JPH06506343A

JPH06506343A - エナンチオマー性２−アルカン酸類の製造方法

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Publication number: JPH06506343A
Application number: JP3516964A
Authority: JP
Inventors: アントン，　デイビツド・レロイ; フアロン，　ロバート・ドナルド; リン，　ウイリアム・ジヨセフ; ステイーグリツツ，　バリー; ウイツターホルト，　ビンセント・ジエラード
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1990-09-20
Filing date: 1991-09-13
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2016-04-09
Also published as: ES2085487T3; EP0549710A1; DK0549710T3; DE69117521D1; EP0683235A1; JP3154721B2; EP0683145A1; EP0549710B1; ATE134706T1; WO1992005275A1; DE69117521T2; HK122196A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】エナンチオマー性２−アルカン酸類の製造方法発明の分野ニトリルからエナンチオマー性アミド中間生成物を介しての対応する２−アルカン酸のエナンチオマーへのエナンチオ選択性の生物学的触媒作用を受ける加水分解。

技術の現状一般式Ｘ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨの多くの農業化学品および薬品がラセミ体またはジアステレオマー混合物として最近市販されている。多くの場合には、生理学的効果は唯一のエナンチオマー／ジアステレオマーから誘導されており、他のエナンチオマー／ジアステレオマーは不活性であったりまたは有害でさえある。エナンチオマー類を分離するための化学的および酵素的技術が高いエナンチオマー純度の化学品を製造するためのますます重要な手段になってきている。

ＷＯ３６１０７３８６は、対応するアミノニトリルとエナンチオ選択性ニトリラーゼとのエナンチオマー性混合物からのアミノ酸類またはアミノ酸アミド類の製造および生じた光学的に活性なアミノ酸またはアミノアミドのその後の回収方法を開示している。この刊行物は本発明を示唆しておらず、その理由はそれは異なる微生物を使用しており且つ記されている加水分解は立体特異性でなく立体選択性であるためである。

ＥＰＡ３２６．４８２は、対応するラセミ体アミドの微生物性加水分解による例えば２−（４−クロロフェニル）−３−メチル酪酸の如きアリール−２−アルカン酸類の立体特異性製造を開示している。ＥＰＡ３２６．４８２中に開示されている微生物には、プレヴイバクテリウムおよびコリネバクテリウムの構成員が包含される。該方法は有機溶媒を用いずにパッチ式に行われ、そして酵素活性物質は１回使用された後に廃棄されていた。ＥＰＡ３２６．４８２の実施例中のデータは、Ｓ−アミドの３５−６０％が未転化のまま残っていたことを示している。

製造されたＳ−酸のエナンチオマー過剰量は９２−９７％でありた。

Ｕ、　Ｓ、　４．３６６．２５０は、一般的なニトリルヒドラターゼおよびＬ− 立体特異性アミダーゼを有するバクテリアを用いる対応するラセミ体アミノニトリルからのし一アミノ酸類の製造方法を開示している。微生物はバシラス、バクテリウム、ミクロコツカスおよびプレヴイバクテリウムから選択される。

ＥＰＡ３５６，９１２は、微生物または酵素の存在下での対応するラセミ体ニトリルの加水分解による光学的に活性な２−置換されたカルボン酸類の製造を開示している。使用される微生物は、ここで見いだされたものがニトリル類を酸類のアミド先駆体に転化させることは示唆していない。

ＥＰＡ３４８．９０１は、式ｉのラセミ体α−置換されたニトリルまたはアミドをアルカリゲネス、シュードモナス、ロドシュードモナス、コリネバクテリウム、アシネトバクタ−、バシラス、ミコバクテリウム、ロドコッカスおよびカンジダ群から選択された微生物で処理することによる式ｉｉの光学的に活性なα−置換された有機酸の製造方法を開示している：ＨＨ［式中、Ｒ３およびＲ１はそれぞれハロゲン、ヒドロキシ、置換されているかもしくは未置換のアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシまたは複素環を表し、但し条件としてＲ１およびＲ１は異なりでおり、そしてＸはニトリルまたはアミド基である］ヤマモト（Ｙａｍａｓｏｔｏ）他、Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、旦旦（１０）、３１２５−９．１９９０も参照のこと。

ＥＰＡ３３０．５２９は、対応するラセミ体アリール−２−プロピオン酸アミドからの式１ｉｉＡｒ−ＣＨ−ＣＯＯＨＡｒは置換されているもしくは未置換の単環式または多環式の芳香族またはへテロ芳香族基を表す］のアリール−２−プロピオン酸のＳ−エナンチオマーの製造用のプレヴイバクテリウムおよびコリネバクテリウムの使用方法を開示している。

Ｕ、Ｓ、４，８００．１６２は、多相および抽出酵素膜を使用する例えばエステル類、アミド類、カルボン酸類、アルコール類およびアミン類の如き光学的に活性な化合物のラセミ体混合物の分割を開示している。

発明の要旨本発明は、ラセミ体アルキルニトリルを中間生成物であるアミドを介して対応するＲ−またはＳ−アルカン酸へ転化させるための生物学的に触媒作用を受ける方法におけるある種の個別および組み合わせ工程に関するものである。出発ニトリルは、Ｉ（Ｒ，Ｓ）［式中、Ａは ■ ＾−Ｉ　Ａ４　＾４＾−８Ａ−９＾−１０Ａ・１１からなる群から選択され、Ｒ１はＣＩ−Ｃ４アルキルであり、ＲｘはＨまたはＯＨであり、Ｒ”はＨ，ＣＩ、０ＣＦ２Ｈ，（ＣＨｓ）ｚｃＨｃＨｔ、Ｈｚ　Ｃ＝　Ｃ（ＣＨｓ　）　ＣＨ！　Ｎ　Ｈ−であり、そしてＲ４はＣ１またはＦである］である。

への好適な意味は、Ａ−１、Ａ−５、Ａ−９、Ａ−１０およびＡ−１１である。

Ａ−１の好適な意味は、Ｒ３が群ＣＩ、（ＣＨｓ）ｔｃＨｃＨｚ、から選択されるものである。’Ｒ１に関する好適な意味は、ＣＨｓおよびＣＨ（ＣＨｓ）＊である。

本発明の方法の工程ｉにおけるアミドの製造は、式Ｉのニトリル類のＲ，Ｓ混合物を実質的に反対のエナンチオマーを含んでいないＲ−またはＳ−アミドに立体特異的に転化させる生物学的物質とＩを接触させることを含んでいる。式■のニトリルの混合されたＲ−およびＳ−エナンチオマーの分割後に、本発明の方法の工程ｉｉによる式ＩＩの対応する酸への転化を行う。

ＩＩアミド中間生成物はＡ−Ｃ（Ｒ’ＸＲリ−ＣＯＮＨｚである。本発明は、ラセミ化（工程１ｉｉ）およびその後の工程ｉｉから元の反応器への連続的方法における未転化のＲ−またはＳ−二トリルの再循環にも関するものであり、ここでＲｚはＨである。連続的方法では、ラセミ体アルキルニトリル出発反応物をニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ酵素を同時に含有しているかまたはそれらからなっている生物学的物質と接触させるかまたは連続的に最初にアミドへ（工程ｉ）そして次に酸へ（工程ｉｉ）進行させる。アルキル酸は連続的に除去され、そして副生物であるＲ−またはＳ−アルキルニトリル（ここでＲ１はＨである）をラセミ化しそして連続的方法で再循環させ、そこでそれを追加のアルキルニトリルと組み合わせそして酵素（類）と接触させてアルキルアミドを製造しそして次に酸を製造する。

本発明は特に、工程ｉで使用される生物学的物質（微生物またはそれらの変異体もしくは突然変異体、或いは酵素）により、並びに生物学的触媒作用（工程ｉ）と鉱酸加水分解（工程ｉｉ）または既知のアミダーゼ酵素（工程１ｉｉ）との組み合わせにより、特徴づけられている。ニトリルラセミ化は、実質的量の水の不存在下でのそして最も好適には例えばメタノール、エタノール、トルエン、ジオキサンなどの如き非水性溶媒の存在下での強塩基性イオン交換樹脂の使用により特徴づけられている。

本発明の記載を簡単にするために、有用であると見いだされている酵素を参照しながら該方法を説明しよう。

好適な工程ｉの酵素は下記の微生物中で見いだされるものを含んでいる：シュードモナス種、例えばピュチダ、アラレオファシェンス、モレクセラ種、セレイシア、例えばセレイシア・リクエファシエンス。これらの酵素は単離または生合成することができそしてそのままで使用されるが、適当な微生物（類）を使用することの方が一般的にさらに簡便である。

ニトリルのＲ，Ｓ−混合物を水和しそして対応するＲ−またはＳ−エナンチオマー性の酸に転化させるためのこの方法では、工程ｉは立体特異性ニトリルヒドラターゼの製造用に適している培地の存在下での微生物の培養により得られた微生物中で生じる立体特異性ニトリルヒドラターゼ酵素の作用により達成される。この培地は酵素誘発剤としてニトリル類またはアミド類を含むことができ、または誘発剤の不存在下で本質的に酵素を生成するシュードモナス・ピュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐの場合には成長用の適当な窒素源（例えば塩化アンモニウム）のみを含むことが必要である。このようにして得られたニトリルヒドラターゼをＲ−またはＳ−ニトリル類に加えて作用させて対応するＲ−またはＳ−アミド類を生成する。工程ｉｉでは、Ｒ−またはＳ−アミドを鉱酸またはアミダーゼ酵素により対応するＲ−またはＳ−酸に加水分解する。

この二工程方法がＲ−またはＳ−酸およびＳ−またはＲ−ニトリルをそれぞれ生成する。偏光性ニトリルおよび酸を最初に中和および溶媒抽出により分離する。

次に、偏光性ニトリルをＲ，Ｓニトリルの混合物にラセミ化し、それを工程ｉに記されている立体特異性ニトリルヒドラターゼの作用により再びＲ−またはＳ− アミドに立体特異的に加水分解することができる。

ニトリルヒドラターゼをニトリルに作用させるための一方法は、酵素を生成する微生物から酵素を集めそして酵素を酵素調合物として生物学的に認識された方法で使用することである。

本発明はまた、ラセミ体ニトリルを対応するエナンチオマー性Ｒ−またはＳ−アミドに立体特異的に転化させるシュードモナス種３Ｌ−Ｇ−１−５−１ａ、シュードモナス種２Ｇ−８−５−１ａＳＰ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐおよびＰ、アラレオファシェンスＭＯＢＣ２−１中に存在しているかもしくはそれらから誘導される生物学的物質またはそれらの変異体もしくは突然変異体にも関するものである。

発明の詳細本開示の概念では、「立体特異性反応」または「立体特異性ニトリルヒドラターゼ」という語はＲ−およびＳ−エナンチオマー類に関するエナンチオマー比（Ｅ）により定義されている。Ｅは２種のエナンチオマ−類の反応速度の比に対応している。Ｅが高いすなわち７より大きい時には反応は立体特異性であり、モしてＥが７より小さい時には反応は立体選択性である。好適な反応はＥが８．５より高いものであり、そして最も好適な反応は１０以上であるものである。

略語ＣＰＩＮ　−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチロニトリルＣＰＩＡｍ−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチルアミドＣＰＩＡ　−２−（４−クロロフェニル）−３−メチル酪酸ＩＢＣＮ　−２−（４−インブチルフェニル）−プロピオニトリルＩＢＡｍ−２−（４−インブチルフェニル）−プロピオアミドＩＢＡＣ−２−（４−インブチルフェニル）−プロピオン酸（イブプロフェン）ＮＰＣＮ　−２−（６−メドキシー２−ナフチル）−プロピオニトリルＮＰＡｍ −２−（６−メドキシー２−ナフチル）−プロピオアミドＮＰＡＣ−２−（６− メドキシー２−ナフチル）−プロピオン酸ＨＰＬＣ−高性能液体クロマトグラフィーＧＣ−ガスクロマトグラフィーＤＭＳ　Ｏ−ジメチルスルホキシド工程ｉ本発明で使用される微生物はシュードモナス、モラクセラ、およびセレイシア属に属している。代表的菌株には、Ｐ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐ１モラクセラ種３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ−１、Ｐ、ビュチダ１３−５３−ＡＣＮ−２ａ、シュードモナス種３Ｌ−Ｇ−１−５−１ａ、およびセレイシア・リクエファシエンスＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３が包含される。

これらの菌株はブダペスト条約の下でＮＲＲＬ　（北部地方研究センター、米国農業省、１８１５ノース・ユニバージティー・ストリート、ペオリア、イリノイ州）に供託されており、そして下記の受け入れ番号がついている：Ｐ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２ＰＳＮＲＲＬ−Ｂ−１８６６８モラクセラ種３Ｌ −Ａ−１−５−１ａ−１、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６７１Ｐ、ビュチダ１３−５８− ＡＣＮ−２ａ、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６６９シユ一ドモナス種３Ｌ−Ｇ−１−５− １ａ、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６７０セレイシア・リクエファシエンスＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３、ＮＲＲＬ−Ｂ−Ｐ、ビュチダ２Ｄ−１１−５−１ｂ、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８２０シユ一ドモナス種２Ｄ−１１−５−１ｃ、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８１９シユ一ドモナス種２Ｇ−８−５−１ａ、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８３３Ｐ、アラレオファシェンスＭＯＢ　Ｃ２−１、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８３４゜上記の菌株はテキサス州オレンジで集められた土壌から単離された。

下記の修飾培地（ＰＲ基底培地）を用いる標準的な増菌工程を使用した。

ＰＲ基底培地　呈乙旦ＫＨｚＰＯ＜　ｓ、８５クエン酸ナトリウム　０．２２５ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，５ＦｅＳＯ４・７Ｈ！ＯＯ，０５ＦｅＣ１＊・４ＨｔＯＯ，００１５ＣＯＣＩ！・６Ｈ！ＯＯ，０００２ＭｎＣｈ・４ＨｔＯＯ，０００１ＺｎＣ１ｚ　Ｏ，００００７Ｈ，Ｂｏ、　０．００００６２ＮａＭｏＯｎ・２Ｈ！ＯＯ，００００３６ＮｉＣ１ｚ・６ＨｚＯＯ，００００２４ＣｕＣＬ１２ＨｚＯＯ，００００１７ビオチン　０．００００１葉酸　０．００００５ピリドキシン・ＨＣＩ　０．００００２５リボフラビン　０．００００２５ニコチン酸　０．００００２５パントテン酸　０．０００２５ビタミンＢ１□　０．０００００７Ｐ−アミノ安息香酸　０．０００２５上記の増重用のＰＲ基底培地に対して下記の添加および／または修飾５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐ　（±）−２−メチルゲルタロニトリル　７．２３０琥珀酸二ナトリウムル３Ｌ−ＡＬＬ−５−１ａ−１（±）−２−メチルゲルタロニトリル　５．６３０ｇグルコ−スル３Ｌ−Ｇ−１−５−１ａ１３−５Ｓ−＾ＣＮ−２ａ　アセトニトリル　７．２３０ｇ琥珀酸二ナトリウムル菌株を最初に増菌ニトリル上での成長およびアンモニア生成を基にして選択した。単離物をバクト・プレイン・ハート・インフュージョン・アガー上の反復通過およびその後の増菌ニトリルからのアンモニア生成に関するスクリーニングにより精製した。

精製された菌株を、マイクロバイアル■Ｄインコーポレーテッドにューワーク、プラウエア州）からのマイクロバイアルＩＤソフトウェア・アンド・ニアローブ・ライブラリー（型３，０）を用いる標準的方法（ムカワヤ（Ｍｕｋａｗａｙａ）他、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、　１９８９．２７：２６４０− ４６）後のメチルエステル類の膜脂肪酸分析並びに以下で数値がつけられている標準的な細菌学、生理学および生化学試験を基にして同定した。

ダラム菌株　陰性　陰性細胞形態学　棒状　棒状鞭毛　書名性　書名性ポリシアニン　陰性　陰性ビオベルジン　陽性　陽性アルギニンジヒドロラーゼ　陽性　陽性４１℃における成長　陰性　陰性ゼラチン加水分解　陰性　陰性脱窒素作用　陰性　陰性澱粉加水分解　陰性　陰性単独炭素源としての使用ブチルアミン　陽性　陽性イノシトール　陽性　陰性シトラコネート　陽性　陰性り一タルトレート　陰性　陽性属種　シュードモナス・　シュードモナス・ビュチダ　ビュチダダラム菌株　陰性　陰性細胞形態学　棒状　球棒状オキシダーゼ　陽性　陽性サイトレート上の成長　陽性　陽性尿素加水分解　陽性　陰性デキストロースの好気性酸化　陽性　陰性キシロースの好気性酸化　陽性　陰性インドール製造　陰性　陰性硫化水素製造　陰性　陰性脱窒素作用による窒素製造　陰性　陰性アルギニンジヒドロロアーゼ　陽性　陰性デキストロース発酵　陰性　陰性運動性　試験しなかった　陰性属種　シュードモナス種群４モラクセラ種ニトリル加水分解活性を試験するために、Ｌｏｇ／Ｌのグルコースを含んでいるＰＲ基底培地を使用して細胞物質を成長させた。この培地には２５ｍＭの（±）−２−メチルゲルタロニトリル（５Ｂ −ＭＧＮ−２Ｐ、３Ｌ−Ｇ−１−５−１ａ）または２５ｍＭの１．４−ジシアノブタン（３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ−１，１３−５３−ＡＣＮ−２ａ）または２５ｍＭのアセトアミド（全菌株）が補足されていた。Ｐ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ− ２ｐもニトリルまたはアミ下の代わりに２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌまたは（ＮＨＪｚＳＯａを含んでいるニトリルまたはアミド誘発剤の不存在下で成長させた。１０ｍＬ容量の完全培地に０．１ｍＬの凍結貯蔵培養物（全菌株）を接種した。２５Ｏｒｐｍのシェーカー上での室温（２２−２５℃）における−夜の成長後に、２ −Ｌフラスコ中で１０ｍＬの接種物を９９０ｍＬの新しい培地に加えた。細胞を室温において培地中で発泡を起こすのに充分高い速度で撹拌しながら一夜成長させた。細胞を遠心により採取し、０．８５％食塩水で１回洗浄し、そして濃縮された細胞ペーストを直ちに一７０℃の凍結器中に貯蔵のために入れた。約８０％の水を含有している解凍された細胞ペーストを全てのニトリル加水分解生転化で使用した。

上記の立体特異性ニトリル−加水分解用微生物は、上記の増菌培養物を介して単離された微生物の供託物からの代表的な菌株であった。増重実験から単離されたニトリル−加水分解用微生物の立体特異的および立体選択的活性を表１に示す。

表１増重　ＣＰＩＮ　ＮＰＣＮ’　ＩＢＣＮ微生物１　菌株　ニトリル”　Ｒ／Ｓ″ 　Ｅ’　Ｒ／ＳｔＥ’　Ｒ／ＳｅＥ’Ｐ、ピュチダ　１３−５Ｓ−＾ＣＮ−２ａ　ＡＣＮ　９０／１０　＞１０　０／１００　＜７　１０／９０　＞１０Ｐ、ビュチダ　５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐ　ＭＧＮ　７７／３３　＞１０　４３１５７　＞７　３０／７０　＞１０シュードモナス種　２０−５−ＭＧＮ−ＩＰ　ＭＧＮ　主転化なし０／１００　＜７　主転化なしモラクセラ種　３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ −Ｉ　ＭＧＮ　５ｇ／４２　＞１０　５０１５０　＜７　４４１５６　＞１０シュードモナス種　３Ｌ−Ｂ−２−６−ＩＰ　ＡＣＮ　主転化なし５９／４１　＜７　主転化なしシュードモナス種　３Ｌ−Ｇ−２−５−１ａ　ＡＣＮ　５５／４５＞１０　０／１００＜７　５０１５０＞１０シュードモナス種　２Ｏ−５−３ＢＮ−１ａ　ＳＢＮ　主転化なし主転化なし主転化なし未分類　３Ｌ−Ｇ−１− ２−１ａ　ＭＧＮ　主転化なし３９／６１　＞７　主転化なしシュードモナス種　３Ｌ−Ｇ−１−５−１ａ　ＭＧＮ　主転化なし８３／１７１０　主転化なしシュードモナス種　５＾−ＭＧＮ−ＩＰ　ＭＧＮ　主転化なしＮＴ”　ＮＴ”　主転化なしシュードモナス種　５Ｂ−＾ＣＮ−ＩＰ　ＡＣＮ　５８／４２　＞１０　４７１５３　＞１０　４９１５１　＞１０シｘ　Ｆモｆ　２種２Ｇ−８−５− １４ＣＰ　主転化なし９２／８　＞１０　主転化なしＰ、アラレオファシェンス　ＭＯＢ　Ｃ２−Ｉ　ＰＢＮ　６９／３１　＞１０　１９／８１　＞１０　０／１００　＞１Ｏ８，リクエファシエンス　ＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３　ＰＰＡ　５４／４ｇ　＞１０　２１／７９　＜７　主転化なしシュードモナス種　２Ｇ−８−５ −２４ＣＰ　主転化なし６８／３２　＜７　主転化なしシュードモナス　２Ｄ− １１−５−Ｉ　ＮＡＮ　６５／３５　＞１０　４４１５６　＞１０　０／１００　＞１０シュードモナス種’　２Ｄ−１１−５−１ｃ　ＮＡＮ　主転化なし１００１０８．８　主転化なしシュードモナス種　２Ｏ−５−３ＢＮ−１ｂ　ＳＢＮ　主転化なしＦｒ０＜７　１０／９０　＞１０°明細書中に記されている如き脂肪酸分析による菌株同定ゝ＾ＣＮ＝アセトニトリル、ＭＧＮ＝２−メチルゲルタロニトリル、　５ＢＮ＝Ｓ−２−メチルブチロニトリル；４ＣＰ＝４−シアノフェノール、ＮＡＮ＝１−ナフトアセトニトリル、　ＰＢＮ＝７二二ルブチロニトリル；ＰＰＡ　＝プロピオンアミド ′２８℃における４８−６４時間後に残っているＲ−およびＳ−エナンチオマーの比：偏光ＨＰＬＣにより測定された。

’Ｅ＝明細書中で定義されている如きエナンチオマー比。逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定された。

”　ＮＴ＝試験されなかった。

１基質中に存在している痕跡量のＲ，５−ＮＰＡｊに関して補正されたデータ’ 　２Ｄ−１１−５−１から誘導された２Ｄ−１１−５−１ｂおよび２Ｄ−１１− ５−１ｃ微生物は突然変異を受ける傾向がある。従って、バクテリアはそれらが上記の適格性菌株の突然変異体である場合でもそれの培養が立体特異性ニトリルヒドラターゼを生成する限り本発明に従う方法で使用することができる。ここに表されている開示と一緒に表１を参照することにより、当技術の専門家は全てのニトリル出発反応物をそれらの対応するアミド類／酸類に転化させるための別のシュードモナス、モラクセラ、およびセレイシア（並びに他の属）を最少の実験で選択することができる。

゛本発明では、Ｒ，Ｓニトリルから誘導されたＲ−またはＳ−アミドをＲ−またはＳ−酸に加水分解させるために鉱酸を使用することができる。

おもしろいことに、偏光性シアノヒドリン類は濃鉱酸を用いて対応する偏光性ヒドロキシ酸類に加水分解される：エラフェンベルゲル（Ｅ　ｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ）他、テトラヘドロン・レタース（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９９０．３１（９）：　１２４９−１２５２およびそこに引用されている参考文献を参照のこと。しかしながら、２−アリール−２−アルキルアセトニトリル類は対応する偏光性アミド類が偏光性酸類に加水分解されるような条件下では鉱酸により加水分解されないということを見いだした。

偏光性酸は下記の如くして望ましくないニトリルから容易に分離することができる。

さらに、偏光性アミドを例えばＥＰＡ３２６．４８２中に記されているプレヴイバクテリウムおよびコリネバクテリウム種の如きアミダーゼ酵素により加水分解することもできる。この反応は立体特異性アミダーゼを必要とせず、従ってラセミ体２−アリール−アルキルアミド類を加水分解するアミダーゼならどれでも使用することができる。

偏光性ニトリル類のラセミ化立体特異性微生物性ニトリル加水分解とアミド類の鉱酸またはアミダーゼ加水分解との組み合わせが、希望する偏光性酸および望ましくない偏光性ニトリルの混合物を生成する。例えば塩基中和およびニトリルの溶媒抽出による希望する酸からの望ましくないニトリルの分離後に、Ｒ−またはＳ−二トリルの再循環がラセミ化に必要である。偏光性ニトリル（ここではＲ１はＨである）を例えばアンベルライト”ＩＲＡ−４００（ＯＨ）樹脂、アンベルライト”Ａ−２６、またはダウエックス”ＩＸ８樹脂（水酸化物イオンとの交換後）の如き強塩基性イオン交換樹脂を用いて有機溶媒中でラセミ体ニド）ルに転化できるということを見いだした。この工程は高いラセミ体ニトリル収率を生じ、ニトリルから対応するアミドまたは酸への実質的な加水分解はなかった。生成したラセミ体ニトリルを前記の条件下で対応するＲ−またはＳ−酸に加水分解することができる。

分析工程ニトリル類並びに微生物または鉱酸加水分解によるアミドおよび酸生成物は逆相ＨＰＬＣにより測定される。検出は紫外線吸収による。０゜１％のＨ３ＰＯ３で酸性化された７０−７５％のメタノールおよび２５−３０％のＲ２０の移動相または０．１％のＨｓ　Ｐ　Ｏ４で酸性化された６７％のアセトニトリル（ＡＣＮ）および３３％のＨ！Ｏを使用するデュポンゾルパックス１０１８カラムを使用する。ニトリル類のクロマトグラフィー同定および定量化並びにそれらの生じるアミドおよび酸生成物は認証されている標準との比較により測定することができる。

エナンチオマー類の分離用の偏光ＨＰＬＣはクロムチク（スエーデン）から得られるα１−酸グリコ蛋白質カラムを用いて実施することができる。種々のエナンチオマー類の分離用の移動相は以下にまとめられている。

ニトリル、アミドおよび酸エナンチオマー類の偏光ＨＰＬＣ分離エナンチオマー類　移動相ＣＰＩＮ、　ＣＰＩＡＩｌ、　ＣＰＩＡ　９５％Ｏ，０１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ６，０）　：５％エタノールＮＰＣＮ、ＮＰＡｍ、ＮＰＡＣ９５％０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ５，６）：５％エタノールＩＢＣＮ、ＩＢＡｍ、ＩＢＡＣ９６％０．０２Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐ［１５，２）：４％エタノール上記のニトリル類、アミド類および酸類のエナンチオマー組成、純度並びにクロマトグラフィー同定を認証されている標準的エナンチオマー類またはラセミ体混合物との比較により測定した。

ＣＰＩＮ、ＣＰＩＡｍおよびＣＰＩＡのＧＣ分析は、スペルコ担体（１２０メツシユ）上に３％の５Ｐ２１００を含有している１８３ｃｍｘ２ｍｍ（内径）ガラスカラムの上で実施された。１２５℃における５分間から出発しそして２５０℃ までの毎分８℃の上昇という温度プログラムを使用した。

本発明の方法を下記の実施例により説明する。

実施例１工程ｉ、Ｐ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐの凍結細胞ペーストの１００ｍｇ　（Ｓ−ＣＰ　Ｉ　Ｎ、　Ｒ−ＣＰ　Ｉ　Ｎ加水分解）または２００ｍｇ　（Ｒ。

５−ＣＰＩＮ加水分解）試料を室温において３ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ７，０）に加えた。次に、１２０μＬのジメチルスルホキシド中の３０ −４０ｇモルの５−ＣＰＩＮもしくはＲ−ＣＰＩＮまたはＲ，５−ＣＰＩＮを加えた。２８℃における撹拌しながらの４８時間にわたる培養後に、反応を３Ｍ　Ｈ，ＳＯ４を用いてｐＨ３，０に酸性化した。４容量の塩化メチレンを各試料に加え、そして懸濁液を１５−３０分間撹拌した。塩化メチレン層を除去し、窒素流の下で蒸発乾固し、そして残渣を３ｍＬのメタノール中に再懸濁させた。メタノール溶液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定し、そしてそれを表２Ｐ、ピュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐによる５−ＣＰＩＮｌＲ−ＣＰＩＮおよびＲ，５−ＣＰＩＮ加水分解基質（加えられたμモル）ＣＰＩＮ　ＣＰＩＡｍ　５−ＣＰＩＮ　Ｒ−ＣＰＩＮ　Ｓ −ＣＰＩＡｍ　Ｒ−ＣＰＩＡ諷５−ＣＰＩＮ（３０，９）　１．８２ｇ、２　１．８　ＮＤ’　２８．２　ＮＤ−Ｒ−ＣＰＩＮ（３７，５）　３３．７　３．８　ＮＴ’　ＮＴ”　ＮＴ”　ＮＴ’Ｒ，５−ＣＰＩＮ（３１，９）　２０．４　１１．５　４．７　１５．７　１１．０　０．５’　ＮＤ＝検出されなかった ”ＮＴ＝試験されなかった実施例２工程ｔ、２５ｍＭの（±）−２−メチルゲルタロニトリルの代わりに２５ｍＭのＮＨ，ＣＩが補足されているＰＲグルコース培地上で繁殖ささられている培養物から得られたＰ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐの凍結細胞ペーストの５０ｍｇ試料を室温において２０．６μモルの５−ＣＰＩＮまたはＲ，５−ＣＰＩＮを含有している１ｍＬの燐酸塩緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７，５）に加えた。２８℃における撹拌しながらの２４時間にわたる培養後に、反応を３　Ｍ　Ｈ２Ｓ　Ｏ４を用いてｐＨ３，０に酸性化した。４容量の塩化メチレンを各試料に加え、そして懸濁液を１５−３０分間撹拌した。塩化メチレン層を除去し、窒素流の下で蒸発乾固し、モして残渣を１ｍＬのメタノール中に再懸濁させた。メタノール溶液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定し、そしてそれを表３ニトリルまたはアミド誘導剤の不存在下で繁殖させられたＰ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐによる５−ＣＰＩＮＳＲ，５−ＣＰＩＮ加水分解基質（加えられたμモル）ＣＰＩＮ　ＣＰＩＡｓ＋　５−ＣＰＩＮ　Ｒ−ＣＰＩＮ　Ｓ−ＣＰＩＡｍ　Ｒ−ＣＰＩＡｍ５−ＣＰＩＮ（２０，６）　１．２　１７．７　ＮＴ’　ＮＴ“　ＮＴ”　ＮＴ’Ｒ，５−ＣＰＩＮ（２０，６）　１５．１　３．３　６．０　９．１　３．３　ＮＯ６”　ＮＤ＝検出されなかった ”ＮＴ＝試験されなかった実施例３工程ｔ、ｐ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐの凍結細胞ペーストの２０ｍｇ試料を室温においてＭｇＣ１，・６　Ｈｔｏ　（２ｍＭ）を含有している１ｍＬの燐酸塩緩衝液（０，３ｍＭ、ｐＨ７，２）に加えた。次に４０μＬのジメチルスルホキシド中の０．９５μモルのＲ，５−ＮＰＣＮを加えた。２８℃における撹拌しながらの２４時間にわたる培養後に、反応を３Ｍ　Ｈ２ＳＯ，を用いてｐＨ３，０に酸性化した。４容量の塩化メチレンを各試料に加え、そして懸濁液を３０分間撹拌した。塩化メチレン層を除去し、窒素流の下で蒸発乾固し、モして残渣を１ｍＬのメタノール中に再懸濁させた。抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定し、そしてそれを表４に示す。

表４Ｐ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２ＰによるＲ、５−ＮＰＣＮ加水分解基質（加エラｔＬりμモル）　ＮＰＣＮ　ＮＰＡＩＩＮＰＡＣ５−ＮＰＣＮ　Ｒ−ＮＰＣＮ　５−ＮＰＡｓ　Ｒ−ＮＰｈ　５−ＮＰＡＣＬＳ−ＮＰＣＮ（０，９５）　０．５　０．２２０．０３　０．２８　０．２２　１ｍ”　０．２２　０．０３’　ＮＤ＝検出されなかったゝ基質中に存在している痕跡量のＲ，Ｓ−ＮＰＡｍに関して補正されたデータ実施例４工程ｔ、ｐ、ビュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐの凍結細胞ペーストの４０ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７゜０）に加えた。次に４０μＬのジメチルスルホキシド中の１０．７μモルのＲ，５−ＩＢＣＮを加えた。２８℃における撹拌しながらの４８時間にわたる培養後に、反応を３Ｍ　Ｈ１ＳＯ４を用いてｐＨ３，０に酸性化した。４容量の塩化メチレンを各試料に加え、そして懸濁液を１５−３０分間撹拌した。塩化メチレン層を除去し、窒素流の下で蒸発乾固し、そして残渣を１ｍＬのメタノール中に再懸濁させた。抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定し、そしてそれを表５に示す。

表呈Ｐ、ピュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２ＰによるＲ、５−ＩＢＣＮ加水分解ＨＰＬＣ分析（回収されたμモル）逆相　偏光基質（加えられたμモル）ＩＢＣＮ　ＩＢＡｍ　５−ＩＢＣＮ　Ｒ−ＩＢＣＮ　５− ＩＢ＾−Ｒ−ＩＢＡｍＲ，５−ＩＢＣＮ（１０，７）　７．９”２．８　５．５ °　２．４°　ＮＤ″″　２．８°加えられたＩＢＣＮのμモルから回収されたＩＢＡｍのμモルを引算することにより計算された推定値 ’　ＮＤ＝検出されなかった実施例５工程ｉ、　モラクセラ種３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ−１の凍結細胞ペーストの５０ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ。

ｐＨ７，０）に加えた。次に、４０μＬのジメチルスルホキシド中の１０．３μ モルの５−ＣＰＩＮ％Ｒ−ＣＰＩＮまたはＲ，５−ＣＰＩＮを加えた。２８℃における撹拌しながらの４８時間にわたる培養後に、反応を３Ｍ　Ｈ，ＳＯ２を用いてｐＨ３，０に酸性化した。４容量の塩化メチレンを各試料に加え、そして懸濁液を１５−３０分間撹拌した。塩化メチレン層を除去し、窒素流の下で蒸発乾固し、モして残渣を１ｍＬのメタノール中に再懸濁させた。メタノール溶液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定し、そしてそれを表６に示す。

モラクセラ種３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ−１による５−ＣＰＩＮ。

Ｒ−ＣＰＩＮおよびＲ，５−ＣＰＩＮ加水分解基質（加えられたμモル）ＣＭＮ　ＣＰＩ＾！　５−ＣＰＩＮ　Ｒ−ＣＰＩＮ　５− ＣＰＩＡ■Ｒ−ＣＰＩ＾履５−ＣＰＩＮ（１０，３）　０．５８．７　０．５　ＮＤ”　８．７　ＮＤ”Ｒ−ＣＰＩＮ（１０，３）　１０．３　ＮＤ’　ＮＴ’ 　ＮＴ’　Ｎｉ２　ＮＴ”Ｒ，５−ＣＰＩＮ（１０，３）　９．７０．５　４．１　５．６　０．５　ＮＤ””　ＮＤ＝検出されなかった ’　ＮＴ＝試験されなかった実施例６工程ｉ、　モラクセラ種３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ−１の凍結細胞ペーストの４０ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ。

ｐＨ７，０）に加えた。実施例４中と同じ方法で、１０．７μモルのＲ９５−ＩＢＣＮを加えた。実施例４中と同じ培養および抽出処方に従い、抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。結果を表７に示す。

煮ユモラクセラ種３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ−１によるＲ、５−ＩＢＣＮ加水分解ＨＰＬＣ分析（回収されたμモル）逆相　偏光基質　Ｓ−Ｒ−Ｓ−Ｒ−Ｓ−Ｒ− （加えられたμモル）ＩＢＣＮＩＢ＾■ＩＢＡＣリ９」成１μ艷」四覧」睦とＵ煕Ｒ，５−ＩＢＣＮ（１０，７）　９．８”０．４　０．５　５．５’４．３” ｌ［）”　０．４　ＮＤ”　０．５°加えられたＩＢＣＮのμモルから回収されたアミドのμモルを引算することに　より計算された推定値 ″″ＮＤ＝ＮＤ＝検出った実施例７工程１．　シュードモナス種３Ｌ−Ｇ−１−５−１ａ−１の凍結細胞ペーストの２０ｍｇ試料を室温においてＭ　ｇ　Ｃ１ｔ・６Ｈ，Ｏを含有している燐酸塩緩衝液（０，３ｍＭ、ｐＨ７，０）に加えた。実施例３中と同じ方法で、０．９５ μモルのＲ，５−ＮＰＣＮを加えた。実施例３中と同じ培養および抽出に従い、抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。

結果を表８に示す。

表呈シュードモナス種３Ｌ−Ｇ−１−５−１ａ−１によるＲ、５−ＮＰＣＮ加水分解基質（加えられたμモル）ＮＰＣＮ　ＮＰＡｍ　ＮＰＡＣ５−ＮＰＣＮ　Ｒ−ＮＰＣＮ　５−ＮＰＡ騰Ｒ−ＮＰＡ膳５−ＮＰ＾ＣＲ，５−ＮＰＣＮ（０，９５）　０．４４０．３　０．３０　０．０３　０．４１　ＮＤ”　０．０３　０．３０” 　ＮＤ＝検出されなかった１基質中に存在している痕跡量のＲ，Ｓ−ＮＰＡｍに関して補正されたデータ実施例８工程ｔ、ｐ、ピュチダ１３−５Ｓ−ＡＣＮ−２ａの凍結細胞ペーストの１００ｍｇ試料を室温において３ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ。

ｐＨ７，０）に加えた。次に４０μＬのジメチルスルホキシド中の１０゜７μモルのＲ，５−ＩＢＣＮを加えた。実施例１中と同じ方法で、３０゜９５μモルの５−ＣＰＩＮＳＲ−ＣＰＩＮまたはＲ，５−ＣＰＩＮを加えた。実施例１中と同じ培養および抽出方法に従い、抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。結果を表９に示す。

表９Ｐ、ピュチダ１３−５３−ＡＣＮ−２ａによる５−ＣＰＩＮ、Ｒ−ＣＰＩＮまたはＲ，５−ＣＰＩＮ加水分解基質（加えられたμモル）ＣＰＩＮ　ＣＰＩＡｍ　５−ＣＰＩＮ　Ｒ−ＣＰＩＮ　Ｓ −ＣＰＩＡｍ　Ｒ−ＣＰＩＡＩＩＩＳ−ＣＰＩＮ（３０，９）　ＮＤ”　３０．２　ＮＤ’　ＮＤ”　３０．２　ＮＤ尋Ｒ−ＣＰＩＮ（３０，９）　２８．５０．６　ＮＴ’　ＮＴ’　ＮＴ’　ＮＴ”Ｒ，５−ＣＰＩＮ（３０，９）　１３．２１４．７　１．３　１１．９　１４．０　０．７’　ＮＤ＝検出されなかったゝＮＴ＝試験されなかった実施例９工程ｉ、ｐ、ビュチダ１３−５Ｓ−ＡＣＮ−２ａの凍結細胞ベーストの４０ｍｇ試料を室温において燐酸塩緩衝液（１００ｍＭＳｐＨ７，０）に加えた。実施例４中と同じ方法で、１０．７μモルのＲ，５−ＩＢＣＮを加えた。実施例４中と同じ培養および抽出方法に従い、抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。結果を表１０に示す。

表１０Ｐ、ピュチダ１３−５Ｓ−ＡＣＮ−２ａによるＲ、５−ＩＢＣＮ加水分解ＨＰＬＣ分析（回収されたμモル）逆相　偏光基質（加えられたμモル）　ＩＢＣＮ　ＩＢＡｍ　５−ＩＢＣＮ　Ｒ−ＩＢＣＮ　Ｓ −ＩＢＡｍ　Ｒ−ＩＢＡｍＲ，５−ＩＢＣＮ（１０，７）　６．６”４．１　５．９”　０．７’　ＮＤゝ　４．１１加えられたＩＢＣＮのμモルから回収されたＩＢＡｍのμモルを引算することにより計算された推定値ｌ′ＮＤ＝検出されなかった実施例１０工程ｉ、ｐ、ピュチダ２Ｄ−１１−５−１ｂの凍結細胞ペーストの５０ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７゜０）に加えた。実施例５中と同じ方法で、１０．３μモルの５−ＣＰ　ＩＮまたはＲ，５−ＣＰＩＮを加えた。実施例５中と同じ培養および抽出処方に従い、抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。結果を表１１に示す。

表１１Ｐ、ビュチダ２Ｄ−１１−５−１ｂによる５−ＣＰＩＮまたはＲ，５−ＣＰＩＮ加水分解ＨＰＬＣ分析（回収された　モル）逆相　偏光基質（加えられたμモル）　ＣＰＩＮＣＰＩ＾■　５−ＣＰＩＮ　Ｒ−ＣＰＩＮ　Ｓ −ＣＰＩＡｍ　Ｒ−ＣＰＩＡｍ５−ＣＰＩＮ（１０，３）　ＮＤ　１０．ＯＮＤ　ＮＤ　１０．ＯＮＤＲ，５−ＣＰＩＮ（１０，３）　８．５３．０　２．６　５．９　３．ＯＮＤＮＤ＝検出されなかったＣＰＩＮの明らかに過剰量の回収はほとんどが実験誤差によるものであるようである。

実施例１１工程ｔ、ｐ、ピュチダ２Ｄ−１１−５−１ｂの凍結細胞ペーストの５０ｍｇ試料を室温において２ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７゜０）に加えた。実施例４中と同じ方法で、１０．７μモルのＲ，５−ＩＢＣＮを加えた。実施例４中と同じ培養および抽出処方に従い、抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。

結果を表１２に示す。

嚢１」− Ｐ、ビュチダ２Ｄ−１１−５−１ｂによるＲ、５−ＩＢＣＮ加水分解ＨＰＬＣ分析（回収されたμモル）逆相　−偏光基質（加えられたｕモＡｔ）　ＩＢＣＮ　ＩＢＡｍ　５−ＩＢＣＮ　Ｒ−ＩＢＣＮ　Ｓ−ＩＢＡｍ　Ｒ−ＩＢＡｍＲ，５−ＩＢＣＮ（１０，７）　？、１°３．６　５．０“　２．１°　０．４　３．２“加えられたＩＢＣＮのμモルから回収されたＩＢＡｍのμモルを引算することにより計算された推定値実施例１２工程ｔ、Ｓ、リクエファシエンスＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３の凍結細胞ペーストの５０ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ。

ｐＨ７，０）に加えた。実施例５と同じ方法で、１０．３μモルの５−ＣＰＩＮ、Ｒ−ＣＰＩＮまたはＲ，５−ＣＰＩＮを加えた。実施例５中と同じ培養および抽出方法に従い、抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。結果を表１３に示す。

表１３Ｓ、リクエファシエンスＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３による５−ＣＰＩＮ。

Ｒ−ＣＰＩＮ加水分解基質（加えられたμモル）　ＣＰＩＮＣＰＩ＾ＩＩＩＳ−ＣＭＮ　Ｒ−ＣＰＩＮ　Ｓ −ＣＰＩＡｍ　Ｒ−ＣＰＩＡｍＳ−ＣＰＩＮ　（１０，３）　Ｃ１８８，２ＮＴ ”　ＮＴ”　ＮＴ”　ＮＴ”Ｒ−ＣＰＩＮ（１０，３）　９．５　＜０．Ｉ　ＮＴ″　ＮＴ”　ＮＴ”　ＮＴ“１？、５−ＣＰＩＮ（１０，３）　８．６１．２　４．０　４．６　１．２　ＮＤ’“ＮＴ＝試験されなかった ”　ＮＤ＝検出されなかった実施例１３工程ｔ、ｐ、アラレオファシェンスＭＯＢ　Ｃ２−１の凍結細胞ペーストの５０ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ。

ｐＨ７，０）に加えた。実施例５と同じ方法で、１０．３μモルの５−ＣＰＩＮ、Ｒ−ＣＰＩＮまたはＲ，５−ＣＰＩＮを加えた。実施例５中と同じ培養および抽出方法に従い、抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。結果を表１４に示す。

青１１Ｐ、アラレオファシェンスＭＯＢ　Ｃ２−１による５−ＣＰＩＮ。

Ｒ−ＣＰＩＮ加水分解基質（加えられたμモル）ＣＰＩＮ　ＣＰＩＡｍ　５−ＣＰＩＮ　Ｒ−ＣＰＩＮ　５ −ＣＰＩＡｉ　Ｒ−ＣＰＩＡｍＳ−ＣＰＩＮ（１０，３）　ＮＤ”８．４　ＮＤ ”　ＮＤ”　８．４　ＮＤ”Ｒ−ＣＰＩＮ（１０，３）　９．０＜０．１　ＮＴ ”　ＮＴ’　ＮＴ’　ＮＴ’Ｒ，５−ＣＰＩＮ（１０，３）　８．４１．０　２．６　５．８　１．ＯＮＤｊ”　Ｎ０士検出されなかった ’　ＮＴ＝試験されなかった実施例１４工程ｉ、Ｐ、アラレオファシェンスＭＯＢ　Ｃ２−１の凍結細胞ペーストの５０ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ。

ｐＨ７，０）に加えた。実施例４中と同じ方法で、１０．７μモルのＲ２５−ＩＢＣＮを加えた。実施例４中と同じ培養および抽出方法に従い、抽出された上澄み液の組成を逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。結果を表１５に示す。

表１５Ｐ、アラレオファシェンスＭＯＢ　Ｃ２−１によるＲ、５−ＩＢＣＮ加水分解基質（加えられたμモル）ＩＢＣＮＩＢ＾■　５−ＩＢＣＮ　Ｒ−ＩＢＣＭ　５−ＩＢＡｓ　Ｒ−ＩＢＡ■Ｒ，５−ＩＢＣＮ（１０，７）　８．３′″２．４　５．４”　２．９”　ＮＤｌ　２．４°加えられたＩＢＣＮのμモルから回収されたＩＢＡｍのμモルを引算することにより計算された推定値 ’　ＮＤ＝検出されなかった実施例１５工程１．　シュードモナス種２Ｇ−８−５−１ａの凍結細胞ペーストの２０ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７，２）に加えた。

次に、４０μＬのジメチルスルホキシド中の約１μモルのＲ，５−ＮＰＣＮを加えた。２８℃における撹拌しながらの４８時間にわたる培養後に、反応を３Ｍ　Ｈ，ＳＯ，を用いてｐＨ３，０に酸性化した。４容量の塩化メチレンを各試料に加え、そして懸濁液を３０分間撹拌した。塩化メチレン層を除去し、そして窒素流の下で蒸発乾固させた。残渣を１ｍＬのメタノール中に再溶解させた。抽出された上澄み液の組成を他に記載されている如くして逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣにより測定した。結果を表１６に示す。

表１６シユードモナス種２Ｇ−８−５−１ａによるＲ、５−ＮＰＣＮ加水分解基質（加えられたμモル）　ＮＰＣＮ　ＮＰＡｍ　ＮＰＡＣ５−ＮＰＣＮ　Ｒ−ＮＰＣＮ　Ｓ−ＮＰＡｍ　Ｒ−ＮＴＡｍ　５−ＮＰＡｃ　Ｒ−ＮoＡｃＲ，５−ＮＰＣＮ（０，９５）　０．５２０．０４０．３６　ＮＤ“　０．５２　１１Ｄ　Ｏ，０４０，３６ＮＤ”　ＮＤ＝検出されなかった１基質中に存在している痕跡量のＲ，Ｓ−ＮＰＡｍに関して補正されたデータ実施例１６工程ｉ、　シュードモナス種２Ｄ−１１−５−１ｃの凍結細胞ペーストの約１０ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７，２）に加えた。次に、４０μＬのジメチルスルホキシド中の約１μモルのＲ，５−ＮＰＣＮを加えた。２８℃における撹拌しながらの４８時間にわたる培養後に、反応を３Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨ３，０に酸性化した。４容量の塩化メチレンを各試料に加え、そして懸濁液を３０分間撹拌した。塩化メチレン層を除去し、そして窒素流の下で蒸発乾固させた。残渣を１ｍＬのメタノール中に再溶解させた。抽出された上澄み液の組成を他に記載されている如くして逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＯにより測定した。結果を表１７に示す。

表１ユンユードモナス種２Ｄ−１１−５−１ｃによるＲ、５−ＮＰＣＮ加水分解ＨＰＬＣ分析（回収されたμモル）逆相１　偏光１基質Ｒ，５−ＮＰＣＮ（０，９５）　０．６６０．０９０．４０　ＮＤ”　０．６６　０．０５　０．０５　０．４　ＮＤ’　ＮＤ＝検出されなかったゝ基質中に存在している痕跡量のＲ，Ｓ−ＮＰＡｍに関して補正されたデータ実施例１７工程ｉ、Ｐ、アラレオファシェンスＭＯＢ　Ｃの凍結細胞ペーストの約２ｍｇ試料を室温において１ｍＬの燐酸塩緩衝液（０，１Ｍ５ｐＨ７゜２）に加えた。次に、４０μＬのジメチルスルホキシド中の約１μモルのＲ，５−ＮＰＣＮを加えた。２８℃における撹拌しながらの４８時間にわたる培養後に、反応を３Ｍ　Ｈ，ＳＯ４を用いてｐＨ３，０に酸性化した。４容量の塩化メチレンを各試料に加え、そして懸濁液を３０分間撹拌した。塩化メチレン層を除去し、モして窒素流の下で蒸発乾固させた。

残渣を１ｍＬのメタノール中に再溶解させた。抽出された上澄み液の組成を他に記載されている如くして逆相ＨＰＬＣおよび偏光ＨＰＬＣｉこより測定した。結果を表１８に示す。

表１８Ｐ、アラレオファシェンスＭＯＢ　ＣによるＲ、５−ＮＰＣＮ加水分解基質（加えられたμモル）　ＮＰＣＮ　ＮＰＡｍ　ＮＰＡＣ５−ＮＰＣＮ　Ｒ−ＮＰＣＮ　５−ＮＰＡｍ　Ｒ−ＮＴＡｍ　５−ＮＰＡｃ　Ｒ−ＮoＡｃＲ，５−ＮＰＣＮ（０，９５）　０．６６０．１７ＮＤ　Ｏ，５３０，１３ＮＤ　Ｏ，１７ＮＤ　ＮＤ”　ＮＤ＝検出されなかった１基質中に存在している痕跡量のＲ，Ｓ−ＮＰＡｍに関して補正されたデータ実施例１８工程ｉｉ、１．０ＯｆのＳ−ＣＰＩＡｍの１６ｍＬの水性塩酸（１８％）中懸濁液を撹拌し、そして加熱還流させた。懸濁液が加熱されるにつれて、固体が溶解した。１６時間後に、反応混合物を冷却した。沈澱しそしてスタラーの周囲で固化した固体を塩化メチレンで抽出した。抽出物を蒸発させると、０．９８ｇの無色固体が残り、それをＧＣおよびＨＰＬＣの組み合わせにより分析した。ＧＣによると主としてＣＰＩＡ（９２，３面積％）であり残りが未変化のアミドであることが示された。酸の構造は偏光ＨＰＬＣによるとＳ−エナンチオマー（少なくとも９８゜２％）であると制定され、痕跡量だけのラセミ化されたＲ−エナンチオ工程ｔｔ、１．０２ｇのＳ−ＣＰＩＡｍおよび１５ｍＬの濃塩酸を用いて反応を実施例１８中の如（して繰り返した。還流下での約１６時間後に、反応混合物を冷却し、そして沈澱した固体を濾過により集めそして空気乾燥した。０．９６ｇの無色固体が回収され、それをＧＣ／質量分光計およびＨＰＬＣにより分析した。主成分はＣＰＩＡ（９６％）であり約４％が未変化のアミドであると同定された。偏光ＨＰＬＣは、酸が９６．６％のＳ−エナンチオマーおよび３．４％のＲ−エナンチオマーであることを示した。

実施例２０工程ｔｉｔ、Ｉｇの湿っているアンベルライト”ＩＲＡ−４００（ＯＨ−形）を１０ｍＬの５％ＮａＯＨで撹拌しながら１０分間処理し、濾過し、そして洗浄液が中性となるまで蒸留水で洗浄した。固体を２５ｍＬの無水エタノール中に懸濁させ、そして１．０６ｇのＲ−ＣＰＩＮを加えた。

これを撹拌しそして６４時間にわたり加熱還流させた。濾過による樹脂の除去後に、濾液を冷却しそして回転−蒸発させると、１．０１ｇの無色油が残った。偏光ＨＰＬＣ分析は、油がＲ−および５−ＣＰＩＮの５０１５０混合物であることを示した。

例えばＣＰＩＮの如きＲ，Ｓアルキルニトリル類の相対的安定性および相対的に強い反応条件下での対応する酸類への転化がないことを示す方法は下記の如（であった。９．７０ｇのＲ，５−ＣＰＩＮの１００ｍＬの製塩酸中懸濁液を１６時間にわたり加熱還流させた。反応混合物を冷却しそして塩化メチレンで３回抽出した。−緒にした抽出物を水で洗浄し、そして無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を除去すると無色油が残り、それをＧＣにより同定した。１種の主成分（９０％以上）が存在しており、認定された出発ニトリルと同じ保有時間を有していた。

加水分解により生成されるであろう対応する酸に関する証拠はなかった。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成５年３月１８日

Claims

【特許請求の範囲】

１．式 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ（Ｒ，Ｓ）［式中、Ａは ▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−１，▲数式、化学式、表等があります▼ Ａ−２，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−３，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−４，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−５，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−６，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−７，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−８，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−９， ▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−１０および▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−１１；からなる群から選択され、Ｒ１はＣ１−Ｃ４アルキルであり、Ｒ２はＨまたはＯＨであり、Ｒ３はＨ、Ｃｌ、ＯＣＦ２Ｈ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２、Ｈ２Ｃ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＮＨ、 ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼；であり、そしてＲ４はＣｌまたはＦである］のニトリルを、ラセミ体ニトリルを対応するＲ−またはＳ−アミドに立体特異的に変える生物学的物質と接触させることを含んでなる、該ニトリルを対応するアミドに変える方法。
２．Ａが群 ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼ から選択され、そしてＲ１がＣＨ３およびＣＨ（ＣＨ３）２から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。
３．Ａが群 ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼から選択される、請求の範囲第２項に記載の方法。
４．ニトリルが群（２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチロニトリル、２−（４−イソブチルフェニル）プロピオニトリルおよび２−（６−メトキシ− ２−ナフチル）−プロピオニトリルから選択される、請求の範囲第３項に記載の方法。
５．ニトリルが群２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチロニトリルおよび２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオニトリルから選択される、請求の範囲第４項に記載の方法。
６．生物学的物質がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）およびセレイシア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）群中に存在しているかまたはそれらから誘導される、請求の範囲第１項に記載の方法。
７．生物学的物質がシュードモナス・ピュチダ（Ｐｕｔｉｄａ）、モラクセラ種およびセレイシア・リクエファシエンス（Ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）中に存在しているかまたはそれらから誘導される、請求の範囲第６項に記載の方法。
８．生物学的物質がシュードモナス・ピュチダ中に存在しているかまたはそれらから誘導される、請求の範囲第７項に記載の方法。
９．生物学的物質がモラクセラ種中に存在しているかまたはそれらから誘導される、請求の範囲第７項に記載の方法。
１０．生物学的物質がセレイシア・リクエファシエンス中に存在しているかまたはそれらから誘導される、請求の範囲第７項に記載の方法。
１１．エナンチオマー性アミドを対応する２−アルカン酸に加水分解する追加の工程を含んでいる、請求の範囲第１項に記載の方法。
１２．アミドを酸に加水分解するために強鉱酸を使用する、請求の範囲第１１項に記載の方法。
１３．アミドを酸に加水分解するために生物学的物質を使用する、請求の範囲第１１項に記載の方法。
１４．生物学的物質がブレヴィバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｖｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス、モラクセラおよびセレイシア中に存在しているかまたはそれらから誘導される、請求の範囲第１３項に記載の方法。
１５．エナンチオマー性２−アルカン酸を連続的に除表し、強塩基性イオン−交換樹脂と接触させることによりニトリル−酸反応のエナンチオマー性ニトリル副生物をラセミ化し、そしてラセミ体ニトリルを再循環させることを含んでなる、Ｒ２がＨである請求の範囲第１１項に記載のエナンチオマー性２−アルカン酸の連続的製造方法。
１６．イオン交換樹脂が第四級水酸化アンモニウム官能基を含有している架橋結合された共重合体である、請求の範囲第１５項に記載の方法。
１７．▲数式、化学式、表等があります▼のＲ−またはＳ−エナンチオマーと式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のＲ−またはＳ−アミドとの混合物を強鉱酸または生物学的物質の存在下で加水分解することによる、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の酸の製造方法：［式中、 ▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−１，▲数式、化学式、表等があります▼ Ａ−２，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−３，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−４，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−５，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−６，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−７，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−８，▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−９， ▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−１０および▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−１１；からなる群から選択され、Ｒ１はＣ１−Ｃ４アルキルであり、Ｒ２はＨまたはＯＨであり、Ｒ３はＨ、Ｃｌ、ＯＣＦ２Ｈ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２、Ｈ２Ｃ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＮＨ、 ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼；であり、そしてＲ４はＣｌまたはＦである］。
１８．鉱酸がＨＣＩであり、そして生物学的物質がプレヴィバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス、セレイシアおよびモラクセラ中に存在しているかまたはそれらから誘導される、請求の範囲第１７項に記載の方法。
１９．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のエナンチオマー性Ｒ−またはＳ−ニトリルを強塩基性イオン−交換樹脂と接触させることを含んでなる、該ニトリルのエナンチオマー性Ｒ−またはＳ−ニトリルをラセミ化する方法。
２０．イオン−交換樹脂が第四級水酸化アンモニウム官能基を含有している架橋結合された共重合体である、請求の範囲第１９項に記載の方法。
２１．アミドが２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチルアミド、２−（４−イソブチルフェニル）プロピオアミドおよび２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオアミド群から選択される、請求の範囲第１１−１８項のいずれかに記載の方法。
２２．ニトリルが２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチロニトリル、２ −（４−イソブチルフェニル）プロピオニトリルおよび２−（６−メトキシ−２ −ナフチル）−プロピオニトリル群から選択される、請求の範囲第１９−２０項のいずれかに記載の方法。
２３．ラセミ体ニトリルを対応するＲ−またはＳ−アミドに立体特異的に変える、シュードモナス種３Ｌ−Ｇ−１−５−１ａ、シュードモナス種２Ｇ−８−５− １ａ、Ｐ．ピュチダ５Ｂ−ＭＧＮ−２ｐおよびＰ．アウレオファシエンス（Ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＭＯＢＣ２−１、またはそれらの変異体もしくは突然変異体中に存在しているかまたはそれらから誘導される生物学的物質。