JP7462762B2 - アフィニティークロマトグラフィー用の新規な洗浄緩衝液 - Google Patents
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Description
1つの態様では、本開示は、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製における不純物除去を改善するための方法であって、以下のステップ:
1)アフィニティークロマトグラフィーカラムにタンパク質サンプルをロードすること、
2)式(I):
[式中、R1は、HまたはC1-6アルキルであり;ここで、C1-6アルキルは、非置換であるか、またはカルボキシ、アミノ、ハロゲンもしくはヒドロキシから独立して選択される1、2もしくは3個の置換基で置換される]
で示される化合物、およびpH調整剤を含む洗浄緩衝液でカラムを洗浄することを含む、方法を提供する。
1)アフィニティークロマトグラフィーカラムにタンパク質サンプルをロードすること、
2)セリンおよび/またはシステイン、およびpH調整剤を含む洗浄緩衝液でカラムを洗浄すること、
を含む、方法を提供する。
[式中、R1は、HまたはC1-6アルキルであり;ここで、C1-6アルキルは、非置換であるか、またはカルボキシ、アミノ、ハロゲンもしくはヒドロキシから独立して選択される1、2もしくは3個の置換基で置換される]
で示される化合物を含む、組成物を提供する。
[式中、R1は、HまたはC1-6アルキルであり;ここで、C1-6アルキルは、非置換であるか、またはカルボキシ、アミノ、ハロゲンもしくはヒドロキシから独立して選択される1、2もしくは3個の置換基で置換される]
で示される化合物、セリンまたはシステインを含む組成物を含む、キットを提供する。
本開示は、アフィニティークロマトグラフィーのための効率的でロバストな洗浄液を提供する。洗浄液は、ヒスチジンまたはイミダゾール(芳香族複素環、ヒスチジンの官能基)の存在を特徴とし、生成物の回収を損なうことなく、溶出ステップの前の洗浄ステップに適用される。
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明全体に記載される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
酢酸ナトリウム三水和物、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸二ナトリウムは、Merck (Darmstadt、ドイツ)から購入した。酢酸、L-ヒスチジン、L-ヒスチジン一塩酸塩、L-アルギニン塩酸塩、L-システイン、セリン、プロリンおよび塩酸(6.0N溶液)は、J. T. Baker、Millipore (Bedford、MA、アメリカ)から購入した。イミダゾールは、Sigma (Saint Louis、アメリカ)から購入した。
Unicornソフトウェアバージョン6.3(GE Healthcare、Uppsala、スウェーデン)がインストールされたAKTA pure 150システムを、すべてのクロマトグラフィー分析に使用した。pHおよび導電率は、SevenExcellence S470 pH/導電率計(Mettler-Toledo、Columbus、OH、アメリカ)を使用して測定した。NanoDrop One分光光度計(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、米国)を使用してタンパク質濃度を測定した。SEC-HPLC分析には、Agilent 1260液体クロマトグラフィー機器(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、米国)を使用した。
プロテインA/カプトブルークロマトグラフィー
エシュムノA(プロテインAアフィニティー培地)/カプトブルー(high-sub)を直径0.5cmのカラムに詰め、ベッドの高さを15cmにした。カラム容量(CV)は約3mlである。ロードは、明らかにされた培養収穫物である。すべての実行で、カラムがロードされ、結合-溶出モードで実行された。標的タンパク質を溶出緩衝液で溶出した。すべての分析で、サンプルをロードした後、溶出前に3CVのカラムを異なる緩衝液で洗浄した。すべてのクロマトグラフィー分析について、システムは、180cm/時間の流速で実行された(滞留時間:5分)。すべてのクロマトグラムは、280nmでのUV吸光度をモニターすることによって記録された。選択した実行からの溶出液をフラクションで集め、SEC-HPLCでモノマー純度、HCPおよび/またはPLBL2アッセイを分析した。
すべてのサンプルは、Tosoh TSKgel G3000SWxlステンレス鋼カラム(7.8 x 300mm)を使用して分析した。1回の実行ごとに100μgのサンプルを注入した。移動相は、pH6.8の50mMリン酸ナトリウム、300mM塩化ナトリウムから構成された。各サンプルを1.0mL/分の流速で20分間アイソクラティックに溶出した。タンパク質の溶出を、280nmでのUV吸光度によってモニターした。モノマーと凝集体に対応するピークを統合して、各種のパーセンテージを計算した。
残留CHO宿主細胞タンパク質の測定は、Cygnus TechnologiesのCHO Host Cell Proteins F550キットを使用して行う。CHO HCPを含むサンプルは、HRP標識抗CHO抗体と同時に反応し、マイクロタイターストリップ中で、コーティングされた抗CHO抗体を捕捉する。免疫反応は、固相抗体-HCP-酵素標識抗体のサンドイッチ複合体の形成をもたらす。次に、基質、TMBは、HRPと反応する。反応を終了し、450nmおよび650nmのOD値を読み取る。決定されたOD値は、サンプルに存在するCHO HCPの濃度に正比例して、サンプルに存在する残留CHO宿主細胞タンパク質のレベルを決定する。
サンプルは、MyBioSourceのハムスターホスホリパーゼB様(PLBL2)ELISAキットを使用して分析される。このアッセイでは、サンプルに存在するPLBL2は、ポリスチレンマイクロタイターウェルの表面に吸着された抗PLBL2抗体と反応する。洗浄により未結合のタンパク質を除去した後、検出抗体、ビオチン結合抗PLBL2を添加し、複合体を形成させる。洗浄ステップに続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプトアビジンを添加し、複合体を形成させる。別の洗浄ステップに続いて、複合体を、TMBの添加によってアッセイする。試験サンプル中のPLBL2の量は、標準から作成された標準曲線から補間し、サンプル希釈に対して補正することができる。
本開示は、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製における不純物除去を改善するための方法であって、以下のステップ:
1)アフィニティークロマトグラフィーカラムにタンパク質サンプルをロードすること、
2)少なくとも1つの式(I):
[式中、R1は、HまたはC1-6アルキルであり;ここで、C1-6アルキルは、非置換であるか、またはカルボキシ、アミノ、ハロゲンもしくはヒドロキシから独立して選択される1、2もしくは3個の置換基で置換される]
で示される化合物およびpH調整剤を含む洗浄緩衝液でカラムを洗浄すること、
を含む、方法を提供する。
1)アフィニティークロマトグラフィーカラムにタンパク質サンプルをロードすること、
2)セリンおよび/またはシステインを含む洗浄緩衝液でカラムを洗浄すること、
を含む、方法を提供する。
もう1つの態様では、本開示は、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製における不純物除去を改善するのに使用するための組成物であって、少なくとも1つの式(I):
[式中、R1は、HまたはC1-6アルキルであり;ここで、C1-6アルキルは、非置換であるか、またはカルボキシ、アミノ、ハロゲンもしくはヒドロキシから独立して選択される1、2もしくは3個の置換基で置換される]
で示される化合物を含む、組成物を提供する。1つの実施形態では、R1はHであり、化合物はイミダゾールである。1つの実施形態では、R1は、カルボキシおよびアミノによって置換されるC3アルキルである。1つの実施形態では、化合物は、ヒスチジンおよび/またはイミダゾールである。
もう1つの態様では、本開示は、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製における不純物除去を改善するためのキットであって、式(I):
[式中、R1は、HまたはC1-6アルキルであり;ここで、C1-6アルキルは、非置換であるか、またはカルボキシ、アミノ、ハロゲンもしくはヒドロキシから独立して選択される1、2もしくは3個の置換基で置換される]
で示される化合物を含む組成物を含む、キットを提供する。1つの実施形態では、R1はHであり、化合物はイミダゾールである。1つの実施形態では、R1は、カルボキシおよびアミノによって置換されるC3アルキルである。1つの実施形態では、化合物は、ヒスチジンまたはイミダゾールである。1つの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインAクロマトグラフィー、カプトブルー(High Sub)クロマトグラフィー、プロテインGクロマトグラフィー、プロテインLクロマトグラフィー、ラムダFabセレクトクロマトグラフィー、カッパセレクトクロマトグラフィー、lgセレクトクロマトグラフィー、ブルーセファロースクロマトグラフィー、カプトヘパリンクロマトグラフィー、VIIセレクトクロマトグラフィー、VIIIセレクトクロマトグラフィー、XセレクトクロマトグラフィーおよびカプトLクロマトグラフィーから選択される。1つの実施形態では、キットは、pH調整剤をさらに含む。1つの実施形態では、pH調整剤は、NaAcおよび/またはHAcなどの酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはトリス-HClを含む。
米国特許第6,090,382号に開示されている抗hTNFαを発現するcDNA配列を、それぞれブラストサイジンおよびゼオシン耐性マーカーを含む2つのベクターにクローン化した。リポソームを用いて安定したトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、プール選択のために細胞を選択培地(9μg/mLのブラストサイジンと400μg/mLのゼオシンを含むCDCHO培地)で継代した。プール選択の約2週間後、プールをFACSソーティングによってクローン化した。クローンを、スピンチューブでの流加培養によってスクリーニングした。選択した細胞クローンを培養し、抗hTNFαIgG4を含む細胞培養物から収穫物を清澄化する。
この実施例では、アフィニティークロマトグラフィー中のIgG4含有細胞培養物からの不純物の除去に対するヒスチジン含有洗浄液の濃度効果を調査する。洗浄2の溶液中の4つの異なる濃度のヒスチジンを比較する。
この実施例では、アフィニティークロマトグラフィー中のIgG4含有細胞培養物からの不純物の除去に対するイミダゾール含有洗浄緩衝液の濃度効果を調査する。具体的には、4つの異なる濃度の洗浄液を比較する。
この実施例では、アフィニティークロマトグラフィー中のIgG4含有細胞培養物からの不純物の除去に対するヒスチジン含有洗浄緩衝液のpH効果を調査する。具体的には、4つの異なるpHの洗浄液を比較する。
この実施例では、アフィニティークロマトグラフィー中のIgG4含有細胞培養物からの不純物の除去に対するイミダゾール含有洗浄緩衝液のpH効果を調査する。具体的には、4つの異なるpHの洗浄液を比較する。
この実施例では、アフィニティークロマトグラフィー中のIgG4含有細胞培養物からの不純物の除去に対するヒスチジン含有洗浄緩衝液の効果を評価する。具体的には、7つの洗浄液を比較する。
WO 2019/057124A1に開示されている二重特異性抗CD3×CD19抗体を発現するcDNA配列を、それぞれブラストサイジンおよびゼオシン耐性マーカーを含む2つのベクターにクローン化した。リポソームを使用して安定したトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、ミニプール選択のために、細胞を96ウェルプレートの選択培地(9 μg/mLブラストサイジンと400μg/mLゼオシンを含むCD CHO培地)にプレーティングした。ミニプール選択の約2週間後、高生産性ミニプールを個別に拡張した。ミニプールは、1ラウンドのFACSによってクローン化され、クローンは、スピンチューブ内の流加培養によってスクリーニングされた。選択された細胞クローンを培養し、二重特異性抗CD3×CD19抗体を含む細胞培養物から収穫物を清澄化した。
PD1を標的とするモノクローナル抗体(キイトルーダ)を発現するcDNA配列は、特許出願番号WO2008/156712Aに開示されている。VEGFを標的とする融合タンパク質アイリーアを発現するためのcDNA配列は、米国特許第7,070,959B1号に開示されている。cDNA配列を、それぞれブラストサイジンおよびゼオシン耐性マーカーを含む2つのベクターにクローン化した。リポソームを使用して安定したトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、プール選択のために、細胞を選択培地(9 μg/mLブラストサイジンと400μg/mLゼオシンを含むCD CHO培地)に継代した。プール選択の約2週間後、プールをFACSソーティングによってクローン化した。クローンは、スピンチューブ内の流加培養によってスクリーニングされた。選択された細胞クローンを培養し、抗PD1 IgG4または抗VEGF融合タンパク質を含む細胞培養物から収穫物を清澄化した。
米国特許出願第15/557358号(配列番号:145を参照)に開示される抗CD40 HSA融合タンパク質を発現するためのcDNA配列をクローン化し、当技術分野で訓練されたものに精通している技術を使用して、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で発現させた。
Claims (13)
- アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製における不純物除去を改善するための方法であって、以下のステップ:
1)アフィニティークロマトグラフィーカラムにタンパク質サンプルをロードすること、
2)式(I):
[式中、R1は、HまたはC1-6アルキルであり;ここで、C1-6アルキルは、非置換であるか、またはカルボキシ、アミノ、ハロゲンもしくはヒドロキシから独立して選択される1、2もしくは3個の置換基で置換される]
で示される化合物、およびpH調整剤を含む洗浄緩衝液でカラムを洗浄することを含み、
化合物のモル濃度が、100mM以上であり、
洗浄緩衝液のpHが、pH5.5以下である、方法。 - 化合物が、ヒスチジンまたはイミダゾールである、請求項1に記載の方法。
- アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインAクロマトグラフィー、カプトブルー(High Sub)クロマトグラフィー、プロテインGクロマトグラフィー、プロテインLクロマトグラフィー、ラムダFabセレクトクロマトグラフィー、カッパセレクトクロマトグラフィー、lgセレクトクロマトグラフィー、ブルーセファロースクロマトグラフィー、カプトヘパリンクロマトグラフィー、VIIセレクトクロマトグラフィー、VIIIセレクトクロマトグラフィー、XセレクトクロマトグラフィーおよびカプトLクロマトグラフィーから選択される、請求項1または2に記載の方法。
- pH調整剤が、NaAcおよび/またはHAcなどの酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス-HClの少なくとも1つを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 化合物のモル濃度が、100mM~1Mである、請求項1または2に記載の方法。
- 化合物のモル濃度が、300mM~700mMである、請求項5に記載の方法。
- タンパク質サンプルが、Fcドメインを含む抗体であるか、または融合タンパク質である、請求項1または2に記載の方法。
- 融合タンパク質が、Fc融合タンパク質またはHAS融合タンパク質である、請求項7に記載の方法。
- Fc融合タンパク質が、目的のペプチドまたはタンパク質に結合したIgGのFcドメインで構成される、請求項8に記載の方法。
- HAS融合タンパク質が、目的のペプチドまたはタンパク質に結合したHASで構成される、請求項8に記載の方法。
- 不純物が、宿主細胞タンパク質(HCP)を含む、請求項1または2に記載の方法。
- アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製における不純物除去を改善するのに使用するための、少なくとも1つの式(I):
[式中、R1は、HまたはC1-6アルキルであり;ここで、C1-6アルキルは、非置換であるか、またはカルボキシ、アミノ、ハロゲンもしくはヒドロキシから独立して選択される1、2もしくは3個の置換基で置換される]
で示される化合物およびpH調整剤を含む、組成物またはキットであって、
化合物のモル濃度が、100mM以上であり、
洗浄緩衝液のpHが、pH5.5以下である、組成物またはキット。 - 化合物が、ヒスチジンまたはイミダゾールである、請求項12に記載の組成物またはキット。
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