx1(HC)之解離。
圖18顯示被疊在一起之一系列之SPR結合感應圖，其展示雙專一性物[Fab-VLDx1(LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對一濃度系列之B7-1-Fc(於25、12.5、6.25、3.125、1.56與0ug/ml)之第二結合。該雙專一性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]輕鏈之B7-1結合性VLD，如於圖6中闡明的。
注射雙專一性物：Fab-VLDx1(LC)被添加至感應器表面之點。曲線顯示Fab-VLDx1(LC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合。
注射緩衝劑1：Fab-VLDx1(LC)之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示Fab-VLDx1(LC)自固定在生物感應器表面上之溶菌酶之解離。
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc被以所具體指明之濃度(25、12.5、6.25、3.125、1.56與0ug/ml)添加之點。曲線顯示B7-1-Fc對仍和固定在生物感應器表面上之溶菌酶結合之Fab-VLDx1(LC)之結合。
注射緩衝劑2：B7-1-Fc之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示B7-1-Fc自仍與固定在生物感應器表面上之溶菌酶接附之Fab-VLDx1(LC)之解離。
圖19顯示被疊在一起之一系列之SPR結合感應圖，其展示三專一性物[Fab-VLDx2(HC+LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對一濃度系列之B7-1-Fc(25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)之第二結合。該三專一性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]重鏈與輕鏈兩者之B7-1結合性VLD，如於圖7中闡明的。
注射三專一性物：Fab-VLDx2(HC+LC)被添加至感應器表面之點。曲線顯示Fab-VLDx2(HC+LC)對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合。
注射緩衝劑1：Fab-VLDx2(HC+LC)之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示Fab-VLDx2(HC+LC)自固定在生物感應器表面上之溶菌酶之解離
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc被以所具體指明之濃度(25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)添加之點。曲線顯示B7-1-Fc與仍和固定在生物感應器表面上之Fab-VLDx2(HC+LC)結合。
注射緩衝劑2：B7-1-Fc之注射被停止並以緩衝劑置換之點。曲線顯示B7-1-Fc自仍與固定在生物感應器表面上之溶菌酶接附之Fab-VLDx2(HC+LC)之解離。
實施例5 分子之結合化學計量
雙專一性物[IgG VLDx2(HC)]與三專一性[IgG Imx4(HC+LC)]對於B7-1-Fc之結合化學計量亦係藉由SPR測定(圖20)。動力學分析係針對IgG-VLDx2(HC)、IgG-VLDx2(LC)與IgG-VLDx4(HCLC)藉由在 生物素-溶菌酶表面上之捕捉並以一系列之濃度之B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、3.125、1.56與0μg/ml)作為分析物來執行。分析物之理論最大結合訊號(Rmax)係基於所捕捉之IgG-VLD蛋白質之量計算，說明分析物與配體之分子量。
對所有樣本假設1：1化學計量，分析物與配體之結合性水平係針對各個濃度作圖成Rmax值之百分比。隨著分析物濃度增加至25μg/ml，結合水平靠近飽和或平衡水平。四價蛋白質IgG-VLDx4(HC+LC)之平衡結合水平(Rmax之103.9%)係大約二價蛋白質IgG-VLDx2(HC)之水平(56.7%)與IgG-VLDx2(LC)之水平(51.4%)之兩倍。此暗示IgG-VLDx4(HC+LC)能夠同時透過與重鏈和輕鏈融合之VLD功能域結合B7.1-Fc。
雙專一性物[Fab-VLDx1(HC)]、[Fab-VLDx1(LC)]與[FabVLDx2(HC+LC)對B7-1-Fc之結合化學計量係於圖21中顯示。結果暗示Fab-VLDx2(HC+LC)能夠同時透過與重鏈和輕鏈融合之VLD功能域結合B7.1。
實施例6 分子對B7.1-Fc之結合親和力
抗體-VLD雙專一性與三專一性分子與Fab-VLD雙專一性與三專一性分子之結合動力學係藉由表面電漿子共振測定。締合常數(Ka)、解離常數(Kd)與平衡解離常數/結合常數KD係分別於表3與4顯示。
結果展示三專一性分子IgG VLDx4 10(HC+LC)與雙專一性分子IgG VLDx2(HC)對B7-1-Fc之結合親和力係可比較的。
結果展示三專一性分子Fab VLDx4 15(HC+LC)與雙專一性分子Fab VLDx1(HC)對B7-1-Fc之結合親和力係可比較的。
實施例7 三專一性結合之分析
修飾IgG VLDx4(HCLC)構築體，藉此抑硬素(Scl)結合性VLD係與抗溶菌酶抗體D1.3之重鏈之C端耦合且B7-1結合性VLD係與抗 溶菌酶抗體之抗體恆定輕(CL)鏈耦合。此三專一性分子被稱為[IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)]。
與抗抑硬素VLD融合之抗溶菌酶IgG1重鏈「1E1」之序列係於以下顯示(SEQ ID NO：25)：
抗抑硬素VLD之序列係於以下顯示： (SEQ ID NO：14)
SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：14之VLD結合環被加底線。
為了分析溶菌酶、B7-1與抑硬素之同時三重結合性，分析 係於Biacore X100 SPR儀器(GE)上執行。抗體-Imunexin蛋白質被以35μg/ml注射到鏈黴抗生物素蛋白感應晶片表面上，於該表面上經生物素化溶菌酶已於流動槽2上被捕捉(大約200RU)。注射抗體-Imunexin蛋白質，接著一個穩定期。第一分析物B7.1-Fc係以25μg/ml之濃度注射。執行一個對照循環，其中僅僅緩衝劑被注射來取代B7.1-Fc。接著立即以15μg/ml注射第二分析物抑硬素(R&D Systems目錄編號1406ST/CF)共60s，解離時間120s。執行一個對照循環，其中僅僅緩衝劑被注射來取代抑硬素。
表面係藉由注射pH 2.1之10mM甘胺酸緩衝劑共30秒來再生。
所有的數據皆以減去來自不含有溶菌酶之參考表面(流動槽1)之反應後之反應單位(RU)表現。
(a)全長抗體構築體之三專一性結合之分析
圖22顯示被疊在一起之一系列之SPR結合感應圖，其展示三專一性物[IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)]對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對B7-1-Fc及抑硬素之同時結合。該三專一性物具有融合至D1.3抗體[D1.3 IgG]重鏈之抑硬素結合性VLD及融合至其之輕鏈之B7-1結合性VLD。
僅僅B7-1-Fc之曲線係一個該三專一性物之感應圖，其顯示對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著B7-1-Fc之添加。該感應圖展示對溶菌酶及B7-1-Fc之同時雙重目標結合。
僅僅抑硬素之曲線係一個該三專一性物之感應圖，其顯示對 固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著抑硬素之添加。該感應圖展示對溶菌酶及抑硬素之同時雙重目標結合。
B7-1-Fc及抑硬素曲線係一個該三專一性物之感應圖，其顯示對固定在生物感應器表面上之溶菌酶之結合，接著B7-1-Fc之添加，與再接著抑硬素之添加。該感應圖展示對溶菌酶及B7-1-Fc及抑硬素之同時三目標結合。
該分子對B7-1及抑硬素之結合係藉由SPR檢查，如於圖22中顯示的。結果顯示該三專一性物能夠同時與B7-1及抑硬素結合。
(b)Fab構築體之三專一性結合之分析
修飾Fab VLDx2(HC+LC)構築體，藉此B7-1結合性VLD係與抗溶菌酶Fab D3.1之重鏈之C端耦合且抑硬素(Scl)結合性VLD係與抗溶菌酶Fab之Fab恆定輕(CL)鏈耦合。此三專一性分子被稱為[Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)]。製作第二構築體，藉此抑硬素結合性VLD係與抗溶菌酶Fab D3.1之重鏈之C端耦合且B7-1結合性VLD係與抗溶菌酶Fab之Fab恆定輕(CL)鏈耦合。此三專一性分子被稱為[Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-1-LC)]
圖23顯示三專一性物Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)之結合分析且圖24顯示三專一性物Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-1-LC)之結合分析。結合分析係使用ForteBio Blitz執行。結合曲線展示該等三專一性物(於圖23為Fab VLDx2(B7-HC)(Scl-LC)且於圖24為Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-1LC))對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記溶菌酶之最初結合接著對B7-1-Fc和抑硬素之相繼及同時結合。生物感應器曲線顯示該等三專一性物對固定在生 物感應器表面上之溶菌酶之最初結合接著對B7-1-Fc(B7-1-Fc係於所指示之點添加)之結合。結合曲線展示對溶菌酶及B7-1-Fc之同時雙重目標結合。抑硬素係隨後於所指示之點添加且生物感應器曲線顯示Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)與Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-1-LC)分子兩者對溶菌酶及B7-1Fc及抑硬素之同時三目標結合。最後，抑硬素被以緩衝劑置換以顯示解離率。
實施例8 人類血清白蛋白-VLD融合蛋白質之產生 方法
圖25顯示根據本文之揭示內容之一個實例與VLD耦合之蛋白質之示意圖。該雙專一性物可與目標A與B兩者個別或同時結合。
載體產生
製造編碼融合至一或二個VLD之人類血清白蛋白(HSA)之序列，其包括經強調之16個胺基酸之連接子序列(SGGGGSGGGGSGGGGS)與C端組胺酸標籤。該序列被選殖入哺乳類動物表現載體中。所使用之載體係pcDNA3.4載體(Thermo Fisher)。該等序列係加上訊號胜肽來選殖以允許該蛋白質被分泌。該胜肽之序列係如下：MAWMMLLLGLLAYGSG(SEQ ID NO：8)。
細菌之載體轉形係根據標準技術使用電穿孔勝任細胞(例如ElectroTen-Blue Cell，Stratagene Cat #200159)執行。
於載體擴增後，使用Qiagen HiSpeed質體Maxi套組(Cat # 12663)或Promega PureYieldTM質體Midiprep系統(Cat # A2492)萃取與製備質體DNA。於無核酸酶純水中洗提DNA。
轉染
3-5x106個細胞/mL之密度與>95%之生存力之Expi293哺乳類動物細胞之轉染係使用Expi293表現系統(ThermoFisher Science Cat # A14635)執行。將DNA載體加至Opti-MEM I減少血清培養基(LifeTechnologies Cat #31985070)與ExpiFectamine 293試劑(ThermoFisher Cat # A14525)並於室溫下培養共20min。將轉染複合物加至細胞並於37℃，5% CO2下於120rpm培養。於20個小時後，將Expifectamine 293轉染增強劑1與2(ThermoFisher Cat # A14525)加至細胞。於大約4-5日後收穫含蛋白質之上清液。
純化
蛋白質係藉由親和力層析術使用鎳Sepharose Excel(GE，Cat # 17-3712-01)純化。以5倍管柱體積之20mM磷酸鈉、0.5M NaCl，ph7.4平衡鎳Sepharose管柱。將含有以His標記之HSA-VLD蛋白質之經轉染細胞培養物上清液裝載至該管柱上，並以10倍管柱體積之20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、5mM咪唑，ph7.4洗滌該管柱。以20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、500mM咪唑ph7.4洗提蛋白質。將所洗提出之流份倒在一起並使用PBS根據標準方法透析。
圖26顯示使用抗His HRP(Sigma Aldrich，Cat # 11965085001) 之經純化之HSA融合蛋白質之西方墨點轉漬分析與偵測，該等蛋白質包含融合至HSA之C端、N端、或C端與N端兩者之VLD。該等蛋白質之估計大小分別係：67kDa(預測之大小：81.9kDa)；69.3kDa(預測之大小：81.8kDa)；與94.4kDa(預測之大小：96.2kDa)。
結合之評估
經純化之分子之結合特性係使用ForteBio Blitz生物感應器使用標準化學與試劑界定特徵。
經親和力純化之分子係以商業可得之B7.2-Fc蛋白質(R&D Systems,Cat# 141-B2)、CD3(Acrobiosystems,Cat# CDD-H52W3)、與經生物素化抗HSA親和體(Abcam,Cat# 31898)測試。
CD3與B7.2Fc蛋白質係以1：1莫耳每公升比率使用EZ-Link磺酸基-NHS-LC-生物素(ThermoFisher,Cat # 21327)根據標準方法生物素化。
使用鏈黴抗生物素蛋白捕捉性表面(SA Sensor,ForteBio cat# 18-5019)以捕捉經生物素標記蛋白質。使HSA-VLD分子通過在生物感應器表面上被捕捉之目標以產生結合性感應圖。
圖27顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示HSA-VLD分子對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記B7.2-Fc之結合之分析。曲線1係具有接附至C端之B7結合性VLD之HSA-VLD融合蛋白質之感應圖。曲線2係具有接附至N端與C端兩者之B7結合性VLD之VLD-HSA-VLD融合蛋白質之感應圖。顯示該等分子對固定在生物感應器表面上B7.2-Fc之結合，接著於點1之緩衝劑之添加。
圖28顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示HSA-VLD分子對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記CD3 δ/ε(de)異元二聚體之結合之分析。所顯示之曲線係具有接附至C端之CD3結合性VLD之HSA-VLD融合蛋白質之感應圖。顯示分子對固定在生物感應器表面上之CD3de之結合，接著於點1之緩衝劑之添加。
圖29顯示使用ForteBio Blitz生物感應器以展示HSA-VLD分子對經鏈黴抗生物素蛋白捕捉生物素標記抗HSA親和體之結合之分析。所顯示之曲線係具有接附至C端之B7結合性VLD之HSA-VLD融合蛋白質之感應圖。顯示該分子對固定在生物感應器表面上之抗HSA親和體之結合，接著於點1之緩衝劑之添加。於點2，B7.2Fc蛋白質被允許與感應器表面上所捕捉之分子結合。接著於點3以緩衝劑置換B7.2Fc。
結果 (i)CTLA4 VLD於人類血清白蛋白之C端、N端或C與N端兩者融合至HSA。
序列係於以下顯示：
融合至HSA之C端之B7-2結合性VLD(SEQ ID NO：26)：
融合至HSA之N端之B7-1結合性VLD(SEQ ID NO：27)：
融合至HSA之N端與C端兩者之B7-2結合性VLD(SEQ ID NO：28)：
(ii)融合至人類血清白蛋白之C端CD3結合性VLD(稱為AF3)
序列係於以下顯示：
融合至HSA之C端之CD3結合性VLD「AF3」(SEQ ID NO：29)：
<110> 伊莫納瑟斯有限公司
<120> 多重專一性分子
<130> 524290
<140> 2016900709
<141> 2017-02-27
<160> 30
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDM支架序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (26)..(26)
<223> X係介於5與15個間之任何胺基酸
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (48)..(48)
<223> X係介於5與15個間之任何胺基酸
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (86)..(86)
<223> X係介於5與15個間之任何胺基酸
<400> 5
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDM支架序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (26)..(26)
<223> X係介於5與15個間之任何胺基酸
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (49)..(49)
<223> X係介於5與15個間之任何胺基酸
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (87)..(87)
<223> X係介於5與15個間之任何胺基酸
<400> 6
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 單一胜肽
<400> 8
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
<210> 13
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
<210> 14
<211> 130
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (6)..(6)
<223> X意指任何數字，即SGGGG之多重複
<400> 15
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子序列
<400> 16
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子序列
<400> 17
<210> 18
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 18
<210> 19
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 19
<210> 20
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 20
<210> 21
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 21
<210> 22
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 22
<210> 23
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 23
<210> 24
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 24
<210> 25
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 25
<210> 26
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 26
<210> 27
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 27
<210> 28
<211> 875
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 28
<210> 29
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 29
<210> 30
<211> 332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BDM支架序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (85)..(85)
<223> n係編碼一第一結合環之核苷酸之長度
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (139)..(139)
<223> n係編碼一第二結合環之核苷酸之長度
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (149)..(149)
<223> n係a、c、g、或t
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (251)..(251)
<223> n係編碼一第三結合環之核苷酸之長度
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (261)..(261)
<223> n係a、c、g、或t
<400> 30

Claims (43)

  1. 一種能夠與二或多種不同的目標抗原或表位結合之多重專一性分子，該分子包含：(i)至少一個與第一目標抗原或表位結合之結合功能域分子(BDM)，該BDM包含似V功能域(V-like domain，VLD)支架，其內含有三個暴露之結合環(BL)且其中該三個BL之至少二者相較於其等之支架中的相對應天然序列係經修飾或置換以與異源性目標抗原或表位選擇性結合；與(ii)藥理活性蛋白質或胜肽，其係與第二目標抗原或表位結合之抗體或其抗原停留片段或非抗體蛋白質或胜肽；其中至少一個BDM係與該藥理活性蛋白質或胜肽內出現之多肽之C端耦合。
  2. 根據申請專利範圍第1項之分子，其中至少一個BDM係與抗體重鏈多肽之C端耦合。
  3. 根據申請專利範圍第1或2項之分子，其中至少一個BDM係與抗體輕鏈多肽之C端耦合。
  4. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中至少一個BDM係與所有抗體重鏈與輕鏈多肽之C端耦合。
  5. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該藥理活性蛋白質係全長抗體。
  6. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中抗體鏈對BDM之比率係4：2n，其中n係介於1與5間之數字。
  7. 根據申請專利範圍第1至5項中之任一項之分子，其中該藥理活性蛋 白質係抗原結合片段係選自由Fab、Fab’、F(ab’)2或經化學連接之F(ab’)2所組成之群組。
  8. 根據申請專利範圍第7項之分子，其中抗原結合片段鏈對BDM之比率係2：n，其中n係介於1與16間之數字。
  9. 根據申請專利範圍第1至6項中之任一項之分子，其中至少一個BDM係與該重鏈多肽之CH1、CH2或CH3功能域之C端耦合。
  10. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中至少一個BDM係與該非抗體蛋白質或多肽之各多肽鏈之C端耦合。
  11. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該VLD支架包含人類CTLA4、ICOS或CD28之細胞外部分。
  12. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該藥理活性蛋白質與其之天然目標抗原或表位結合。
  13. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該第一目標抗原與該第二目標抗原係不同的。
  14. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該第一目標表位與該第二目標表位係在相同或不同的抗原上。
  15. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該分子係雙專一性物或三專一性物。
  16. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該分子包含一、二、三、四、五或六個BDM。
  17. 根據申請專利範圍第1至6項中之任一項之分子，其中該分子包含一對或二對BDM，其中於該對中之該等BDM係完全相同的。
  18. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該至少一個BDM係與一或多個另外的BDM連接。
  19. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該分子包含最少二個BDM、或至少一對BDM，其中各BDM(或BDM對)與不同的目標抗原或表位結合。
  20. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中各BDM與和該藥理活性蛋白質或多肽所結合之目標抗原表位不同之目標抗原或表位結合。
  21. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該非抗體蛋白質或胜肽係選自由以下者所組成之群組：凝血因子、抗運載蛋白(anticalin)、類毒素、膠原結合蛋白、人類血清白蛋白(HSA)、TNF-α受體結合蛋白、整聯蛋白結合蛋白、VEGF或其擬似物、EPO或其擬似物、C4結合蛋白、尿激酶受體拮抗劑、淋巴激素、細胞介素、護骨素(osteoprotegerin，OPG)或選自計畫性細胞死亡1蛋白質(PD1)、計畫性死亡配體1(PD-L1)、NKG2D、與第I類MHC多肽相關之序列A(MICA)、與第I類MHC多肽相關之序列B(MICB)、UL16結合蛋白(ULBP)之蛋白質之細胞外功能域。
  22. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該VLD支架係選自由細胞外功能域人類CTLA4、CD28或ICOS所組成之群組。
  23. 根據申請專利範圍第22項之分子，其中該VLD支架係由對應於在以下提出之SEQ ID NO：1之殘基1至25、34至54、60至97與106至126之架構序列組成：
  24. 根據申請專利範圍第23項之分子，其中該VLD支架包含與SEQ ID NO：1之殘基1至25、34至54、60至97與106至126有至少約70%序列一致性之序列。
  25. 根據申請專利範圍第23或24項之分子，其中位於SEQ ID NO：1之位置26至33、及/或位置55至59及/或位置98至105之胺基酸殘基係經修飾或經異源性序列置換。
  26. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該BDM包含於以下提出之序列或係由其組成： (SEQ ID NO：5) 其中X、X與X係任何胺基酸殘基且n係介於5與15間之數字且1、2、3分別指示BL 1、2與3。
  27. 根據申請專利範圍第26項之分子，其中Xn 1 係介於5與8個之間的胺基酸，Xn 2 係介於5與8個之間的胺基酸，且Xn 3 係介於10與15個之間的胺基酸。
  28. 根據申請專利範圍第26或27項之分子，其中Xn 1 係8個胺基酸。
  29. 根據申請專利範圍第26或27項之分子，其中Xn 2 係5個胺基酸。
  30. 根據申請專利範圍第26或27項之分子，其中Xn 3 係介於10與15個之間的胺基酸。
  31. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該至少一個BDM係 呈單體、二聚體或一系列連接在一起之BDM單體。
  32. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該至少一個BDM與該藥理活性蛋白質或胜肽之耦合係藉由連接子、藉由直接融合、藉由共軛或藉由共價或非共價鍵結。
  33. 根據申請專利範圍第32項之分子，其中該連接子係Gly-Ser胜肽連接子。
  34. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該目標抗原係蛋白質、醣蛋白、聚糖、脂質、脂蛋白質或核酸。
  35. 根據前述申請專利範圍中之任一項之分子，其中該分子選擇性地與表現被該分子之個別BDM與醫藥活性蛋白質部分辨識之二或多種不同的目標抗原或表位之細胞結合但不與僅僅表現該等目標抗原或表位之一者之細胞結合。
  36. 根據前述者之任一者之分子，其係多肽。
  37. 根據申請專利範圍第34項之分子，其中該多肽係選自由SEQ ID NO：5、6、13、14、19、21、22、23、24、25、27、28或29所組成之群組。
  38. 根據申請專利範圍第1至37項中之任一項之分子，其係核酸。
  39. 一種宿主細胞，其經根據申請專利範圍第38項之核酸轉形。
  40. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至37項中之任一項之分子、加上醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑。
  41. 根據申請專利範圍第40項之組成物，其係用於製造醫藥品。
  42. 根據申請專利範圍第1至37項中之任一項之分子，其中該分子係以劑標記以幫助偵測。
  43. 一種根據申請專利範圍第1至37項中之任一項之分子之用途，其係用於偵測一或多個該分子與之結合之目標抗原。
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