CN104561142A - (r)-3-羟基戊二酸单酯的生物合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及(R)-3-羟基戊二酸单酯的生物合成方法。更具体的，本发明提供了一种利用腈水解酶及其基因工程菌将(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯水解成(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法，所述的(R)-3-羟基戊二酸单酯是氟伐他汀、瑞舒伐他汀及匹伐他汀等他汀类药物的关键中间体。本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。

Description

(R)-3-羟基戊二酸单酯的生物合成方法

技术领域

本发明属于生物催化制备药物中间体和绿色化学领域，涉及一种表达腈基水解酶的基因工程菌，以及利用基因工程菌、培养物、或者加工制品来催化(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯水解成(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法。主要涉及一种(R)-3-羟基戊二酸单酯及其类似物的生物制备方法。 

背景技术

心血管疾病是危害人类健康最常见、最严重的疾病之一，血脂异常是动脉粥样硬化、冠心病以及其它心脑血管疾病的重要危险因素，调脂药可降低这些疾病的发生率和死亡率，对心血管疾病的防治产生积极的作用和深远的影响。在诸多调脂药中，他汀类药物是目前公认的效果最好的一种，具有选择性好、疗效高、副作用少的特点，可明显降低由高胆固醇血症引起的动脉粥样硬化和冠心病的发病率和死亡率，是目前治疗高胆固醇血症的主导药物。临床常用的药物有：洛伐他汀(Lovastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、阿托伐他汀(Atovastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)、匹伐他汀(Pitavastatin)(如化学方程式1)(A.Liljeblad，A.Kallinen，L.T.Kanerva.Biocatalysis in the Preparation of the Statin Side Chain.Current Organic Synthesis，2009，6，362-379)。 

化学方程式1几种他汀类药物的分子结构式 

由他汀类药物的结构可以看出，氟伐他汀(Fluvastatin)、瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)、匹伐他汀(Pitavastatin)等都有相同的侧链，而这一产生药效的侧链都可以从(R)-3-羟基戊二酸单酯化合物合成而得(化学方程式2)(P.L.Brower，D.E.Butler，C.F.Deering，T.V.Le，A.Millar，T.N.Nanninga，B.D.Roth.The Synthesis of(4R-cis)-1，1-Dimethylethyl-6-cyanomethyl-2，2-dimethyl-1，3-dioxane-4-acetate，a Key Intermediate for the Preparation of CI-981，a Highly Potent，Tissue Selective Inhibitor of HMG-CoA Reductase.Tetrahedron Lett.，1992，33(17)：2279-2282)。 

化学方程式2他汀类药物关键中间体的合成 

目前文献报道的合成(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法主要有以下几种： 

(一)手性试剂拆分法 

手性试剂拆分法是利用一种光学纯的手性化合物与外消旋化合物反应形成非对映异构体盐或共价衍生物，然后再将其还原为光学纯的化合物(如化学方程式3，化学方程式4)，常用的手性试剂有(R)-扁桃酸盐(T.Konoike，Y.Araki.Practical Synthesis of Chiral Synthons for the Preparation of HMG-CoA Reductase Inhibitors.J.Org.Chem.1994，59，7849-7854)、(R)-1-苯乙醇(T.Rosen，C.H.Heathcock.Total Synthesis of(+)-Compactin.J.Am.Chem.SOC.1985，107，3731-3733)、(S)-1-(1-萘基)乙醇(P.D.Theisen and C.H.Heathcock.Improved Procedure for Preparation of Optically Active 3-Hydroxyglutarate Monoesters and 3-Hydroxy-5-oxoalkanoic Acids.J.Org.Chem.1988，53，2374-2378.)、(S)-1-苯乙胺(D.S.Karanewsky，M.F.Malley，J.Z.Gougoutas.Practical Synthesis of an Enantiomerically Pure Synthon for the Preparation of Mevinic Acid Analogues.J.Org.Chem.1991，56，3744-3747T.Rosen，M.Watanabe，C.H.Heathcock.A Convenient Assay for the Optical Purity of Scheme I Monomethyl3-Hydroxypentanedioate.J.Org.Chem.1984，49，3657-3659)。 

化学方程式3利用(S)-1-苯乙胺拆分法 

化学方程式4利用(R)-扁桃酸盐拆分法 

(二)生物去对称法 

R.Ohrlein等(R.G.Baisch.Chemo-Enzymatic Approach to Statin Side-Chain Building Blocks.Adv.Synth.Catal.2003，345，713-715)用α-胰凝乳蛋白酶催化3-甲氧乙酰基戊二酸二乙酯选择性水解(如化学方程式5)，生成相应的手性单乙酯，产率为94％，对映体过量值高达98％。 

化学方程式5利用α-胰凝乳蛋白酶选择性酯水解 

南极假丝酵母脂肪酶B(CAL-B)能选择性水解3-羟基戊二酸二乙酯生成(R)-3-戊二酸单乙酯(E.E.Jacobsen，B.H.Hoff，A.E.Moen，T.Anthonsen.Enantioselective enzymatic preparation of chiral glutaric monocarboxylic acids and amides.J.Mol.Cat.B Enzym.，2003，21，55-58.)。此外，Lim报道了酯酶CLS-BC-14011能高对映选择性的得到3-羟基戊二酸二乙酯生成(R)-3-戊二酸单乙酯(K.-M.Lim.Chiral Intermediate and Process for the Production Thereof.WO2003/087112，2003.)(化学方程式6)，底物浓度达到3.6mol/L，产物ee值为99.5％，收率为99.7％。 

化学方程式6利用脂肪酶选择性酯水解 

我们发现目前存在的工艺中，尚没有利用腈水解酶及其基因工程菌将(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯水解成(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法。本方法利用基因工程重组菌中表达的腈水解酶进行催化，一步水解羧酸并产生一分子的氨，该过程反应条件比较温和，不需要辅因子的参与， 反应效率极高，具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。 

发明内容

本发明中提供了一种产腈水解酶的基因工程菌，以及利用该酶或菌体制备(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法。 

本发明中所述的产腈水解酶的基因工程菌，具体的构建方法是：对拟南芥的NIT1(NM_180680.2)、NIT2(NM_114298.2)、NIT3(NM_114300.3)基因进行密码子优化后全合成相对应序列，并在基因两端加上Nco I和Hind III酶切位点，并将合成的基因构建到相应表达载体中，然后表达载体转化入受体菌，即分别得到所述的产腈水解酶的基因工程菌N1、N2、N3；并对基因工程菌进行发酵培养，实现了腈基水解酶的高效异源表达。 

本发明中所述产腈水解酶的基因工程菌所用到的载体系列包括：pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。 

本发明中所述的产腈水解酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。 

在本发明中，由质粒转化宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本发明所述的腈水解酶。任何一种人工的或天然的含有合适碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能满足宿主菌体的生长并且能够表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能满足宿主生长并能产生相应活性的腈水解酶即可。 

用于制备本发明的(R)-3-羟基戊二酸单酯及其类似物中的腈水解酶可以是上述腈水解酶基因工程重组菌的培养物，也可以是通过将培养基离心后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得到的提取物、破碎液、或者对提取物腈水解酶进行的分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化提取物或者加工制品的固定化制品。 

本发明还涉及全细胞或固定化细胞转化合成(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法，所述方法为： 

将所述产腈水解酶的基因工程菌经种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳糖或二者混合物诱导培养一定时间，离心收集菌体，加入pH值为6.0～10.0的缓冲液，底物100～280g/L，20～40℃，200rpm下转化2～24小时，反应完全后经离心、酸化、萃取、脱溶后得到(R)-3-羟基戊二酸单酯，收率大于85％。 

也可以通过常规固定化细胞的方法将收集的菌体细胞固定化，把固定化细胞填充到填充柱中。然后将(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的缓冲液溶液，在适当温度下，以一定流速流经填充柱，然后将接收液酸化、萃取、脱溶后得到(R)-3-羟基戊二酸单酯，收率为95％。 

反应中适用的介质可以是水或含有不同缓冲液的水介质，其所用的缓冲液可以是水中加入一种或几种适当磷酸盐、Tris盐酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐等。 

本发明所述的pH值优选能够保持在腈水解酶可以表达其活性的pH范围内，优选pH值为6.0～10.0。反应温度优选保持在腈水解酶可以表达其活性的温度范围内，优选20～40℃。 

本发明所述的底物浓度没有限制，通常底物为100～280g/L，考虑到反应效果，底物浓度优选大于等于100g/L，更优选大于等于180g/L，并且优选小于等于200g/L。同时为了提高生产效率，可以在反应时批次添加底物。反应产物也可以在反应结束后分离或通过原味分离的方法不断的将产物移走。 

本发明所述的催化剂是静息细胞时，其用量为1～100g/L；当使用的催化剂是固定化细胞时，其用量为5～500g/L；当催化剂是细胞提取物时，其用量为5～100mg/L。 

本发明所述的腈水解酶可以提供催化(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯及其类似物的方法，其结构通式为： 

R¹＝Me，Et，Pr，i-Pr，n-Bu，s-Bu，i-Bu，t-Bu，Bn，etc 

R²＝H，Ac，TMS，TBS，etc 

其特征在于所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯为甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、苄酯、叔丁酯等，优选甲酯及乙酯。 

具体实施方式

以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。 

实施例1：高表达基因工程菌的获得 

全基因合成由上海旭冠公司完成。 

根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)的腈水解酶NIT1(NM_180680.2)、NIT2(NM_114298.2)、NIT3(NM_114300.3)，并对其进行密码子优化，以期使植物基因能够在大肠杆菌表达宿主中进行表达，序列见附表。并在基因两端加上Nco I和Hind III酶切位点，构建到pET-28a(+)载体中，得到基因工程菌N1、N2、N3。 

将制备得到的重组载体用常规方法转化入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami以构建重组腈基水解酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好。以目的蛋白表达量不低于20％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。 

实施实例2基因工程菌的培养和静息细胞的制备 

挑取平板上单菌落接种至5ml含相应抗生素的发酵培养基中，培养15h左右作为种子液，按照1％的接种量接种至含600ml的发酵培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导10h以上，以8000rpm离心培养液收集菌体。 

实施实例3利用静息细胞N2催化(R)-3-羟基戊二酸乙酯单次水解 

取1.0g N2的静息细胞重悬于20mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.2)，加入(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(5.32g，34mmol)，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，TLC显示反应完全(展开剂：5％甲醇/二氯甲烷，磷钼酸显色)，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH1，分别用50mL乙酸乙酯萃取合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸乙酯5.59g，收率94％。 

实施实例4利用静息细胞N2催化(R)-3-羟基戊二酸乙酯批次水解 

取1.0g上述静息细胞N2(湿重)重悬于20mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.2)，加入(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(4.7g，30mmol)，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，TLC显示反应完全(展开剂：5％甲醇/二氯甲烷，磷钼酸显色)，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH1，分别用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸乙酯(4.57g，87％)。1H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ4.16-4.24(1H，m)，4.03(2H，q，J＝7.0Hz)，2.43-2.50(1H，m)，2.26-2.41(3H，m)，1.16(3H，t，J＝7.2Hz)。 

取以上回收的静息细胞重悬于20mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.2)，加入(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(4.7g，30mmol)，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，TLC显示反应完全(展开剂：5％甲醇/二氯甲烷，磷钼酸显色)，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH1，分别用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸乙酯(4.53g，86％)。 

实施实例5利用静息细胞N1催化(R)-3-羟基戊二酸乙酯单次水解 

取1.0g N1的静息细胞重悬于20mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.2)，加入(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(2.83g，18mmol)，然后于30℃、200rpm的摇床反应12小时，TLC显示反应完全(展开剂：5％甲醇/二氯甲烷，磷钼酸显色)，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH1，分别用50mL乙酸乙酯萃取合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸乙酯2.85g，收率90％。 

实施实例6利用静息细胞N3催化(R)-3-羟基戊二酸乙酯单次水解 

取1.0g N3的静息细胞重悬于20mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.2)，加入(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(3.14g，20mmol)，然后于30℃、200rpm的摇床反应12小时，TLC显示反应完全(展开剂：5％甲醇/二氯甲烷，磷钼酸显色)，离心回收静息细胞，收集上层清液，6M盐酸酸化至pH1，分别用50mL乙酸乙酯萃取合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸乙酯3.10g，收率88％。 

实施实例7丙烯酰胺固定化细胞法催化(R)-3-羟基戊二酸乙酯水解 

将8％的丙烯酰胺和0.2％的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺加入到50ml磷酸缓冲液中，然后加入细胞浓度为40g/L的菌悬液，混合均匀，搅拌下滴入120μl的10％过硫酸铵和30μl四甲基乙胺，4℃保存12小时，然后用蒸馏水清洗，切成粒径约为4mm*4mm*4mm的正方形小块，备用。 

取13.3g上述固定化细胞(约0.5g湿细胞)倒入10mL磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.2)中，加入(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(2g，12mmol)，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，TLC显示反应完全(展开剂：5％甲醇/二氯甲烷，磷钼酸显色)，倒出反应液，换新的反应液进行反应，后处理时用6M盐酸酸化至pH1，分别用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸乙酯。固定化细胞重复使用六次，活性没有明显变化，反应转化率仍保持在95％以上。 

实施实例8海藻酸钠固定化细胞法催化(R)-3-羟基戊二酸乙酯水解 

将实施实例2中制得的静息细胞中加入用生理盐水重悬的细胞浓度约300g/L的菌悬液，然后加入3％(W/V)海藻酸钠水溶液(预先加热煮沸溶解后冷却)混合均匀。取长度为4mm*6mm的乳胶管，在一端采用7号注射器针头作为滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至100滴/min。在搅拌的条件下，混合液逐滴滴入4％CaCl₂溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值≤0.5mm，固定化5小时后，用纱布滤出，制得直径约为5mm凝胶珠，固定化后细胞酶活为固定化菌体的99％。 

取11.2g上述固定化细胞(约0.5g湿细胞)倒入10mL Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0)中，加入(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(2g，12mmol)，然后于30℃、200rpm的摇床反应6小时，TLC显示反应完全(展开剂：5％甲醇/二氯甲烷，磷钼酸显色)，倒出反应液，换新的反应液进行反应，后处理时用6M盐酸酸化至pH1，分别用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸乙酯。固定化细胞重复使用十次，活性没有明显变化，反应转化率仍保持在95％以上。 

实施实例9海藻酸钠固定化细胞连续柱式反应 

先取一根高径比为30的有机玻璃珠作为填充柱，把实施实例5中的固定化细胞填充到填 充柱中。然后将浓度为180g/L(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0)溶液，在温度为30℃条件下，以流速为0.8ml/min流经填充柱，在此反应条件下，(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯转化率为99％，产率为95％，固定化细胞转化480h后，细胞催化活性没有明显下降，即固定化细胞的使用寿命为480h。得到的产物溶液先用6M的盐酸调至pH至1，然后用乙酸乙酯萃取，得到的有机相干燥，减压旋蒸，得到产物。 

Claims (9)

1.一种生物催化合成(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法，其特征在于通过腈水解酶催化(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯得到(R)-3-羟基戊二酸单酯，包括如下步骤： 

a)将腈水解酶基因工程菌在发酵培养基中，进行扩增培养，并进行诱导产生目的蛋白后，进行离心收集菌体； 

b)将收集的重组菌体细胞或对重组菌体细胞进行固定化处理后得到的固定化细胞悬浮在缓冲液中，加入一定量的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯或其底物类似物，在适当条件下反应一定时间； 

c)反应中止后从反应体系中收集上层清液，盐酸酸化，并用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得到目标产物。 

2.如权利要求1所述的方法，a)步骤其特征在于所述的腈水解酶是通过基因组数据分析获得NIT1，NIT2，NIT3腈水解酶基因序列，经密码子优化后，进行全基因合成得到相应的基因并构建到质粒载体中，得到NIT1、NIT2、NIT3腈水解酶的高表达基因工程菌N1、N2、N3。 

3.如权利要求1所述的a)步骤产腈水解酶的基因工程菌，其特征在于所述的供体菌所含有腈水解酶基因来自植物十字花科或茄科。 

4.如权利要求1所述的a)步骤产腈水解酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的质粒为下列之一：pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列；高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。 

5.如权利要求1所述的方法中b)步骤中，其中所述酶催化剂是完整的微生物细胞、微生物细胞萃取物、硫酸铵粗纯的酶、精纯后纯度较高的酶、或固定在载体上的酶催化剂形式的腈水解酶；所述全细胞催化剂可自由选N1、N2、N3或其中任意两种或三种的组合。 

6.如权利要求1所述的转化方法b)步骤，其特征在于所述的反应条件：温度为20～40℃，优选25～30℃；所用的缓冲液为磷酸盐、Tris盐酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐等；所用的缓冲液的pH为6.0～10.0，优选pH为8.0；反应时间为2～24小时，优选3～6小时。 

7.如权利要求1所述的转化方法b)步骤，所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯及其类似物为(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯为甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、苄酯、叔丁酯等，优选甲酯及乙酯，它们的结构通式为： 

R¹=Me，Et，Pr，i-Pr，n-Bu，s-Bu，i-Bu，t-Bu，Bn，etc 

R²=H，Ac，TMS，TBS，etc。 

8.如权利要求1所述的转化方法b)步骤，其特征在于所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯及其类似物的浓度为100～280g／L，优选180g／L。 

9.如权利要求1所述的b)步骤固定化方法，其特征在于使用一种或多种化学试剂以使腈水解酶和载体交联和／或不溶化，其特征在于化学试剂选自： 

-聚氮杂环丁烷， 

-聚乙烯亚胺， 

-聚酰胺， 

-异氰酸酯聚合物， 

-海藻酸盐， 

-k-角叉菜胶， 

-胺类， 

-醛类， 

-羧酸， 

-异氰酸酯。