CN109609582A - 一种微生物催化去消旋化制备l-草铵膦的方法 - Google Patents
一种微生物催化去消旋化制备l-草铵膦的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109609582A CN109609582A CN201910045109.XA CN201910045109A CN109609582A CN 109609582 A CN109609582 A CN 109609582A CN 201910045109 A CN201910045109 A CN 201910045109A CN 109609582 A CN109609582 A CN 109609582A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ammonium
- glufosinate
- deracemization
- xylose lysine
- lysine bacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 7
- GBWARTHIRIVTNI-PJHQGUKWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2r,3s,4r)-2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GBWARTHIRIVTNI-PJHQGUKWSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 241001589484 Lysinibacillus xylanilyticus Species 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- QLULGSLAHXLKSR-UHFFFAOYSA-N azane;phosphane Chemical compound N.P QLULGSLAHXLKSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 2
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 claims 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 7
- FBWXUNCARHZYFO-UHFFFAOYSA-N C(=O)=C(C(=O)O)CCP(=O)(OCO)O Chemical compound C(=O)=C(C(=O)O)CCP(=O)(OCO)O FBWXUNCARHZYFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 6
- 238000004176 ammonification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 2
- 238000007833 oxidative deamination reaction Methods 0.000 abstract description 2
- -1 hydroxymethyl phosphono Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 4
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- CHDRYQOHTORLAX-UHFFFAOYSA-N (3-amino-3-cyanopropylidene)-(hydroxymethyl)-oxidophosphanium Chemical compound NC(C#N)CC=P(=O)CO CHDRYQOHTORLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000001357 Cystobacterineae bacterium Species 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002246 beta-d-glucopyranose Drugs 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008236 heating water Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000001476 phosphono group Chemical group [H]OP(*)(=O)O[H] 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000009333 weeding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种微生物催化去消旋化制备L‑草铵膦的方法，该方法以DL‑草铵膦为原料，解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX‑2全细胞中的D‑氨基酸氧化酶催化D‑草铵膦氧化脱氨为2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸，L‑草铵膦保留。细胞中共表达的氨基酸脱氢酶催化2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸原位还原氨化为L‑草铵膦，从而实现DL‑草铵膦的完全去消旋化。制备的L‑草铵膦无其他副产物，总收率>70％，光学纯度>99％。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地说，涉及一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XX-2用于制备L-草铵膦的方法。
背景技术
草铵膦是一种手性除草剂，有L-和D-两种对映体。其中，L-草铵膦除草活性是消旋体的2倍。草铵膦以L-构型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于降低使用成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。
L-草铵膦的制备方法主要包括化学法和生物法。相比于化学法，生物法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化的优点，是实现L-草铵膦工业化生产最具潜力的方法。
生物法包括生物不对称合成法和生物拆分法。
生物不对称合成法主要包括氨基酸脱氢酶法和转氨酶法。氨基酸脱氢酶法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，草铵膦脱氢酶/甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌为生物催化剂，在辅酶NADP+和辅底物甲酸铵存在下制备L-草铵膦(ZL 201710195364.3，CN108588045A)。该方法中不仅L-草铵膦收率低，光学纯度不高，而且辅酶NADH需再生，难以在工业化生产中应用。转氨酶法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，在氨基供体如丙氨酸存在的条件下，利用离体的转氨酶或体外表达转氨酶的细胞催化底物与氨基供体发生转氨反应，得到L-草铵膦，转化率85-100％，ee>99.9％(ZL201610045121.7，CN 108660167A)。由于转氨化是一个可逆反应，存在两个L-氨基酸和两个α-酮酸的反应平衡，分离难度大。
生物拆分法主要包括以N-乙酰-DL-草铵膦为原料，以含羧肽酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，制备L-草铵膦。D-N-乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分(CN 108690854 A)以及以2-氨基-4-(羟基甲基磷酰基)丁腈为原料的腈水解酶拆分法(ZL201310201317.7)。生物拆分法的理论收率为50％。通常情况下，生物拆分法需要以衍生的DL-草铵膦为原料，涉及无效对映体的化学消旋和循环拆分。
夏仕文等(CN105567780A)公开了一种L-草铵膦的酶-化学催化去消旋化制备方法。该方法采用固定化D-氨基酸氧化酶-钯碳/甲酸铵组合体系实现DL-草铵膦去消旋化，L-草铵膦收率>90％，ee>99％，但制备成本偏高。杨立荣等(CN107502647 A)公开了一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，该方法以DL-草铵膦为原料，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，L-草铵膦因不参与反应而被完全保留；而2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸又被氨基酸脱氢酶催化还原为L-草铵膦，进而实现了DL-草铵膦的原位去消旋化，得到的L-草铵膦中无其他副产物，产品总收率>99％，光学纯度可超过99％。
开发一种简捷、高效、低廉、绿色的生物催化去消旋化方法将是今后生产L-草铵膦的重要突破口和发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物催化去消旋化制备L-草铵膦的方法。采用“一锅煮”反应方式，以未经衍生的DL-草铵膦为原料，利用微生物细胞中的D-氨基酸氧化酶对映选择性催化DL-草铵膦中的D-对映体氧化脱氨为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，L-草铵膦完全保留。利用细胞中共表达的氨基酸脱氢酶体系将2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸原位还原氨化为L-草铵膦，通过生物氧化脱氨-生物还原氨化实现DL-草铵膦的去消旋化。
技术路线如下：
本发明中的解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M2015520。
本发明所需的D-氨基酸氧化酶/氨基酸脱氢酶体系来源于解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2。解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2的培养条件为：
斜面培养基：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠、15g/L琼脂，pH6.0。
种子培养基：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，pH6.0。
产酶培养基：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，3g/L D-草铵膦(诱导剂)，pH6.0。
斜面培养：将木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2接种于斜面培养基上，30℃培养24～64小时；
种子培养：将斜面培养的菌株，无菌条件下用接种环接种于5ml发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时，制得种子液；
摇瓶培养：以10％接种量将种子液接入新鲜的产酶培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时。
菌体收集：摇瓶培养的菌液在4℃、8000转/分条件下离心5分钟，收集菌体，用磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH8.0)洗涤2次，得到湿菌体。
一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XX-2在去消旋化制备L-草铵膦中的应用，即利用解木糖赖氨酸芽孢杆菌催化去消旋化制备L-草铵膦的方法。按照上述方法将木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2接入灭菌后的产酶培养基中，培养后离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，菌体重新悬浮在磷酸盐缓冲液中，制成一定细胞浓度的菌悬液，加入DL-草铵膦，恒温摇床振荡反应，直至D-草铵膦反应完全。
本发明中解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2细胞可回收循环使用。
作为优选，磷酸盐缓冲液浓度为100mmol/L，pH8.0。
作为优选，细胞浓度为20～50g/L(干重)。
作为优选，DL-草铵膦终浓度为20～200mmol/L。
作为优选，反应温度为20～40℃，振荡速度为150～200转/分，反应时间为24～48小时。
与现有的L-草铵膦制备方法相比，本发明提出的微生物催化去消旋制备L-草铵膦的方法具有以下优点：1)工艺简单。生物催化氧化脱氨-生物催化还原氨化在同一反应体系中进行。高浓度DL-草铵膦不经衍生，直接作为D-氨基酸氧化酶的反应底物。2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸不经分离，直接原位转化为L-草铵膦。2)分离过程简单。产物流中仅含L-草铵膦，只需采用简单的浓缩、结晶方法即可以高的收率和高的光学纯度实现L-草铵膦的分离。3)成本低廉。微生物细胞可回收重复使用多次，有效降低了过程成本。
附图说明
图1为草铵膦两个光学异构体的高效液相色谱检测图(柱前手性衍生-HPLC法)，其中，保留时间6.793min为D-草铵膦，保留时间7.582min为L-草铵膦。
图2为实施例3中DL-草铵膦微生物催化去消旋化后的高效液相色谱检测图(柱前手性衍生-HPLC法)，其中，保留时间7.573min为L-草铵膦。
具体实施方式
以下所述实施例仅为本发明构思下的基本说明，根据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均属于本发明保护的范围。
下列实施例中的催化反应采用高效液相色谱(HPLC)监测并对反应物和产物进行分析。柱前手性衍生-HPLC条件为：反应上清液中加入4g/L三乙胺/乙腈溶液和2g/L 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)/乙腈溶液，30℃下水浴加热20min。离心，采用HPLC测定上清液中的D-和L-草铵膦浓度，根据校正曲线计算转化率。色谱柱：C18柱；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液/甲醇(51:49，v/v)，pH 2.5；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：25℃。
实施例1：菌体培养
解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2在摇瓶中发酵培养。以10％接种量将种子液接入灭菌后的产酶培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时。菌液在4℃、8000转/分条件下离心5分钟，收集菌体，用磷酸钠缓冲液((100mmol/L，pH8.0)洗涤2次。菌体重新悬浮在磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中备用。
实施例2：D-草铵膦的立体反转
反应液(10ml)含100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)，100mmol/L D-草铵膦，500mg(干重)解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2细胞。30℃、180rpm下恒温摇床振荡反应。每隔一定时间取样，离心去除细胞收集上清液，采用柱前手性衍生-HPLC测定上清液中L-和D-草铵膦浓度。24h后，D-草铵膦反应完全，反应液中L-草铵膦的生成浓度为66mmol/L，ee 99.8％。
实施例3：DL-草铵膦去消旋化
反应液(10ml)含100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)，200mmol/L DL-草铵膦，500mg(干重)解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2细胞。30℃、180rpm下恒温摇床振荡反应。每隔一定时间取样，离心去除细胞收集上清液，采用柱前手性衍生-HPLC测定上清液中L-和D-草铵膦浓度。24h后，D-草铵膦反应完全，反应液中L-草铵膦的生成浓度为166mmol/L，ee99.5％。
实施例4：细胞循环使用
反应体系同实施例3。实施例3中的细胞离心后，加入反应体系中，30℃、180rpm下摇床振荡反应28h后，柱前手性衍生-HPLC监测D-草铵膦反应完全，L-草铵膦生成浓度为160mmol/L，ee 99.4％。
实施例5：细胞循环使用
反应体系同实施例3。实施例4中的细胞离心后，加入反应体系中，30℃、180rpm下摇床振荡反应32h后，柱前手性衍生-HPLC监测D-草铵膦反应完全，L-草铵膦浓度为156mmol/L，ee 99.5％。
实施例6：细胞循环使用
反应体系同实施例3。实施例5中的细胞离心后，加入反应体系中，30℃、180rpm下摇床振荡反应40h后，柱前手性衍生-HPLC监测D-草铵膦反应完全，L-草铵膦的生成浓度为150mmol/L，ee 99.3％。
实施例7：细胞循环使用
反应体系同实施例3。实施例6中的细胞离心后，加入反应体系中，30℃、180rpm下摇床振荡反应48h后，柱前手性衍生-HPLC监测D-草铵膦反应完全，L-草铵膦的生成浓度为140mmol/L，ee 99.2％。
Claims (6)
1.一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XX-2在去消旋化制备L-草铵膦中的应用。
2.权利要求1所述解木糖赖氨酸芽孢杆菌在去消旋化制备L-草铵膦中的应用，其特征在于：包括利用解木糖赖氨酸芽孢杆菌催化去消旋化制备L-草铵膦的方法，将木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2接入灭菌后的产酶培养基中，培养后离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，菌体重新悬浮在磷酸盐缓冲液中，然后加入DL-草铵膦，恒温摇床振荡反应，直至D-草铵膦反应完全。
3.根据权利要求2所述解木糖赖氨酸芽孢杆菌在去消旋化制备L-草铵膦中的应用，其特征在于：所述恒温摇床振荡反应的反应体系为，磷酸盐缓冲液终浓度为100mmol/L，DL-草铵膦终浓度为20～200mmol/L，干重20～50g/L的解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2细胞。
4.根据权利要求2或3所述解木糖赖氨酸芽孢杆菌在去消旋化制备L-草铵膦中的应用，其特征在于：所述恒温摇床振荡反应的反应温度为20～40℃，振荡速度为150～200转/分，反应时间为24～48小时。
5.根据权利要求2所述解木糖赖氨酸芽孢杆菌在去消旋化制备L-草铵膦中的应用，其特征在于：所述产酶培养基组成为：牛肉膏3g/L，酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，D-草铵膦3g/L，pH6.0；产酶培养条件为：温度30℃，转速180转/分，时间48小时。
6.根据权利要求1或2或3所述解木糖赖氨酸芽孢杆菌在去消旋化制备L-草铵膦中的应用，其特征在于：解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2细胞可回收循环使用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910045109.XA CN109609582B (zh) | 2019-01-17 | 2019-01-17 | 一种微生物催化去消旋化制备l-草铵膦的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910045109.XA CN109609582B (zh) | 2019-01-17 | 2019-01-17 | 一种微生物催化去消旋化制备l-草铵膦的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109609582A true CN109609582A (zh) | 2019-04-12 |
| CN109609582B CN109609582B (zh) | 2021-11-09 |
Family
ID=66016932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910045109.XA Active CN109609582B (zh) | 2019-01-17 | 2019-01-17 | 一种微生物催化去消旋化制备l-草铵膦的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109609582B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110885803A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-03-17 | 浙江工业大学 | 重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备l-草铵膦中的应用 |
| CN111019917A (zh) * | 2019-05-23 | 2020-04-17 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 |
| CN111321193A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-06-23 | 浙江工业大学 | 一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备l-草铵膦的方法 |
| CN111424060A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-17 | 重庆邮电大学 | 一种同时制备d-脯氨酸和l-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法 |
| CN111621482A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-04 | 浙江工业大学 | 一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法 |
| CN112391438A (zh) * | 2019-08-13 | 2021-02-23 | 四川利尔生物科技有限公司 | 一种l-草铵膦或其盐的生产方法 |
| WO2021115256A1 (zh) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | 四川利尔生物科技有限公司 | 经修饰的daao酶及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102363756A (zh) * | 2011-10-08 | 2012-02-29 | 广东省微生物研究所 | 一种赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sp.）GY32及其应用 |
| CN105316257A (zh) * | 2015-10-23 | 2016-02-10 | 重庆邮电大学 | 一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌及其制备α-酮酸的方法 |
| CN107502647A (zh) * | 2017-09-15 | 2017-12-22 | 浙江大学 | 一种生物酶法去消旋化制备l‑草铵膦的方法 |
| CN109182200A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-01-11 | 浙江工业大学 | 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌zjb-17006及其应用 |
-
2019
- 2019-01-17 CN CN201910045109.XA patent/CN109609582B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102363756A (zh) * | 2011-10-08 | 2012-02-29 | 广东省微生物研究所 | 一种赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sp.）GY32及其应用 |
| CN105316257A (zh) * | 2015-10-23 | 2016-02-10 | 重庆邮电大学 | 一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌及其制备α-酮酸的方法 |
| CN107502647A (zh) * | 2017-09-15 | 2017-12-22 | 浙江大学 | 一种生物酶法去消旋化制备l‑草铵膦的方法 |
| CN109182200A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-01-11 | 浙江工业大学 | 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌zjb-17006及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ZHU LIN等: "Directed evolution of leucine dehydrogenase for improved efficiency of L-tert-leucine synthesis", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 * |
| 张雨晴: "氨基酸脱氢酶/醇脱氢酶的制备及应用", 《万方学位论文》 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111019917A (zh) * | 2019-05-23 | 2020-04-17 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 |
| CN112391438A (zh) * | 2019-08-13 | 2021-02-23 | 四川利尔生物科技有限公司 | 一种l-草铵膦或其盐的生产方法 |
| CN112391438B (zh) * | 2019-08-13 | 2023-01-13 | 四川利尔生物科技有限公司 | 一种l-草铵膦或其盐的生产方法 |
| CN110885803A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-03-17 | 浙江工业大学 | 重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备l-草铵膦中的应用 |
| WO2021115256A1 (zh) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | 四川利尔生物科技有限公司 | 经修饰的daao酶及其应用 |
| CN111321193A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-06-23 | 浙江工业大学 | 一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备l-草铵膦的方法 |
| CN111321193B (zh) * | 2020-03-18 | 2020-11-10 | 浙江工业大学 | 一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备l-草铵膦的方法 |
| WO2021184557A1 (zh) * | 2020-03-18 | 2021-09-23 | 浙江工业大学 | 一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备l-草铵膦的方法 |
| CN111424060A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-17 | 重庆邮电大学 | 一种同时制备d-脯氨酸和l-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法 |
| CN111424060B (zh) * | 2020-03-30 | 2023-03-28 | 重庆邮电大学 | 一种同时制备d-脯氨酸和l-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法 |
| CN111621482A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-04 | 浙江工业大学 | 一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法 |
| CN111621482B (zh) * | 2020-06-30 | 2022-04-29 | 浙江工业大学 | 一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109609582B (zh) | 2021-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109609582A (zh) | 一种微生物催化去消旋化制备l-草铵膦的方法 | |
| CN106191170B (zh) | 一种酶法制备三磷酸腺苷的方法 | |
| JP2589693B2 (ja) | Ｌ−２−アミノー４−（ヒドロキシメチルホスフイニル）−酪酸の製造法 | |
| JP3710497B2 (ja) | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 | |
| FI95397B (fi) | Menetelmä (S)-ketoprofeenin valmistamiseksi | |
| CN112143764B (zh) | 一种生物酶催化制备布瓦西坦中间体化合物的方法 | |
| CN111304106A (zh) | 一株克劳氏芽孢杆菌及使用其生产四氢嘧啶的方法 | |
| US11085059B2 (en) | Methylopila sp. and use thereof in selective resolution preparation of (S)-α-ethyl-2-oxo-1-pyrrolidineacetate | |
| CN110885803A (zh) | 重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备l-草铵膦中的应用 | |
| CN104726478A (zh) | 表达精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN104131041A (zh) | 一种α-酮戊二酸的生产方法 | |
| CN108715881B (zh) | 一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法 | |
| CN104962540A (zh) | 一种腈水解酶、编码基因、载体及应用 | |
| CN114657164B (zh) | (s)-转氨酶及其应用 | |
| JPH0353889A (ja) | ４‐ハロ‐３‐ヒドロキシブチロニトリルの製造法 | |
| HU216652B (hu) | Eljárás amidszármazékok előállítására mikroorganizmusok felhasználásával | |
| CN101285085B (zh) | 一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法 | |
| CN112779233B (zh) | 重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备l-草铵膦中的应用 | |
| CN113151378B (zh) | 制备烟酸或其衍生物的核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸单核苷酸的方法、酶组合物及应用 | |
| CN112176007B (zh) | 一种氨基醇手性中间体的制备方法 | |
| JPH06506343A (ja) | エナンチオマー性２−アルカン酸類の製造方法 | |
| JP2000217590A (ja) | 光学活性シアノヒドリンの製造方法 | |
| JP2696127B2 (ja) | 光学活性な２―ヒドロキシカルボン酸の製造法 | |
| CN105154487A (zh) | 氨基转移酶和异构酶在催化形成L-allo-Ile中的应用 | |
| CN110004081A (zh) | 一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（＋）γ-内酰胺的菠萝泛菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240122 Address after: Room 304, Building 4, South District, Agricultural Science Institute, No. 28 Sangyuan Road, Quanfu Street, Licheng District, Jinan City, Shandong Province, 250100 Patentee after: Shandong Zhongxin Kenong Life Technology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 400039 16-4, No. 73, Keyuan 1st Road, Jiulongpo District, Chongqing Patentee before: CHONGQING HUIJIAN BIOTECH Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| TR01 | Transfer of patent right |