CN108624641A - 一种通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：1).PCR扩增ethA和inhA的DNA序列片段；2).构建pCDFDuet‑inhA‑ethA质粒；3).纯化InhA蛋白；4).纯化ETH‑NAD化合物。本发明的有益效果是：在大肠杆菌细胞内直接合成ETH‑NAD并通过超滤管浓缩纯化和短时间加热后离心、过滤等步骤实现ETH‑NAD的纯化。

Description

一种通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌感染而引起的传染性疾病。结核病是困扰人类时间最长、危害最大的传染病之一。1882年，结核病的病原菌结核分枝杆菌才被德国科学家科赫分离并鉴定。在此之前，结核病在全球范围内多次发生大规模流行，并且被称为“白色瘟疫”。自五十年代以来，人类不断发现了有效的抗结核药物，使TB的流行得到了一定控制。抗结核药物是一把双刃剑，它既能够治疗TB，但是它也能够导致结核分枝杆菌出现对应的抗结核药物耐药株。

在今天全球TB的防控面临巨大的挑战，尤其是结核分枝杆菌和HIV(TB/HIV)共感染，耐多药(multidrμg-resistant，MDR)和广泛耐药(extensively drμg-resistant，XDR)结核病病例的出现。用于治疗结核病的药物通常分为一线药物和二线药物，目前常用的一线药物主要有异烟肼(INH)，利福平(RIF)，吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)，一线药物疗效显著并能缩短整个治疗的周期。二线药物主要有：氨基糖苷类(aminoglycosides)：卡那霉素(kanamycin)和丁胺卡那霉素(amikacin)；环多肽类(polypeptides)：卷曲霉素(capreomycin)、紫霉素(viomycin)和恩维霉素(enviomycin)；氟喹诺酮类(fuoroquinolones)：氧氟沙星(ofoxacin)、加替沙星(gatifoxacin)和环丙沙星(ciprofloxacin)；环丝氨酸(D-cycloserine)；碳硫胺类(thionamides)：乙硫异烟胺(Ethionamide，ETH)和丙硫异烟胺(prothionamide)；对氨基水杨酸(para-AminosalicylicAcid，PAS)。二线药物毒性更大并且没有一线药物显著的疗效，主要用于MDR-TB的治疗以及延长治疗时间。乙硫异烟胺于1956年发现，是一种应用广泛的二线抗结核药物。该药物发挥抗结核活性首先需要蛋白EthA活化，活化后与NAD形成有活性的抗结核化合物乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(ETH-NAD)，该化合物能够结合到InhA蛋白中进而抑制其活性并最终影响结核分支杆菌细胞壁中分枝菌酸(Mycolic acid)的合成进而杀死结核分枝杆菌。乙硫异烟胺发挥抗结核活性必须是其活化后的化合物乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(ETH-NAD)，临床分离耐药性结核分枝杆菌中InhA蛋白通常会发生突变，从而导致ETH-NAD不能结合到InhA蛋白上导致结核分枝杆菌耐受ETH作用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种在大肠杆菌细胞内直接合成ETH-NAD并快速高效纯化分离该化合物的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：

1).PCR扩增ethA和inhA的DNA序列片段：

1-1).以SEQ ID№1所示的引物ethANFP和SEQ ID№2所示的引物ethAKRP，进行ethA的PCR扩增；以SEQ ID№3所示的引物inhABFP和SEQ ID№4所示的引物inhAHRP，进行inhA的PCR扩增；PCR扩增的目的DNA片段经核酸凝胶电泳后回收，-20℃保存备用；

2).构建pCDFDuet-inhA-ethA质粒：

2-1).扩大培养含有pCDFDuet-1质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pCDFDuet-1质粒；

2-2).将步骤1-1扩增后回收的ethA序列片段和步骤2-1获得的pCDFDuet-1质粒分别都使用NdeⅠ和KpnⅠ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的ethA序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pCDFDuet-1使用T4DNA连接酶16℃连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pCDFDuet-ethA质粒；

2-3).将pCDFDuet-ethA质粒和步骤1-1扩增后回收的inhA序列片段分别都使用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的inhA序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pCDFDuet-ethA使用T4DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pCDFDuet-inhA-ethA质粒；

3).纯化InhA蛋白：

3-1).将pCDFDuet-inhA-ethA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞单克隆扩大培养，控温16℃并添加0.5mM IPTG诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2-3小时，然后加入100mg/mL的乙硫异烟胺培养16小时；

3-2).离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬，超声破碎后离心取上清液经结合缓冲液预平衡的Ni²⁺-NTA亲和层析柱，然后使用5个柱体积的第一洗脱缓冲液洗脱不能结合到层析柱上的杂蛋白，进一步使用第二洗脱缓冲液洗脱并收集获得的目的InhA蛋白；所述第一洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH 8.0；所述第二洗脱缓冲液为50mMTris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH8.0；

4).纯化ETH-NAD化合物：

4-1).使用Millipore 10K超滤管浓缩纯化的InhA蛋白并使用pH8.0的50mM Tris-HCl置换原有的洗脱液，将纯化的InhA蛋白浓缩换液至1mL，将浓缩液100℃加热50秒，然后离心收集上清，将获得的上清液添加到Millipore Microcon 3过滤柱中10000g 4℃离心1小时过滤除去蛋白，离心滤液即含有ETH-NAD。

其中，各步骤所述的单克隆扩大培养具体为将细胞涂布于含有50μg/mL链霉素的LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有50μg/mL链霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。

进一步，步骤2-1所述扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株接种于含有50μg/mL链霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。其单克隆扩大培养获得的质粒使用NdeⅠ和KpnⅠ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNA片段ethA连接到pCDFDuet-1载体上获得质粒pCDFDuet-ethA。

进一步，步骤2-3单克隆扩大培养获得的质粒使用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNA片段inhA连接到pCDFDuet-ethA载体上获得质粒pCDFDuet-inhA-ethA。

进一步，步骤3-2所述离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬菌体包括使用离心机4℃8500rpm收集培养好的细菌，菌体沉淀用结合缓冲液洗涤一次，然后重悬于50mL结合缓冲液，所述结合缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，25mM咪唑，pH 8.0。

步骤4-1后还包括检测鉴定ETH-NAD的步骤：

4-2).使用Bio-Tek Synergy H1酶标仪全波长扫描检测其特征紫外吸收峰，以及使用高效液相色谱-电喷雾电离质谱联用仪进行分子量检测鉴定，所述电喷雾电离质谱工作参数：毛细管电压4000V；雾化氮气流速8L/min，压力0.8bar；采用负离子模式检测。

本发明的有益效果是：在大肠杆菌细胞内直接合成ETH-NAD并通过超滤管浓缩纯化和短时间加热后离心、过滤等步骤实现ETH-NAD的纯化。

附图说明

图1是实施例1纯化收集到的目的蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图2是实施例1纯化收集到的目的蛋白经酶标仪检测结果图；

图3是实施例1纯化收集到的目的蛋白经电喷雾电离质谱检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

PCR扩增ethA和inhA的DNA序列片段：PCR扩增ethA和inhA的DNA序列分别使用引物对ethANFP/ethAKRP和inhABFP/inhAHRP，引物序列如下：

ethANFP：5'-CTGGCATATGACCGAGCACCTCGACGT-3'(SEQID№1)；

ethAKRP：5'-GCTAGGTACCTTAAACCCCCACCGGGGCA-3'(SEQ ID№2)；

inhABFP：5'-GTCAGGATCCGATGACAGGACTGCTGGACG-3'(SEQ ID№3)：

inhAHRP：5'-GCCGAAGCTTTTAGAGCAATTGGGTGTG-3'(SEQ ID№4)。

PCR扩增的目的DNA片段经核酸凝胶电泳后，使用Omega公司胶回收试剂盒回收DNA目的片段，回收后的DNA片段。冻存-20℃冰箱备用。

构建pCDFDuet-inhA-ethA质粒：

1)含有pCDFDuet-1质粒的大肠杆菌DH5α菌株接种LB液体培养基(含有50μg/mL链霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用Omega公司质粒提取试剂盒抽提质粒pCDFDuet-1。

2)将PCR扩增回收的ethA序列片段和试剂盒抽提的pCDFDuet-1质粒分别都使用NdeⅠ和KpnⅠ限制性内切酶进行双酶切，酶切后的EthA序列片段使用Omega公司Cycle-pure试剂盒回收；酶切后的pCDFDuet-1质粒进行琼脂糖凝胶电泳并使用Omega公司胶回收试剂盒回收酶切后的线性化含有粘性末端的pCDFDuet-1质粒；将酶切后回收的ethA序列片段和线性化的质粒pCDFDuet-1使用T4DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板(含有50μg/mL链霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基(含有50μg/mL链霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使用NdeⅠ和KpnⅠ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证ethA序列片段连接到pCDFDuet-1载体上获得质粒pCDFDuet-ethA。同时验证正确的质粒pCDFDuet-ethA经擎科公司测序验证序列无突变。

3)将构建成功的pCDFDuet-ethA质粒和PCR扩增回收的InhA序列片段分别都使用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切，酶切后的InhA序列片段使用Omega公司Cycle-pure试剂盒回收；酶切后的pCDFDuet-ethA质粒进行琼脂糖凝胶电泳并使用Omega公司胶回收试剂盒回收酶切后的线性化含有粘性末端的pCDFDuet-ethA质粒；将酶切后回收的inhA序列片段和线性化的质粒pCDFDuet-ethA使用T4DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板(含有50μg/mL链霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基(含有50μg/mL链霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证inhA序列片段连接到pCDFDuet-ethA载体上获得质粒pCDFDuet-inhA-ethA。同时验证正确的质粒pCDFDuet-inhA-ethA经擎科公司测序验证序列无突变。

纯化InhA蛋白：

将构建成功的pCDFDuet-inhA-ethA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并涂布LB固体平板(含有50μg/mL链霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基(含有50μg/mL链霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，将液体培养的菌种1:100转接新鲜的1升LB液体培养基(含有50μg/mL链霉素)37℃摇床200rpm震荡培养2-3小时至OD600为0.6，然后将培养温度降至16℃并添加0.5mM IPTG诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2-3小时，然后加入100mg/mL的乙硫异烟胺(ETH)培养16小时。使用离心机4℃ 8500rpm收集培养好的细菌，菌体沉淀用结合缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，25mM咪唑，pH 8.0)洗涤一次，然后重悬于50mL结合缓冲液中，超声破碎后，以12000rpm离心30min，上清液上样于经结合缓冲液预平衡的Ni²⁺-NTA亲和层析柱(GE公司HisTrap HP层析柱)，然后使用5个柱体积的洗脱缓冲液1(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH 8.0)洗脱不能结合到层析柱上的杂蛋白，进一步使用洗脱缓冲液2(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱并收集获得的目的蛋白InhA。纯化收集到的目的蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测，结果图1所示。

纯化并检测ETH-NAD化合物：

使用Millipore 10K超滤管浓缩纯化的InhA蛋白并使用50mMTris-HCl(pH 8.0)置换原有的洗脱液，将纯化的InhA蛋白浓缩换液至1mL。由于ETH-NAD化合物能够紧密结合到InhA蛋白中，通过短时间加热让InhA蛋白变性释放其结合的ETH-NAD化合物而又不影响其降解，因此将InhA蛋白100℃加热50秒，然后使用离心机15000g4℃离心15分钟后，收集上清。将获得的上清液添加到MilliporeMicrocon 3过滤柱中10000g4℃离心1小时过滤除去蛋白，收集离心下来的滤液即含有ETH-NAD化合物。ETH-NAD化合物同时使用Bio-TekSynergy H1酶标仪全波长扫描检测其特征紫外吸收峰和高效液相色谱(HPLC)-电喷雾电离质谱(ESI/MS)联用仪(液质联用仪)进行分子量检测鉴定。液质联用仪设备型号：

高效液相色谱仪：Agilent 1200HPLC；

质谱仪：Bruker Daltonic MicrOTOF_Q mass spectrometer；

色谱分离柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(Shimadzu，250×2.0mmi.d，5μm)；

ESI/MS工作参数如下：毛细管电压4000V；雾化氮气流速8L/min，压力0.8bar；采用负离子模式检测。

酶标仪和质谱检测结果分别如图2和图3所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法

<130> 2018

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctggcatatg accgagcacc tcgacgt 27

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctaggtacc ttaaaccccc accggggca 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcaggatcc gatgacagga ctgctggacg 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccgaagctt ttagagcaat tgggtgtg 28

Claims (7)

1.一种通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：

1).PCR扩增ethA和inhA的DNA序列片段：

1-1).以SEQ ID №1所示的引物ethANFP和SEQ ID №2所示的引物ethAKRP，进行ethA的PCR扩增；以SEQ ID №3所示的引物inhABFP和SEQ ID №4所示的引物inhAHRP，进行inhA的PCR扩增；PCR扩增的目的DNA片段经核酸凝胶电泳后回收，-20℃保存备用；

2).构建pCDFDuet-inhA-ethA质粒：

2-1).扩大培养含有pCDFDuet-1质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pCDFDuet-1质粒；

2-2).将步骤1-1扩增后回收的ethA序列片段和步骤2-1获得的pCDFDuet-1质粒分别都使用NdeⅠ和KpnⅠ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的ethA序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pCDFDuet-1使用T4 DNA连接酶16℃连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pCDFDuet-ethA质粒；

2-3).将pCDFDuet-ethA质粒和步骤1-1扩增后回收的inhA序列片段分别都使用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的inhA序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pCDFDuet-ethA使用T4 DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pCDFDuet-inhA-ethA质粒；

3).纯化InhA蛋白：

3-1).将pCDFDuet-inhA-ethA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞单克隆扩大培养，控温16℃并添加0.5mM IPTG诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2-3小时，然后加入100mg/mL的乙硫异烟胺培养16小时；

3-2).离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬，再超声破碎后离心取上清液经结合缓冲液预平衡的Ni²⁺-NTA亲和层析柱，然后使用5个柱体积的第一洗脱缓冲液洗脱不能结合到层析柱上的杂蛋白，进一步使用第二洗脱缓冲液洗脱并收集获得的目的InhA蛋白；所述第一洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH 8.0；所述第二洗脱缓冲液为50mMTris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0；

4).纯化乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸化合物：

4-1).使用Millipore 10K超滤管浓缩纯化的InhA蛋白并使用pH 8.0的50mM Tris-HCl置换原有的洗脱液，将纯化的InhA蛋白浓缩换液至1mL，将浓缩液100℃加热50秒，然后离心收集上清，将获得的上清液添加到Millipore Microcon 3过滤柱中10000g 4℃离心1小时过滤除去蛋白，离心滤液即含有乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

2.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：各步骤所述的单克隆扩大培养具体为将细胞涂布于含有50μg/mL链霉素的LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有50μg/mL链霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。

3.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤2-1所述扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株接种于含有50μg/mL链霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。

4.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤2-2单克隆扩大培养获得的质粒使用NdeⅠ和KpnⅠ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNA片段ethA连接到pCDFDuet-1载体上获得质粒pCDFDuet-ethA。

5.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤2-3单克隆扩大培养获得的质粒使用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNA片段inhA连接到pCDFDuet-ethA载体上获得质粒pCDFDuet-inhA-ethA。

6.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤3-2所述离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬菌体包括使用离心机4℃8500rpm收集培养好的细菌，菌体沉淀用结合缓冲液洗涤一次，然后重悬于50mL结合缓冲液，所述结合缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，25mM咪唑，pH 8.0。

7.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤4-1后还包括检测鉴定乙硫异烟胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的步骤：

4-2).使用Bio-Tek Synergy H1酶标仪全波长扫描检测其特征紫外吸收峰，以及使用高效液相色谱-电喷雾电离质谱联用仪进行分子量检测鉴定，所述电喷雾电离质谱工作参数：毛细管电压4000V；雾化氮气流速8L/min，压力0.8bar；采用负离子模式检测。