CN101684460A - 高活性重组脂酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高活性重组脂酶的制备方法。该方法包括：(a)将脂肪酶包涵体与3－10M尿素水溶液混合，从而溶解包涵体，获得含变性脂肪酶的变性溶液；(b)对步骤(a)的变性溶液在低离子强度的复性液中进行稀释复性，从而获得含活性脂肪酶的复性溶液；(c)对步骤(b)的复性溶液进行分离纯化，从而获得比活性大于或等于10000U/g的脂肪酶，或者对步骤(b)的复性溶液进行浓缩，从而获得含比活性大于或等于10000U/g的脂肪酶的浓缩溶液。本发明方法可高效地得高活性、高纯度的重组脂酶。

Description

高活性重组脂酶的制备方法

技术领域

本发明涉及重组脂酶的制备方法，具体地涉及通过对包涵体的变性和复性从而高锡地制备高活性、高纯度重组脂酶的方法。

背景技术

非甾体抗炎药例如常见酮基布洛芬和萘普生是一类重要的药物。由于酮基布洛芬和萘普生都是手性化合物，而且其不同对映体的药理活性是不同的。右旋酮基布洛芬，或称为(S)-酮基布洛芬，在医药行业中有着十分广泛的应用；而左旋酮基布洛芬，或称为(R)-酮基布洛芬则可添加于牙膏中，用于防治骨质疏松。奈普生的(S)-(+)-对映体的活性是其(R)-(-)-对映体的28倍。为提高药效，降低药物毒副作用，扩大用药安全范围，减少并发症及正确评价药物，需制备光学纯的单一对映体药物。

获得单一对映体的常用方法包括化学方法和生物方法。化学方法包括不对称化学合成和立体选择性结晶等化学拆分方法。而利用酶法进行生物催化拆分，由于操作简便，环境污染小而得到越来越多的开发和应用，成为许多科技人员所关注的新兴技术方法。

脂酶可实现单一对映体-如非甾体抗炎药的生物催化法拆分。常见的非甾体抗炎药包括酮基布洛芬和萘普生，底物为2-芳基丙酸。

美国专利5037751中公开了一种Bacillus thai酯酶，它可以水解拆分萘普生和布洛芬的甲酯或乙酯。对该酯酶进行了克隆表达，虽然重组酶表现出更高的对映体选择性，但对映选择性并不理想，(S)-构型产物的含量仅略大于90％，无法达到制药工业的高纯度要求。

中国专利申请200410067046.1中公开了一种产立体选择性酯水解酶的沙雷氏菌菌株即粘质沙雷氏菌ECU1010(保藏号CGMCC 1219)及其在制备地尔硫卓手性前体中的应用。该专利申请中所公开的沙雷氏菌脂肪酶具有催化效率高、选择性强、产品光学纯度好，且回收容易等优点。但是该酶的可溶性表达非常困难，难以大规模生产。

此外，目前虽然有应用复性技术对某些重组蛋白质进行成功复性的例子，但是尚没有应用复性技术成功对脂酶进行复性的报道。因此，本领域迫切需要开发对进行脂酶的包涵体进行复性的工艺，以便于脂酶的生产。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的对重组沙雷氏菌脂肪酶的包涵体的进行变性和复性的方法，从而高效地获得可催化拆分2-芳基丙酸对映体的重组酶。

在本发明的第一方面，通过了一种脂肪酶的制备方法，它包括步骤：

(a)将脂肪酶包涵体与3-10M尿素水溶液混合，从而溶解包涵体，获得含变性脂肪酶的变性溶液；

(b)对步骤(a)的变性溶液在低离子强度和pH 5.5-8.5的条件下进行稀释复性，从而获得含复性脂肪酶的复性溶液，其中所述的低离子强度是指溶液的离子强度小于或等于1.5mmol/L PBS水溶液的离子强度；

(c)对步骤(b)的复性溶液进行分离纯化，从而获得比活性大于或等于10000U/g的脂肪酶(如比活性为10000-150000U/g)，或者对步骤(b)的复性溶液进行浓缩，从而获得含比活性大于或等于10000U/g的脂肪酶(如比活性为10000-150000U/g)的浓缩溶液。

在另一优选例中，所述的低离子强度是指溶液的离子强度小于或等于1mmol/L PBS水溶液的离子强度；

在另一优选例中，步骤(b)中稀释复性的稀释比为5-30(即变性溶液：复性液的体积比＝5-30)。

在另一优选例中，步骤(b)中在pH6-7下进行复性。

在另一优选例中，步骤(b)中在4-35℃(较佳地10-30℃)下进行复性。

在另一优选例中，步骤(b)中在0.01-1mmol/L PBS条件下进行复性。

在另一优选例中，步骤(b)中在0.1-20mmol/L Tris·HCl条件下进行复性。

在另一优选例中，步骤(b)中在脂肪酶浓度为0.001-0.5mg/ml(更佳地0.005-0.2mg/ml)条件下进行复性。

在另一优选例中，所述的脂肪酶来自粘质沙雷氏菌，更佳地，所述的脂肪酶来自保藏号为CGMCC 1219的粘质沙雷氏菌ECU1010。

在另一优选例中，在步骤(c)中通过阴离子交换树脂一步吸附进行浓缩。更佳地，在步骤(c)中先进行阴离子交换树脂一步吸附，然后进行连续盐浓度梯度洗脱。更佳地，在步骤(c)中还包括对获得的脂肪酶进行冻干处理，从而获得冻干的脂肪酶制剂。

在另一优选例中，在步骤(c)中，对步骤(b)的复性溶液进行分离纯化，从而获得比活性大于或等于20000U/g(更佳地≥30000U/g，最佳地≥50000U/g)的脂肪酶，或者对步骤(b)的复性溶液进行浓缩，从而获得含比活性大于或等于20000U/g(更佳地≥30000U/g，最佳地≥50000U/g)的脂肪酶的浓缩溶液。

在本发明的第二方面，提供用本发明上述方法制备的高比活脂肪酶，其比活性为10000-150000U/g，更佳地为20000-140000U/g。

附图说明

图1显示了SDS-PAGE电泳分析重组脂酶表达情况。

各泳道如下：M，蛋白质分子量标准；1，重组菌经0.5mmol/L的IPTG诱导后，超声破碎后沉淀，即包涵体部分；2，上清部分。结果表明，重组菌经37℃培养，0.5mmol/L的IPTG诱导后，获得脂酶的包涵体形式表达。

图2是复性脂酶的DEAE-FF纯化图。图中，□为酶活性(U/L)，◆为OD_280nm值。

上样：1000ml复性液；柱：50ml DEAE-FF；洗脱液：0-1mol/L NaCl溶解在pH7.0 Tris-HCl中，线性洗脱，8ml/管，分管收集。

结果表明，复性后的脂酶可被阴离子交换树脂DEAE-FF有效吸附，并被NaCl有效洗脱。

图3显示了复性实验中主要因素的效应曲线图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次在特定的、优化的变性和复性条件下，对脂肪酶包涵体进行变性和复性，从而高效地获得了高活性(比活性大于10000U/g)的重组脂肪酶。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“脂肪酶”、“脂酶”和“酯酶”可互换使用，都指具有酶解酯键活性的酶。

如本文所用，术语“具酶活性”指具有天然存在的脂酶的生物活性。天然存在的脂酶的生物活性指其特异性的三丁酸甘油酯或对硝基苯酚丁酸酯的水解能力。

可用于本发明方法的脂肪酶没有特别限制，可以是来源于任何物种的脂肪酶。一种优选的脂肪酶是细菌的脂肪酶，例如来自粘质沙雷氏菌的脂肪酶。一种特别优选的脂肪酶是来自保藏号为CGMCC 1219的粘质沙雷氏菌ECU1010(见中国专利申请200410067046.1)。

通常，用于本发明的脂肪酶是重组表达的脂肪酶。重组脂酶表示通过重组体DNA方法和其他人工方法制备的重组多肽，它具有与任何天然存在的脂酶相同的和基本上相同的氨基酸序列。

众所周知，根据已公开的脂肪酶序列，本领域技术人员可以通过PCR扩增等方法制备酯酶的编码序列，然后将其插入表达载体，进而转化常见的宿主细胞(如大肠杆菌)，就可以包涵体形式表达重组脂肪酶。在本发明的一个优选例中，通过IPTG诱导使得大肠杆菌表达脂肪酶包涵体，然后回收的脂酶包涵体。

本领域技术人员能够选择表达载体和宿主细胞。优选的表达载体宜包括在宿主细胞内表达克隆的基因所必需的调节元件，定位在编码脂酶的核酸附近，以便影响其表达。优选的细菌寄主细胞是大肠杆菌细胞，一种合适的大肠杆菌的例子是常见的大肠杆菌BL21(DE3)。

对于表达重组脂肪酶的大肠杆菌，通过常规的破细胞和分离手段，可以获得纯化的重组脂肪酶的包涵体。该纯化的重组脂肪酶的包涵体，就可作为本发明变性步骤的原料。

在本发明的一个优选方案中，通过破坏大肠杆菌的细胞壁以产生细胞裂解产物，离心分离细胞裂解产物中的沉淀，然后在适当的条件下洗涤沉淀，获得纯化的重组脂肪酶包涵体。

本发明的高活性的重组脂酶的制备方法的关键之一在于脂酶包涵体变性-复性技术，该变性复性技术主要包括包涵体的合适的变性条件和优化的复性条件。

在一个优选的实施方案中，变性条件优选8M尿素而不是6M盐酸胍；复性方法优选稀释复性法；复性液的组成包括氧化还原对：0.5mM GSSG+1mM GSH；pH5.0-pH9.0的缓冲体系；缓冲对优选Tris-HCl和磷酸盐缓冲液；复性温度优选低温，如4℃；复性时间优选20h-60h。

对于复性后所获得的重组脂肪酶，还可进行浓缩和/或纯化。

一种优选的浓缩方法为阴离子树脂吸附法；优选的阴离子树脂包括DEAE阴离子交换树脂；优选的纯化方法包括连续NaCl梯度洗脱；优选的NaCl洗脱的浓度范围为0-1M。

在本发明的一个优选例中，本发明对重组表达的粘质沙雷氏菌ECU1010(CGMCC 1219)的脂肪酶包涵体，通过变性条件和复性条件的优化，得到高活性的重组脂酶。复性溶液中的高活性重组脂酶可经阴离子交换树脂一步吸附浓缩，特定条件洗脱纯化可得高活性高纯度的重组脂酶。

本发明的主要优点在于：

(a)可以高效地获得高比活性脂肪酶，所述的脂肪酶的比活性≥10000U/g，更佳地≥30000U/g，最佳地≥50000U/g。通常，比活性为10000-150000U/g。

(b)制备工艺简便。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

试验材料

所用培养基及菌株、质粒：

LB培养液：1％蛋白胨(tryptone)(购自Difco公司)，0.5％酵母提取物(Difco)，1％NaCl，pH7.0；

LB平板：LB培养液，加琼脂粉至浓度为1.5～2.0％；

实施例1

产脂酶重组菌的诱导表达及SDS-PAGE蛋白电泳鉴定

I.工程菌

带有重组脂酶基因的表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)(购自华东理工大学；文献见Jian-He Xu等，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 47(2007)105-110)，接种于含氨苄(100μg/ml)的固体LB培养基上生长。该工程菌表达包涵体形式的脂肪酶，而该脂肪酶来自保藏号为CGMCC 1219的粘质沙雷氏菌ECU1010(专利申请200410067046.1)。

II.发酵表达

挑取工程菌单菌落于5ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃，摇菌过夜；过夜菌按1％接种于含250ml LB氨苄抗性培养液中，37℃，摇菌至OD600nm 0.3～0.5，IPTG诱导，诱导后3～5小时，离心收集菌体。

III.表达情况分析

将诱导前及诱导后的菌体离心，弃上清，沉淀菌体中加入电泳上样缓冲液，煮沸10min，离心，上清进行变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

与诱导前相对照，含有重组质粒的经IPTG诱导后有相应蛋白条带(63kD)表达(结果如图1所示)。

实施例2

包涵体的洗涤与变性

I.包涵体的变性及洗涤：将表达脂肪酶包涵体的大肠杆菌裂解后，离心，收集沉淀。经SDS-PAGE电泳鉴定表明：沉淀为脂肪酶的包涵体表达部分。将包涵体收集，用0.5％Triton-X 100悬浮，洗涤，离心，用不含的Triton-X 100的Tris-HCl缓冲液充分洗涤。

II.将经0.5％Triton-X 100充分洗涤的包涵体离心收集后，按照20mg/ml(湿包涵体/变性液)的比例，把脂肪酶包涵体单独溶解于8M、6M或4M的尿素，6M或3M的盐酸胍，或者1％或0.25％SDS；其结果如表1所示。

表1脂酶包涵体在不同变性条件下的溶解度

充分溶解后，离心，取上清，即为变性脂肪酶。

实施例3：

不同变性条件下的复性效果

对实施例1的表1中所获得的变性液用100mM PBS稀释10倍复性，5h后测活，结果见表2.

表2脂酶包涵体不同变性条件下的复性情况

从表2可知，虽然尿素、盐酸胍、SDS均可溶解脂酶包涵体，但出乎意料的是只有尿素溶解的包涵体才得到比较好的复性效果。

因此，在后续试验中选择尿素作为脂酶包涵体的变性剂。

实施例4：

有关复性条件的正交试验

按照常规的方法，按表3.1测定复性液pH、复性液的离子强度(用PBS溶液)、稀释倍数等因素对复性结果的影响。脂酶复性实验方差分析示于表3.2。

表3.1脂酶变性/复性直观分析表

所在列	1	2	3	4
						因素	PH	PBS(mmol/L)	尿素(M)	稀释倍数	实验结果
实验1	6.0	100	8	20	0
						实验2	6.0	50	6	15	458.1
实验3	6.0	1	4	10	1905.696
						实验4	6.5	100	6	10	73.296
实验5	6.5	50	4	20	1099
						实验6	6.5	1	8	15	1191
实验7	7.0	100	4	15	73
						实验8	7.0	50	8	10	677
实验9	7.0	1	6	20	1649
						均值1	787.932	48.765	622.667	916.000
均值2	787.765	744.700	726.799	574.033
						均值3	799.667	1581.899	1025.899	885.331
极差	11.902	1533.134	403.232	341.967

表3.2脂酶复性实验方差分析表

因素	偏差平方和	自由度	F比	F临界值	显著性
						pH	279.372	2	0.001	9.000
PBS	3535724.486	2	13.449	9.000	*
						尿素	262900.329	2	1.000	9.000
稀释倍数	214787.839	2	0.817	9.000
						误差	262900.33	2

通过极差分析可以看出PBS浓度对其复性的影响是最大的，并且具有显著性(图3)。

从正交实验可以知道，PBS浓度(离子强度)对脂酶包涵体的复性有着很重要的影响，以低离子强度为佳。

尿素浓度与复性结果是有一定相关性，在测试的4-8M范围内都可获得较好的复性结果。

稀释倍数与复性结果有一定相关性。在测试的10-20倍的范围内都可较好的复性结果。

在pH对复性影响不大。在测试的PH6-7的范围内皆可复性。

因此，优选的复性条件可以是例如pH6-7，PBS浓度为0.01-1mmol/L，稀释倍数为6-30倍。

实施例5：

复性液pH的影响

基于实施例4的试验结果，进一步确定复性液pH对复性效果的影响。

将脂肪酶包涵体用6M尿素变性，用不同pH的1mol/L PBS稀释15倍复性，30℃下复性。结果如表4所示。

表4复性液pH对脂酶复性的影响

由复性结果可知，复性液的pH可以为5.5-8.5，较佳地为6-8，更佳地为约6.0，这与正交试验的实施例4的结果是一致的。

实施例6

复性液温度

基于实施例4的试验结果，进一步确定复性液温度对复性效果的影响。

将包涵体用6M尿素变性，用pH6.0的1mmol/L PBS稀释15倍复性，分别放置不同温度下复性。结果见表5。

表5不同复性温度对脂酶复性的影响

结果表明，温度对复性有一定影响，在4-35℃内都可复性。然而，4℃条件的复性随时间延长，复性18h与44h相比，酶活和比活分别升高2.2和2.5倍。30℃条件下，复性18h与44h相比，酶活和比活基本不变。37℃不适合复性。

因此，合适的复性温度为4-35℃，较佳地为10-35℃，更佳地为15-35℃。

实施例7

复性缓冲液组成

基于实施例4的试验结果，进一步确定复性液离子强度和离子种类对复性效果的影响。

将包涵体用6M尿素变性，分别用水、pH6.0的1mmol/LPBS、10mmol/LTris·HCl、1mmol/L NaCl稀释15倍、30℃复性。不同复性时间下测活，结果见表6。

表6不同复性液组成对脂酶复性的影响

结果表明：复性18h后的酶活顺序为：水＞pH6.0的1mmol/L PBS＞10mmol/L Tris Tris·HCl＞1mmol/L NaCl。复性44h后，酶活顺序为：10mmol/LTris Tris·HCl＞水＞1mmol/L NaCl＞pH6.0的1mmol/LPBS。

该结果提示：PBS由于含有三价阴离子，故离子强度高的原因，对于酶的复性不利。Tris是一比较合适的缓冲液，复性44h，酶活和比活均升高1.4倍，说明Tris的存在有利于复性的进行，同样的活性升高现象发生在1mmol/L NaCl复性液中。

因此，宜在低离子强度下进行复性，其中所述的低离子强度是指溶液的离子强度≤1.5mmol/L(较佳地≤1.0mmol/L，更佳地≤0.5mmol/L)PBS水溶液的离子强度。更佳地，在复性液中，三价阴离子浓度≤0.1mmol/L。

一种优选的复性液是0.1-20mmol/L Tris·HCl。

实施例8：

复性液中不同蛋白浓度的复性

基于实施例4的试验结果，进一步确定复性溶液中蛋白浓度对复性效果的影响。

将包涵体用6M尿素变性，分别用的10mmol/L Tris-HCl(pH6.5)，稀释15倍复性，30℃下复性。不同复性时间下测活，结果见表7。

表7复性液中蛋白含量对脂酶复性的影响

随着复性液中蛋白浓度的提高，所得酶的总活性相差不大，低蛋白浓度(0.028mg/ml)条件下，经过20h复性后，活性达到最高。同时比活达到133,000U/g，远远高于0.22mg/ml的复性液中的比活(15,000U/g)。只有在低浓度蛋白(0.028mg/ml)条件下，20h的活性和比活均高于13h的活性和比活1.4倍。

上述结果表明：该复性条件下，蛋白浓度越低，复性后获得的脂肪酶比活约高，即高蛋白浓度不利于获得高比活的脂肪酶。

因此，复性时蛋白浓度虽然可以为0.001-0.5mg/ml，但优选0.005-0.2mg/ml，更佳地优选0.005-0.05mg/ml。

实施例9：

不同复性温度下不同复性缓冲液组成中的稀释复性

本实施例进一步确定不同复性温度下不同复性缓冲液组成中对复性效果的影响。

将包涵体用6M尿素变性，分别用pH6.0的1mmol/L PBS、10mmol/L Tris稀释15倍复性，分别放置4℃和30℃下复性。不同复性时间下测活，结果见表8。

表8复性温度对高蛋白复性浓度下脂酶复性的影响

注：表格中(1)，(2)表示两次单独的平行试验。

高蛋白浓度(＞0.5mg/ml)下复性，所得酶的总活性提高，最高达到4400u/L。但比活下降，为10000U/g左右。

复性时间(2-48小时)和温度(4℃或30℃)对复性后的酶活性的影响不大。

实施例10

复性脂酶的浓缩和纯化

(a)较高蛋白浓度(约1mg/ml)复性

将脂肪酶包涵体1g溶解在50ml 8M尿素中，充分溶解后，离心，上清滴加到复性液1000ml中进行稀释复性(复性液：10mmol/L Tris-HCl，pH7.0)，复性12h，之后直接流加上DEAE-FF阴离子交换柱(50ml)，柱事先用pH7.010mMTris-HCl平衡，上样结束后，用0-1mol/L NaCl线性梯度洗脱，分管收集，8ml/管，测定各管的在280nm下的光吸收值，即OD280，同时按常规方法测活性和蛋白含量。

结果如表9和附图2所示。

表9复性脂酶纯化表

(b)中等蛋白浓度(约0.5mg/ml)和较低蛋白浓度(约0.25mg/ml)复性

重复实施例9(a)，不同点在于，用复性液2000ml(中等蛋白浓度)或4000ml复性液(较低蛋白质浓度)替换1000ml复性液。

结果表明，在中等蛋白浓度获得了比活性约为13000U/g复性脂酶，在较低蛋白浓度获得了比活性约为15500U/g复性脂酶。两种条件下，活性回收率均为约60％。

讨论

目前，以可溶形式标的重组酯酶，其最优条件可得到酯酶约5000U/L发酵培养液，比活为约5000U/g蛋白。而采用包涵体方式生产重组酯酶，虽然可以获得大量的包涵体，但是因复性效果差，无法应用大规模生产。

与之相反，采用本发明的高效变性-复性方法，即使在较高蛋白浓度下复性，仍可以获得高比活的脂肪酶，例如表8中，在0.37mg蛋白/ml下复性，获得了活性4400U/L复性液，其比活提高到11890U/g。在实施例9的表9中，在约1mg/ml下的高蛋白浓度下复性，仍可以获得比活高达11000U/g的高比活的脂肪酶。在表7所示的在较低蛋白浓度下(0.028mg/ml)下，获得的复性酯酶的比活性高达133,000U/g，远远优于现有技术。这表明，本发明方法适用于大规模和高效地制备高活性酯酶。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1、一种脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将脂肪酶包涵体与3-10M尿素水溶液混合，从而溶解包涵体，获得含变性脂肪酶的变性溶液；

(b)对步骤(a)的变性溶液在低离子强度和pH 5.5-8.5的条件下进行稀释复性，从而获得含复性脂肪酶的复性溶液，其中所述的低离子强度是指溶液的离子强度小于或等于1.5mmol/L PBS水溶液的离子强度；

(c)对步骤(b)的复性溶液进行分离纯化，从而获得比活性大于或等于10000U/g的脂肪酶，或者对步骤(b)的复性溶液进行浓缩，从而获得含比活性大于或等于10000U/g的脂肪酶的浓缩溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的低离子强度是指溶液的离子强度小于或等于1mmol/L PBS水溶液的离子强度；

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中稀释复性的稀释比为5-30。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中在pH6-7下进行复性。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中在4-35℃，较佳地10-30℃下进行复性。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中在0.01-1mmol/L PBS条件下或在0.1-20mmol/L Tris·HCl条件下进行复性。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中在脂肪酶浓度为0.001-0.5mg/ml，更佳地0.005-0.2mg/ml的条件下进行复性。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶来自粘质沙雷氏菌，更佳地，所述的脂肪酶来自保藏号为CGMCC 1219的粘质沙雷氏菌ECU1010。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中通过阴离子交换树脂一步吸附进行浓缩。

10.一种用权利要求1所述方法制备的脂肪酶，其比活性为10000-150000U/g。

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