CN103194467A - 一种古菌嗜热酯酶及(s)-酮洛芬的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种古菌嗜热酯酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，它的步骤如下：（1）设计一对引物，以Thermotogamaritima全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选重组质粒，进行双酶切及测序验证；（2）基因的诱导表达与蛋白质的纯化得到古菌嗜热酯酶。本发明采用基因工程方法在大肠杆菌Escherichiacoli中克隆表达该酯酶基因，制备了该酯酶蛋白，蛋白纯度高（95%以上）。该酯酶最适反应温度和反应pH分别为70℃和5.0-5.5；具有较好的耐酸性，在70℃和pH4.5反应体系中处理60min可以保持50%左右活性。
Description
技术领域
本发明设计一种古菌嗜热酯酶及其用于制备(S)-酮洛芬的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
2-芳基丙酸类药物（2-APA）属于非甾体消炎镇痛药（NSAIDS），是解热镇痛、消炎抗风湿的基本药物和主要产品，它是目前处方药和非处方药处方量最大的一类药物。常用的有布洛芬、奈普生和酮洛芬 3 种，其 α位有一个手性碳原子存在(S)-构型和(R)-构型一对光学对映体，临床上一般以外消旋体的形式供应。其中酮洛芬的消炎镇痛作用是阿司匹林的150倍，解热作用是阿司匹林的 100 倍，临床上用于治疗慢性类风湿性关节炎、变性性关节炎、外伤和术后疼痛等。药理实验表明，其(S)-异构体的消炎镇痛作用是外消旋酮洛芬的2倍，而(R)-异构体的活性很低，但有其他方面药用价值，它对牙周病的骨质疏松有治疗作用。
目前，(S)- 酮洛芬的制备方法主要有化学合成法和微生物酶法拆分。采用化学法合成(S)- 酮洛芬，一般先得到等量的一对对映体混合物(外消旋体),将其拆分是获得光学纯(S)- 酮洛芬。通常利用手性试剂将外消旋体混合物中一对对映体转化为两种非对映体,然后利用非对映体理化性质的差异,将其分开,但此拆分过程较繁杂,手性试剂昂贵,多数情况下难以得到满意的收率。采用微生物酶法拆分合成(S)- 酮洛芬，具有立体专一性强、拆分效率高、生产条件温和、无环境污染、反应步骤简单、不需手性源、生产成本低等诸多优点。目前，用于拆分(S)- 酮洛芬的酶多数是商品化的脂肪酶，而利用酯酶拆分合成(S)- 酮洛芬的方法还未建立。商品化的脂肪酶多数是在中温酶，反应pH也在中性左右，没有能够适应高温酸性条件下拆分合成(S)- 酮洛芬的脂肪酶。
发明内容
本发明要解决的技术问题是化学合成法制备（S）-酮洛芬收率低。提供一种古菌嗜热酯酶及其用于制备（S）-酮洛芬的方法。
本发明的技术方案是：一种古菌嗜热酯酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，它的步骤如下：
（1）设计一对引物: 上游[5’-GCC CATATG GTT AAG CTG ATA ATC AAG-3’]，下游[5’-GAT GTCGAC TCACCTCTTCAAAAAGGAAAC-3’]，以Thermotoga maritima全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，进行双酶切及测序验证；
（2）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入0.5 mol/L IPTG于37℃继续培养4 h，诱导表达的蛋白经过70℃热处理30 min，镍柱亲和层析(洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole) 和分子筛Superdex-200 (16/60) column（洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl；洗脱速度为：0.5 ml/min）纯化后，得到古菌嗜热酯酶。
所述的古菌嗜热酯酶用于制备(S)-酮洛芬的方法，它的步骤如下：反应体系中底物酮洛芬乙酸酯 25 mg/ml，古菌嗜热酯酶0.235 mg/ml，1 ml 50 mM醋酸钠缓冲液，反应体系的pH为5-6，在反应温度60-80 ℃，200-250 rpm/min搅拌速度条件下下，水解反应10-60 h，得到(S)-酮洛芬。
该酶的最适酶活温度为70℃，最适酶活pH为5.0-5.5。该酶具有具有较好的嗜热性和耐酸性，是目前已发现少数古菌嗜热酯酶之一。
本发明的有益效果是：本发明得到了嗜热酯酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在Thermotoga maritima中发现并制备获得的第一个古菌嗜热酯酶；本发明获得了一种不同于现有技术的新的古菌嗜热酯酶；本发明获得了一种在高温酸性条件下酶法催化制备（S）-酮洛芬的新方法。
本发明在嗜热细菌海栖热袍菌Thermotoga maritima中发现了一个能够高效拆分外消旋酮洛芬乙酸酯的古菌嗜热酯酶Tm1160，采用基因工程方法在大肠杆菌Escherichia coli中克隆表达该酯酶基因，经70℃热处理、亲和层析和分子筛等方法制备了该酯酶蛋白，蛋白纯度高（95%以上）。该酯酶最适反应温度和反应pH分别为70℃和5.0-5.5；具有较好的耐酸性，在70℃和pH 4.5反应体系中处理60 min可以保持50%左右活性。该酶可以立体选择性高效拆分外消旋酮洛芬乙酸酯，制备光学纯的（S）-酮洛芬。经优化最佳拆分条件：底物酮洛芬乙酸酯浓度为25 mg/ml,酯酶用量0.235 mg/ml，pH 5.5, 反应温度70℃，水解反应23 h，底物转化率为41.1%, eep（产物对应体过量）为91.4%，E（对应体选择率）＞90。底物转化率接近50%和E＞90，表明该酶具有较高手性化合物拆分活性。在目前微生物酶法制备（S）-酮洛芬方法中，反应pH在7.0左右，并且在常温下（30-40℃）反应，而Tm1160具有良好的热稳定性和耐酸性，可以在嗜热酸性环境中完成对酮洛芬乙酸酯的拆分。综上所述，嗜热酯酶TM1160具有良好的热稳定性和耐酸性，以及高效立体选择性活性，适用于(S)- 酮洛芬及其类似物的生物酶法制备，具有较好的工业应用前景。
非甾体类抗炎镇痛药（NSAIDs）是全球发展最快的药物，据Kalorama Information发布的最新调查数据显示，2010年全球疼痛治疗药物和仪器的市场规模已达到了330亿美元，其中酮洛芬占市场份额的10%左右。酮洛芬是迄今为止11种NSAID药物中毒副作用较小的品种，许多发达国家都将其作为非处方药销售，已列入我国基本医疗保险药品目录。
我国抗炎镇痛药产业的主要特点是规模大、产量高、品种全。在产品价格占尽优势的竞争中，我国已成为亚洲最大、世界第二大的抗炎镇痛药生产、出口国，从而为我国医药化工对外贸易市场奠定了良好的基础。目前，酮洛芬被广泛地用于治疗关节炎，特别是骨关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎以及红斑狼疮引起的各种炎症疼痛。我国的关节炎患者人数已超过1 亿人，每年治疗总费用支出在135亿元以上；类风湿性关节炎也高居不下，目前，全国约有400万-500万类风湿性关节炎患者，从而形成了庞大的酮洛芬抗炎药市场。采用本方法制备的（S）-酮洛芬具有纯度高、副产物少等特点，可用于制备酮洛芬胶囊、凝胶、贴剂等药物剂型的原料，具有较好的工业应用前景。
附图说明
图1是蛋白质表达的电泳照片，其中： 1. 标准蛋白质分子量；2. 细胞总提取物； 3.经热处理以后的粗酶提取液；4. 经镍柱亲和层析纯化的酶蛋白；5.经分子筛纯化后的酶蛋白
图2是该酶的酶活与温度、热稳定性变化关系曲线，其中：A. 最适反应温度；B. 热稳定性，菱形代表70℃，方框代表80℃，三角代表90℃。
图3是该酶的酶活与最适反应pH、pH稳定性和耐酸性变化关系曲线，其中：A. 最适反应pH和pH稳定性，方框代表最适pH，菱形代表pH稳定性；B. 耐酸性，菱形代表pH 4.5，方框代表pH 5.0，三角代表pH 5.5。
图4 是该酶的酶活与水解酮洛芬乙酸酯关系曲线，其中：A. 水解反应式；B. 水解率和产物对应体过量；C. 对应体选择率。
具体实施方式
一种古菌嗜热酯酶，具有DNA序列如下（ORF：TM1160，基因序列号NC_000853.1）：
atgttaatca aaagctttgc aatcgagagt aatatattaa aagataatcc tttaaaagat 60
cccaatgtta gaaaagtcta ttctatagag gttggagatg taactcaagc tccaatagta 120
atttatttga gtggattttt ctcttcctct attacactct taaattatga tcctttatca 180
gaatctataa atgaaaaact agatagatta cataaagaag ggaaaatcaa gaatttaata 240
tttatacttc cagatctttt tacaaaatta ggtgggaatc aatacataaa ttcaacagct 300
gtaggaatgt acgaggattt tattataaaa gaattaatcc catatctttt tgatatatat 360
ggaaagaagg atgtaatatt aatgggaaag tcttctggtg gttacggttc aatagtttta 420
gctatgaaat atccagaaat aatacgcggc ctaataaatc attctggaga ttcttatttt 480
gaatatgttt acttacctta ttttcctcat gctattagac atataaggag agaaggtgga 540
cttaataagt ggttggaaaa gtactggagt aaggaaaata agaaggataa agatgatctt 600
aatacattaa atattattgc catggccgca ttttattccc cagaagggac agaaattgtt 660
ttgccatttg atcttgatac tggagaaata attgaggatg tttggaaaag atggctagaa 720
aaagatccag taagactagt agaaaaatac agcgaaaacc tgaaaaaatt aaggctgatt 780
taccttgatg taggtaataa agatgagttt aggataaact ttggtatgag gatactacac 840
aagaaaatgc ttaggtataa tgttaagcat gaatttgaag aatatgaagg aggtcatttc 900
aatacctcat atagatacga ta 922
一种古菌嗜热酯酶，具有氨基酸序列如下：
Met Leu Ile Lys Ser Phe Ala Ile Glu Ser Asn Ile Leu Lys Asp
1 5 10 15
Asn Pro Leu Lys Asp Pro Asn Val Arg Lys Val Tyr Ser Ile Glu
20 25 30
Val Gly Asp Val Thr Gln Ala Pro Ile Val Ile Tyr Leu Ser Gly
35 40 45
Phe Phe Ser Ser Ser Ile Thr Leu Leu Asn Tyr Asp Pro Leu Ser
50 55 60
Glu Ser Ile Asn Glu Lys Leu Asp Arg Leu His Lys Glu Gly Lys
65 70 75
Ile Lys Asn Leu Ile Phe Ile Leu Pro Asp Leu Phe Thr Lys Leu
80 85 90
Gly Gly Asn Gln Tyr Ile Asn Ser Thr Ala Val Gly Met Tyr Glu
95 100 105
Asp Phe Ile Ile Lys Glu Leu Ile Pro Tyr Leu Phe Asp Ile Tyr
110 115 120
Gly Lys Lys Asp Val Ile Leu Met Gly Lys Ser Ser Gly Gly Tyr
125 130 135
Gly Ser Ile Val Leu Ala Met Lys Tyr Pro Glu Ile Ile Arg Gly
140 145 150
Leu Ile Asn His Ser Gly Asp Ser Tyr Phe Glu Tyr Val Tyr Leu
155 160 165
Pro Tyr Phe Pro His Ala Ile Arg His Ile Arg Arg Glu Gly Gly
170 175 180
Leu Asn Lys Trp Leu Glu Lys Tyr Trp Ser Lys Glu Asn Lys Lys
185 190 195
Asp Lys Asp Asp Leu Asn Thr Leu Asn Ile Ile Ala Met Ala Ala
200 205 210
Phe Tyr Ser Pro Glu Gly Thr Glu Ile Val Leu Pro Phe Asp Leu
215 220 225
Asp Thr Gly Glu Ile Ile Glu Asp Val Trp Lys Arg Trp Leu Glu
230 235 240
Lys Asp Pro Val Arg Leu Val Glu Lys Tyr Ser Glu Asn Leu Lys
245 250 255
Lys Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Asp Val Gly Asn Lys Asp Glu Phe
260 265 270
Arg Ile Asn Phe Gly Met Arg Ile Leu His Lys Lys Met Leu Arg
275 280 285
Tyr Asn Val Lys His Glu Phe Glu Glu Tyr Glu Gly Gly His Phe
290 295 300
Asn Thr Ser Tyr Arg Tyr Asp Ile Ser Ile Ser Leu Ile Ser Lys
305 310 315
Val Phe Asn Gly Asp Asn Ser
320
古菌嗜热酯酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。具体步骤如下：
（1）菌株、质粒、酶与培养基：
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、限制性内切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接kit ver.2.1购自TakaRa公司；克隆与表达质粒载体pET15b、大肠杆菌Escherichia coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL购自Novagen公司；LB培养基：每升含Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g； 氨苄青霉素浓度为100 mg/L, 氯霉素浓度为34 mg/L。
（2）PCR扩增及重组质粒的构建：
设计一对引物: 上游[5’-GCC CATATG GTT AAG CTG ATA ATC AAG-3’]，下游[5’-GAT GTCGAC TCACCTCTTCAAAAAGGAAAC-3’]，其中，粗体部分为上游引物NdeⅠ酶切位点及下游引物SalⅠ酶切位点。以Thermotoga maritima全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。
（3） 基因的诱导表达与蛋白质的纯化：
将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入0.5 mol/L IPTG于37℃继续培养4 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析和分子筛纯化后，得到纯化的酶蛋白。
所述的古菌嗜热酯酶用于制备(S)-酮洛芬的方法，它的步骤如下：反应体系中底物酮洛芬乙酸酯 25 mg/ml，古菌嗜热酯酶0.235 mg/ml，1 ml 50 mM醋酸钠缓冲液，反应体系的pH为5-6，在反应温度60-80 ℃，200-250 rpm/min搅拌速度条件下下，水解反应10-60 h，得到(S)-酮洛芬。
高温酸性环境中高效水解酮洛芬乙酸酯，得到光学纯的（S）-酮洛芬，在生物工程和医药领域具有重要的工业应用价值。由于该酶所具有的独特的嗜热及热稳定性，可以提高反应速率并消除反应可能带来的污染物等负面影响。
高效液相色谱HPLC检测水解产物，所用手性色谱柱为Chiralcel OJ (日本Daical公司，25 cm × 4.6 cm)，流动相为己烷：异丙醇：乙酸 （90:10:0.5,v/v/v）,洗脱速度为1.0 mL/min，在紫外254 nm检测。在此条件下，酮洛芬乙酸酯、(R)-酮洛芬和(S)-酮洛芬保留时间分别为5.4、14.8和18.2 min。
转化率（c）、产物对映体过量（eep）和产物对映体选择率（E）计算公式如下：转化率c＝1-[([A]＋[B])/ ([A]0＋[B]0)]，其中[A] 和[B] 分别表示(S)-酮洛芬乙酯和(R)-酮洛芬乙酯的浓度，[A]0和[B]0分别表示(S)-酮洛芬乙酯和(R)-酮洛芬乙酯的起始浓度；产物对映体过量eep =([P]-[Q])/([P]+[Q])，其中[P]和[Q]分别表示(S)-酮洛芬和(R)-酮洛芬的浓度；对映体选择率E= ln [1-c (1 + eep)]/ln [1-c (1- eep)]。
古菌嗜热酯酶的酶学性质分析鉴定，原理：酯酶能够水解对硝基苯酯为对硝基苯酚（p-NP）及相应的酸，对硝基苯酚在410nm处有特征吸收峰，利用对硝基苯酚的光吸收值表征酯酶酶活。酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟生成1 微摩尔的对硝基苯酚（p-NP）所需要的酶量为一个活力单位(U)。
反应体系如下（1ml）：以20 mmol/L对硝基苯酚乙酸酯作为底物，取经70℃保温的pH值为8.0的50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，加入相应量的粗酶，再加入20 μl 20mM 的底物，70℃反应15 min (对照用相等酶量的缓冲液Tris-HCl代替)，在410nm以对照反应液为对照测吸光度。根据对硝基苯酚的浓度计算酶活。
通过对嗜热酯酶进行分析鉴定，得到该酶的主要以下酶学性质如下：
（1）得到编码古菌嗜热酯酶的基因序列（ORF：TM1160，基因序列号NC_000853.1）：基因序列如上所述。（2）得到编码酯酶的氨基酸序列：氨基酸序列如上所述。（3）得到的纯化的酯酶蛋白电泳图如图1所示。（4）该酶最适反应温度为70℃，在90℃处理60 min仍然保持50%活性（如图2所示）。（5）该酶是一种酸性酯酶，在pH 5.0-7.5的范围内具有很高的稳定性，最适酶活pH为5.0-5.5；该酶具有较强的耐酸性，在高温70℃和酸性条件pH为4.5处理60 min，仍保持50%以上的活性（如图3所示）。（6）该酶立体选择性高效拆分外消旋酮洛芬乙酸酯，制备光学纯的（S）-酮洛芬。反应条件：底物酮洛芬乙酸酯浓度为25 mg/ml,酯酶用量0.235 mg/ml，pH 5.5, 反应温度70℃，水解反应23 h可获得最佳拆分效果：转化率为41.1%,eep（产物对应体过量）为91.4%，E（对应体选择率）＞90（如图4所示）。表明该古菌嗜热酯酶对酮洛芬乙酸酯具有高度的对映选择性，具有较好的工业应用价值。
古菌嗜热酯酶的应用：酮洛芬（2-（3-苯甲酰基苯基）-丙酸）作为最有效的2-芳基丙酸类（2-APA）非甾体抗炎药之一，其抗炎活性（以单位重量为基准）大约是阿司匹林的160倍。外消旋酮洛芬是等量的（S）-异构体和（R）-异构体的混合物。然而，只有（S）-异构体具有抗炎镇痛活性。本发明的古菌嗜热酯酶在高温酸性环境中高效水解酮洛芬乙酸酯，得到色谱纯的（S）-酮洛芬，在生物工程和医药领域具有重要的工业应用价值。
氨基酸序列表
<110> 郑州轻工业学院
<120>一种古菌嗜热酯酶及其用于制备(S)-酮洛芬的方法
<160> 4
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(27)
<400> 1
gcccatatggttaagctgataatcaag 27
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gaatctataa atgaaaaact agatagatta cataaagaag ggaaaatcaa gaatttaata 240
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ggaaagaagg atgtaatatt aatgggaaag tcttctggtg gttacggttc aatagtttta 420
gctatgaaat atccagaaat aatacgcggc ctaataaatc attctggaga ttcttatttt 480
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cttaataagt ggttggaaaa gtactggagt aaggaaaata agaaggataa agatgatctt 600
aatacattaa atattattgc catggccgca ttttattccc cagaagggac agaaattgtt 660
ttgccatttg atcttgatac tggagaaata attgaggatg tttggaaaag atggctagaa 720
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taccttgatg taggtaataa agatgagttt aggataaact ttggtatgag gatactacac 840
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<212> DNA
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<220>
<222> (1)...(322)
<400> 4
Met Leu Ile Lys Ser Phe Ala Ile Glu Ser Asn Ile Leu Lys Asp
1 5 10 15
Asn Pro Leu Lys Asp Pro Asn Val Arg Lys Val Tyr Ser Ile Glu
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75
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155 160 165
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230 235 240
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305 310 315
Val Phe Asn Gly Asp Asn Ser
320
Claims (2)
1.一种古菌嗜热酯酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，其特征在于：它的步骤如下：
（1）设计一对引物: 上游[5’-GCC CATATG GTT AAG CTG ATA ATC AAG-3’]，下游[5’-GAT GTCGAC TCACCTCTTCAAAAAGGAAAC-3’]，以Thermotoga maritima全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，进行双酶切及测序验证；
（2）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入0.5 mol/L IPTG于37℃继续培养4 h，诱导表达的蛋白经过70℃热处理30 min，镍柱亲和层析，洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole和分子筛Superdex-200 (16/60) column，洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl；洗脱速度为：0.5 ml/min，纯化后，得到古菌嗜热酯酶。
2.如权利要求1所述的古菌嗜热酯酶用于制备(S)-酮洛芬的方法，其特征在于：它的步骤如下：反应体系中底物酮洛芬乙酸酯 25 mg/ml，古菌嗜热酯酶0.235 mg/ml，1 ml 50 mM醋酸钠缓冲液，反应体系的pH为5-6，在反应温度60-80 ℃，200-250 rpm/min搅拌速度条件下下，水解反应10-60 h，得到(S)-酮洛芬。
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| CN2013100162020A CN103194467A (zh) | 2013-01-17 | 2013-01-17 | 一种古菌嗜热酯酶及(s)-酮洛芬的制备方法 |
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| CN2013100162020A CN103194467A (zh) | 2013-01-17 | 2013-01-17 | 一种古菌嗜热酯酶及(s)-酮洛芬的制备方法 |
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| CN2013100162020A Pending CN103194467A (zh) | 2013-01-17 | 2013-01-17 | 一种古菌嗜热酯酶及(s)-酮洛芬的制备方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434512A (zh) * | 2016-11-07 | 2017-02-22 | 江南大学 | 一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其表达 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1336437A (zh) * | 2001-09-04 | 2002-02-20 | 华东理工大学 | 两种酵母菌株及其用于制备光学纯2－芳基丙酸的方法 |
| KR20030013770A (ko) * | 2001-08-09 | 2003-02-15 | 학교법인 포항공과대학교 | 재조합 내열성 에스터라아제 및 이를 이용한 광학활성카르복실산의 제조방법 |
| US20040219594A1 (en) * | 2002-01-17 | 2004-11-04 | Chung Bong Hyun | Esterase, its DNA, its overexpression and production of optically active aryl propionic acids using the same |
| CN101684460A (zh) * | 2008-09-22 | 2010-03-31 | 华东理工大学 | 高活性重组脂酶的制备方法 |
-
2013
- 2013-01-17 CN CN2013100162020A patent/CN103194467A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| WEI TAO ET AL: "Characterization of a new thermophilic and acid tolerant esterase from Thermotoga maritima capable of hydrolytic resolution of racemic ketoprofen ethyl ester", 《 JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN106434512A (zh) * | 2016-11-07 | 2017-02-22 | 江南大学 | 一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其表达 |
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