CN106047837B

CN106047837B - 沙雷氏菌脂肪酶突变体、重组表达转化子、酶制剂及应用

Info

Publication number: CN106047837B
Application number: CN201610379653.4A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 陈科材; 李春秀; 陈琦; 潘江
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2016-06-01
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2036-06-01
Also published as: CN106047837A

Abstract

本发明涉及沙雷氏菌脂肪酶(SmL)分子改造所得的突变体、其基因和氨基酸序列，含有该突变体基因的重组表达质粒及重组表达转化子，重组酶制剂的制备方法，以及该酶制剂在地尔硫卓前体合成中的应用。与野生型沙雷氏菌脂肪酶相比，本发明的突变体活性显著提高，并保持了优异的立体选择性，在心血管病药物地尔硫卓的关键手性前体(–)‑对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的工业生产中具有良好的应用前景。

Description

沙雷氏菌脂肪酶突变体、重组表达转化子、酶制剂及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种沙雷氏菌脂肪酶的突变体、表达该突变体的重组表达质粒及重组表达转化子、该脂肪酶突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在酶法拆分制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯中的应用。

背景技术

地尔硫卓是一个高选择性的钙通道阻滞剂，可以抑制钙离子通过血管平滑肌和心肌细胞膜通道的运转，具有使心肌细胞激动—收缩解偶联和强效的扩张血管的作用。该药具有良好的疗效，并且毒副作用小，广泛应用于心绞痛和高血压的长期治疗。采用化学—酶法合成地尔硫卓可以简化合成路线、提高收率、降低成本，该法已广泛应用于工业化生产。在该工艺中，一般采用脂肪酶选择性拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(±)-MPGM]获得关键的单一构型手性中间体(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。

地尔硫卓的化学-酶法生产工艺于上世纪首先在日本投产，田辺公司使用的专利菌株为S.marcescens Sr41 8000，他们将该菌株的胞外脂肪酶LipA固定在膜反应器中用于拆分消旋体，制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，产量为40kg(-)-MPGM/m²/年。

本实验室以(±)-MPGM为底物，从100多株不同微生物菌株中筛选到一株粘质沙雷氏菌(S.marcescens)ECU1010(中国专利ZL200410067046.1，保藏号CGMCC 1219)，该菌株其所产胞外脂肪酶能高度立体选择性水解拆分(±)-MPGM得到(2R,3S)-(-)-MPGM(E>100)。利用PCR方法克隆了粘质沙雷氏菌CGMCC 1219胞外脂肪酶SmL基因。该基因全长1845bp，编码614个氨基酸，与基因数据库中其它的粘质沙雷氏菌脂肪酶基因相比，在DNA水平有94％～96％的同源性，在氨基酸水平有96％～98％的同源性。利用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌株、pET-24a(+)作为表达载体，实现了该脂肪酶基因的表达。

沙雷氏菌脂肪酶的应用中，由于酶的活性较低，因此酶用量大，导致反应液乳化严重，产物分离困难。因此有必要通过蛋白质工程改造，提高沙雷氏脂肪酶的活性。

发明内容

本发明的目的在于，通过蛋白质工程对沙雷氏菌脂肪酶SmL进行改造，得到活性提高的突变体，用于拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酯，制备地尔硫卓合成的关键手性前体(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。与野生型沙雷氏菌脂肪酶SmL相比，通过蛋白质工程改造得到的突变体的催化效率显著提高，从而可以减少酶蛋白的用量。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

技术方案之一：活性提高的沙雷氏菌脂肪酶突变体的获得

本发明所述的野生型沙雷氏菌脂肪酶SmL来源于沙雷氏菌ECU 1010，该菌株已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 1219，已在中国专利ZL200410067046.1中公开。所述脂肪酶SmL的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。基于已报道的沙雷氏菌脂肪酶SmL的结构，选择底物结合口袋周围的氨基酸位点，进行饱和突变，通过大量的筛选和验证，发现在SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基础上对第315位的亮氨酸残基、第271位的丝氨酸残基和第311位的色氨酸残基进行单点替换后，具有较高的脂肪酶活性，在此基础上，通过饱和突变获得活性有显著提高的突变体。

较佳地，SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第315位的亮氨酸残基替换为丝氨酸得到的蛋白质(命名为SmL_L315S)，第271位的丝氨酸残基替换为苯丙氨酸得到的蛋白质(命名为SmL_S271F)，第311位的色氨酸残基替换为甲硫氨酸得到的蛋白质(命名为SmL_W311M)。相对于母本，这三个突变体活性提高较为显著。

在此基础上，对所获得的单点突变体进行了组合，获得了活性进一步提高的组合突变体，也就是以下四种蛋白质：

(1)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，命名为SmL_S271F/L315S；或，

(2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸，命名为SmL_W311M/L315S；或，

(3)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸，命名为SmL_S271F/W311M；或，

(4)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸，命名为SmL_{S271F/W311M/L315S}。

其中所述脂肪酶的活性测定采用比色法进行测定。在3mL比色皿中加入2.87mL磷酸钾缓冲液(KPB,100mM,pH 7.0)，加入100μL适当浓度的酶液，在30℃预保温3min后，然后加入30μL对硝基苯酚丁酸酯溶液(100mM，溶解于DMSO中)，于30℃、405nm读取水解产物对硝基苯酚的吸光度增长速率。在上述反应条件下，每分钟生成1.0μmol对硝基苯酚所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

技术方案之二：一种分离的核酸，所述核酸编码如技术方案一所述沙雷氏菌脂肪酶突变体

本发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，通过基因克隆技术获得编码沙雷氏菌脂肪酶SmL突变体的核酸分子，或通过人工全序列合成的方法得到编码沙雷氏菌脂肪酶SmL突变体的核酸分子。

技术方案之三：一种包含上述核酸的重组表达质粒

可通过本领域常规方法将本发明的沙雷氏菌脂肪酶SmL突变体核酸序列连接到合适的载体上构建而成，优选载体为质粒pET28a。较佳地，可由以下操作获得上述重组表达质粒：将PCR扩增得到的核酸产物和质粒pET28a用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行双酶切，回收酶切产物，经T₄连接酶连接得到重组表达质粒。

技术方案之四：一种包含上述重组表达质粒的重组表达转化子

可通过将本发明的重组表达质粒转化至宿主细胞中来构建所述重组表达转化子，所转化述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主微生物，前提是能使所述重组表达质粒可以复制，且其所携带脂肪酶SmL突变体基因可被有效表达。本发明优选宿主细胞为大肠杆菌，更优选地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。

技术方案之五：一种沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂的制备方法

一种沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂的制备方法，所述酶制剂可以是下列形式中的任意一种：

(1)培养如权利要求6所述的重组表达转化子，离心得到重组表达转化子细胞；或，

(2)对获得的重组表达转化子细胞进行破碎，分离得到含有如权利要求1-3中任一项所述重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的粗酶液；或，

(3)对粗酶液进一步纯化得到的重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的纯酶。

所述重组表达转化子的培养条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型选择适当的条件，只要可以使重组表达转化子生长并且生产所述沙雷氏菌脂肪酶突变体即可。

其中所述沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂制备方法较佳地为：将如技术方案四所述重组表达沙雷氏菌脂肪酶突变体的重组大肠杆菌，接种至含50μg/mL硫酸卡那霉素的培养基(蛋白胨5～10g/L，酵母膏2～5g/L，NaCl 5～10g/L，pH 7.0)中，30～40℃，160～200rpm振荡培养至OD₆₀₀为1.0～3.0。按0.8～2％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.05～2mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，15～30℃诱导12～24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，获得含有重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的重组表达大肠杆菌细胞。将获得的细胞悬浮于10mL的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即得到重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的粗酶液。

进而对得到的粗酶液进行纯化，可以采用镍层析柱纯化的方法。将粗酶液上样到镍层析柱上，用结合液洗脱杂蛋白，随后用洗脱液洗脱目标蛋白，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果收集纯化后的蛋白质。其中，结合液的配方：20mM磷酸钠缓冲液，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.4；洗脱液的配方为：20mM磷酸钠缓冲液，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4。

技术方案之六：本发明的沙雷氏菌脂肪酶突变体在酶法拆分制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯中的应用

将技术方案之五得到的重组沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂，在有机-水两相反应体系中，酶法拆分制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。反应条件按本领域此类反应的常规条件进行选择。其中有机-水两相体系优选为甲苯/水体系，优选体积比为1/1，反应时间为2～24h，较佳地，反应过程中间歇取样检测剩余(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的对映体过量值(ee_s)，待ee_s>99％时终止反应。甲苯有机相中底物(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的浓度为100～250g/L，酶制剂的加入量为50～250U/g底物。

本发明的所有试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：与野生型的沙雷氏菌脂肪酶相比，本发明中的脂肪酶突变体具有更高的催化活性，并且维持了高的立体选择性。使用本发明的脂肪酶突变体催化制备地尔硫卓合成(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯具有酶用量少，酶制剂成本低，反应时间短，产品收率高的显著优势，具有很强的工业应用潜力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1粘质沙雷氏菌CGMCC 1219脂肪酶(SmL)基因的克隆

将野生沙雷氏菌(菌种保藏号：CGMCC No.1219)在LB培养基中进行培养。采用酚氯仿法提取沙雷氏菌的基因组，具体步骤如下：

将培养得到的菌体离心，然后用生理盐水(0.85％,w/v)重悬，吸取1.5mL重悬液，加入到1.5mL EP管中，再次离心。加入500μL生理盐水于EP管中，加入适量陶瓷珠子(直径约1mm，陶瓷珠总体积为溶液体积的1/3)；将EP管放在振荡器上振荡5min后放在冰面上冰浴15min，然后再在振荡器上振荡10min；离心，收集上清液；向上清液中加入500μL酚氯仿溶液，振荡均匀后，14000rpm离心5min。然后吸取300μL上清液，再加入900μL无水乙醇，摇晃均匀。-80℃放置20min后有DNA沉淀产生。离心，弃去上清液，用75％(v/v)乙醇洗涤沉淀；37℃烘箱中放置约30min，烘干乙醇，最后将沉淀用50μL TE buffer(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)溶解，-20℃保存备用。

以提取的基因组作为模板，进行脂肪酶SmL基因的PCR扩增，成功得到大约1900bp的目的片段。使用的引物如下：

上游引物(SmL-F)：5’-CCGGAATTCCCGCATACCAATAAC-3’(EcoR I)；

下游引物((SmL-R)：5’-CCCAAGCTTTTAGGCCAACACCACC-3’(Hind III)。

PCR体系(50μL)：Taqmix 25μL，二甲基亚砜(DMSO)5μL，基因组DNA约50ng，上游引物2μL，下游引物2μL，diH₂O补足至50μL。

PCR反应程序：(1)94℃预变性6min；(2)95℃变性1min；(3)58℃退火40sec；(4)72℃延伸2.5min；(5)步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存PCR产物。

将PCR扩增得到的DNA片段与质粒pET28a用EcoR I/Hind III进行双酶切。体系如下：

37℃酶切2h，酶切产物通过凝胶电泳纯化，切胶回收目的片段和质粒。

将纯化回收的PCR片段与pET28a在16℃连接过夜。体系如下：

取10μL酶连产物用CaCl₂法转化100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，并均匀涂布含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，菌落PCR验证阳性克隆，挑选单克隆送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，得到如SEQ ID No.1所示核酸序列，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将获得的重组大肠杆菌接种至含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，然后用质粒抽提试剂盒提取获得重组表达质粒pET28a-SmL，进一步转化宿主大肠杆菌BL21，得到重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-SmL。

实施例2脂肪酶SmL的单点饱和突变

以已经公布的沙雷氏菌脂肪酶的晶体结构(PDB：2QUA)作为模板，利用在线建模工具Swiss-Model进行同源建模。以酶促反应底物(+)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(+)-MPGM]作为配体小分子，以同源建模得到的沙雷氏菌脂肪酶SmL的模型三维结构为基础，用AutoDock软件进行分子对接。以底物为中心，的范围内，选取18个氨基酸位点，分别为：Y29、T143、D161、G165、F166、H206、L208、A237、S238、P239、V258、A261、L262、L267、S271、W311、L315、Y319，分别进行饱和突变。

以质粒pET28a作为载体，大肠杆菌BL21作为宿主，构建上述位点的NNK饱和突变库。以位点L315为例，引物设计如下：

上游引物：5’-ggctgtcgcacNNKccgttcttcta-3’

下游引物：5’-tagaagaacggMNNgtgcgacagcc-3’

其中：N代表核苷酸A/T/C/G；K代表核苷酸C/G；M代表核苷酸G/C；

其他所有位点的引物序列见表一。

表一突变位点的引物序列

PCR反应体系(50μL)如下：Prime STARTMHS 25μL，DMSO 5μL，重组质粒pET28a-SmL约50ng，Primer F 1μL，Primer R 1μL，diH₂O补足至50μL。

PCR反应程序：(1)94℃预变性6min；(2)98℃变性10sec；(3)58℃退火10sec；(4)72℃延伸7min；(5)步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min。

将PCR产物用限内酶Dpn I在37℃消化处理2h后，转化E.coli BL21感受态细胞，并均匀涂布含有50μg/mL硫酸卡那霉素的琼脂转化平板，37℃过夜培养。在96孔深孔板的每个孔中加入400μL新鲜LB培养基。将转化平板上的转化子用牙签挑入96孔深孔板中，于37℃，220rpm摇床中培养过夜。然后将一级板中的50μL菌液接入二级96孔深孔板，于37℃，220rpm摇床中再培养2～3h后，加入IPTG(终浓度0.5mM)进行诱导，然后16℃继续培养18h。之后4℃、4000rpm离心15min，弃去培养基，放入-70℃冰箱冷冻。从冰箱中拿出菌体冻融后，加入200μL溶菌液(750mg溶菌酶溶解于1L BES缓冲液(5mM,pH 7.2)中)，漩涡振荡混匀，37℃静置1h。4℃、4000rpm再次离心20min，获得的细胞破碎上清液进行活力测定分析。

用标准底物对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)对饱和突变库进行初筛，筛选反应体系为：170μL KPB缓冲液(100mM,pH 7.0)，加20μL酶液，再加10μL底物(100mM pNPB的DMSO溶液)，震荡混匀，读取405nm处吸光值的增长。筛选活性有明显提高的克隆子，经复筛比较，对活性最高的三个克隆进行测序，确定突变为S271F、L315S、W311M。将获得的三个单点突变体分别命名为SmL_S271F，SmL_L315S，SmL_W311M。

实施例3SmL单点突变体重组表达转化子细胞以及粗酶的制备

将含有单点突变重组表达质粒的重组大肠杆菌，接种至含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到1.2，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导18h。培养液4000rpm离心20min，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞，即为沙雷氏菌脂肪酶SmL单点突变体的重组表达转化子细胞。将获得的细胞悬浮于10mL的KPB缓冲液(100mM,pH 8.0)中，超声破碎，12000rpm离心收集上清液，即得到重组沙雷氏菌脂肪酶SmL单点突变体的粗酶液，对粗酶液进行脂肪酶活力测定，结果见表二，与母本SmL相比，单点突变体的粗酶液活力有显著提高。

表二单点突变体与野生脂肪酶对pNPB的粗酶活力比较

实施例4沙雷氏菌脂肪酶SmL的组合突变

在单点饱和突变获得突变点S271F、L315S和W311M的基础上，分别将L315S、S271F和W311M这三个突变位点进行组合，进一步得到组合突变体SmL_S271F/W311M、SmL_S271F/L315S、SmL_W311M/L315S和SmL_{S271F/W311M/L315S}。

将含有组合突变重组表达质粒的重组大肠杆菌，接种至含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到1.2，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导18h。培养液4000rpm离心20min，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞，即为沙雷氏菌脂肪酶SmL组合突变体的重组表达转化子细胞。将获得的细胞悬浮于10mL的KPB缓冲液(100mM,pH 8.0)中，超声破碎，12000rpm离心收集上清液，即得到重组沙雷氏菌脂肪酶SmL组合突变体的粗酶液，对粗酶液进行脂肪酶活力测定，结果见表三，组合突变体的粗酶液活力提高更显著。

表三组合突变体与野生脂肪酶SmL对pNPB的粗酶活力比较

实施例5沙雷氏菌脂肪酶SmL突变体的纯酶制备

对实施例3和4中得到的粗酶进行纯化，具体方法如下：纯化所用的镍柱(柱体积5mL)预先用缓冲液A(20mM磷酸钠，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.4)平衡，流速设为5mL/min，待平衡后上样，用6倍柱体积(30mL)的结合液洗脱亲和柱中的未结合蛋白，再用20倍柱体积(100mL)的缓冲液B(20mM磷酸钠，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱。收集含目的蛋白的洗脱液，透析过夜去除其中的咪唑。然后用截留分子量为10kDa的超滤管离心进行蛋白浓缩，所得蛋白质浓缩液加入终浓度为10％(w/v)的甘油，分装后于-80℃环境中长期保存，备用。对野生型脂肪酶SmL和突变体的纯酶进行比活力测定，结果如表四所示。与母本SmL相比，突变体的比活显著提高。

表四：突变体与野生脂肪酶对pNPB的纯酶活力比较

实施例6-12重组脂肪酶SmL突变体纯酶拆分(±)-MPGM

反应体系：甲苯相(底物浓度500mM) 5mL

水相(Tris-HCl,100mM,pH 8.0，含1％Tween-80) 5mL

反应器中依次加入5mL溶有500mM(±)-MPGM的甲苯，5mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)，30℃保温10min。之后分别加入0.5mg如实施例5制备的纯酶，30℃磁力搅拌反应，pH控制在8.0左右(用2M氨水进行pH调节)，每半小时取样。反应液高速离心3min，取上清10μL，用乙酸乙酯稀释100倍，加入无水硫酸钠干燥，过滤去除蛋白，采用HPLC检测反应的转化率和对映体过量值，色谱柱为OJ-H柱，流动相为：正己烷/异丙醇＝60:40，流速0.8ml/min，紫外检测，检测波长为254nm。结果如表五。

表五：沙雷氏菌脂肪酶突变体拆分(±)-MPGM

实施例13重组突变体SmL_{S271F/W311M/L315S}整细胞用于拆分(±)-MPGM

反应体系：甲苯相(底物浓度500mM) 5mL

水相(Tris-HCl,100mM,pH 8.0，含1％Tween-80) 5mL

反应器中依次加入5mL溶有500mM(±)-MPGM的甲苯，5mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)，30℃保温10min，之后加入20mg湿细胞(2.5U/mg湿细胞)，30℃磁力搅拌反应，pH控制在7.0左右(用2M氨水进行pH调节)，每半小时取样。反应液高速离心3min，取上清10μL，用乙酸乙酯稀释100倍，加入无水硫酸钠干燥，过滤去除蛋白，采用HPLC检测反应的转化率和对映体过量值，色谱柱为OJ-H柱，流动相为：正己烷/异丙醇＝60:40，流速0.8ml/min，紫外检测，检测波长为254nm。反应10h后，反应转化率为50.1％，剩余(-)-MPGM的光学纯度超过99％。

实施例14突变体SmL_{S271F/W311M/L315S}的粗酶液用于拆分(±)-MPGM

反应体系：甲苯相(底物浓度500mM) 5mL

水相(Tris-HCl,100mM,pH 8.0，含1％Tween-80) 5mL

反应器中依次加入5mL溶有500mM(±)-MPGM的甲苯，5mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)，30℃保温10min。之后加入1mL如实施例4制备的突变体SmL_{S271F/W311M/L315S}的粗酶液，30℃磁力搅拌反应，pH控制在9.0左右(用2M氨水进行pH调节)，每半小时取样。反应液高速离心3min，取上清10μL，用乙酸乙酯稀释100倍，加入无水硫酸钠干燥，过滤去除蛋白，采用HPLC检测反应的转化率和对映体过量值，色谱柱为OJ-H柱，流动相为：正己烷/异丙醇＝60:40，流速0.8ml/min，紫外检测，检测波长为254nm。反应6h后，反应转化率为49.8％，剩余(-)-MPGM的光学纯度超过99％。

实施例15突变体SmL_{S271F/W311M/L315S}用于制备光学纯的(-)-MPGM

在5L三口烧瓶中，加入104.1g(±)-MPGM和甲苯1.0L，机械搅拌至底物完全溶解。然后加入900mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)和100mL如实施例4制备的突变体SmL_{S271F/W311M/L315S}的粗酶液，30℃保温10min。开动机械搅拌，搅拌转速200rpm，用自动电位滴定仪滴加1.0M的NaOH溶液，控制pH 8.0左右。反应8h后，反应转化率50.4％，终止反应，用分液漏斗分离有机相，水相用500mL甲苯萃取两次。合并有机相，依次用500mL的5％亚硫酸氢钠溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。抽滤，滤液旋转蒸发回收甲苯，得到微黄色固体50.4g，然后在甲醇中重结晶得到46.0g光学纯的无色晶体，收率为44.2％。

对比例1重组脂肪酶SmL纯酶拆分(±)-MPGM

反应体系以及酶的用量同实施例6-12。反应器中依次加入5mL溶有500mM(±)-MPGM的甲苯，5mL 100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，30℃保温10min。之后加入0.5mg如实施例5制备的重组脂肪酶SmL的纯酶，30℃磁力搅拌反应，pH控制在8.0左右(用2M氨水进行pH调节)，每隔二小时取样。反应液高速离心3min，取上清10μL，用乙酸乙酯稀释100倍，加入无水硫酸钠干燥，过滤去除蛋白，采用HPLC检测反应的转化率和对映体过量值，色谱柱为OJ-H柱，流动相为：正己烷/异丙醇＝60:40，流速0.8ml/min，紫外检测，检测波长为254nm。反应12h后，反应转化率仅为30％，剩余(-)-MPGM的光学纯度仅有41％。

与实施例6-12相比，本发明所述沙雷氏菌脂肪酶SmL的突变体催化拆分(±)-MPGM的效果显著好于母本。使用突变体酶在较短时间内，反应的转化率即可达到50％左右，获得接近光学纯的剩余底物，而相同蛋白浓度的条件下，母本酶由于活性低，因此转化率低，剩余底物的光学纯度差，达不到应用要求。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种活性提高的沙雷氏菌脂肪酶突变体，其特征在于，其选自如下序列对应的蛋白质：

(1)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第271位丝氨酸替换为苯丙氨酸；或，

(2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第311位色氨酸替换为甲硫氨酸；或，

(3)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第315位亮氨酸替换为丝氨酸；或，

(4)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸替换为苯丙氨酸；或，

(5)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸；或，

(6)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸；或，

(7)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸。

2.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸是编码如权利要求1所述的沙雷氏菌脂肪酶突变体的核酸分子。

3.一种重组表达质粒，其特征在于，含有如权利要求2所述的核酸。

4.一种重组表达转化子，其特征在于，含有如权利要求3所述的重组表达质粒。

5.一种沙雷氏菌脂肪酶制剂，其特征在于，所述酶制剂是下列形式中的任意一种：

(1)培养如权利要求4所述的重组表达转化子，离心得到重组表达转化子细胞；或，

(2)对获得的重组表达转化子细胞进行破碎，分离得到含有如权利要求1所述沙雷氏菌脂肪酶突变体的粗酶液；或，

(3)对粗酶液进一步纯化得到的沙雷氏菌脂肪酶突变体的纯酶。

6.一种如权利要求1所述沙雷氏菌脂肪酶突变体在制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯中的应用，其特征在于，使用如权利要求5所述沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂在有机溶剂和水相缓冲液构成的两相体系中催化(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的酶法拆分，然后从反应混合物中分离剩余的高光学纯度的(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。

7.根据权利要求6所述沙雷氏菌脂肪酶突变体的应用，其特征在于，所述的有机溶剂为甲苯，所述水相缓冲液的pH为7.0～9.0。