CN108611358A - 一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法 - Google Patents

一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法 Download PDF

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周盈
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Abstract

本发明提供了一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：1).PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段；2).构建pTrcHis2c‑katG质粒；3).构建pET28a‑inhA质粒；4).纯化InhA蛋白；5).纯化INH‑NAD化合物。本发明的有益效果是：在大肠杆菌细胞内直接合成INH‑NAD并通过超滤管浓缩纯化和短时间加热后离心、过滤等步骤实现INH‑NAD的纯化分离。

Description

一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的 方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(结核菌)感染而引起的传染性疾病。结核病是困扰人类时间最长、危害最大的传染病之一。1882年，结核病的病原菌结核分枝杆菌才被德国科学家科赫分离并鉴定。在此之前，结核病在全球范围内多次发生大规模流行，并且被称为“白色瘟疫”。自五十年代以来，人类不断发现了有效的抗结核药物，使TB的流行得到了一定控制。抗结核药物是一把双刃剑，它既能够治疗TB，但是它也能够导致结核分枝杆菌出现对应的抗结核药物耐药株。
在今天全球TB的防控面临巨大的挑战，尤其是结核分枝杆菌和HIV(TB/HIV)共感染，耐多药(multidrug-resistant，MDR)和广泛耐药(extensively drug-resistant，XDR)结核病病例的出现。用于治疗结核病的药物通常分为一线药物和二线药物，目前常用的一线药物主要有异烟肼(INH)，利福平(RIF)，吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)，一线药物疗效显著并能缩短整个治疗的周期。二线药物主要有：氨基糖苷类(aminoglycosides)：卡那霉素(kanamycin)和丁胺卡那霉素(amikacin)；环多肽类(polypeptides)：卷曲霉素(capreomycin)、紫霉素(viomycin)和恩维霉素(enviomycin)；氟喹诺酮类(fuoroquinolones)：氧氟沙星(ofoxacin)、加替沙星(gatifoxacin)和环丙沙星(ciprofloxacin)；环丝氨酸(D-cycloserine)；碳硫胺类(thionamides)：乙硫异烟胺(Ethionamide，ETH)和丙硫异烟胺(prothionamide)；PAS。二线药物毒性更大并且没有一线药物显著的疗效，主要用于MDR-TB的治疗以及延长治疗时间。异烟肼于1956年发现，是一种应用广泛的一线抗结核药物。该药物发挥抗结核活性首先需要蛋白KatG活化，活化后与NAD形成有活性的抗结核化合物异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(INH-NAD)，该化合物结合到InhA蛋白中进而抑制其活性并最终影响结核菌细胞壁中分枝菌酸(Mycolic acid)的合成进而杀死结核菌(见下图)。异烟肼发挥抗结核活性必须是其活化后的化合物(INH-NAD)，临床分离耐药性结核菌中InhA蛋白通常会发生突变，从而导致INH-NAD不能结合到InhA蛋白上导致结核菌耐受INH作用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种在大肠杆菌细胞内直接合成INH-NAD并快速高效纯化分离该化合物的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：
1).PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段：
1-1).以SEQ ID №1所示的引物katGBglIIFP和SEQ ID №2所示的引物katGEcoRIRP，进行katG的PCR扩增；以SEQ ID №3所示的引物InhANcoIFP和SEQ ID №4所示的引物InhAHindШRP，进行inhA的PCR扩增；PCR扩增的目的DNA片段经核酸凝胶电泳后回收，-20℃保存备用；
2).构建pTrcHis2c-katG质粒：
2-1).扩大培养含有pTrcHis2c质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pTrcHis2c质粒；
2-2).将步骤1-1扩增后回收的katG序列片段和步骤2-1获得的pTrcHis2c质粒分别都使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的katG序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pTrcHis2c使用T4DNA连接酶16℃连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pCDFDuet-katG质粒；
3).构建pET28a-inhA质粒：
3-1).扩大培养含有pET28a质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pET28a质粒；
3-2).将步骤1-1扩增后回收的inhA序列片段和pET28a质粒分别都使用NcoI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的inhA序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pET28a使用T4DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pET28a-inhA质粒；
4).纯化InhA蛋白：
4-1).将pTrcHis2c-katG质粒和pET28a-inhA质粒等量混合后共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞单克隆扩大培养，控温16℃并添加0.5mM IPTG诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2-3小时，然后加入100mg/mL的异烟肼和10mM的MnCl2培养16小时；
4-2).离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬，再超声破碎后离心取上清液经结合缓冲液预平衡的Ni2+-NTA亲和层析柱，然后使用5个柱体积的第一洗脱缓冲液洗脱不能结合到层析柱上杂蛋白，进一步使用第二洗脱缓冲液洗脱并收集获得的目的InhA蛋白；所述第一洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH 8.0；所述第二洗脱缓冲液为50mMTris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0；
5).纯化INH-NAD化合物：
5-1).使用Millipore 10K超滤管浓缩纯化的InhA蛋白并使用pH 8.0的50mMTris-HCl置换原有的洗脱液，将纯化的InhA蛋白浓缩换液至1mL，将浓缩液100℃加热50秒，然后离心收集上清，将获得的上清液添加到Millipore Microcon 3过滤柱中10000g 4℃离心1小时过滤除去蛋白，离心滤液即含有INH-NAD。
进一步，步骤2-1所述扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。步骤2-2所述单克隆扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。步骤2-2单克隆扩大培养获得的质粒使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNA片段katG连接到pTrcHis2c载体上获得质粒pTrcHis2c-katG。
进一步，步骤3-1所述扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株接种于含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。步骤3-2所述单克隆扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株涂布于含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。步骤3-2单克隆扩大培养获得的质粒使用NcoI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNA片段inhA连接到pET28a载体上获得质粒pET28a-inhA。
进一步，步骤4-1所述单克隆扩大培养是将转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养，将液体培养的菌种1:100转接于新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡培养2-3小时至OD600为0.6。步骤4-2所述离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬具体包括使用离心机4℃8500rpm收集培养好的细菌，菌体沉淀用结合缓冲液洗涤一次，然后重悬于50mL结合缓冲液，所述结合缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，25mM咪唑，pH 8.0。
进一步，步骤5-1后还包括检测鉴定INH-NAD的步骤：
5-2).使用Bio-Tek Synergy H1酶标仪全波长扫描检测其特征紫外吸收峰，以及使用高效液相色谱-电喷雾电离质谱联用仪进行分子量检测鉴定，所述电喷雾电离质谱工作参数：毛细管电压4.5kV；CDL9温度为250℃，加热模块温度为200℃；雾化氮气流速1.5L/min，压力0.02MPa；检测器压力1.4eV；采用负离子模式检测。
本发明的有益效果是：在大肠杆菌细胞内直接合成INH-NAD并通过超滤管浓缩纯化和短时间加热后离心、过滤等步骤实现INH-NAD的纯化分离。
附图说明
图1是纯化的InhA蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图2是实施例1纯化收集到的目的蛋白经电喷雾电离质谱检测结果图；
图3是实施例1分光光度计检测INH-NAD的检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段：PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段分别使用引物对ethANFP/ethAKRP和inhABFP/inhAHRP进行扩增，引物序列如下：
katGBglIIFP：5'-ACCAAGATCTATGCCCGAGCAACACCCACC-3'(SEQ ID №1)；
katGEcoRIRP：5'-CCCCGAATTCTCAGCGCACGTCGAACCT-3'(SEQ ID №2)；
InhANcoIFP：5'-ACAACCATGGGAATGACAGGACTGCTGGACGGC-3'(SEQ ID №3)；
InhAHindШRP：5'-ATGCAAGCTTGAGCAATTGGGTGTGCGCGCCG-3'(SEQ ID №4)。
PCR扩增的目的DNA片段经核酸凝胶电泳后，使用Omega公司胶回收试剂盒回收DNA目的片段，回收后的DNA片段。冻存-20℃冰箱备用。
构建pTrcHis2c-katG质粒：
1)含有pTrcHis2c质粒的大肠杆菌DH5α菌株接种LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用Omega公司质粒提取试剂盒抽提质粒pTrcHis2c。
2)将PCR扩增回收的katG序列片段和试剂盒抽提的pTrcHis2c质粒分别都使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切，酶切后的KatG序列片段使用Omega公司Cycle-pure试剂盒回收；酶切后的pTrcHis2c质粒进行琼脂糖凝胶电泳并使用Omega公司胶回收试剂盒回收酶切后的线性化含有粘性末端的pTrcHis2c质粒；将酶切后回收的KatG序列片段和线性化的质粒pTrcHis2c使用T4DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板(含有100μg/mL氨苄青霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNAkatG序列片段连接到pTrcHis2c载体上获得质粒pTrcHis2c-katG。同时验证正确的质粒pTrcHis2c-katG经擎科公司测序验证序列无突变。
构建pET28a-inhA质粒：
1)含有pET28a质粒的大肠杆菌DH5α菌株接种LB液体培养基(含有100μg/mL硫酸卡那霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用Omega公司质粒提取试剂盒抽提质粒pET28a。
2)将PCR扩增回收的InhA序列片段和试剂盒抽提的pET28a质粒分别都使用NcoI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切，酶切后的InhA序列片段使用Omega公司Cycle-pure试剂盒回收；酶切后的pET28a质粒进行琼脂糖凝胶电泳并使用Omega公司胶回收试剂盒回收酶切后的线性化含有粘性末端的pET28a质粒；将酶切后回收的InhA序列片段和线性化的质粒pET28a使用T4 DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板(含有100μg/mL硫酸卡那霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基(含有100μg/mL硫酸卡那霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使用NcoI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证InhA序列片段连接到pET28a载体上获得质粒pET28a-inhA。同时验证正确的质粒pET28a-inhA经擎科公司测序验证序列无突变。
纯化InhA蛋白：
将构建成功的pTrcHis2c-katG和pET28a-inhA质粒等量混合后共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并涂布LB固体平板(含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL硫酸卡那霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL硫酸卡那霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，将液体培养的菌种1:100转接新鲜的1升LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL硫酸卡那霉素)37℃摇床200rpm震荡培养2-3小时至OD600为0.6，然后将培养温度降至16℃并添加0.5mM IPTG诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2-3小时，然后加入100mg/mL的异烟肼(INH)培养16小时和10mM MnCl2。使用离心机4℃8500rpm收集培养好的细菌，菌体沉淀用结合缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，25mM咪唑，pH 8.0)洗涤一次，然后重悬于50mL结合缓冲液中，超声破碎后，以12000rpm离心30min，上清液上样于经结合缓冲液预平衡的Ni2 +-NTA亲和层析柱(GE公司HisTrap HP层析柱)，然后使用5个柱体积的洗脱缓冲液1(50mMTris-HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH 8.0)洗脱不能结合到层析柱上杂蛋白，进一步使用洗脱缓冲液2(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱并收集获得的目的蛋白InhA。纯化收集到的目的蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测，结果如图1所示。
纯化并检测INH-NAD化合物：
使用Millipore 10K超滤管浓缩纯化的InhA蛋白并使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)置换原有的洗脱液，将纯化的InhA蛋白浓缩换液至1ml。由于INH-NAD化合物能够紧密结合到InhA蛋白中，通过短时间加热让InhA蛋白变性释放其结合的INH-NAD化合物而又不影响其降解，因此将InhA蛋白100℃加热50秒，然后使用离心机15000g4℃离心15分钟后，收集上清。将获得的上清液添加到Millipore Microcon 3过滤柱中10000g 4℃离心1小时过滤除去蛋白，收集离心下来的滤液即含有INH-NAD化合物。INH-NAD化合物同时使用Bio-TekSynergy H1酶标仪全波长扫描检测其特征紫外吸收峰和高效液相色谱(HPLC)-电喷雾电离质谱(ESI/MS)联用仪(液质联用仪)进行分子量检测鉴定。液质联用仪设备型号：(ShimadzuLCMS-2010EV,Tokyo,Japan)。使用的分离柱是Shim-pack VP-ODSC18柱(Shimadzu，250×2.0mm i.d.，5μm)。ESI/MS工作参数如下：毛细管电压4.5kV；CDL9(curved desolvationline)温度为250℃，加热模块(heat block)温度为200℃；雾化氮气流速1.5L/min，压力0.02MPa；检测器电压1.4eV；采用负离子模式检测。
质谱检测结果和分光光度计检测结果分别如图2和图3所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法
<130> 2018
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accaagatct atgcccgagc aacacccacc 30
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccccgaattc tcagcgcacg tcgaacct 28
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acaaccatgg gaatgacagg actgctggac ggc 33
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgcaagctt gagcaattgg gtgtgcgcgc cg 32

Claims (8)

1.一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：
1).PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段：
1-1).以SEQ ID №1所示的引物katGBglIIFP和SEQ ID №2所示的引物katGEcoRIRP，进行katG的PCR扩增；以SEQ ID №3所示的引物InhANcoIFP和SEQ ID №4所示的引物InhAHindШRP，进行inhA的PCR扩增；PCR扩增的目的DNA片段经核酸凝胶电泳后回收，-20℃保存备用；
2).构建pTrcHis2c-katG质粒：
2-1).扩大培养含有pTrcHis2c质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pTrcHis2c质粒；
2-2).将步骤1-1扩增后回收的katG序列片段和步骤2-1获得的pTrcHis2c质粒分别都使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的katG序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pTrcHis2c使用T4 DNA连接酶16℃连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pCDFDuet-katG质粒；
3).构建pET28a-inhA质粒：
3-1).扩大培养含有pET28a质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pET28a质粒；
3-2).将步骤1-1扩增后回收的inhA序列片段和步骤3-1获得的pET28a质粒分别都使用NcoI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的inhA序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pET28a使用T4 DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pET28a-inhA质粒；
4).纯化InhA蛋白：
4-1).将pTrcHis2c-katG质粒和pET28a-inhA质粒等量混合后共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞单克隆扩大培养，控温16℃并添加0.5mM IPTG诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2-3小时，然后加入100mg/mL的异烟肼和10mM的MnCl2培养16小时；
4-2).离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬，再超声破碎后离心取上清液经结合缓冲液预平衡的Ni2+-NTA亲和层析柱，然后使用5个柱体积的第一洗脱缓冲液洗脱不能结合到层析柱上杂蛋白，进一步使用第二洗脱缓冲液洗脱并收集获得的目的InhA蛋白；所述第一洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH 8.0；所述第二洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0；
5).纯化INH-NAD化合物：
5-1).使用Millipore 10K超滤管浓缩纯化的InhA蛋白并使用pH 8.0的50mM Tris-HCl置换原有的洗脱液，将纯化的InhA蛋白浓缩换液至1mL，将浓缩液100℃加热50秒，然后离心收集上清，将获得的上清液添加到Millipore Microcon 3过滤柱中10000g 4℃离心1小时过滤除去蛋白，离心滤液即含有INH-NAD。
2.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤2-1所述扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养；步骤2-2所述单克隆扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。
3.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤2-2单克隆扩大培养获得的质粒使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNA片段katG连接到pTrcHis2c载体上获得质粒pTrcHis2c-katG。
4.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤3-1所述扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株接种于含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养；步骤3-2所述单克隆扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株涂布于含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。
5.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤3-2单克隆扩大培养获得的质粒使用NcoI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNA片段inhA连接到pET28a载体上获得质粒pET28a-inhA。
6.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤4-1所述单克隆扩大培养是将转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养，将液体培养的菌种1:100转接于新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡培养2-3小时至OD600为0.6。
7.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤4-2所述离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬具体包括使用离心机4℃8500rpm收集培养好的细菌，菌体沉淀用结合缓冲液洗涤一次，然后重悬于50mL结合缓冲液，所述结合缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，25mM咪唑，pH 8.0。
8.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤5-1后还包括检测鉴定INH-NAD的步骤：
5-2).使用Bio-Tek Synergy H1酶标仪全波长扫描检测其特征紫外吸收峰，以及使用高效液相色谱-电喷雾电离质谱联用仪进行分子量检测鉴定，所述电喷雾电离质谱工作参数：毛细管电压4.5kV；CDL9温度为250℃，加热模块温度为200℃；雾化氮气流速1.5L/min，压力0.02MPa；检测器压力1.4eV；采用负离子模式检测。
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