CN111748548B

CN111748548B - 一种精氨酸脱羧酶突变体及其在生产胍基丁胺中的应用

Info

Publication number: CN111748548B
Application number: CN202010741881.8A
Authority: CN
Inventors: 徐美娟; 饶志明; 许家钰; 王怡; 杨凤玉; 杨套伟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2020-07-29
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2040-07-29
Also published as: CN111748548A

Abstract

本发明公开了一种精氨酸脱羧酶突变体及其在生产胍基丁胺中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了受产物抑制影响小的精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W，其中，精氨酸脱羧酶突变体I534D是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型精氨酸脱羧酶的第534位异亮氨酸突变为天冬氨酸得到的，其半抑制常数可达0.66mol/L，较野生型精氨酸脱羧酶提高了5.5倍；精氨酸脱羧酶突变体D535W是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型精氨酸脱羧酶的第535位天冬氨酸突变为色氨酸得到的，其半抑制常数可达0.50mol/L，较野生型精氨酸脱羧酶提高了4.2倍。

Description

一种精氨酸脱羧酶突变体及其在生产胍基丁胺中的应用

技术领域

本发明涉及一种精氨酸脱羧酶突变体及其在生产胍基丁胺中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

胍基丁胺是是精氨酸的衍生物。研究表明，胍基丁胺有降血糖、降血压、利尿、抗炎、抗抑郁、抑制细胞增生等生物活性，并且，研究表明，胍基丁胺对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的拮抗作用强而持久，具有对动物吗啡依赖性的戒断作用，是一种极具开发价值的戒毒类药物。因此，胍基丁胺在医药领域市场十分广阔。

目前，工业上主要使用化学合成法和酶转化法这两种方法生产胍基丁胺。其中，化学合成法一般以1,4-丁二胺、己二酸二乙酯、1,4-二溴丁烷和邻苯二甲酰亚胺钾等化合物作为底物，通过还原、取代、胺解和胍基化等化学途径合成胍基丁胺。但是，由于使用化学合成法合成胍基丁胺具有步骤繁琐、产量低下、副产物多以及副产物具有毒性等缺陷，因此，使用化学合成法合成胍基丁胺越来越不被现代工业所接受。

酶转化法则主要是利用精氨酸脱羧酶将L-精氨酸转化为胍基丁胺。与化学合成法相比，利用酶转化法生产胍基丁胺具有步骤简单、副产物少以及绿色环保等优势，但是，由于现有的酶转化法使用的精氨酸脱羧酶存在产物抑制性，在产物胍基丁胺存在的情况下，精氨酸脱羧酶的酶活受到抑制，因此，现有的精氨酸脱羧酶在应用于生产胍基丁胺时常在产量上受到严重的限制。急需找到一种受产物抑制影响小的精氨酸脱羧酶。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种受产物抑制影响小的精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,ADC,EC 4.1.1.19)。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种精氨酸脱羧酶突变体，所述精氨酸脱羧酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶相比，第534位异亮氨酸突变为了天冬氨酸，命名为I534D；

或者，所述精氨酸脱羧酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶相比，第535位天冬氨酸突变为了色氨酸，命名为D535W。

在本发明的一种实施方式中，编码所述精氨酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述精氨酸脱羧酶突变体。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体为pET-28a(+)质粒或pXMJ19质粒。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

本发明还提供了一种生产胍基丁胺的方法，所述方法为先将上述精氨酸脱羧酶突变体或上述宿主细胞添加至含有L-精氨酸的转化体系中进行转化，得到转化液，然后从转化液中分离得到胍基丁胺。

在本发明的一种实施方式中，所述转化的条件为温度为35～40℃、pH为8.0～9.0。

在本发明的一种实施方式中，所述转化体系还含有MgSO₄、磷酸吡哆醛和缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。

本发明还提供了上述精氨酸脱羧酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述方法在生产胍基丁胺中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了受产物抑制影响小的精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W，其中，精氨酸脱羧酶突变体I534D是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型精氨酸脱羧酶的第534位异亮氨酸突变为天冬氨酸得到的，其半抑制常数可达0.66mol/L，较野生型精氨酸脱羧酶提高了5.5倍；精氨酸脱羧酶突变体D535W是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型精氨酸脱羧酶的第535位天冬氨酸突变为色氨酸得到的，其半抑制常数可达0.50mol/L，较野生型精氨酸脱羧酶提高了4.2倍。

(2)本发明提供了可高效转化L-精氨酸生产胍基丁胺的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2，重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2分别以大肠杆菌BL21为宿主，表达精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W；将重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2分别添加至含有20g/L L-精氨酸的转化体系中进行转化，转化12h，即可使转化液中胍基丁胺的含量分别高达0.039mol/L和0.029mol/L，L-精氨酸的转化率分别高达68.4％和50.9％。

(3)本发明提供了可高效转化L-精氨酸生产胍基丁胺的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA-1和C.glutamicum/pXMJ19-speA-2，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA-1和C.glutamicum/pXMJ19-speA-2分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主，表达精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W；将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA-1和C.glutamicum/pXMJ19-speA-2分别添加至含有50g/L L-精氨酸的转化体系中进行转化，转化12h，即可使转化液中胍基丁胺的含量分别高达0.251mol/L和0.203mol/L，L-精氨酸的转化率分别高达87.3％和70.8％。

(4)本发明提供了一种生产胍基丁胺的方法，此方法为将重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和/或BL21/pET-28a-speA-2添加至含有L-精氨酸的转化体系中进行转化；使用此方法，将重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2分别添加至含有20g/L L-精氨酸的转化体系中进行转化，转化12h，即可使转化液中胍基丁胺的含量分别高达0.039mol/L和0.029mol/L，L-精氨酸的转化率分别高达68.4％和50.9％。

(5)本发明提供了一种生产胍基丁胺的方法，此方法为将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA-1和/或C.glutamicum/pXMJ19-speA-2添加至含有L-精氨酸的转化体系中进行转化；使用此方法，将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA-1和C.glutamicum/pXMJ19-speA-2分别添加至含有50g/L L-精氨酸的转化体系中进行转化，转化12h，即可使转化液中胍基丁胺的含量分别高达0.251mol/L和0.203mol/L，L-精氨酸的转化率分别高达87.3％和70.8％。

附图说明

图1：重组质粒pET-28a-speA的酶切验证结果；其中，1为重组质粒pET-28a-speA经EcoR I/BamH I双酶切后的条带，从上到下，条带大小分别为5363bp、1394bp、589bp，2为Marker。

图2：不同精氨酸脱羧酶的SDS-PAGE凝胶电泳结果；其中，1为Marker，2为未纯化的野生型精氨酸脱羧酶，3为纯化后的野生型精氨酸脱羧酶，4为未纯化的精氨酸脱羧酶突变体I534D，5为纯化后的精氨酸脱羧酶突变体I534D，6为未纯化后的精氨酸脱羧酶突变体D535W，7为纯化后的精氨酸脱羧酶突变体D535W。

具体实施方式

下述实施例中涉及的L-精氨酸购自麦克林公司；下述实施例中涉及的磷酸吡哆醛(PLP)购自阿拉丁公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032均购自美国模式培养物集存库；下述实施例中涉及的pET-28a(+)质粒和pXMJ19质粒均购自Novagen公司；下述实施例中涉及的胍基丁胺购自上海阿拉丁公司。

下述实施例中涉及的试剂和培养基如下：

Tris-HCL缓冲液：先将6.057g Tris加入800mL的去离子水中，然后用50％(v/v)的HCl溶液调节pH至8.5，最后用去离子水定容至1L。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L。

BHI液体培养基：脑心浸液肉汤37g/L。

BHI固体培养基：脑心浸液肉汤37g/L、琼脂20g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

精氨酸脱羧酶酶活和比酶活的测定：反应体系(2mL)为添加有5g/L L-精氨酸、2.5mmol/L MgSO₄、0.6mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)的Tris-HCL缓冲液(pH 8.5、50mmol/L)；将反应体系在37℃、600r/min的高通量摇床上预热5min后，在反应体系中加入终浓度为0.05mg/mL的纯酶反应10min，反应结束后，在反应体系中加入200μL甲醇终止反应，得到反应液；将反应液冰浴冷却后，12000r/min离心10min，取上清；将上清稀释适当倍数后过0.22μm滤膜过滤，得到滤液；用HPLC检测滤液中胍基丁胺的含量；

其中，HPLC检测的条件为：安捷伦C18，5μm，4.6×250mm色谱柱；流速为1.0mL/min；柱温40℃；检测波长338nm；流动相：A相：8.0g乙酸钠(13.3g三水合乙酸钠)溶于1000mL水，加入225μL三乙胺，用5％的乙酸将pH调到7.20±0.05，最后加入5mL四氢呋喃；B相：称取6.0g乙酸钠于200mL水溶解，用5％乙酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入400mL的HPLC级甲醇和400mL的HPLC级乙腈，混合；

精氨酸脱羧酶酶活的计算公式为：精氨酸脱羧酶酶活(U/mL)＝滤液中胍基丁胺的含量(mol)×10⁶/转化时间(min)；

精氨酸脱羧酶酶活的定义为：将标准条件下每分钟产生1μmol胍基丁胺所需的酶量定义为一个酶活力单位(1U)；

精氨酸脱羧酶比酶活的计算公式为：精氨酸脱羧酶比酶活(U/mg)＝精氨酸脱羧酶纯酶的酶活(U/mg)/精氨酸脱羧酶纯酶中精氨酸脱羧酶的蛋白浓度(mg/mL)；

精氨酸脱羧酶比酶活的定义为：每毫克精氨酸脱羧酶具有的酶活力；

蛋白浓度采用Nanodrop仪器测定。

L-精氨酸和胍基丁胺含量的测定：高效液相色谱法；安捷伦C18，5μm，4.6×250mm色谱柱；流速为1.0mL/min；柱温40℃；检测波长338nm；流动相：A相：8.0g乙酸钠(13.3g三水合乙酸钠)溶于1000mL水，加入225μL三乙胺，用5％的乙酸将pH调到7.20±0.05，最后加入5mL四氢呋喃；B相：称取6.0g乙酸钠于200mL水溶解，用5％乙酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入400mL的HPLC级甲醇和400mL的HPLC级乙腈，混合。

实施例1：精氨酸脱羧酶突变体的制备

具体步骤如下：

合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码精氨酸脱羧酶的基因speA；将获得的编码精氨酸脱羧酶的基因speA与pET-28a(+)质粒经EcoR I/BamH I双酶切后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(验证结果见图1)以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pET-28a-speA和重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA。

利用融合PCR技术，以获得的重组质粒pET28a-speA为模板进行定点突变，获得PCR扩增产物；将PCR扩增产物用1％(v/v)琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，将大小正确的PCR扩增片段通过胶回收试剂盒回收，得到回收片段；将回收片段与pET-28a(+)质粒经EcoR I/BamH I双酶切后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得分别携带有编码精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W的基因的重组质粒pET28a-speA-1和pET28a-speA-2，以及，分别携带有编码精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W的基因的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2；

其中，引入I534D突变所用的引物如下；

I534D-F1：tggacagcaaatgggtcgcggatccatgtctgacgacatgtcta(SEQ ID NO.3)；

I534D-F2：caccatcaatatagtggtcgtcagcaccgtcagagtcacaggta(SEQ ID NO.4)；

I534D-F3：tacctgtgactctgacggtgctgacgaccactatattgatggtg(SEQ ID NO.5)；

I534D-F4：cttgtcgacggagctcgaattcttactcatcttcaagataagta(SEQ ID NO.6)；

引入D535W突变所用的引物如下；

D535W-F1：gacagcaaatgggtcgcggatccatgtctgacgacatgtctatgg(SEQ ID NO.7)；

D535W-F2：caccatcaatatagtgccagatagcaccgtcagagtcacag(SEQ ID NO.8)；

D535W-F3：ctgtgactctgacggtgctatctggcactatattgatggtg(SEQ ID NO.9)；

D535W-F4：tgtcgacggagctcgaattcttactcatcttcaagataag(SEQ ID NO.10)；

融合PCR的反应条件为：先加入F2和F3引物，95℃预变性5min；然后进入8个循环：95℃变性30s，55℃退火40s；再加入F1和F4引物，95℃预变性5min；接着进入30个循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸5min，4℃保温。

将重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA、BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2分别划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养8～12h，得到单菌落；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养12～14h，得到种子液；将种子液以1％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基中，于37℃的条件下培养2～3h后，在LB液体培养基中添加终浓度为0.5mM的IPTG，于16℃的条件下继续诱导培养12h，获得发酵液；将发酵液4℃、8000rpm离心10min离心，收集菌体；将菌体超声波细胞破碎，得到细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液利用0.22μm滤膜过滤后经Ni-NTA柱纯化，获得野生型精氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶突变体I534D和精氨酸脱羧酶突变体D535W的纯酶。

对获得的野生型精氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶突变体I534D和精氨酸脱羧酶突变体D535W的纯酶进行SDS-PAGE凝胶电泳分析(分析结果见图2)。

由分析结果可知，精氨酸脱羧酶突变体I534D和精氨酸脱羧酶突变体D535W表达成功且纯化成功。

实施例2：精氨酸脱羧酶突变体对胍基丁胺的产物抑制性

具体步骤如下：

在检测精氨酸脱羧酶酶活和比酶活的反应体系中分别添加浓度为0、5、10、20、50、100g/L(分别对应0.0000、0.0385、0.0769、0.1538、0.3846、0.7692mol/L)的胍基丁胺，得到含有不同浓度胍基丁胺的反应体系；使用含有不同浓度胍基丁胺的反应体系分别检测实施例1获得的野生型精氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶突变体I534D和精氨酸脱羧酶突变体D535W的纯酶的比酶活(检测结果见表1)；根据比酶活的检测结果得到野生型精氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶突变体I534D和精氨酸脱羧酶突变体D535W对胍基丁胺的半抑制常数；其中，半抑制常数＝精氨酸脱羧酶的比酶活为50％时所对应的胍基丁胺浓度。

由检测结果可知，野生型精氨酸脱羧酶对胍基丁胺的半抑制常数为0.12mol/L；精氨酸脱羧酶突变体I534D和精氨酸脱羧酶突变体D535W对胍基丁胺的半抑制常数分别为0.66mol/L和0.50mol/L，分别较野生型精氨酸脱羧酶分别提高了5.5和4.2倍。

表1不同精氨酸脱羧酶在不同浓度胍基丁胺下的比酶活(单位：U·mg^-1)

实施例3：胍基丁胺的生产(全细胞转化法+重组大肠杆菌)

具体步骤如下：

转化体系为添加有20g/L L-精氨酸、4mmol/L MgSO₄、7mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)的Tris-HCL缓冲液(pH 8.5、50mmol/L)；将实施例1获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA、BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2的菌体分别以30g/L的添加量添加至转化体系中，于37℃、220r/min的条件下转化12h，得到转化液。

检测转化液中胍基丁胺的含量和L-精氨酸的转化率，检测结果见表2；

其中，L-精氨酸转化率的计算公式如下：

L-精氨酸转化率＝胍基丁胺生成量(mol)/L-精氨酸初始添加量(mol)×100％。

由表2可知，重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA转化得到的转化液中胍基丁胺的含量为0.026mol/L、L-精氨酸的转化率45.6％；重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2转化得到的转化液中胍基丁胺的含量分别高达0.039mol/L和0.029mol/L，L-精氨酸的转化率分别高达68.4％和50.9％，均较重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA有了显著的提高。

表2不同重组大肠杆菌转化得到的转化液中胍基丁胺的含量以及L-精氨酸的转化率

组别	野生型	I534D	D535W
				胍基丁胺的含量(mol/L)	0.026	0.039	0.029
L-精氨酸的转化率(％)	45.6	68.4	50.9

实施例4：胍基丁胺的生产(全细胞转化法+重组谷氨酸棒杆菌)

具体步骤如下：

将实施例1获得的编码精氨酸脱羧酶的基因speA与pXMJ19质粒经EcoR I/BamH I双酶切后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pXMJ19-speA。

将实施例1获得的回收片段与pXMJ19质粒经EcoR I/BamH I双酶切后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得分别携带有编码精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W的基因的重组质粒pXMJ19-speA-1和pXMJ19-speA-2。

将重组质粒pXMJ19-speA、pXMJ19-speA-1和pXMJ19-speA-2分别电击转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，得到转化产物；将转化产物涂布在BHI固体培养基(含有10μg·mL^-1氯霉素)上，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；挑取转化子接种至BHI液体培养基中，于30℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养36h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得分别携带有编码精氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶突变体I534D和精氨酸脱羧酶突变体D535W的基因的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA、C.glutamicum/pXMJ19-speA-1和C.glutamicum/pXMJ19-speA-2，以及，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA、C.glutamicum/pXMJ19-speA-1和C.glutamicum/pXMJ19-speA-2培养得到的培养液；将发酵液4℃、8000rpm离心10min离心，收集菌体。

在实施例3的基础上，将转化体系中L-精氨酸的含量替换为50g/L，并且，将重组大肠杆菌的菌体分别替换为重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA、C.glutamicum/pXMJ19-speA-1和C.glutamicum/pXMJ19-speA-2的菌体，得到转化液。

检测转化液中胍基丁胺的含量和L-精氨酸的转化率，检测结果见表3。

由表3可知，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA转化得到的转化液中胍基丁胺的含量为0.026mol/L、L-精氨酸的转化率45.6％；重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA-1和C.glutamicum/pXMJ19-speA-1转化得到的转化液中胍基丁胺的含量分别高达0.251mol/L和0.203mol/L，L-精氨酸的转化率分别高达87.3％和70.8％，均较重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pXMJ19-speA有了显著的提高。

表3不同重组谷氨酸棒杆菌转化得到的转化液中胍基丁胺的含量以及L-精氨酸的转化率

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种精氨酸脱羧酶突变体及其在生产胍基丁胺中的应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asp Asp Met Ser Met Gly Leu Pro Ser Ser Ala Gly Glu His

1 5 10 15

Gly Val Leu Arg Ser Met Gln Glu Val Ala Met Ser Ser Gln Glu Ala

20 25 30

Ser Lys Met Leu Arg Thr Tyr Asn Ile Ala Trp Trp Gly Asn Asn Tyr

35 40 45

Tyr Asp Val Asn Glu Leu Gly His Ile Ser Val Cys Pro Asp Pro Asp

50 55 60

Val Pro Glu Ala Arg Val Asp Leu Ala Gln Leu Val Lys Thr Arg Glu

65 70 75 80

Ala Gln Gly Gln Arg Leu Pro Ala Leu Phe Cys Phe Pro Gln Ile Leu

85 90 95

Gln His Arg Leu Arg Ser Ile Asn Ala Ala Phe Lys Arg Ala Arg Glu

100 105 110

Ser Tyr Gly Tyr Asn Gly Asp Tyr Phe Leu Val Tyr Pro Ile Lys Val

115 120 125

Asn Gln His Arg Arg Val Ile Glu Ser Leu Ile His Ser Gly Glu Pro

130 135 140

Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ser Lys Ala Glu Leu Met Ala Val Leu Ala

145 150 155 160

His Ala Gly Met Thr Arg Ser Val Ile Val Cys Asn Gly Tyr Lys Asp

165 170 175

Arg Glu Tyr Ile Arg Leu Ala Leu Ile Gly Glu Lys Met Gly His Lys

180 185 190

Val Tyr Leu Val Ile Glu Lys Met Ser Glu Ile Ala Ile Val Leu Asp

195 200 205

Glu Ala Glu Arg Leu Asn Val Val Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Arg

210 215 220

Leu Ala Ser Gln Gly Ser Gly Lys Trp Gln Ser Ser Gly Gly Glu Lys

225 230 235 240

Ser Lys Phe Gly Leu Ala Ala Thr Gln Val Leu Gln Leu Val Glu Thr

245 250 255

Leu Arg Glu Ala Gly Arg Leu Asp Ser Leu Gln Leu Leu His Phe His

260 265 270

Leu Gly Ser Gln Met Ala Asn Ile Arg Asp Ile Ala Thr Gly Val Arg

275 280 285

Glu Ser Ala Arg Phe Tyr Val Glu Leu His Lys Leu Gly Val Asn Ile

290 295 300

Gln Cys Phe Asp Val Gly Gly Gly Leu Gly Val Asp Tyr Glu Gly Thr

305 310 315 320

Arg Ser Gln Ser Asp Cys Ser Val Asn Tyr Gly Leu Asn Glu Tyr Ala

325 330 335

Asn Asn Ile Ile Trp Ala Ile Gly Asp Ala Cys Glu Glu Asn Gly Leu

340 345 350

Pro His Pro Thr Val Ile Thr Glu Ser Gly Arg Ala Val Thr Ala His

355 360 365

His Thr Val Leu Val Ser Asn Ile Ile Gly Val Glu Arg Asn Glu Tyr

370 375 380

Thr Val Pro Thr Ala Pro Ala Glu Asp Ala Pro Arg Ala Leu Gln Ser

385 390 395 400

Met Trp Glu Thr Trp Gln Glu Met His Glu Pro Gly Thr Arg Arg Ser

405 410 415

Leu Arg Glu Trp Leu His Asp Ser Gln Met Asp Leu His Asp Ile His

420 425 430

Ile Gly Tyr Ser Ser Gly Ile Phe Ser Leu Gln Glu Arg Ala Trp Ala

435 440 445

Glu Gln Leu Tyr Leu Ser Met Cys His Glu Val Gln Lys Gln Leu Asp

450 455 460

Pro Gln Asn Arg Ala His Arg Pro Ile Ile Asp Glu Leu Gln Glu Arg

465 470 475 480

Met Ala Asp Lys Met Tyr Val Asn Phe Ser Leu Phe Gln Ser Met Pro

485 490 495

Asp Ala Trp Gly Ile Asp Gln Leu Phe Pro Val Leu Pro Leu Glu Gly

500 505 510

Leu Asp Gln Val Pro Glu Arg Arg Ala Val Leu Leu Asp Ile Thr Cys

515 520 525

Asp Ser Asp Gly Ala Ile Asp His Tyr Ile Asp Gly Asp Gly Ile Ala

530 535 540

Thr Thr Met Pro Met Pro Glu Tyr Asp Pro Glu Asn Pro Pro Met Leu

545 550 555 560

Gly Phe Phe Met Val Gly Ala Tyr Gln Glu Ile Leu Gly Asn Met His

565 570 575

Asn Leu Phe Gly Asp Thr Glu Ala Val Asp Val Phe Val Phe Pro Asp

580 585 590

Gly Ser Val Glu Val Glu Leu Ser Asp Glu Gly Asp Thr Val Ala Asp

595 600 605

Met Leu Gln Tyr Val Gln Leu Asp Pro Lys Thr Leu Leu Thr Gln Phe

610 615 620

Arg Asp Gln Val Lys Lys Thr Asp Leu Asp Ala Glu Leu Gln Gln Gln

625 630 635 640

Phe Leu Glu Glu Phe Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu

645 650 655

Asp Glu

<210> 2

<211> 1977

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtctgacg acatgtctat gggtttgcct tcgtcagcgg gcgaacacgg tgtactacgc 60

tccatgcagg aggttgcaat gagctcccag gaagccagca agatgctgcg tacttacaat 120

attgcctggt ggggcaataa ctactatgac gttaacgagc tgggccacat tagcgtgtgc 180

ccggacccgg acgtcccgga agctcgcgtc gatctcgcgc agttagtgaa aactcgtgaa 240

gcacagggcc agcgtctgcc tgcactgttc tgtttcccac agatcctgca gcaccgtttg 300

cgttccatta acgccgcgtt caaacgtgcg agggaatcct acggctataa cggcgattac 360

ttccttgttt atccgatcaa agttaaccag caccgccgcg tgattgagtc cctgattcat 420

tcgggcgaac cgctgggtct ggaagccggt tccaaagccg agttgatggc agtactggca 480

catgctggca tgacccgtag cgtcatcgtc tgcaacggtt ataaagaccg cgaatatatc 540

cgcctggcat taattggcga gaagatgggg cacaaggtct atctggtcat tgagaagatg 600

tcagaaatcg ccattgtgct ggatgaagca gaacgtctga atgtcgttcc tcgtctgggc 660

gtgcgtgcac gtctggcttc gcagggttcg ggtaaatggc agtcctccgg cggggaaaaa 720

tcgaagttcg gcctggctgc gactcaggta ctgcaactgg ttgaaaccct gcgtgaagcc 780

gggcgtctcg acagcctgca actactgcac ttccacctcg gttcgcagat ggcgaatatt 840

cgcgatatcg cgacaggcgt tcgtgaatcc gcgcgtttct atgtggaact gcacaagctg 900

ggcgtcaata ttcagtgctt cgacgtcggc ggcggtctgg gcgtggatta tgaaggtact 960

cgttcgcagt ccgactgttc ggtgaactac ggcctcaatg aatacgccaa caacattatc 1020

tgggcgattg gcgatgcgtg tgaagaaaac ggtctgccgc atccgacggt aatcaccgaa 1080

tcgggtcgtg cggtgactgc gcatcacacc gtgctggtgt ctaatatcat cggcgtggaa 1140

cgtaacgaat acacggtgcc gaccgcgcct gcagaagatg cgccgcgcgc gctgcaaagc 1200

atgtgggaaa cctggcagga gatgcacgaa ccgggaactc gccgttctct gcgtgaatgg 1260

ttacacgaca gtcagatgga tctgcacgac attcatatcg gctactcttc cggcatcttt 1320

agcctgcaag aacgtgcatg ggctgagcag ctttatttga gcatgtgcca tgaagtgcaa 1380

aagcagctgg atccgcaaaa ccgtgctcat cgtccgatta tcgacgagct gcaggaacgt 1440

atggcggaca aaatgtacgt caacttctcg ctgttccagt cgatgccgga cgcatggggg 1500

atcgaccagt tgttcccggt tctgccgctg gaagggctgg atcaagtgcc ggaacgtcgc 1560

gctgtgctgc tggatattac ctgtgactct gacggtgcta tcgaccacta tattgatggt 1620

gacggtattg ccacgacaat gccaatgccg gagtacgatc cagagaatcc gccgatgctc 1680

ggtttcttta tggtcggcgc atatcaggag atcctcggca acatgcacaa cctgttcggt 1740

gataccgaag cggttgacgt gttcgtcttc cctgacggta gcgtagaagt agaactgtct 1800

gacgaaggcg ataccgtggc ggacatgctg caatatgtac agctcgatcc gaaaacgctg 1860

ttaacccagt tccgcgatca agtgaagaaa accgatcttg atgctgaact gcaacaacag 1920

ttccttgaag agttcgaggc aggtttgtac ggttatactt atcttgaaga tgagtaa 1977

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggacagcaa atgggtcgcg gatccatgtc tgacgacatg tcta 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccatcaat atagtggtcg tcagcaccgt cagagtcaca ggta 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tacctgtgac tctgacggtg ctgacgacca ctatattgat ggtg 44

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttgtcgacg gagctcgaat tcttactcat cttcaagata agta 44

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacagcaaat gggtcgcgga tccatgtctg acgacatgtc tatgg 45

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caccatcaat atagtgccag atagcaccgt cagagtcaca g 41

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgtgactct gacggtgcta tctggcacta tattgatggt g 41

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtcgacgga gctcgaattc ttactcatct tcaagataag 40

Claims

1.一种精氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶相比，第534位异亮氨酸突变为了天冬氨酸；

或者，所述精氨酸脱羧酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶相比，第535位天冬氨酸突变为了色氨酸。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的精氨酸脱羧酶突变体。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2所述的基因。

4.如权利要求3所述的一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体为pET-28a(+)或pXMJ19。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求2所述的基因或权利要求3或4所述的重组质粒。

6.如权利要求5所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）或大肠杆菌（Escherichia coli）。

7.一种生产胍基丁胺的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1所述的精氨酸脱羧酶突变体或权利要求5或6所述的宿主细胞添加至含有L-精氨酸的转化体系中进行转化，得到转化液，然后从转化液中分离得到胍基丁胺。

8.如权利要求7所述的一种生产胍基丁胺的方法，其特征在于，所述转化的条件为温度为35~40℃、pH为8.0~9.0。

9.权利要求1所述的精氨酸脱羧酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3或4所述的重组质粒或权利要求5或6所述的宿主细胞或权利要求7或8所述的方法在生产胍基丁胺中的应用。