CN102250934A - 一种酰胺水解酶的高效表达及应用 - Google Patents

Abstract

酰胺水解酶基因的克隆、工程菌的构建与酶蛋白表达以及工业化的应用，该发明属于生物工程技术，主要解决自然菌产生酰胺水解酶酶活低、菌浓低、生产应用困难等问题。在代尔伏特菌属(Delftia)的Delftiatsuruhatensis菌发酵产生水解酶的基础上，克隆出酰胺水解酶基因，建立了一整套大肠杆菌基因工程菌发酵、诱导表达、应用于工业化生产的工艺。通过上述基因工程改造，酰胺酶活性达到3000u/l以上，远远高于原始菌株的300u/l；通过实际应用表明，该酶用途广泛，可以应用于他汀类药物侧链的生产，大大降低了生产成本，有助于实现绿色化工。

Description

一种酰胺水解酶的高效表达及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和酶工程，具体地说，本发明涉及利用DNA重组技术构建大肠杆菌基因工程菌新菌株，并用该菌株产生的酶水解酰胺类化合物，拆分(R，S)-型酰胺类化合物。

背景技术

酰胺类化合物是自然界中广泛分布的一类物质。其中，手性酰胺类化合物及其衍生物在他汀类药物合成中，起着重要的作用。例如，S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺是西司他汀的重要中间体；(R)-4-羧酸-3-羟-丁酸乙酯是(R)-4-氰-3-羟-丁酸乙酯经过腈水合酶与酰胺水解酶两步作用得到的，前者是超级他汀合成的重要中间体。西司他汀是第一个应用临床的肾脱氢酶抑制剂，能有效避免体内肾脱氢酶降解亚胺培南，增强亚胺培南的抗菌活性。超级他汀又名为瑞舒伐他汀(RosuvastatinCalcium)或者罗伐他汀，是迄今为止最强的降脂药物，从其已有的临床验证结果和与同类产品的比较两方面来看，它都不愧为被称为“超级他汀”。超级他汀具有抑制HMG-CoA还原酶、增加低密度脂蛋白受体、抑制极低密度脂蛋白胆固醇合成以及抗动脉粥样硬化的作用。

传统的化学法合成手性酰胺类化合物及其衍生物能耗大，副产物多，且比较困难。通过微生物法，利用含光学选择性酰胺酶的微生物Delftia tsuruhatensis(CCTCC No.M205114)、Ochrobactrum anthropi SV3(Eur.j.Biochem.267，2028-2035(2000))、Comamonas acidovorans TG 308(DSM No.6552)、Pseudomonas sp.NSAK：42(DSM No.6433)，把外消旋的酰胺类化合物及其衍生物进行动力学拆分，获得相应的化合物。微生物法或者酶法合成手性化合物的方法具有条件温和、环境污染小、能够较好地实现立体对映选择性、化学选择性和区域选择性等优点。

目前，对具有光学选择性的酰胺酶的研究，国内外研究人员已经做了大量的工作。

Thomas Zimmermann等研究人员(US Patent 5427934)，从具有酰胺水解酶活性的微生物中克隆出1281bp的基因片断，该基因编码426个氨基酸。他们将该基因克隆到表达载体中，并在大肠杆菌中进行表达，得到有活性的酶蛋白。作者将该酶针对性地用于S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的合成，并且对酶的活性条件进行了进一步的研究。

Hidenobu Komeda等(Eur.j.Biochem.267，2028-2035(2000))曾报道，从微生物Ochrobactrum anthropi SV3克隆出1092bp的基因片断，编码363个氨基酸。他们将这个基因克隆到表达载体中，在宿主菌大肠杆菌中进行表达，得到具有光学选择性酰胺酶活性的酶蛋白。

与Hidenobu Komeda同属于一个研究团队的TipparatHongpattarakere等(J Ind Microbiol Biotechnol(2005)32：567-576)还曾从另一种具有酰胺水解酶活性的微生物Delftia acidovorans基因组中克隆出相关基因片断。该基因片断长度为1401bp的基因片断，编码466个氨基酸。但是，在此研究中，研究人员并未对该基因的表达体系做进一步的研究。

在光学选择性酰胺酶方面的研究，国内机构同样取得了进展。以沈寅初院士为首的科研小组在这方面的研究走在了前列。他们建立了具有活性的光学选择性酰胺酶筛选系统(Applied Microbiology andBiotechnology(2007)74：256-262)；从土壤中筛选出能够表达光学选择性酰胺酶活性的Delftia tsuruhatensis(申请号：200510062180)；从腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZJB-07112分离纯化酰胺酶并对其酶学性质进行了研究。

本发明人在前人工作的基础上，从由中国典型微生物菌种保藏中心保藏的Delftia tsuruhatensis(CCTCC No.M205114)菌中克隆出具有光学选择性的酰胺酶基因。该基因序列见附件序列表SEQ ID No.1，该基因序列与Gene Bank上一个总基因组序列中的一段基因(gi|160361034：5879135-5880535)一致，而与以上文献报道的基因序列和氨基酸序列均存在差异性。我们通过表达载体把该基因克隆到大肠杆菌BL21/DE3进行表达，在摇瓶里或者批发酵的情况下，酶活可以达到3000U/L.min，是自然菌酶活的300U/L.min。我们把该基因命名为DAM，它表达出来的酰胺酶成为R-型酰胺水解酶。该酶可以与腈水合酶耦连催化，将氰化物转化成具有手性的酰胺类化合物和具有手性的羧酸类化合物。我们已经将该项生物催化技术用于西司他汀侧链和超级他汀侧链的工业化生产。

目前，大肠杆菌是表达外源蛋白常用的宿主菌系统，具有发酵周期短、易于实现高密度发酵等优点，所以如果对光学选择性酰胺水解酶进行高密度发酵，则该酶的酶活还有比较大的增值空间。相对于自然菌发酵表达酰胺水解酶，大肠杆菌工程菌发酵具有培养基成本低、生物积累量高的特点。这些特性使得大肠杆菌工程菌具备以极低的价格生产光学选择性酰胺水解酶的潜力。通过分子生物学的手段和酶工程的方法表达R-型酰胺水解酶，能够提高单位发酵液体积内的酶的活力，降低生产成本，提高催化效率。促进“绿色化工”的发展，具有经济和社会的双重价值。

发明内容

本发明人为了解决上述课题，通过筛选大量的微生物，发现代尔夫菌属微生物能产生一种有高度立体选择性的酰胺水解酶，可用于拆分(R，S)-型化合物或水解手性酰胺化合物，为了提高这种酶的表达量，本发明克隆了该种酶的基因，并对此基因在大肠杆菌内进行表达。因此，本发明的目的之一是提供包括该酰胺水解酶基因的表达载体和利用该载体转化的重组微生物，如基因工程菌株；目的之二是提供从所述微生物制备重组酶的方法及由此制得的重组酶；目的之三是提供该水解酶在拆分(R，S)-型化合物或水解手性酰胺化合物中的用途。

本发明具有R-型异构体立体选择性的酰胺水解酶基因可得自代尔夫菌属微生物，如Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M205114。本发明采用的技术方案是通过PCR扩增得到代尔夫菌的一种具有立体选择性的酰胺水解酶基因(我们将该基因命名为DAM)，其具体步骤如下：1)获取含有立体选择性酰胺水解酶基因的Delftia tsuruhatensis(CCTCCNo.M205114)的基因组DNA。2)根据立体选择性酰胺水解酶基因的核苷酸序列设计引物A和引物B(引物A、B核甘酸序列见实施例1)。3)以Delftia tsuruhatensis基因组DNA为摸板，加入引物A、引物B、TaqDNA聚合酶以及dNTP混合物进行PCR扩增。4)PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA胶回收试剂盒回收1.4kb大小的PCR扩增片断。

对这种具有立体选择性的酰胺水解酶基因(DAM)的核苷酸序列进行测定，结果如序列表中SEQ ID No.1所示，其中DNA从第1个碱基起至第1399个碱基终止，ATG为转录起始密码子，TGA为转录终止密码子，并得到相应的氨基酸序列，如序列表SEQ ID No.2中所示。当然，如本技术领域技术人员所知，本发明酰胺水解酶基因还可以是编码由序列表SEQ ID No.2中所示的氨基酸组成的蛋白质的其它核苷酸序列；而本发明的酰胺水解酶不仅限于序列表SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列组成的蛋白质还可以是将序列表SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失、或添加具有相同酶活性的有序列SEQID No.2衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加1个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响修饰形式上的差异等情况。

本发明的另一目的是提供包括上述酰胺水解酶基因核苷酸序列的表达载体，其是用常规方法将本发明的酰胺水解酶基因的核苷酸序列连接于各种表达载体上构建而成，该表达载体选自质粒、粘粒或噬菌体。其中质粒选自pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen，Inc.，Madison，Wis.)，pQE(Qiagen)，pSE420和pLEX(Invitrogen)。

较佳是将PCR扩增到的DAM基因与克隆载体pUC118连接，形成克隆载体pUC118-DAM。pUC 118-DAM和表达载体pET24a(+)分别用限制性内切酶消化，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成DAM基因的表达载体(质粒)pET24a(+)-DAM，表达载体上的启动子可以是可以是其它任何可以在大肠杆菌BL21/DE3细胞内发挥作用的启动子，其中优选T7启动子。表达载体上的操纵子可以用其它操纵子进行替换，其中优选LacI操纵子。

本发明的另一目的是提供了一种基因工程菌株，其是将包含本发明酰胺水解酶基因核苷酸序列的表达载体转化到宿主微生物，例如感受态大肠杆菌-大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，得到基因工程菌，如将上述质粒PET24a(+)-DAM转化其中得到含有PET24a(+)-DAM的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/PET24a(+)DAM。

上述宿主细胞优选大肠杆菌，最优选大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)。

本发明的又一目的是提供一种制备具有立体选择性的重组酰胺水解酶的方法，其是将上述基因工程菌在诱导剂条件下发酵来生产重组立体选择性酰胺水解酶，其中诱导剂选自IPTG或α-乳糖；发酵、诱导温度范围控制在20-42℃之间；培养模式选自批发酵培养、或流加培养；培养基选自蛋白胨、酵母粉、氯化钠或其它基础盐培养基。

本发明的重组酰胺水解酶选自a)SEQ ID No.2所述的氨基酸序列；或b)具有与SEQ ID No.2所述的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列；或c)在a或b序列的前端或后端加上一段SEQ ID No.3所述的氨基酸序列。

本发明的重组酰胺水解酶可用于拆分(R，S)-型化合物或水解手性酰胺化合物。特别用于拆分R/S-2，2-二甲基环丙甲酰胺和水解他汀类化合物侧链如R-(4)-酰胺-3-羟基丁酸乙酯。

本发明的重组酰胺水解酶用于R/S-2，2-二甲基环丙甲酰胺的拆分时，具有R-型选择性，拆分过程可以由工程菌菌体或者菌体破碎液来完成，并且在一定的温度和PH条件下进行。拆分温度优选20-55℃，拆分pH优选6-10。

本发明的效果：

本发明克服了自然菌酰胺水解酶表达量低的缺点，利用大肠杆菌工程菌发酵表达外源蛋白具有培养基成本低、生物积累量高，大规模发酵可得到较高的细胞密度和生物转化率的特点，运用在大肠杆菌细胞内表达来源于Delftia tsuruhatensis的立体选择性酰胺水解酶的技术路线，通过将其置于操纵子、启动子的调控下，使细胞内能够产生出大量的立体选择性酰胺水解酶，从而使单位菌体能够转化更多的底物。通过筛选和培养，我们得到了比自然菌立体选择性酰胺水解酶活力提高了5-10倍的工程菌。要获得等量活力的酶，原来自然菌的发酵体积是该菌发酵体积的10倍左右，该菌的发酵大大降低了能耗和废水、废气、废液的排放量。该菌用于他汀类药物侧链的生产，更有助于克服化学合成中条件苛刻、能耗大、反应困难以及副产物多等缺点。该酶的表达成功促进了酶法合成手性酰胺类化合物及其衍生物在他汀类药物生产上的大规模应用，有助于实现他汀类药物生产的绿色环保。

附图说明

图1琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增目的片断的分析图谱

其中，PCR产物1和2均为目的基因片断

图2为重组表达质粒pUC118-DAM的酶切鉴定图谱

图3为重组质粒pUC118-DAM的构建示意图

图4为重组表达质粒PET24a(+)-DAM的酶切鉴图谱

其中，1为空载质粒PET24a(+)的EcoR I酶切产物；2为重组质粒PET24a(+)-DAM的EcoR I酶切产物；3、6为DNA分子量标志；4为空载质粒PET24a(+)的EcoR I、Nde I的酶切产物；5为重组质粒PET24a(+)-DAM的EcoR I、Nde I的酶切产物

图5为重组表达质粒PET24a(+)-DAM的构建示意图

图6大肠杆菌工程菌与代尔夫特菌属发酵过程中OD600的比较

图7大肠杆菌工程菌与代尔夫特菌属发酵过程中单位发酵液体积酶活的比较

图8为R-型酰胺水解酶在宿主菌BL21/DE3中表达的SDS-PAGE图

其中，1、4为经α-乳糖诱导后的含有PET24a(+)-DAM的重组菌株表达的蛋白条带；3为经α-乳糖诱导后的含有PET24a(+)的重组菌株表达的蛋白条带；2、5为蛋白Maker。

图9R-型酰胺水解酶转化拆分底物R/S-2，2-二甲基环丙甲酰胺的液相图谱

图10生产制备出的二甲基环丙甲酰胺的气相图谱

图11R-型酰胺水解酶转化底物R-(4)-酰胺-3-羟基丁酸乙酯的液相图谱

图12在不同温度反应体系中，酶活随反应体系温度的变化曲线

具体实施方式

本发明可以通过下述实施例进一步阐明

实验材料和方法简要说明：

1、试剂：

实验所用的基因组抽提试剂盒、Blunting Kination Ligation Kit、TaqDNA聚合酶以及限制性内切酶均购自Takara公司。

DNA胶回收试剂盒和质粒DNA试剂盒为上海华舜生物工程公司产品。

大肠杆菌宿主菌BL21/DE3购自TianGen公司。

表达质粒PET24a(+)购自Novagen公司。

Delftia tsuruhatensis由中国典型微生物菌种保藏中心保藏(CCTCCNo.M205114)。

2、常规分子生物学操作

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化，基因克隆等分子生物学的操作均按照《分子克隆实验指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著黄培堂等译)完成的。

实施例1：从代尔夫菌中克隆立体选择性酰胺水解酶基因(DAM基因)

1.基因组DNA获得

利用基因组抽提试剂盒抽提Delftia tsuruhatensis(CCTCCNo.M205114)的基因组DNA。

2.引物设计及目的基因DAM的扩增

根据GenBank中报道的的来源于Delftia acidovorans的酰胺水解酶基因(gi|160361034：5879135-5880535，研究人员推测该基因具有酰胺水解酶功能)，设计两条PCR引物：

引物A(5′to 3′)：TCT CAT ATG ATG AAC GAC AGC GAA CTGCAC CAT CTC GAA CT

引物B(5′to 3′)：CTA GAA TTC TCA GGC AGC AGG GTG CTGTCT GTG CCA GT

在设计基因5′端引物(引物A)引入了一个Nde I酶切位点；基因3′端引物(引物B)引入了一个EcoR I酶切位点。

以基因组DNA为模板，加入一定量的引物A和B、Taq DNA聚合酶以及dNTP混合物，PCR反应条件如下：

Step1 95℃ 5分钟

Step2 94℃ 45秒

Step3 58℃ 45秒

Step4 72℃ 2分钟

Step5 72℃ 10分钟

Step6 Step2 to step4 30个循环

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为一条带，分子量约1.4kb(图1)，与理论值一致。

3.PCR产物(目的基因DAM)的回收

采用0.8％琼脂糖凝胶电泳中分离PCR产物，用上海华舜生物工程公司的DNA胶回收试剂盒从凝胶回收1.4kb大小的PCR扩增片断。回收的PCR产物经平末端磷酸化载体试剂盒(Blunting Kination LigationKit)与克隆载体pUC118相连。所得到的连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有X-gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。采用上海华舜公司的质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，所得质粒pUC118-DAM用EcoR I和Nde I双酶切分析，证明含有正确的插入片段(如图2所示)。

对DAM DNA进行DNA测序，序列如SEQ ID No.1所示，编码成熟肽的DNA大小为1401bp，其对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

重组质粒pUC118-DAM的构建如图3所示。

实施例2：表达载体PET24a(+)-DAM和基因工程菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/PET24a(+)DAM的构建

pUC118-DAM质粒和PET24a(+)分别经EcoR I和Nde I双酶切后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳中分离酶切产物，从凝胶中回收1400bp和5260bp左右的DNA片段，用T4DNA连接酶连接，所得质粒称PET24a(+)-DAM质粒，连接产物转化感受态大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)，经涂卡那霉素抗性平板筛选得阳性克隆并进行EcoR I和Nde I双酶切鉴定，证明含有正确的插入片段(如图4所示)，从而得到含有本发明酰胺水解酶的基因工程菌株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)/PET24a(+)DAM。重组表达质粒PET24a(+)-DAM的构建如图5所示。

实施例3：外源立体选择性酰胺水解酶工程菌BL21(DE3)/PET24a(+)DAM的发酵表达

种子培养基为LB培养基，接种量为0.5-6％。发酵培养基为TB培养基：24g/L酵母膏，12g/L蛋白胨，4g/L工业甘油，磷酸盐缓冲液为0.1M，PH＝7.5。在种子OD600＝1左右时，把150ml种子发酵液接入3000ml发酵培养基，37℃开始培养，OD600＝2左右时，加入1％的α-乳糖进行诱导，诱导温度为28℃，5小时后，第二次补加1％的α-乳糖，溶氧回升至较高值不再跌落时，放罐。

发酵过程生长曲线见图6，与宿主菌Delftia tsuruhatensis的发酵过程相比，发酵时间缩短，生物量提高。在上述培养条件下，放罐时的酶活可以达到3000U/L.min左右，远高于自然菌发酵的酶活(300U/L.min左右)，见图7。SDS-PAGE结果表明：与对照相比，酰胺水解酶工程菌经诱导物诱导后在49KD有明显的表达条带(见图8)，其大小与酰胺水解酶理论分子量相符。

实施例4：含有R-型酰胺水解酶的重组细胞催化外消旋的2，2-二甲基环丙酰胺的动力学拆分

取1ml实施例3的(摇瓶，5L罐还是200L罐)的发酵液与3ml的7g/L的底物水溶液，分别在37℃温浴10min，然后混合均匀，37℃反应十分钟，甲醇终止反应，12,000g离心6min，将上清利用高效液相色谱法定量测量R-2，2-二甲基环丙甲酸(如图9所示)，利用气相色谱法对反应的手性化合物进行分析(如图10所示)。

实施例5：含有R-型酰胺水解酶的重组细胞催化水解手性的超级他汀侧链R-(4)-酰胺-3-羟基丁酸乙酯

取0.5g湿菌体与2.5g底物分别溶于50ml自来水，分别在30℃温浴10min，然后混合均匀，30℃反应十分钟，甲醇终止反应，12,000g离心6min，利用高效液相色谱法定量测量上清中R-(4)-羧基-3-羟基丁酸乙酯的含量，结果见图11。

实施例6：2，2-二甲基环丙甲酸的高效液相色谱法定量

测定2，2-二甲基环丙甲酸所用的柱子为C18反相柱，型号为：Hypersil ODS 5um(4.6*250mm)。流动相为：50mM磷酸二氢钠溶液，用磷酸调节PH＝3，与甲醇等体积混合，流速为0.6ml/min，检测波长为210nm。保留时间为10.1分钟，由于室温和的轻微波动，前后偏差1分钟左右。

实施例7：R-2，2-二甲基环丙甲酰胺、S-2，2-二甲基环丙甲酰胺及其对应酸的高效气相色谱法定量

我们依据专利200510061680.9的方法，采用的操作条件为：气相色谱仪为GC-14C，毛细管柱为HP-1，进样口、检测器、柱箱的温度分别为180℃、220℃、120℃，分流比为50∶1；用手性液相色谱测定转化产物中R-和S-2，2-二甲基环丙甲酰胺以及对应酸的含量。首先将酰胺衍生为N，N-二苯甲基酰胺，在Chiralcel OD柱上进行分离，流动相为环己烷/2-丙酮，比例为9∶1，流速为0.4ml/min。

实施例8：R-(4)-羧基-3-羟基丁酸乙酯的高效液相色谱法定量

测定R-(4)-羧基-3-羟基丁酸乙酯所用的柱子为C18反相柱，型号为：Hypersil ODS 5um(4.6*250mm)。流动相为：50mM磷酸二氢钠溶液，用磷酸调节PH＝3，与甲醇等体积混合，流速为0.6ml/min，检测波长为210nm。保留时间为5.3分钟，由于室温和的轻微波动，前后偏差1分钟左右。

实施例9：R-型酰胺水解酶活力的测定

因为工业生产的实际需要，我们在应用此酶时并不破碎工程菌细胞，所以我们测定的酶活力时并不破碎细胞，直接用菌体细胞催化酶反应，测定酶的活力，我们称之为表观酶活。测定方法是：培养结束后，离心收集菌体(4000g*9min，4℃)，并用反应缓冲液(0.1M的磷酸盐缓冲液，PH值为7.4)进行重悬；反应底物是7g/L的外消旋的2，2-二甲基环丙甲酰胺；取1ml的菌体细胞重悬液和3ml的底物分别在37℃预热10min，然后混合均匀进行反应，反应10分钟，甲醇终止反应，离心(10000g*6min，4℃)，高效液相测定R-2，2-二甲基环丙甲酸的含量，根据产物的含量来计算酶的表观活力。

在整个酶活测定过程中，R-型酰胺水解酶活力随着反应温度的升高而增加，在55℃左右达到最大，随后急剧下降(如图12所示)。根据实际反应过程的需要，我们一般采用37℃的反应温度。

序列表

<110>浙江海正药业股份有限公司

<120>一种酰胺水解酶的高效表达及应用

<160>3

<210>1

<211>1401

<212>DNA

<213>代尔伏特菌(Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M205114

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1401)

<223>

<400>1

     1            5                10               15

    Met Asn Asp Ser Glu Leu His His Leu Glu Leu Leu Glu Val Gly Arg

  1 atg aac gac agc gaa ctg cac cat ctc gaa ctg ctg gag gtg ggg cgt

          20                25                30

    Glu Ile Gln Ser Arg Arg Ile Ser Ser Glu Glu Val Thr Arg His Met

 49 gag atc cag tcc cgc cgc att tcc tcg gaa gag gtg acc cgc cac atg

        35               40               45

    Leu Ala Arg Ile Glu Ala Val Asp Ala Arg Leu His Ser Tyr Val Thr

 97 ctg gcg cgc atc gag gcc gtg gac gcg cgg ctg cac agc tac gtg acg

    50               55               60

    Val Met Ala Gln Gln Ala Leu Glu Asp Ala Arg Arg Ala Asp Ala Glu

145 gtg atg gcg cag cag gcg ctg gag gac gcc cgc cgc gcc gac gcg gag

 65               70               75                80

    Ile Ala Gln Gly Arg Arg Arg Gly Ala Leu His Gly Val Pro Leu Ala

193 atc gcg cag ggc cgc cgc cgt ggt gcg ctg cac ggc gtg ccg ctg gcg

              85               90                95

    Leu Lys Asp Leu Leu Trp Thr Arg Gly Val Pro Thr Thr His Gly Met

241 ctc aag gac ctg ctg tgg acc cgg ggt gtc ccc acc acg cat gga atg

           100              105               110

    Thr Leu His Arg Glu His Arg Pro Thr Glu Asp Ala Thr Val Val Arg

289 acg ctg cac cgc gag cat cgc ccc acg gaa gat gcc acc gtg gtg cgc

       115               120              125

    Arg Leu Arg Glu Ala Gly Ala Val Ile Leu Gly Lys Leu Gln Gln Thr

337 agg ctg cgc gag gcc ggc gcc gtc atc ctg ggc aag ctg cag cag acc

    130               135              140

    Glu Gly Ala Phe Ala Asp His His Pro Glu Ile Thr Ala Pro Val Asn

385 gaa ggc gcc ttt gcc gac cac cat ccc gag atc act gcc ccc gtc aac

  145             150               155              160

    Pro Trp Gly Ala Gln Leu Trp Pro Gly Ala Ser Ser Ser Gly Ser Gly

433 ccc tgg gga gcc cag ctg tgg ccc ggg gcc tcg tcc agc ggc tcg ggc

              165               170              175

    Val Ala Thr Ala Ala Gly Leu Cys Phe Gly Ser Leu Gly Thr Asp Thr

481 gtg gcc acg gcg gcg ggg ctg tgc ttc gga tcg ctg ggc acg gac acc

           180                185              190

     Gly Gly Ser Ile Arg Phe Pro Ser Ala Ala Asn Gly Ile Thr Gly Leu

529  ggg ggc tcc atc cgc ttt cca tcg gcc gcc aac ggc atc acg ggg ctc

       195               200              205

     Lys Pro Thr Trp Gly Arg Val Ser Arg His Gly Ala Phe Glu Leu Ala

577  aag ccc acc tgg ggc agg gtg agc cgc cac ggc gcc ttc gaa ttg gcc

     210               215              220

     Ala Ser Leu Asp His Ile Gly Pro Met Ala Arg Ser Ala Ala Asp Ala

625  gcg tcc ctg gac cac ata ggc ccg atg gcg cgc agt gcc gcc gat gcc

  225              230               235              240

     Ala Ala Met Leu Ala Ala Ile Ala Gly Ala Asp Pro Leu Asp Pro Thr

673  gca gcc atg ctt gcg gcc atc gcc ggg gcg gac ccg ctg gac cct acg

              245                250              255

     Ala Ser Gln Cys Ser Val Pro Asp Tyr Leu Ala Met Met Thr Arg Gly

721  gcc agc cag tgc agc gtg ccc gac tat ctg gcc atg atg acg cgc gga

           260              265               270

     Phe Ser Gly Leu Arg Leu Gly Met Asp Arg Gln Trp Ala Leu Asp Gly

769  ttc tcc ggc ctg cgc ctg ggt atg gac cgg caa tgg gca ctg gac ggc

           275               280               285

     Val Asp Ala Pro Ser Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala Leu Ala Val Ala

817  gtg gat gcc ccc tcc cgc cag gcg gtg gag cag gcc ctg gcg gtg gcg

     290               295              300

     Gln Arg Leu Gly Ala Ser Val Gln Glu Val Arg Phe Pro Asp Ala Thr

865  cag cgc ctg ggg gcc agc gtg cag gaa gtc cgc ttt ccc gatgcc acc

  305              310               315              320

     Gln Ala Val Gln Asp Trp Pro Ala Leu Cys Ala Val Glu Thr Ala Val

913  cag gcg gtg cag gac tgg ccg gcg ctg tgc gcg gtg gag acc gcc gtg

               325               330              335

     Ala His Gly Ala Thr Phe Pro Ala Arg Arg Glu Ala Tyr Gly Pro Gly

961  gcg cac ggc gcc acg ttc cct gca cgg cgc gag gcc tat ggc ccc ggg

           340               345               350

     Leu Ala Gly Leu Ile Asp Leu Gly Leu Gly Leu Ser Ala Thr Asp Tyr

1009 ctc gcc ggg ctg atc gac ctg ggg ctg ggc ctg tcc gcc acc gac tac

           355               360               365

     Gln Arg Leu Leu Leu Arg Arg Ala Asp Phe Thr Gly Arg Val Arg Ala

1057 cag cgg ctg ctg ctg cgc cgc gcg gac ttc acg ggc cgg gtg cgc gca

     370                375              380

     Leu Phe Ala Gln Val Asp Leu Leu Leu Val Pro Ala Thr Ala Phe Ala

1105 ctc ttc gcg cag gtg gac ctg ctg ctg gtt ccc gcc acg gcc ttt gcg

 385               390               395              400

     Ala Pro Thr Leu Gln Arg Met Ala His Phe Gly Ser Asp Ala Glu Leu

1153 gcc ccc acg ctg caa cgc atg gcg cat ttc ggc tcc gat gcc gag ctg

               405               410               415

     Phe Ser Gly Met Leu Arg Tyr Thr Cys Pro Phe Asp Leu Thr Gly Ser

1201 ttc tcg ggc atg ctg cgc tac aca tgc ccc ttc gac ctg acg ggc agc

           420               425               430

     Pro Thr Ile Thr Leu Pro Gly Gly Arg Thr Pro Glu Gly Ala Pro Val

1249 ccc acg atc acg ctg ccc gga gga cgc act cct gag ggc gcg ccc gtg

        435               440               445

     Ala Phe Gln Phe Val Ala Pro Asp Phe Arg Glu Asp Leu Leu Val Arg

1297 gcc ttc cag ttc gtg gcc ccc gac ttc cgc gaa gac ctg ctg gtg cgc

     450              455               460

     Ala Gly Trp Ala Phe Gln Gln Ala Thr Asp Trp His Arg Gln His Pro

1345 gcg ggc tgg gcg ttc cag cag gcc acg gac tgg cac aga cag cac cct

  465

     Ala Ala＊＊＊

1393 gct gcc tga

<210>2

<211>466

<212>PRT

<213>代尔伏特菌(Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M205114)

<400>2

1               5                   10                  15

Met Asn Asp Ser Glu Leu His His Leu Glu Leu Leu Glu Val Gly Arg

            20                  25                  30

Glu Ile Gln Ser Arg Arg Ile Ser Ser Glu Glu Val Thr Arg His Met

        35                  40                  45

Leu Ala Arg Ile Glu Ala Val Asp Ala Arg Leu His Ser Tyr Val Thr

    50                  55                  60

Val Met Ala Gln Gln Ala Leu Glu Asp Ala Arg Arg Ala Asp Ala Glu

65                  70                  75                  80

Ile Ala Gln Gly Arg Arg Arg Gly Ala Leu His Gly Val Pro Leu Ala

                85                  90                  95

Leu Lys Asp Leu Leu Trp Thr Arg Gly Val Pro Thr Thr His Gly Met

            100                 105                 110

Thr Leu His Arg Glu His Arg Pro Thr Glu Asp Ala Thr Val Val Arg

        115                 120                 125

Arg Leu Arg Glu Ala Gly Ala Val Ile Leu Gly Lys Leu Gln Gln Thr

    130                 135                 140

Glu Gly Ala Phe Ala Asp His His Pro Glu Ile Thr Ala Pro Val Asn

145                 150                 155                 160

Pro Trp Gly Ala Gln Leu Trp Pro Gly Ala Ser Ser Ser Gly Ser Gly

                165                 170                 175

Val Ala Thr Ala Ala Gly Leu Cys Phe Gly Ser Leu Gly Thr Asp Thr

            180                 185                 190

Gly Gly Ser Ile Arg Phe Pro Ser Ala Ala Asn Gly Ile Thr Gly Leu

        195                 200                 205

Lys Pro Thr Trp Gly Arg Val Ser Arg His Gly Ala Phe Glu Leu Ala

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Asp His Ile Gly Pro Met Ala Arg Ser Ala Ala Asp Ala

225                 230                 235                 240

Ala Ala Met Leu Ala Ala Ile Ala Gly Ala Asp Pro Leu Asp Pro Thr

                245                 250                 255

Ala Ser Gln Cys Ser Val Pro Asp Tyr Leu Ala Met Met Thr Arg Gly

            260                 265                 270

Phe Ser Gly Leu Arg Leu Gly Met Asp Arg Gln Trp Ala Leu Asp Gly

        275                 280                 285

Val Asp Ala Pro Ser Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala Leu Ala Val Ala

    290                 295                 300

Gln Arg Leu Gly Ala Ser Val Gln Glu Val Arg Phe Pro Asp Ala Thr

305                 310                 315                 320

Gln Ala Val Gln Asp Trp Pro Ala Leu Cys Ala Val Glu Thr Ala Val

                325                 330                 335

Ala His Gly Ala Thr Phe Pro Ala Arg Arg Glu Ala Tyr Gly Pro Gly

            340                 345                 350

Leu Ala Gly Leu Ile Asp Leu Gly Leu Gly Leu Ser Ala Thr Asp Tyr

        355                 360                 365

Gln Arg Leu Leu Leu Arg Arg Ala Asp Phe Thr Gly Arg Val Arg Ala

    370                 375                 380

Leu Phe Ala Gln Val Asp Leu Leu Leu Val Pro Ala Thr Ala Phe Ala

385                 390                 395                 400

Ala Pro Thr Leu Gln Arg Met Ala His Phe Gly Ser Asp Ala Glu Leu

                405                 410                 415

Phe Ser Gly Met Leu Arg Tyr Thr Cys Pro Phe Asp Leu Thr Gly Ser

            420                 425                 430

Pro Thr Ile Thr Leu Pro Gly Gly Arg Thr Pro Glu Gly Ala Pro Val

        435                 440                 445

Ala Phe Gln Phe Val Ala Pro Asp Phe Arg Glu Asp Leu Leu Val Arg

    450                 455                 460

Ala Gly Trp Ala Phe Gln Gln Ala Thr Asp Trp His Arg Gln His Pro

465

Ala Ala＊＊＊

<210>3

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>为了酶蛋白的纯化和酶蛋白的固定化而设计

<400>3

1            5

His His His His His His

Claims (22)

1.一种包括酰胺水解酶基因(DAM基因)的核苷酸序列的表达载体，其中DAM基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列。

2.权利要求1所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)获取含有DAM基因的Delftia tsuruhatensis(CCTCCNo.M205114)的基因组DNA；

2)根据R-型异构体立体选择性酰胺水解酶基因的核苷酸序列设计引物A和引物B；

3)以Delftia tsuruhatensis基因组DNA为摸板，加入引物A、引物B、Taq DNA聚合酶以及dNTP混合物进行PCR扩增；

4)PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA胶回收试剂盒回收1.4kb大小的PCR扩增片断(DAM基因)；

5)将PCR扩增到的DAM基因与克隆载体pUC118连接，形成克隆载体pUC118-DAM；

6)pUC118-DAM和表达载体分别用限制性内切酶消化，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含DAM基因的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体的构建方法，其中第6步所述的表达载体选自质粒、粘粒或噬菌体。

4.权利要求3所述的表达载体的构建方法，其中质粒选自pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen Inc.，Madison，Wis.)，pQE(Qiagen)，pSE420或pLEX(Invitrogen)，但不仅限于这些质粒。

5.根据权利要求3-4任一项所述的表达载体的构建方法，其中所述质粒为pET。

6.根据权利要求3-5任一项所述的表达载体的构建方法，其中所述质粒为pET24a(+)。

7.根据权利要求4-6任一项所述的表达载体的构建方法，其中表达载体上的操纵子可选自乳糖操纵子、半乳糖操纵子、或色氨酸操纵子，其中优选LacI操纵子。

8.根据权利要求4-6任一项所述的表达载体的构建方法，其中载体上的启动子可用λpL启动子、Tet启动子、和T7启动子，其中优选T7启动子。

9.一种用于表达DAM基因工程菌株，其特征是是将权利要求1所述的表达载体转化到宿主微生物中得到基因工程菌株。

10.根据权利要求9所述的基因工程菌株，其特征是宿主微生物为大肠杆菌。

11.根据权利要求9-10任一项所述的基因工程菌株，其特征是该基因工程菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/pET24a(+)-DAM。

12.一种制备具有R-型异构体立体选择性的重组酰胺水解酶的方法，其特征在于用权利要求9-11任一项所述的基因工程菌在诱导剂条件下发酵来生产重组R-型选择性酰胺水解酶。

13.根据权利权利要求12的酰胺水解酶的制备方法，其中诱导剂选自IPTG或α-乳糖；发酵、诱导温度范围控制在20-42℃之间；培养模式可选自批发酵培养或流加培养；培养基选自蛋白胨、酵母粉、氯化钠或其它基础盐培养基。

14.根据权利要求12-13任一项的方法制备得到的重组酰胺水解酶。

15.根据权利要求14所述的重组酰胺水解酶，所述重组酰胺水解酶选自a)由SEQ ID No.2所述的氨基酸序列组成的蛋白质；或b)具有与SEQ ID No.2所述的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列组成的蛋白质；或c)在SEQ ID No.2所述的氨基酸序列前端或后端加上一段SEQ ID No.3所述的氨基酸序列组成的蛋白质。

16.根据权利要求12-13任一项的方法所得到的酰胺水解酶用于水解酰胺类化合物的用途。

17.根据权利要求16所述的用途，所述酰胺类化合物选自(R，S)-型酰胺类化合物或手性酰胺类化合物。

18.根据权利要求17所述的用途，其中(R，S)-型酰胺类化合物选自R/S-2，2-二甲基环丙甲酰胺。

19.根据权利要求17所述的用途，其中手性酰胺类化合物选自超级他汀侧链R-(4)-酰胺-3-羟基丁酸乙酯。

20.一种R/S-2，2-二甲基环丙甲酰胺的拆分方法，该方法用权利要求14-15任一项所述的酰胺水解酶作为拆分剂。

21.根据权利要求20所述的R/S-2，2-二甲基环丙甲酰胺的拆分方法，拆分温度在20-55℃之间。

22.根据权利要求20所述的R/S-2，2-二甲基环丙甲酰胺的拆分方法，拆分pH在6-10之间。

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