CN103911404B - 一种拉科酰胺化学酶法制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种拉科酰胺化学酶法制备方法。该方法以消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺为原料，将具有D型酰胺水解酶活性的湿菌体或粗酶液，或者具有D型酰胺水解酶活性和酰胺消旋酶活性的混合湿菌体或混合粗酶液与消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺溶液混合，一定温度、pH下进行酶转化反应，酶转化后产物为（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸，（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸乙酰化后在DCC催化下与苄胺缩合成终产物拉科酰胺。本发明技术路线具有制备工艺简洁、反应条件温和、收率高、成本低和产品光学纯度高的优点。
Description
一、技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种拉科酰胺化学酶法制备方法。
二、背景技术
拉科酰胺（Lacosamide），化学名称为（R）-2-乙酰氨基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺，是德国SchwarzPharma公司研发的治疗癫痫和神经性疼痛的药物。2008年9月欧盟批准比利时UCB公司的拉科酰胺片上市，用于辅助治疗16岁以上有或无继发性癫痫发作患者的癫痫部分发作。2008年10月美国FDA批准拉科酰胺上市，作为一种辅助药物与其他药物联合用于治疗癫痫部分性发作，商品名为Vimpat。拉科酰胺的药物模型显示其具有放大阻止钠通道失活及调节钠通道对调节蛋白2（CRMP-2）关闭反应双重调节作用，这两点都属于癫痫镇静剂（AEP）的作用机理。拉科酰胺主要作用表现在选择性的增强钠通道减慢失活，这一点能使得神经活动的阈值正常化，降低神经元细胞的活动性，以控制神经细胞避免过度兴奋。
目前文献报道的拉科酰胺合成方法主要包括四种：
（1）将D-丝氨酸经苄氧羰基保护，碘甲烷甲基化，酯水解，酰胺化，去保护及N-乙酰化制得拉科酰胺，总收率约为46%；或酰胺化后甲基化，总收率52%。此法D-丝氨酸原料成本高，反应步骤较多，反应条件苛刻，副产物多，异构体纯度97%以上，异构体纯度达不到要求，必须经柱色谱纯化；
（2）N-叔丁氧羰基-D-丝氨酸经硫酸二甲酯甲基化，氯甲酯异丁酯活化后生成（R）-2-N-叔丁氧羰基氨基-3-甲氧基-N-苄基丙酰胺，再经脱保护，N-乙酰化制得拉科酰胺，总收率约为5%。此法总收率低，不宜工业化生产；
（3）D-丝氨酸首先与醋酐反应生成乙酰化D-丝氨酸，乙酰化D-丝氨酸再与苄胺缩合成相应的中间产物，最后该中间产物在氧化银催化下被碘甲烷甲基化生产终产物拉科酰胺，此方法合成路线简单，但试剂昂贵，不适于工业化生产，且产品部分外消旋（约25%）；
（4）D-丝氨酸甲酯在二乙氧基三苯膦催化下环合生成（R）-氮丙啶-2-甲酸甲酯，再经N-乙酰化，开环，酯水解，最后与苄胺反应制得，总收率10%。此法操作繁琐，成本高，总收率低。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种高效、环保及低成本制备拉科酰胺的方法。消旋的2-氨基-3-甲氧基丙酰胺在具有D型酰胺水解酶活性的苍白杆菌CICC10363或NCCB10026作用下，一半底物转化成（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸；或者在具有D型酰胺水解酶活性的苍白杆菌CICC10363或NCCB10026和具有酰胺消旋酶活性的无色杆菌CICC10400共同作用下完全转化成（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸。（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸乙酰化后生成（R）-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸。（R）-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）作用下与苄胺缩合成（R）-2-乙酰氨基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺，即拉科酰胺。
本发明反应路线如下：
本发明可以通过以下技术方案实现：
拉科酰胺化学酶法制备方法，其步骤为：
（1）具有D型酰胺水解酶活性的苍白杆菌CICC10363或NCCB10026在培养基中培养产生含有D型酰胺水解酶的湿菌体或具有酰胺消旋酶活性的无色杆菌CICC10400在培养基中培养产生含有酰胺消旋酶的湿菌体；
（2）将含有D型酰胺水解酶的湿菌或者粗酶液与一定浓度的消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺混合，再加入表面活性剂，在25～55℃，pH6～11条件下进行酶促反应1～5h，反应产物为（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸和（S）-2-氨基-3-甲氧基丙酰胺混合物或将含有D型酰胺水解酶的湿菌体或者粗酶液与含有酰胺消旋酶的湿菌体或粗酶液按照1:0.5～1:1.5重量比混合，再将上述混合湿菌体或者混合粗酶液与一定浓度的消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺混合，再加入表面活性剂，在25～55℃，pH6～11条件下进行酶促反应1～10h，反应产物为（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸；
（3）（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸在碱性条件下与酰化试剂反应，产物为（R）-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸；
（4）（R）-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在缩合催化剂作用下，与苄胺缩合生成（R）-2-乙酰氨基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺，即拉科酰胺。
上述步骤（1）中具有D型酰胺水解酶活性的苍白杆菌CICC10363为中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）公开保藏菌种，苍白杆菌NCCB10026为荷兰细菌保藏中心（NCCB）公开保藏菌种；具有酰胺消旋酶活性的无色杆菌CICC10400为中国工业微生物菌种保藏中心公开保藏菌种。所述的培养基碳源采用葡萄糖或甘油或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为5～50g/L；氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L。
上述步骤（2）中的表面活性剂为吐温-80或十六烷三甲基溴化铵或聚乙二醇辛基苯基醚，其浓度为0.05～1.0g/L。
上述步骤（3）中的酰化试剂为醋酐。
上述步骤（4）中的缩合催化剂为N，N-二环己基碳二亚胺。
本发明拉科酰胺制备方法与现有的方法相比有益效果是：
（1）本发明采用含D型酰胺水解酶的苍白杆菌CICC10363或NCCB10026和含酰胺消旋酶活性的无色杆菌CICC10400，在优选的培养基中培养可以分别高效表达D型酰胺水解酶和酰胺消旋酶，使得酶法合成重要中间产物（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸有较高的催化速度和转化率，其中在D型酰胺水解酶作用时（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酰胺的转化率可达到95%，在D型酰胺水解酶和酰胺消旋酶共同作用时消旋的2-氨基-3-甲氧基丙酰胺的转化率可达到98%，同时消除了反应中消旋问题，光学纯度达到98.8%；
（2）本发明采用廉价的消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺代替价格昂贵的D-丝氨酸或D-丝氨酸衍生物为原料，大幅度降低拉科酰胺生产成本，具有良好的经济效益和社会效益；
（3）酶催化反应效率高，化学酶法制备拉科酰胺工艺过程绿色环保，反应条件温和，没有使用贵重金属催化剂，也没有使用碘甲烷或硫酸二甲酯等有毒危险的甲基化试剂，有利于降低生产成本和环境保护；
（4）反应过程中避免了氨基保护与去保护步骤，缩短反应进程，降低反应成本，避免了在氨基保护与去保护过程中不必要的产物损失及消旋现象；
四、具体实施方式
以下实施例仅用于对本发明进行具体说明，但本发明的保护范围并不仅限于以下实施例中。
实施例一：单酶转化反应
将1000mL苍白杆菌CICC10363发酵液离心得到20g湿菌体，加入到1000mL转化液中，转化液中含有60g消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺（质量浓度6%），1.0g/L吐温-80，pH11，55℃酶促反应5h。反应结束后将转化液4000r/min离心15min除去菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH5.0，加入5克活性炭，搅拌升温到70℃脱色，抽滤；脱色液真空浓缩析出沉淀，冷却结晶，真空抽滤，分别用纯水淋洗，80%乙醇搅洗，烘干即得到（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸22.1g，（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酰胺转化率约为80%，ee=98.1%。
实施例二：单酶转化反应
将1000mL苍白杆菌NCCB10026发酵液离心得到19g湿菌体，加入到1000mL转化液中，转化液中含有60g消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺（质量浓度6%），0.05g/LCTAB，pH6，25℃酶促反应1h。反应结束后将转化液4000r/min离心15min除去菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH5.0，加入5克活性炭，搅拌升温到70℃脱色，抽滤；脱色液真空浓缩析出沉淀，冷却结晶，真空抽滤，分别用纯水淋洗，80%乙醇搅洗，烘干即得到（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸13.8g，（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酰胺转化率约为50%，ee=97.7%。
实施例三：单酶转化反应
将1000mL苍白杆菌CICC10363发酵液离心得到22g湿菌体，加入到1000mL转化液中，转化液中含有60g消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺（质量浓度6%），0.2g/LOP，pH9，45℃酶促反应4.5h。反应结束后将转化液4000r/min离心15min除去菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH5.0，加入5克活性炭，搅拌升温到70℃脱色，抽滤；脱色液真空浓缩析出沉淀，冷却结晶，真空抽滤，分别用纯水淋洗，80%乙醇搅洗，烘干即得到（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸26.3g，（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酰胺转化率约为95%，ee=98.5%。
实施例四：双酶转化反应
将20g苍白杆菌CICC10363湿菌体和20g无色杆菌CICC10400湿菌体加入到1000mL转化液中，转化液中含有60g消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺（质量浓度6%），0.5g/L吐温-80，pH11，55℃酶促反应5h。反应结束后将转化液4000r/min离心15min除去菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH5.0，加入5克活性炭，搅拌升温到70℃脱色，抽滤；脱色液真空浓缩析出沉淀，冷却结晶，真空抽滤，分别用纯水淋洗，80%乙醇搅洗，烘干即得到（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸46.6g，底物总转化率约为84%，ee=98.2%。
实施例五：双酶转化反应
将20g苍白杆菌NCCB10026湿菌体和10g无色杆菌CICC10400湿菌体加入到1000mL转化液中，转化液中含有60g消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺（质量浓度6%），0.05g/LCTAB，pH6，25℃酶促反应1h。反应结束后将转化液4000r/min离心15min，除去菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH5.0，加入5克活性炭，搅拌升温到70℃脱色，抽滤；脱色液真空浓缩析出沉淀，冷却结晶，真空抽滤，分别用纯水淋洗，80%乙醇搅洗，烘干即得到（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸33.3g，底物总转化率约为60%，ee=98.8%。
实施例六：双酶转化反应
将20g苍白杆菌CICC10363湿菌体和30g无色杆菌CICC10400湿菌体加入到1000mL转化液中，转化液中含有60g消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺（质量浓度6%），1.0g/LOP，pH9，45℃酶促反应4.5h。反应结束后将转化液4000r/min离心15min除去菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH5.0，加入5克活性炭，搅拌升温到70℃脱色，抽滤；脱色液真空浓缩，析出沉淀，真空抽滤，分别用纯水淋洗，80%乙醇搅洗，烘干即得到（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸54.4g，底物总转化率约为98%，ee=98.5%。
实施例七：乙酰化反应
称取24g（R）-2-氨基-3-甲氧基丙酸倒入500mL烧杯，分批加入100mL2mol/L氢氧化钠溶液搅拌溶解，调pH10-11，用冰水浴控制酰化反应液在10℃左右。然后将22mL醋酐缓慢滴加到该溶液中，边滴加边强烈搅拌，同时用6mol/L氢氧化钠溶液保持其pH9-10，在滴加完后继续搅拌反应4h。然后使用6mol/L盐酸调上述反应液pH2，加入1g活性炭，搅拌升温到60℃脱色，抽滤；脱色液真空浓缩、冷却结晶，过滤得到白色固体物，低温下蒸馏水洗涤过滤物2次后60℃烘干，得到（R）-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸共31.8g，转化率约为90%，ee=98.7%。
实施例八：缩合反应
往反应瓶中加入400mL二氯甲烷，搅拌下加入16.1g（R）-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸，将20gDCC溶于100mL二氯甲烷中，DCC被滴加到上述反应瓶中，保持温度0～5℃，滴加完成后保持温度10～20℃反应2h后，加入12.5g苄胺，于25～30℃反应5h，薄板层析判断反应是否完全。反应结束后过滤，滤液用100mL蒸馏水洗涤三次，合并有机层，浓缩至干后，加入30mL氯仿-120mL甲基叔丁基醚混合溶剂重结晶，得到（R）-2-乙酰氨基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺，即拉科酰胺白色固体粉末18.8g，转化率约为75.3%，ee>98%，熔点为142-143℃，（c=1mol/L，MeOH）。
Claims (1)
1.一种拉科酰胺化学酶法制备方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)具有D型酰胺水解酶活性的苍白杆菌CICC10363或NCCB10026在培养基中培养产生含有D型酰胺水解酶的湿菌体，或具有酰胺消旋酶活性的无色杆菌CICC10400在培养基中培养产生含有酰胺消旋酶的湿菌体；培养基碳源采用葡萄糖或甘油或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为5～50g/L；氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L；
(2)将含有D型酰胺水解酶的湿菌或者粗酶液与质量浓度60g/L的消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺混合，再加入表面活性剂，在25～55℃，pH6～11条件下进行酶促反应1～5h，反应产物为(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸和(S)-2-氨基-3-甲氧基丙酰胺混合物；或将含有D型酰胺水解酶的湿菌体或者粗酶液与含有酰胺消旋酶的湿菌体或粗酶液按照1:0.5～1:1.5重量比混合，再将上述混合湿菌体或者混合粗酶液与质量浓度60g/L的消旋2-氨基-3-甲氧基丙酰胺混合，再加入表面活性剂，在25～55℃，pH6～11条件下进行酶促反应1～10h，反应产物为(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸；表面活性剂为吐温-80或十六烷三甲基溴化铵或聚乙二醇辛基苯基醚，其浓度为0.05～1.0g/L；
(3)(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸在碱性条件下与酰化试剂醋酐反应，产物为(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸；
(4)(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在缩合催化剂N，N-二环己基碳二亚胺作用下，与苄胺缩合生成(R)-2-乙酰氨基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺，即拉科酰胺。
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