DE69117521T2 - Verfahren zur herstellung von 2-alkansäureenantiomeren - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 2-alkansäureenantiomeren

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Description

  • Die Erfindung betrifft die enantioselektive biologisch katalysierte Hydrolyse von Nitrilen zu den entsprechenden Enantiomeren der 2-Alkansäuren über enantiomere Amid- Zwischenstufen.
  • Viele Agrochemikalien und Pharmazeutika der allgemeinen Formel X-CHR-COOH sind derzeit als racemische oder diastereomere Gemische auf dem Markt. In vielen Fällen stammt die physiologische Wirkung von nur einem Enantiomer/Diastereomer, während das andere Enantiomer/Diastereomer inaktiv oder sogar schädlich ist. Chemische und enzymatische Verfahren zur Trennung von Enantiomeren werden zunehmend zu wichtigen Werkzeugen zur Herstellung von Chemikalien von hoher enantiomerer Reinheit.
  • Die WO 86/07386 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren oder Aminosäureamiden aus einem enantiomeren Gemisch des entsprechenden Aminonitrils mit einer enantioselektiven Nitrilase und die anschließende Gewinnung der resultierenden optisch aktiven Aminosäure oder des optisch aktiven Aminoamids. Die Veröffentlichung schlägt nicht die Erfindung vor, da sie unterschiedliche Mikroorganismen verwendet und die Hydrolysen, die beschrieben sind, stereoselektiv, nicht stereospezifisch sind.
  • Die EPA 326 482 offenbart die stereospezifische Herstellung von Aryl-1-alkansäuren wie 2-(4-Chlorphenyl)-3-methylbuttersäure durch mikrobielle Hydrolyse des entsprechenden racemischen Amids. die Mikroorganismen, die in der EPA 326 482 offenbart sind, umfassen Mitglieder von Brevibacterium und Corynebacterium. Das Verfahren wurde diskontinuierlich ohne organisches Lösungsmittel durchgeführt, und das enzymatisch aktive Material wurde nach einmaliger Verwendung verworfen. Die Daten in den Beispielen der EPA 326 482 zeigen, daß 35 bis 60 % des S-Amids unumgewandelt zurückbleiben. Der enantiomere Überschuß der erzeugten S-Säure betrug 92 bis 97 %.
  • Die U.S. 4 366 250 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus dem entsprechenden racemischen Aminonitril mit Bakterien, die eine allgemeine Nitrilhydratase und eine L-stereospezifische Amidase aufweisen. Die Mikroorganismen werden ausgewählt aus Bacillus, Bacteridium, Micrococcus und Brevibacterium.
  • Die EPA 356 912 offenbart die Herstellung von optisch aktiven 2-substituierten Carbonsäuren durch Hydrolyse des entsprechenden racemischen Nitrils in Gegenwart eines Mikroorganismus oder Enzyms. Die eingesetzten Mikroorganismen deuten nicht auf die hin, die hier zur Umwandlung von Nitrilen zu den Amid-Vorstufen der Säuren gefunden worden sind.
  • Die EPA 348 902 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven α-substituierten organischen Säure der Formel ii durch Behandlung eines racemischen α-substituierten Nitrils oder Amids der Formel i mit einem Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus und Candida:
  • worin: R&sub1; und R&sub2; jeweils für Halogen, Hydroxy, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy oder einen Heterocyclus stehen, mit der Maßgabe, daß R&sub1; und R&sub2; unterschiedlich sind und X für eine Nitril- oder Amidogruppe steht. Siehe auch Yamamoto et al., Appl. Envir. Microbiol., 56 (10), 3125-9, 1990.
  • Die EPA 330 529 offenbart ein Verfahren, das Brevibacterium und Corynebacterium zur Herstellung der S-Enantiomere von Aryl-2-propionsäuren der Formel iii
  • aus dem entsprechenden racemischen Aryl-2-propionamid, worin Ar ein substituiertes oder unsubstituiertes monocyclisches oder polycyclisches aromatisches oder heteroaromatisches Radikal darstellt, einsetzt.
  • Die U.S. 4 800 162 offenbart die Auflösung von racemischen Gemischen optisch aktiver Verbindungen wie Ester, Amiden, Carbonsäuren, Alkoholen und Ammen unter Verwendung von mehrphasigen und enzymatischen Extraktionsmembranen.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft bestimmte einzelne und kombinierte Stufen eines biologisch katalysierten Verfahrens zur Umwandlung eines racemischen Alkylnitrils zu der entsprechenden R- oder S-Alkansäure über eine Amid-Zwischenstufe. Das Ausgangsnitril ist:
  • worin: A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
  • worin
  • R¹ für C&sub1;-C&sub4;-Alkyl steht;
  • R&sub2; für H oder OH steht;
  • R³ für H, Cl, OCF&sub2;H, (CH&sub3;)&sub2;CHCH&sub2;, H&sub2;C=C(CH&sub3;)CH&sub2;NH, oder und
  • R&sup4; für Cl oder F steht.
  • Bevorzugte Werte für A sind A-1, A-5, A-9, A-10 und A-11. Bevorzugte Werte für A-1 sind diejenigen, worin R³ ausgewählt ist aus der Gruppe Cl, (CH&sub3;)&sub2;CHCH&sub2;, und
  • Bevorzugte Werte für R¹ sind CH&sub3; und CH(CH&sub3;)&sub2;.
  • Gemäß einem Gesichtspunkt unserer Erfindung wird das Nitril (1) zu dem entsprechenden Amid umgewandelt, indem 1 mit einem Nitrilhydratase-Enzym zusammengebracht wird, das das R,S-Gemisch der Nitrile der Formel 1 stereospezifisch entweder zu dem R- oder S-Amid umwandelt, worin das R- oder S-Amid im wesentlichen frei ist von dem Gegen-Enantiomer, wobei sich das Enzym in der Gruppe Pseudomonas, Moraxella oder Serratia (Stufe i) befindet oder sich davon ableitet. Auf die Auflösung des gemischten R- und-S-Enantiomeren eines Nitrils der Formel I zu dem aufgelösten Amid kann gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung eine Umwandlung zu der entsprechenden Säure der Formel I in Stufe ii folgen:
  • Die Amid-Zwischenstufe ist A-C(R¹)(R²)-CONH&sub2;. Weitere und frei wählbare Charakteristika der Erfindung stellen die Racemisierung (Stufe iii) und die anschließende Rückführung von nicht umgewandeltem R- oder S-Nitril, wenn R² für H steht, aus Stufe ii zurück in den Ausgangsreaktor während eines kontinuierlichen Verfahrens bereit. Bei dem kontinuierlichen Verfahren wird der racemische Alkylnitril-Ausgangsreaktant mit einem biologischen Material, das Nitrilhydratase- und Amidase-Enzyme enthält oder umfaßt, gleichzeitig oder nacheinander zusammengebracht, um zuerst zu dem Amid (Stufe i) und dann zu der Säure (Stufe ii) überzugehen. Die Alkylsäure wird kontinuierlich entfernt, und das R- oder S-Alkylnitril-Nebenprodukt, in dem R für H steht, wird durch ein kontinuierliches Verfahren racemisiert und zurückgeführt, bei dem es mit zusätzlichem Alkylnitril kombiniert und mit Enzym(en) kontaktiert wird, wobei sich das Alkylamid und schließlich die Säure bilden.
  • Insbesondere wird die Erfindung charakterisiert durch die Verwendung des vorstehend in Stufe i definierten Hydratase-Enzyms und, falls gewünscht, durch eine anschließende Hydrolyse mit Mineralsäure (Stufe ii) oder mit bekannten Amidase-Enzymen (Stufe ii). Die Nitril-Racemisierung wird charakterisiert durch die Verwendung eines stark basischen Ionenaustauscherharzes in Abwesenheit von wesentlichen Mengen Wasser und am meisten bevorzugt in Gegenwart eines nichtwäßrigen Lösungsmittels wie Methanol, Ethanol, Toluol, Dioxan und dergleichen. Um die Beschreibung der Erfindung zu vereinfachen, wird das Verfahren unter Bezugnahme auf die als geeignet befundenen Enzyme erklärt.
  • Die Enzyme der Stufe i umfassen diejenigen, die in den folgenden Mikroorganismen vorkommen: Pseudomonas spp., z.B. Putida, Aureofaciens, Moraxella spp., Serratia, z.B. Serratia liquefaciens. Diese Enzyme können isoliert oder biosynthetisiert werden und als solche verwendet werden, jedoch ist es im allgemeinen zweckmäßiger, den (die) geeigneten Mikroorganismus(en) einzusetzen.
  • Bei diesem Verfahren zur Hydrierung und Umwandlung eines R,S-Gemisches aus Nitril zu der entsprechenden enantiomeren R- oder S-Säure wird die Stufe i durchgeführt, indem ein stereospezifisches Nitrilhydratase-Enzym einwirkt, das aus einem Mikroorganismus stammt, der durch Züchten des Mikroorganismus in Gegenwart eines Mediums erhalten wird, das zur Produktion der stereospezifischen Nitrilhydratase geeignet ist. Dieses Medium kann Nitrile oder Amide als Enzyminduktoren einschließen, oder im Falle von Pseudomonas putida 5B-MGN-2p, die das Enzym im wesentlichen in Abwesenheit eines Induktors produziert, braucht es nur eine geeignete Stickstoffquelle zum Wachstum (z.B. Ammoniumchlorid) einschließen. Die so erhaltene Nitrilhydratase wird zugesetzt, so daß sie entweder auf das R- oder S-Nitril einwirkt, um das entsprechende R- oder S-Amid zu ergeben. In Stufe ii wird das R- oder S-Amid durch Mineralsäure oder ein Amidase-Enzym zu der entsprechenden R- oder S-Säure hydrolysiert. Dieses Zweistufen-Verfahren führt zu einem Gemisch einer R- oder S-Säure bzw. eines S- oder R-Nitrils. Das chirale Nitril und die chirale Säure werden zunächst durch Neutralisation und Lösungsmittel-Extraktion getrennt. Anschließend kann das chirale Nitril zu einem Gemisch aus R,S-Nitril racemisiert werden, was wiederum stereospezifisch zu dem R- oder S-Amid hydrolysiert werden kann, indem die in Stufe i beschriebene stereospezifische Nitrilhydratase einwirkt.
  • Ein Verfahren zur Induktion der Nitrilhydratase, so daß sie auf das Nitril einwirkt, besteht in der Sammlung des Enzyms aus dem Mirkoorganismus, das es erzeugt und in der Verwendung des Enzyms als Enzym-Präparation auf biologisch anerkannte Weise.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Amidase-Enzym, das sich in Pseudomonas sp. 3L-g-1-5-1a, Pseudomonas sp. 2G-8-5-1a, P. putida 5B-MGN-2p und P. aureofaciens MOB C2-1 oder in einer Variante oder Mutante davon befindet oder davon abstammt, wobei das Material ein racemisches Nitril stereospezifisch zu dem entsprechenden enantiomeren R- oder S-Amid umwandelt.
    • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Im Zusammenhang mit der Offenbarung werden die Bezeichnungen "stereospezifische Reaktion" oder "stereospezifische Nitrilhydratase" durch das enantiomere Verhältnis (E) für die R- und S-Enantiomeren definiert. E entspricht dem Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeit der beiden Enantiomere. Ist E hoch, d.h. größer als 7, so ist die Reaktion stereospezifisch, und wenn E kleiner ist als 7, so ist die Reaktion stereoselektiv. Bevorzugte Reaktionen sind diejenigen, bei denen E größer ist als 8,5, und die am meisten bevorzugten Reaktionen sind diejenigen, bei denen E 10 oder größer ist.
    • Abkürzungen
  • CPIN - 2-(4-Chlorophenyl)-3-methylbutyronitril
  • CPIAM - 2-(4-Chlorophenyl)-3-methylbutyramid
  • CPIA - 2-(4-Chlorophenyl)-3-methylbuttersäure
  • IBCN - 2-(4-Isobutylphenyl)-propionitril
  • IBAm - 2-(4-Isobutylphenyl)-propionamid
  • IBAC - 2-(4-Isobutylphenyl)-propionsäure (Ibuprofen)
  • NPCN - 2-(6-Methoxy-2-naphthyl)-propionnitril
  • NPAm - 2-(6-Methoxy-2-naphthyl)-propionamid
  • NPAC - 2-(6-Methoxy-2-naphthyl)-propionsäure
  • HPLC - Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
  • GC - Gaschromatographie
  • DMSO - Dimethylsulfoxid
    • Stufe i
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen gehören den Gattungen Pseudomonas, Moraxella und Serratia an. Repräsentative Stämme umfassen P. putida 5B-MGN-2P, Moraxella sp. 3L-A-1-5-1a, P. putida 13-5S-ACN-2a, Pseudomonas sp. 3L-G-1-5-1a und Serratia liquefaciens MOB IM/N3. Diese Stämme wurden unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei NRRL (Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University St., Peoria, IL) hinterlegt und tragen die folgenden Zugangsnummern:
  • P. putida 5B-MGN-2P, NRRL-B-18668
  • Moraxella sp. 3L-A-1-5-1a-1, NRRL-B-18671
  • P. putida 13-5S-ACN-2a, NRRL-B-18669
  • Pseudomonas sp. 3L-G-1-5-1a, NRRL-B-18670
  • Serratia liquefaciens, MOB IM/N3, NRRL-B-18821
  • P. putida 2D-11-5-1b, NRRL-B-18820
  • Pseudomonas sp. 2D-11-5-1c, NRRL-B-18819
  • Pseudomonas sp. 2G-8-5-1a, NRRL-B-18833
  • P. aureofaciens MOB C2-1, NRRL-B-18834
  • Die obigen Stämme wurden aus Erde isoliert, die in Orange, Texas, gesammelt worden war. Es wurden Standard-Anreicherungsverfahren mit dem folgenden modifizierten Medium (PR Basismedium) angewendet.
    • PR Basismedium
  • g/l
  • KH&sub2;PO&sub4; 8,85
  • Natriumcitrat 0,225
  • MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,5
  • FeSO&sub4; 7H&sub2;O 0,05
  • FeCl&sub2; 4H&sub2;O 0,0015
  • CoCl&sub2; 6H&sub2;O 0,0002
  • MnCl&sub2; 4H&sub2;O 0,0001
  • ZnCl&sub2; 0,00007
  • H&sub3;BO&sub3; 0,000062
  • NaMoO&sub4; 2H&sub2;O 0,000036
  • MiCl&sub2; 6H&sub2;O 0,000024
  • CuCl&sub2; 2H&sub2;O 0,000017
  • Biotin 0,00001
  • Folsäure 0,00005
  • Pyndoxin HCl 0,000025
  • Riboflavin 0,000025
  • Nicotinsäure 0,000025
  • Pantothensäure 0,00025
  • Vitamin B&sub1;&sub2; 0,000007
  • P-Aminobenzoesäure 0,00025
  • Für die vorstehend beschriebenen Anreicherungen wurden mit dem PR Basismedium die folgenden Zugaben oder Modifikationen vorgenommen: Stamm Anreicherungsnitril (25mM) andere (+-)2-Methylglutaronitril (Aldrich Chem. Co., Milwaukee, WI) Acetonitril 30g Dinatriumsuccinat/1 30g Glucose/1
  • Die Stämme wurden zunächst auf der Grundlage von Wachstum und Ammoniakproduktion mit dem Anreicherungsnitril ausgewahlt. Die Isolate wurden durch wiederholtes Überleiten über Bacto Brain Heart Infusionsagar gereinigt, worauf sie auf die Ammoniakproduktion aus dem Anreicherungsnitril geprüft wurden.
  • Die gereinigten Stamme wurden auf der Grundlage der Membranfettsäure-Analyse der Methylester identifiziert, wobei Standardprotokolle (Mukawaya et al., J. Clin. Microbial, 1989, 27:2640-46) befolgt und die Software Microbial ID und Aerobe Library (Version 3.0) von Microbial ID Inc. (Newark, DE) und die bakteriologischen, physiologischen und biochemischen Standardtests, die nachstehend aufgezählt sind, angewendet wurden. STAMM Charakter Gram-Färbung Zellmorphologie Flagella Pyocyanin Pyoverdin Arginindihydrolase Wachstum bei 41 ºC Gelatine-Hydrolyse Denitrifikation Stärke-Hydrolyse negativ Stäbchen lophotrichos positiv Verwendung als einzige Kohlenstoffquelle Butylamin Inosit Citraconat L-Tartrat Gattung Spezies positiv negativ Pseudomonas putida STAMM Charakter Gram-Färbung Zellmorphologie Oxidase Wachstum auf Citrat Harnstoffhydrolyse aerobe Oxidation von Dextrose aerobe Oxidation von Xylose Indol-Produktion Hydrogensulfid-Produktion Stickstoff-Produktion über Denitrifikation Arginindihydrolase Dextrose-Fermentation Motilität Genus Spezies negativ Stäbchen positiv nicht getestet Pseudomonas sp. kokkenähnliche Stäbchen Moraxella sp. Gruppe 4
  • Zum Testen der Nitrilhydrolyse-Aktivität wurde das PR Basismedium mit 10 g/l Glucose für das Wachstum des Zellmaterials verwendet. Dieses Medium wurde mit 25 mM (±)-2-Methylglutaronitril (5B-MGN-2p, 3L-G-1-5-1a) oder 25 mM 1,4-Dicyanobutan (3L-A-1-5-1a-1, 13-5S-ACN-2a) oder 25 mM Acetamid (alle Stamme) angereichert. P. putida 5B-MGN-2p wurde ebenfalls in Abwesenheit eines Nitril- oder Amidinduktors mit 25 mM NH&sub4;Cl oder (NH4)&sub2;SO&sub4;, das Nitril oder Amid ersetzte, wachsen gelassen. Ein 10-ml-Volumen des Komplettmediums wurde mit 0,1 ml gefrorener Stammkultur (alle Stämme) angeimpft. Nach dem Wachstum über Nacht bei Raumtemperatur (22-25 ºC) auf einem Schüttler bei 250 upm wurde das 10-ml-Inoculum zu 990 ml frischem Medium in einen 2-l-Kolben gegeben. Die Zellen wurden über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren bei einer Geschwindigkeit, die hoch genug war, so daß sich in dem Medium eine Blasenbildung ergab, wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, einmal mit 0,85 % Salzlösung gewaschen, und die konzentrierte Zellpaste wurde sofort zur Lagerung in einen Gefrierschrank bei -70 ºC gegeben. Die aufgetauten Zellpasten, die ungefähr 80 % Wasser enthielten, wurden bei sämtlichen Nitrilhydrolyse-Biokonversionen verwendet.
  • Die obigen stereospezifischen Nitril-hydrolysierenden Mikroorganismen waren die repräsentativen Stamme aus einer Sammlung von Mikroorganismen, die über Anreicherungskulturen, die oben beschrieben worden sind, isoliert wurden. Die stereospezifischen und stereoselektiven Aktivitäten der Nitril-hydrolysierenden Mikroorganismen, die aus den Anreicherungsexperimenten isoliert worden sind, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 STEREOSPEZIFISCHE/STEREOSELEKTIVE HYDROLYSE MIT ANREICHERUNGSISOLATION AUS ERDE Mikroorganismus a Stamm Anreicherungsnitril b R/S c E d NPCN f P.Putida Pseudomonas sp. Moraxella sp. nicht klassifiert P.aureofaciens keine Biokonversion Mikroorganismus a Stamm Anreicherungsnitril b R/S c E d NPCN f Pseudomonas sp. g P.Putida g keine Biokonversion
  • a Stamm-Identifizierung durch Fettsäure-Analyse wie im Text beschrieben
  • b ACN = Acetonitril; MGN = 2-Methylglutaronitril; SBN = S-2-Methylbutyronitril 4CP = 4-Cyanophenol; NAN = 1-Naphthoacetonitril; PBN = Phenylbutylnitril; PPA = Propionamid
  • c Verhältnis von R-Enantomer zu S-Enantomer, das nach 48- bis 64stündiger Inkubation bei 80ºC zurückbleibt, bestimmt durch chirale HPLC
  • d E = Enantomerenverhältnis, wie im Text definiert, bestimmt durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC
  • e NT = nicht getestet
  • f Daten, korrigiert für Spuren von R,S-NPAm, die im Substrat vorhanden sind
  • g 2D-11-5-1b und 2D-11-5-1c, leiten sich ab von 2D-11-5-1. Miroorganismen neigen dazu, einer Mutation zu durchlaufen. Somit können die Bakterien, sogar wenn sie Mutanten oder Varienten eines vorstehend aufgeführten kompetenten Stamm sind, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, solange ihre Kultur eine stereospezifische Nitrilhydratase produziert. Tabelle 1, zusammen mit der hier dargelegten Offenbarung, ermöglicht es einem Fachmann, mit einem Minimum an Experimentierarbeit zusätliche Stämme von Pseudomonas, Moraxelle und Serratia (und ebenso weitere Gattungen) zur Umwandlung sämtlicher Nitril-Ausgangsreakten in ihre entsprechenden Amide/Säuren auszuwählen.
    • Saure Hydrolyse von chiralem Amid zu chiraler Säure
  • Erfindungsgemäß kann Mineralsäure zur Hydrolyse des R- oder S-Amids, das von dem R,S-Nitril stammt, zu der R- oder S-Säure verwendet werden. Ineressanterweise werden chirale Cyanhydrine zu den entsprechenden chiralen Hydroxysäuren mit konzentrierter Mineralsäure hydrolysiert; siehe Effenberger et al., Tetrahedron Letters, 1990, 31 (9): 1249-1252 und die dort zitierten Referenzen. Wir haben jedoch gefunden, daß 2-Aryl-2-alkylacetonitril unter den Bedingungen, bei denen die entsprechenden chiralen Amide zu chiralen Säuren hydrolisiert werden, durch Mineralsäuren nicht hydrolisiert wird. Wie nachstehend beschrieben, kann die chirale Säure leicht von dem unerwünschten Nitril abgetrennt werden.
  • Außerdem kann ein chirales Amid durch ein Amidase-Enzym wie Brevibacterium- und Corynebacterium-Stämme, die in der EPA 326 482 beschrieben sind, hydrolisiert werden. Diese Reaktion erfordert keine stereospezifische Amidase, und darum kann jede Amidase, die racemische 2-Arylalkylamide hydrolisiert, eingestzt werden.
    • Stufe iii Racemisierung von chiralen Nitrilen
  • Die Kombination der stereozpezifische mikrobiellen Nitrilhydrolyse und der Mineralsäure- oder Amidasehydrolyse von Amiden ein Gemisch der gewünschten chiralen Säure und des unerwünschten chiralen Nitrils. Nach Abtrennung des unerwünschten Nitrils von der gewünschten Säure, z. B. durch basische Neutralisation und Lösungsmittelextraction des Nitrils, erfordert die Rückführung des R- oder S-Nitrils die Racemisierung. Wir haben gefunden, daß chirale Nitrile (worin R² für H steht) zu racemischen Nitrilen umgewandelt werden können, indem ein stark basisches Ionenaustauscherharz wie Amberlite -IRA-400(OH)-Harz, Amberlyst -A-26- oder Dowex - 1X6-Harz (nach Austausch mit Hydroxidion) in einem organischen Lösungsmittel verwendet werden kann. Dieses Verfahren führt zu hohen racemischen Nitrilausbeuten ohne eine wesentliche Hydrolyse des Nitrils zu dem entsprechenden Amid oder der entsprechenden Säure. Das resultierende racemische Nitril kann unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zu der entsprechenden R- oder S-Säure hydrolysiert werden.
    • Analytische Verfahrensweisen
  • Die Nitrile und Amid- und Säureprodukte, die sich über eine mikrobielle Hydrolyse oder Mineralsäurehydrolyse ergeben, werden durch Reversed-phase-HPLC gemessen. Der Nachweis erfolgt durch Ultraviolettlicht-Absorption. Eine Zorbax -C18-Säule von Du Pont, die eine mobile Phase aus 70-75 % Methanol und 25-30 % H&sub2;O, angesäuert mit 0,1 % H&sub3;PO&sub4;, oder 67 % Acetonitril und 33 % H&sub2;O, angesäuert mit 0,1 % H&sub3;PO&sub4;, einsetzt, wird verwendet. Die chromatographische Identität und die quantitative Bestimmung der Nitrile und ihre resultierenden Amid- und Säureprodukte können durch Vergleich mit authentischen Standards bestimmt werden.
  • Die chirale HPLC zur Auftrennung der Enantiomere kann mit einer α&sub1;-Säure-Glykoprotein-Säule, erhalten von Chromtech (Schweden) durchgeführt werden. Die mobilen Phasen zur Trennung der verschiedenen Enantiomere sind nachstehend zusammengefaßt. Chirale HPLC-Trennung von Nitril-. Amid- und Säureenantiomeren Enantiomere Mobile Phase Phosphatpuffer Ethanol
  • Die enantiomere Zusammensetzung, Reinheit und chromatographische Identität der obigen Nitrile, Amide und Säuren wurde durch Vergleich mit authentischen Standard- Enantiomeren oder racemischen Gemischen nachgewiesen.
  • Die GC-Analyse von CPIN, CPIAm und CPIA wurde anhand einer Glassäule, 183 cm x 2 mm (i.d.), die 3 % SP2100 auf einem Supelco-Träger (120 mesh) enthielt, durchgeführt. Ein Temperaturprogramm, ausgehend von 5 Minuten bei 125 ºC und mit 8 ºC pro Minute auf 250 ºC, wurde verwendet.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren werden durch die folgenden Beispiele erläutert.
    • Beispiel 1
  • Stufe i: Eine Probe von 100 mg (S-CPIN-, R-CPIN-Hydrolyse) oder 200 mg (R,S-CPIN-Hydrolyse) gefrorener Zellpaste von P. putida 5B-MGN-2P wurde zu 3 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Anschließend wurden 30-40 µmol S-CPIN oder R-CPIN oder R,S-CPIN in 120 µl Dimethylsulfoxid zugegeben. Nach einer 48stündigen Inkubation bei 28 ºC unter Rühren wurden die Reaktionsgemische mit 3 M H&sub2;SO&sub4; auf pH 3,0 angesäuert. Zu jeder Probe wurden vier Volumina Methylenchlorid gegeben, und die Suspensionen wurden 15-30 min gerührt. Die Methylenchloridschichten wurden entfernt und unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft, und die Rückstände wurden in 3 ml Methanol resuspendiert. Die Zusammensetzung der Methanollösung wurde durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt und ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Hydrolyse von S-CPIN, R-CPIN und R,S-CPIN durch P. putida 5B-MGN-2P HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat(µmol zugesetzt) ND =nicht nachgewiesen NT=nicht getestet
    • Beispiel 2
  • Stufe i: Eine Probe von 50 mg gefrorener Zellpaste von P. putida 5B-MGN-2p, erhalten aus den Kulturen, die auf PR Glucosemedium, angereichert mit 25 mM NH&sub4;Cl anstelle von 25 mM (+-)-2-Methylglutaronitril, vermehrt worden war, wurde zu 1 ml Pyrophosphatpuffer (5 mM, pH 7,5) bei Raumtemperatur gegeben, der 20,6 µmol S-CPIN oder R,S-CPIN enthielt. Nach Inkubation bei 28 ºC unter 24stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit 3 M H&sub2;SO&sub4; auf pH 3,0 angesäuert. Jeder Probe wurden vier Volumina Methylenchlorid zugesetzt, und die Suspensionen wurden 15-30 min gerührt. Die Methylenchloridschichten wurden entfernt und unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft, und die Rückstände wurden in 1 ml Methanol resuspendiert. Die Zusammensetzung der Methanollösung wurde durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt und ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Hydrolyse von S-CPIN, R,S-CPIN durch P. putida 5B-MGN-2p, vermehrt in Abwesenheit eines Nitril- oder Amidinduktors HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a NT = nicht getestet b ND =nicht nachgewiesen
    • Beispiel 3
  • Stufe i: Eine 20-mg-Probe gefrorener Zellpaste von P. putida 5B-MGN-2p wurde zu 1 ml Phosphatpuffer (0,3 mM, pH 7,2) gegeben, der MgCl&sub2; 6H&sub2;O (2 mM) bei Raumtemperatur enthielt. Anschließend wurden 0,95 µmol R,S-NPCN in 40 µl Dimethylsulfoxid zugegeben. Nach Inkubation bei 28 ºC unter Rühren für 48 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit 3 M H&sub2;SO&sub4; auf pH 3,0 angesäuert. Es wurden vier Volumina Methylenchlorid zugegeben, und die Suspension wurde 30 min gerührt. Die Methylenchloridschicht wurde entfernt und unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde in 1 ml Methanol resuspendiert. Die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes wurde durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt und ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Hydrolyse von R,S-NPCN durch P. putida 5B-MGN-2P HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase b chiral b Substrat (µmol zugesetzt) ND = nicht nachgewiesen b Daten korrigiert für im Substrat vorhandene Spuren von R,S-NPAm
    • Beispiel 4
  • Stufe i: Eine 40-mg-Probe gefrorener Zellpaste von P. putida SB-MGN-2P wurde zu 1 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Anschließend wurden 10,7 µmol R,S-IBCN in 40 µl Dimethylsulfoxid zugesetzt. Nach 48stündiger Inkubation unter Rühren bei 28 ºC wurde das Reaktionsgemisch mit 3 M H&sub2;SO&sub4; auf pH 3,0 angesäuert. Es wurden vier Volumina Methylenchlorid zugesetzt, und die Suspension wurde 15-30 min gerührt. Die Methylenchloridschicht wurde entfernt und unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde in 1 ml Methanol resuspendiert. Die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes wird durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt und ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Hydrolyse von R,S-IBCN durch P. putida 5B-MGN-2P HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a geschätzter Wert, berechnet durch Subtraktion von µmol IBAm, gewonnen aus µmol IBCN, zugesetzt. ND = nicht nachgewiesen
    • Beispiel 5
  • Stufe i: Eine 50-mg-Probe gefrorener Zellpaste von Moraxella sp. 3L-A-1-5-1a-1 wurde zu 1 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Anschließend wurden 10,3 µmol S-CPIN, R-CPIN oder R,S-CPIN in 40 µl Dimethylsulfoxid zugegeben. Nach 48stündiger Inkubation bei 28 ºC unter Rühren wurden die Reaktionsgemische mit 3 M H&sub2;SO&sub4; auf pH 3,0 angesäuert. Jeder Probe wurden vier Volumina Methylenchlorid zugesetzt, und die Suspensionen wurden 15-30 min gerührt. Die Methylenchloridschichten wurden entfernt und unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft, und die Rückstände wurden in 1 ml Methanol resuspendiert. Die Zusammensetzung der Methanollösung wurde durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt und ist in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Hydrolyse von S-CPIN, R-CPIN und R,S-CPIN durch Moraxella sp. 3L-A-1-5-1a-1 HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a NT = nicht getestet b ND =nicht nachgewiesen
    • Beispiel 6
  • Stufe i: Eine 40-mg-Probe gefrorener Zellpaste von Moraxella sp 3L-A-1-5-1a-1 wurde zu 1 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 wurden 10,7 µmol R,S-IBCN zugesetzt. Im Anschluß an dieselben Inkubations- und Extraktionsprotokolle wie in Beispiel 4 wurde die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes durch Reversed-phase- und chirale HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) Geschätzter Wert, berechnet durch Subtraktion von µmol Amid, gewonnen aus µmol IBCN zugesetzt. b ND =nicht nachgewiesen
    • Beispiel 7
  • Stufe i: Eine 20-mg-Probe gefrorener Zellpaste von Pseudomonas sp. 3L-G-1-5-1a wurde zu Phosphatpuffer (0,3 mM, pH 7,0) gegeben, der MgCl&sub2; 6H&sub2;O(2 mM) bei Raumtemperatur enthielt. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 wurden 0,95 µmol R,S-NPCN zugegeben. Im Anschluß an dieselbe Inkubation und Extraktion wie in Beispiel 3 wurde die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes durch Reversedphase-HPLC und chirale HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Hydrolyse von R,S-NPCN durch Pseudomonas sp. 3L-G-1-5-1a HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a NT = nicht getestet b ND =nicht nachgewiesen Daten, korrigiert für eine in dem Substrat vorhandene Spur von R,S-NPAm.
    • Beispiel 8
  • Stufe i: Eine 100-mg-Probe gefrorener Zellpaste von P. putida 13-5S-ACN-2a wurde zu 3 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurden 30,9 µmol S-CPIN, R-CPIN oder R,S-CPIN zugesetzt. Im Anschluß an dieselben Inkubations- und Extraktionsprotokolle wie in Beispiel 1 wurde die Zusammensetzung der extrahierten Überstände durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Hydrolyse von S-CPIN, R-CPIN, R,S-CPIN durch P. putida 13--5S-ACN-2a HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a NT = nicht getestet b ND =nicht nachgewiesen
    • Beispiel 9
  • Stufe i: Eine 40-mg-Probe gefrorener Zellpaste von P. putida 13-5S-ACN-2a wurde zu Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 wurden 10,7 µmol R,S-IBCN zugegeben. Im Anschluß an dieselben Inkubations- und Extraktionsprotokolle wie in Beispiel 4 wurde die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10 Hydrolyse von R,S-IBCN durch P. putida 13-5S-ACN-2a HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a bestimmter Wert, berechnet durch Subtraktion von µmol IBAm, gewonnen aus µmol IBCN zugesetzt. b ND =nicht nachgewiesen
    • Beispiel 10
  • Stufe i: Eine 50-mg-Probe gefrorener Zellpaste von P. putida 2D-11-5-1b wurde zu 1 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 5 wurden 10,3 umol S-CPIN oder R,S-CPIN zugegeben. Unter Befolgung derselben Inkubations- und Extraktionsprotokolle wie in Beispiel 5 wurde die Zusammensetzung der extrahierten Überstände durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11 Hydrolyse von S-CPIN, R,S-CPIN durch P. putida 2D-11-5-1b HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) ND =nicht nachgewiesen
  • Der anscheinende überschüssige Gewinn an CPIN lag sehr wahrscheinlich an einem experimentellen Fehler.
    • Beispiel 11
  • Stufe i: Eine 50-mg-Probe gefrorener Zellpaste von P. putida 2D-11-5-1b wurde zu 2 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 wurden 10,7 µmol R,S-IBCN zugesetzt. Unter Befolgung derselben Inkubations- und Extraktionsprotokolle wie in Beispiel 4 wurde die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12 Hydrolyse von R,S-IBCN durch P. putida 2D-11-5-1b HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a geschätzter Wert, berechnet durch Subtraktion von µmol IBAm, gewonnen aus µmol IBCN zugesetzt.
    • Beispiel 12
  • Stufe i: Eine 50-mg-Probe gefrorener Zellpaste von S. liquefaciens MOB IM/N3 wurde zu 1 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur zugegeben. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 5 wurden 10,3 µmol S-CPIN, R-CPIN oder R,S-CPIN zugegeben. Unter Befolgen desselben Inkubations- und Extraktionsprotokolls wie in Beispiel 5 wurde die Zusammensetzung der extrahierten Überstände durch Reversedphase-HPLC und chirale HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 13 Hydrolyse von S-CPIN, R-CPIN durch 5. liquefaciens MOB IM/N3 HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a NT = nicht getestet b ND = nicht nachgewiesen
    • Beispiel 13
  • Stufe i: Eine 50-mg-Probe gefrorener Zellpaste von P. aureofaciens MOB C2-1 wurde zu 1 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 5 wurden 10,3 µmol S-CPIN, R-CPIN oder R,S-CPIN zugesetzt. Unter Befolgung desselben Inkubations- und Extraktionsprotokolls wie in Beispiel 5 wurde die Zusammensetzung der extrahierten Überstande durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 zusammengefaßt. Tabelle 14 Hydrolyse von S-CPIN, R-CPIN, R,S-CPIN durch P. aureofaciens MOB C2-1 HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a NT = nicht getestet b ND = nicht nachgewiesen
    • Beispiel 14
  • Stufe i: Eine 50-mg-Probe gefrorener Zellpaste von P. aureofaciens MOB C2-1 wurde zu 1 ml Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) bei Raumtemperatur gegeben. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 wurden 10,7 µmol R,S-IBCN zugegeben. Unter Befolgung desselben Inkubations- und Extraktionsprotokolls wie in Beispiel 4 wurde die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 gezeigt. Tabelle 15 Hydrolyse von R,S-IBCN durch P. aureofaciens MOB C2-1 HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) a geschätzter Wert, berechnet durch Subtraktion von µmol IBAm, gewonnen aus µmol IBCN zugegeben b nicht nachgewiesen
    • Beispiel 15
  • Stufe i: Ungefahr 20 mg gefrorene Zellpaste von Pseudomonas sp. 2G-8-5-1a wurden zu 1 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,2) bei Raumtemperatur gegeben. Anschließend wurde ungefahr 1 µmol R,S-NPCN in 40 µl Dimethylsulfoxid zugegeben. Nach der 48stündigen Inkubation bei 28 ºC unter Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit 3 M H&sub2;SO&sub4; auf pH 3,0 angesäuert. 4 Volumina Methylenchlorid wurden zugegeben, und die Suspension wurde 30 min gerührt. Die Methylenchloridschicht wurde entfernt und unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde erneut in 1 ml Methanol aufgelöst. Die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes wurde durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC, wie anderweitig beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt. Tabelle 16 Hydrolyse von R,S-NPCN durch Pseudomonas sp.2G-8-5-1a HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase b chiral b Substrat (µmol zugesetzt) b ND = nicht nachgewiesen b Daten korrigiert für eine Spur von R,S-NPAm, die in Substrat vorhanden war
    • Beispiel 16
  • Stufe i: Ungefahr 10 mg gefrorene Zellpaste von Pseudomonas sp. 2D-11-5-1c wurden zu 1 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,2) bei Raumtemperatur gegeben. Anschließend wurde ungefahr 1 µmol R,S-NPCN in 40 µl Dimethylsulfoxid zugegeben. Nach der 48stündigen Inkubation bei 28 ºC unter Rühren wurde das Rekktionsgemisch mit 3 M H&sub2;SO&sub4; auf pH 3,0 angesäuert. Vier Volumina Methylenchlorid wurden zugegeben, und die Suspension wurde 30 min gerührt. Die Methylenchloridschicht wurde abgetrennt und unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde wieder in 1 ml Methanol aufgelöst. Die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes wurde durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC, wie anderweitig beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt. Tabelle 17 Hydrolyse von R,S-NPCN durch Pseudomonas sp. 2D-11-5-1c HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase b chiral b Substrat (µmol zugesetzt) b ND = nicht nachgewiesen b Daten korrigiert für in dem Substrat vorhandene Spur von R,S-NPAm.
    • Beispiel 17
  • Stufe i: Ungefähr 2 mg gefrorene Zellpaste von P. aureofaciens MOB C2-1 wurden zu 1 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,2) bei Raumtemperatur gegeben. Anschließend wurde ungefähr 1 µmol R,S-NPCN in 40 µl Dimethylsulfoxid zugegeben. Nach der 48stündigen Inkubation bei 28 ºC unter Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit 3 M H&sub2;SO&sub4; auf pH 3,0 angesäuert. Vier Volumina Methylenchlorid wurden zugegeben, und die Suspension wurde 30 min gerührt. Die Methylenchloridschicht wurde entfernt und unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde erneut in 1 ml Methanol aufgelöst. Die Zusammensetzung des extrahierten Überstandes wurde durch Reversed-phase-HPLC und chirale HPLC, wie anderweitig beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 gezeigt. Tabelle 18 Hydrolyse von R,S-NPCN durch P.aureofaciens MOB C2-1 HPLC-Analyse (µmol gewonnen) Reversed phase chiral Substrat (µmol zugesetzt) b ND = nicht nachgewiesen b Daten korrigiert für eine im Substrat vorhandene Spur von R,S-NPAm.
    • Beispiel 18
  • Stufe ii: Eine Suspension von 1,00 g S-CPIAm in 16 ml wäßriger Chlorwasserstoffsäure (18 %) wurde gerührt und zum Rückfluß erhitzt. Nach dem Erhitzen der Suspension löste sich der Feststoff auf. Nach 16 Std. wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt. Der Feststoff, der ausfiel und sich um den Rührer verfestigte, wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Das Eindampfen des Extraktes hinterließ 0,98 g farblosen Feststoff, der durch eine Kombination aus GC und HPLC analysiert wurde. Es zeigte sich durch GC, daß es hauptsächlich CPIA (92,3 Flächenprozent) war, wobei der Rest unverändertes Amid war. Die Konfiguration der Säure wurde mit chiraler HPLC als das S-Enantiomer (wenigstens 98,2 %) aufgeklärt, mit nur einer Spur des racemisierten R-Enantiomeren.
    • Beispiel 19
  • Stufe ii: Die Reaktion wurde wie in Beispiel 18 unter Verwendung von 1,02 g S-CPIAm und 15 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure wiederholt. Nach ungefahr 16 Std. unter Rückfluß wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt, und der ausgefallene Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und an der Luft getrocknet. Es wurde 0,96 g farbloser Feststoff gewonnen, der durch GC/Massenspektrometrie und durch HPLC charakterisiert wurde. Die Hauptkomponente wurde als CPIA (96 %) mit etwa 4 % unverändertem Amid identifiziert. Die chirale HPLC zeigte, daß die Säure aus 96,6 % des 5-Enantiomeren und 3,4 % des R-Enantiomeren bestand.
    • Beispiel 20
  • Stufe iii: 1 g nasser Amberlite IRA-400 (OH-Form) wurde mit 10 ml 5 % NAOH 10 min unter Rühren behandelt, filtriert und mit destilliertem Wasser gewaschen, bis die Waschlösungen neutral waren. Der Feststoff wurde in 25 ml absolutem Ethanol suspendiert, und 1,06 g R-CPIN wurde zugegeben. Dieses wurde gerührt und unter Rückfluß 64 Std. erhitzt. Nach der Entfernung des Harzes durch Filtration wurde das Filtrat abgekühlt und am Rotationsverdampfer eingedampft, so daß 1,01 g farbloses Öl zurückblieben. Die chirale HPLC-Analyse zeigte, daß das Öl ein 50/50-Gemisch von R- und S-CPIN war.
  • Ein Verfahren, das die relative Stabilität der R,S-Alkylnitrile wie CPIN und ihre geringe Umwandlung zu den entsprechenden Säuren unter relativ scharfen Reaktionsbedingungen zeigt, lautet wie folgt. Eine Suspension von 9,70 g R,S-CPIN in 100 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure wurde 16 Std. unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels hinterließ ein farbloses Öl, das durch GC charakterisiert wurde. Es war eine einzige Hauptkomponente (über 90 %) mit derselben Retentionszeit wie das authentische Ausgangsnitril. Es gab kein Anzeichen für die entsprechende Säure, die durch Hydrolyse erzeugt worden wäre.

Claims (25)

1. Verfahren zur Umwandlung eines Nitrils der Formel
worin: A ausgewahlt wird aus der Gruppe, bestehend aus
R¹ für C&sub1;-C&sub4;-Alkyl steht;
R² für H oder OH steht;
R³ für H, Cl, OCF&sub2;H, (CH&sub3;)&sub2;CHCH&sub2;, H&sub2;C=C(CH&sub3;)CH&sub2;NH,
steht; und
R&sup4; für Cl oder F steht;
zu dem entsprechenden Amid, umfassend das Zusammenbringen des Nitrils mit einem Nitrilhydrataseenzym, das das racemische Nitril stereospezifisch in das entsprechende enantiomere R- oder S-Amid umwandelt, wobei sich das Enzym in der Gruppe Pseudomonas, Moraxella und Serratia befindet oder davon abstammt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem A ausgewählt wird aus der Gruppe
und R¹ ausgewählt wird aus CH&sub3; und CH(CH&sub3;)&sub2;.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem A ausgewählt wird aus der Gruppe und
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Nitril ausgewählt aus der Gruppe (2-(4-Chlorphenyl)-3-methylbutyronitril, 2-(4-Isobutylphenyl)-propionitril und 2-(6-Methoxy-2-naphthyl)-propionitril.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Nitril ausgewählt wird aus der Gruppe 2-(4-Chlorphenyl)-3-methylbutyronitril und 2-(6-Methoxy-2-naphthyl)-propionitril.
6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem sich das Enzym in Pseudomonas putida, Moraxella sp. und Serratia liquefaciens befindet oder davon stammt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem sich das Enzym in Pseudomonas putida befindet oder davon abstammt.
8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem sich das Enzym in Moraxella sp. befindet oder davon abstammt.
9. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem sich das Enzym in Serratia liquefaciens befindet oder davon abstammt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die zusätzliche Stufe der Hydrolyse des enantiomeren Amids zu der entsprechenden 2-Alkansäure.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem eine starke Mineralsäure zur Hydrolyse des Amids zu der Säure eingesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem ein biologisches Mateilal zur Hydrolyse des Amids zu der Säure eingesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das biologische Material ein Amidaseenzym ist, das sich in einem Stamm, ausgewählt aus Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, Serratia und Moraxella befindet oder davon abstammt.
14. Kontinuierliches Verfahren zur Herstellung einer enantiomeren 2-Alkansäure nach Anspruch 10, bei der R² für H steht, umfassend die kontinuierliche Entfernung der Säure, die Racemisierung des enantiomeren Nitril-Nebenproduktes der Nitril-zu- Säure-Reaktion dadurch, daß es mit einem starken basischen Ionenaustauscherharz zusammengebracht wird, und Recycling des racemischen Nitrils.
15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Ionenaustauscherharz ein vernetztes Polymer ist, das eine quaternäre Ammoniumhydroxid-Funktionalität enthält.
16. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem sich das Amidaseenzym in Pseudomonas Sp. 3L-6-1-5-1a, Pseudomonas sp. 2G-8-5-1a, P. putida 5B-MGN-2p und P. aureofaciens MOB C2-1 befindet oder davon oder von einer Mutante oder Variante davon abstammt, die in der Lage ist, ein racemisches Nitril zu dem entsprechenden enantiomeren R- oder S-Amid stereospezifisch umzuwandeln.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, bei dem das Amid ausgewählt wird aus der Gruppe 2-(4-Chlorphenyl)-3-methylbutyramid, 2-(4-Isobutylphenyl)propionamid und 2-(6-Methoxy-2-naphthyl)-propionamid.
18. Amidaseenzym, das sich in Pseudomas sp. 3L-G-1-5-1a (NRLL-B-18670), Pseudomonas sp. 2G-8-5-1a (NRLL-B-18833), P. putida 5B-MGN-2p (NRLL-B- 18668), P. aurofaciens MOB C2-1 (NRLL-B-18834), P. putida 13-5S-ACN-2a, NRLL-B-18669, Serratia liquefaciens MOB IM/N3, NRRL-B-18821, P. putida 2D-11-5-1b, NRRL-B-18820 befindet oder sich davon oder von einer Mutante oder Variante davon ableitet, die in der Lage ist, ein racemisches Nitril stereospezifisch zu dem entsprechenden enantiomeren R- oder S-Amid umzuwandeln.
19. Pseudomonas sp. 3L-G-1-5-1a, NRLL-B-18670 und Mutanten und Varianten davon, die ein stereospezifisches Nitrilhydrataseenzym umfassen, das in der Lage ist, ein racemisches Nitril stereospezifisch in das entsprechende enantiomere R oder S-Amid umzuwandeln.
20. Pseudomonas sp. 2G-8-5-1a, NRRL-B-18833 und Mutanten und Varianten davon, die ein stereospezifisches Nitrilhydrataseenzym umfassen, das in der Lage ist, ein racemisches Nitril stereospezifisch in das entsprechende enantiomere R- oder S-Amid umzuwandeln.
21. P. putida 5B-MGN-2p, NRRL-B-18668 und Mutanten und Varianten davon, die ein stereospezifisches Nitrilhydrataseenzym umfassen, das in der Lage ist, ein racemisches Nitril stereospezifisch in das entsprechende enantiomere R- oder S-Amid umzuwandeln.
22. P. aureofaciens MOB C2-1, NRRL-B-18834 und Mutanten und Varianten davon, die ein stereospezifisches Nitrilhydrataseenzym umfassen, das in der Lage ist, ein racemisches Nitril stereospezifisch in das entsprechende enantiomere R- oder S-Amid umzuwandeln.
23. P. putida 13-5S-ACN-2a, NRRL-B-18669 und Mutanten und Varianten davon, die ein stereospezifisches Nitrilhydrataseenzym umfassen, das in der Lage ist, ein racemisches Nitril stereospezifisch in das entsprechende enantiomere R- oder S-Amid umzuwandeln.
24. Serratia liquefaciens MOB 1M/N3, NRRL-B-18821 und Mutanten und Varianten davon, die ein stereospezifisches Nitrilhydrataseenzym umfassen, das in der Lage ist, ein racemisches Nitril stereospezifisch in das entsprechende enantiomere R- oder S-Amid umzuwandeln.
25. P. putida 2D-11-5-1b, NRRL-B-18820 und Mutanten und Varianten davon, die ein stereospezifisches Nitrilhydrataseenzym umfassen, das in der Lage ist, ein racemisches Nitril stereospezifisch in das entsprechende enantiomere R- oder S-Amid umzuwandeln.
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