EP1005563A1 - VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG ENANTIOMERENREINER CYCLISCHER alpha-AMINOSÄUREN BZW. DEREN N-GESCHÜTZTER DERIVATE MITTELS EINER D-SPEZIFISCHEN AMINOACYLASE - Google Patents

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG ENANTIOMERENREINER CYCLISCHER alpha-AMINOSÄUREN BZW. DEREN N-GESCHÜTZTER DERIVATE MITTELS EINER D-SPEZIFISCHEN AMINOACYLASE

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EP1005563A1
EP1005563A1 EP98946316A EP98946316A EP1005563A1 EP 1005563 A1 EP1005563 A1 EP 1005563A1 EP 98946316 A EP98946316 A EP 98946316A EP 98946316 A EP98946316 A EP 98946316A EP 1005563 A1 EP1005563 A1 EP 1005563A1
Authority
EP
European Patent Office
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protected
proline
microorganisms
amino acid
source
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98946316A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Sauter
Oleg Werbitzky
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Lonza AG
Original Assignee
Lonza AG
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture

Definitions

  • the present invention relates to microorganisms which are capable of one or more N-protected cyclic amino acid derivatives selected from the compounds of the general formula
  • a together with -N- and -CH represent an optionally substituted 4-, 5-, 6- or 7- membered saturated heterocyclic ring and R 1 each represents optionally substituted alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy, in the form of the racemate or one of the optically active isomers as the only C source, as the only N source or as the only C and N source, and / or are able to hydrolyze them.
  • R 1 each represents optionally substituted alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy, in the form of the racemate or one of the optically active isomers as the only C source, as the only N source or as the only C and N source, and / or are able to hydrolyze them.
  • D-amino acids such as D-Prohn are important intermediates for the manufacture of pharmaceuticals (J Org Chem 1994, 59, 7496-7498)
  • JP-A 01 005 488 encompasses a process for the preparation of D-amino acid acylases which, for example, hydrolyze N-benzyloxycarbonylmethionine in D-methionine, N-benzyloxycarbonyl-L-methionine being obtained.
  • JP-A 07 127 354 comprises a process for the preparation of D-proline starting from ornithine by means of microorganisms of the species Proteus mitajiri.
  • a disadvantage of this process is that on the one hand the educt ornithine is too expensive, and on the other hand that D-proline is inferior Yield is obtained
  • JP-A 92 183 399 discloses a process for the preparation of D-proline starting from (DL) -proline using microorganisms of the genus Candida or trichospora. This process also has the disadvantage that D-proline is obtained in low yield
  • the object of the present invention is to provide a simple and technically viable method for producing both N-protected cych L-amino acid derivatives and cych D-amino acids.
  • the corresponding products are to be isolated in good enantiomeric purity
  • microorganisms according to the invention can be isolated, for example, from soil samples, sludge or wastewater, in particular contaminated soil or clear sludge, with the aid of customary microbiological techniques cyclic amino acid derivatives of the general formula I, in the form of the racemate or one of the optically active isomers, __
  • the microorganisms are expediently first enriched in a corresponding liquid culture and the anaerobic or aerobic microorganisms are isolated from the culture obtained, the desired N-protected cychino amino acid derivatives as the only N source, as the only C source or as the only C and Can utilize the N source and / or are able to hydrolyze it
  • optionally substituted saturated 4-membered heterocyclic rings are azetidine.
  • optionally substituted saturated 5-membered heterocyclic rings are proline, hydroxyproline, pyrazolidine, methylpyrazolidine, imidazolidine, pyroglutamate, oxazolidine, isoxazolane, thiazolidine and triazolidine
  • optionally substituted saturated 6-membered heterocyclic rings are piperidine. 3-methylpiperidine, piperazine, pipecolin, 3-methylpiperazine, morpholine
  • R 1 in the N-protected cychino amino acid derivative of the general formula 1 means alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy
  • Alkyl here means a substituted or unsubstituted C 1 -C alkyl group, preferably a substituted or unsubstituted C 1 -C alkyl group. Suitable substituents are, for. B hydroxy or halogens such as F, Cl. Br or J Examples of a Ci-is-alkyl group are methyl, chloromethyl, trifluoromethyl, co-hydroxyalkyl, ethyl, propyl, butyl, iso-butyl, iso-propyl and stearyl ⁇ -hydroxyalkyl group in the following means a hydroxymethyl, hydroxyethyl, Hydroxypropyl or Hydroxybutyl Group Preferably alkyl means methyl
  • Alkoxy means a substituted or unsubstituted C 1 8 alkoxy group, preferably a substituted or unsubstituted C 4 alkoxy group. Suitable substituents are, for example, the substituents mentioned for alkyl. Examples of an alkoxy group are methoxy, chloromethoxy, trifluoromethoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, tert -butoxy, iso-butoxy and stearoxy
  • Aryloxy preferably means benzyloxy
  • the compounds of the general formula I are preferably N-protected cyclic D-amino acid derivatives
  • N-protected cyclic D-amino acid derivatives are N-protected D-proline derivatives, for example N-acetyl and / or N-benzyloxycarbonyl-D-proline (N-Z-D-proline), and N-protected D-pipecolinic acid derivatives
  • the microorganisms can use, for example, sugar, sugar alcohols, or carboxylic acids as a growth substrate as a suitable C source.
  • Hexose for example glucose and fructose, pentoses, for example ribose, or disaccharides, for example sucrose
  • Amino carboxylic acids, mono-, di - or tricarboxylic acids or their salts can be used.
  • mannitol or glycerin can be used as sugar alcohols.
  • proline, glutamate, lysine, glycine or their salts can be used as amino carboxylic acids.
  • Acetic acid, acetate, lactic acid can be used as mono-, di- or tricarboxylic acids. Lactate, succinic acid, succinate, malic acid, malate, citric acid, citrate or their salts are used
  • the microorganisms can, for example, ammonium, nitrate, urea as a suitable N source.
  • the media customary in the art for example the medium described in Table 1, can preferably be used as the selection and growth medium.
  • the medium described in Table 1 is preferably used
  • the active enzymes of the microorganisms are expediently induced during the cultivation and selection.
  • An N-protected cyclic amino acid derivative according to formula I, preferably its D-isomer, is expediently used as the enzyme inducer
  • the cultivation and selection is usually carried out at a temperature of 5 to 100 ° C., expediently from 10 to 75 ° C., preferably from 15 to 40 ° C., in particular from 20 to 35 ° C. and at a pH between pH 0 and pH 12, expediently from pH 4 to 10, preferably between pH 5 and pH 9
  • microorganisms are microorganisms corresponding to the microorganisms with the designation MIS1 12, MIS125, MIS132, MIS211, MIS213, MIS221, MIS222.
  • MIS231, MIS242, MIS253 Particularly preferred are microorganisms of the genus Arthrobacter, such as the species Arthrobacter oxydans GS121, Arthrobacter sp GS132, Arthrobacter pascens or ramosus GS131 (DSM 1 1637), Arthrobacter pascens or ramosus GS134, and their variant organisms and mutant mutants GS131 were deposited on 30.06.1997 with the German Collection of Microorganisms and Zellkultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, according to the Budapest Treaty under the deposit number DSM 1 1637 "Flinktionally equivalent ⁇ ⁇ arianten and mutants" are understood to mean microorganisms which are derived from the described original organisms and
  • a together with -N- and -CH and R 1 have the meaning given, comprises the reaction of a racemic N-protected cych aminosaur derivative of the general formula
  • a together with -N- and -CH and R 1 have the meaning given, by means of the microorganisms already described and / or an enzyme preparation thereof, into a cyclic D-amino acid (formula III) and / or the N- protected cychschen L-amino acid derivatives (formula II), and optionally isolation of these compounds
  • N-protected cyclic amino acid derivatives of the formula I are used as N-protected cyclic amino acid derivatives of the formula I.
  • the educts, the racemic N-protected cyclic amino acid derivatives of the general formula I such as, for example, NZ- (DL) -proline, are commercial compounds
  • biotransformation is possible with all microorganisms that utilize and / or hydrolyze an N-protected cyclic amino acid derivative in the form of the racemate or its optically active isomers as the only N source, as the only C source or as the only C and N source Enzyme extracts from these microorganisms are also suitable.
  • Biotransformation is preferably carried out with the microorganisms described above, in particular with the microorganisms described above of the species Arthrobacter pascens or ramosus GS131 (DSM 1 1637) or with their functions! equivalent variants and mutants
  • the biotransformation can be carried out with resting cells (non-growing cells which no longer require a carbon and energy source) or with growing cells under aerobic or anaerobic conditions.
  • the biotransformation is preferably carried out with resting cells under aerobic conditions
  • Biotransformation for example low-molar buffers such as low-molar phosphate buffer, Tris buffer or the medium described in Table 1.
  • the biotransformation is preferably carried out in the medium according to Table 1
  • the biotransformation is expediently carried out by adding an N-protected amino acid derivative so that the concentration does not exceed 50% by weight, preferably 20% by weight.
  • the N-protected amino acid derivative is expediently added once or continuously
  • the pH of the medium can be in a range from 3 to 12, preferably from 5 to 9.
  • the biotransformation is expediently carried out at a temperature of 10 to 70 ° C., preferably 20 to 50 ° C.
  • an N-protected cyclic amino acid derivative is converted into a cyclic D-amino acid.
  • An N-protected L-amino acid derivative is obtained.
  • the cyclic D-amino acid and the N-protected L-amino acid derivative can be obtained in good yield and Enantiomeric purity (ee greater than 98%) can be isolated
  • N-protected L-amino acid derivative obtained in this way and / or the D-amino acid obtained in this way can be isolated by customary workup methods, such as, for example, by extraction
  • Vitamin solution 1.0 ml / 1 pH 7.0
  • C and N sources were added to this basic medium
  • the isolates obtained with the method described in Example 1 (A) were multiplied in the medium described there.
  • the cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed after resuspending in saline solution the ability to hydrolysis of N-protected cych amino acids was tested with resting cells
  • a suitable amount of cells with 25 mM N-acetyl- (DL) -proline, NZ- (DL) -proline and NZ- (DL) -pipecolinic acid or 12.5 mM N-acetyl- (DL) -pipecolinic acid incubated in buffer solution (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) under rubble (30 ° C).
  • Figure 1 shows the reaction of MIS132 and MIS222 with N-Z- (DL) -pipecolinic acid
  • the isolates obtained with the method described in Example 1 (B) were multiplied in the medium described there.
  • the cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed. After resuspending in saline solution the ability to hydrolysis of N-protected cycho amino acids was tested with resting cells.
  • a suitable amount of cells with 100 mM NZ-DL-proline or 50 mM NZ-DL-pipecolic acid in buffer solution (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) below
  • GS131 In order to characterize bacterial strain GS131 in more detail, the growth of this strain was investigated with different C and N sources.
  • the basic medium described in Table 1 was used and the C sources were added to 10 g / 1 each and the N sources to a final concentration of 40 mM. The cultures were then incubated at 30 ° C. GS131 was able to utilize a wide variety of C and N sources and even showed good growth in most of the media examined.
  • Bacterial strain GS131 was grown under variation of different media components or their concentration at 30 ° C. The cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed. After resuspending in saline solution, the ability to hydrolyze N-Z-D-proline was examined with resting cells under aerobic conditions.
  • Bacterial strain GS131 was propagated in the medium described in Example 1 (B). The cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed. After resuspending in saline solution, the ability to Hydrolysis of N-protected cych amino acids was tested. A suitable amount of cells with the respective substrate (10 mM NZL-proline or NZD-proline or 5 mM NZL-pipecolic acid or N-ZD-pipecolic acid) in buffer solution (50 mM phosphate buffer , pH 7.0) (30 ° C.) Aliquots were removed at various times and the wetting of the substrates was monitored by HPLC
  • Figure 2 shows the enantioselectivity of D-aminoacylase from bacterial strain GS 131
  • Bacterial Strain GS131 was propagated in the medium described in Example 1 (B). The cells thus produced were harvested by centrifugation and then in saline solution (8.5 g / 1) Resuspended and washed After resuspending in saline solution, the ability to hydrolize N-protected cych amino acids was tested with resting cells.
  • NZL-pipecolic acid was then obtained by extraction three times (40 ml each) with butyl acetate. The organic phases were combined, dried over sodium sulfate and finally until evaporated to dryness After dissolving the solid in 10 ml of ethyl acetate and adding 9 ml of hexane, NZL-pipecolic acid was crystallized by cooling to a temperature ⁇ 10 ° C. After filtration and drying, 13.22 g of NZL-pipecolinic acid (64.9% of theory Th) received

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Abstract

Beschrieben werden neue Mikroorganismen, die befähigt sind, ein N-geschütztes cyclisches Aminosäurederivat, ausgewählt aus den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Form des Racemats oder eines seiner optischen Isomere, worin A zusammen mit -N- und -CH einen gegebenenfalls substituierten 4-, 5-, 6- oder 7-gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring und R1 jeweils gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy bedeutet, als einzige C-Quelle, als einzige N-Quelle oder als einzige C- und N-Quelle zu verwerten und/oder befähigt sind, ein N-geschütztes cyclisches Aminosäurederivat, ausgewählt aus den Verbindungen der allgemeinen Formel (I), zu hydrolysieren, sowie Enzymextrakte daraus. Desweiteren wird ein neues Verfahren zur Herstellung von N-geschützten cyclischen L-Aminosäurederivaten und cyclischen D-Aminosäuren unter Verwendung dieser Mikroorganismen beschrieben.

Description

Verfahren zur Herstellung enantiomerenreiner cyciischer α-A inosäuren bzw. deren N-geschiitzter Derivate mittels einer D-spezifischen Aminoacylase.
Die voriiegende Erfindung betrifft Mikroorganismen, die befähigt sind, ein oder mehrere N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate ausgewählt aus den Verbindungen der allgemeinen Formel
worin A zusammen mit -N- und -CH einen gegebenenfalls substituierten 4-, 5-, 6- oder 7- gliedrigen gesattigten heterocyciischen Ring bedeutet und R1 jeweils gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy bedeutet, in Form des Racemats oder eines der optisch aktiven Isomeren als einzige C-Quelle, als einzige N-Quelle oder als einzige C- und N- Quelle zu verwerten, und/oder befähigt sind, diese zu hydrolysieren Diese Mikroorganismen bzw die Enzymextrakte daraus werden für ein neues Verfahren zur Herstellung von N-ge- schützten cychschen L-Aminosaurederivaten und/oder cychschen D-Aminosauren eingesetzt
D-Aminosauren wie z B D-Prohn sind wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von Pharmazeutika (J Org Chem 1994, 59, 7496-7498)
Zur Herstellung von D-Aminosauren sind mehrere Verfahren bekannt Die JP-A 01 005 488 umfasst ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosaureacylasen, die z B N-Benzyloxycarbonylmethionin in D-Methionin hvdroiysieren, wobei N-Benzyloxycarbonyl-L- methionin anfallt Diese D-Aminosaureacyiasen hydrolysieren zum einen keine cychschen N-geschutzten Aminosäuren, zum anderen wird die N-Benzyloxycarbonylgruppe (Z-Gruppe) von ihnen schlecht hydrolysiert Die JP-A 07 289 275 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von D-Prolin durch Umsetzen von L-Prohn mittels Mikroorganismen der Gattung Escherichia mit Racemaseaktivitat zum (DL)-Prolin, welches dann mittels Mikroorganismen, die das nicht geschützte L-Prolin verwerten, metabolisiert wird, um D-Prolin zu erhalten D-Proiin wird dabei in schlechter Aus- beute erhalten
Die JP-A 07 127 354 umfasst ein Verfahren zur Herstellung von D-Prolin ausgehend von Ornithin mittels Mikroorganismen der Spezies Proteus mitajiri Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass zum einen das Edukt Ornithin zu kostspielig ist, zum anderen, dass D-Prolin in schlechter Ausbeute erhalten wird
Die JP-A 92 183 399 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von D-Prolin ausgehend von (DL)-Prolin mittels Mikroorganismen der Gattung Candida oαer Trichospora Auch dieses Verfahren hat den Nachteil, dass D-Prolin in geringer Ausbeute erhalten wird
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches und technisch gangbares Verfahren zur Herstellung sowohl von N-geschutzten cychschen L-Aminosaurederivaten als auch von cychschen D-Aminosauren bereitzustellen Dabei sollen die entsprechenden Produkte in guter Enantiomeren-Reinheit isoliert werden
Diese Aufgabe wird mit den Mikroorganismen gemäss Anspruch 1 und dem Verfahren gemäss Anspruch 5 gelost
Die erfindungsgemassen Mikroorganismen können beispielsweise aus Bodenproben, Schlamm oder Abwasser, insbesondere kontaminierten Boden oder Klarschlmm, unter Zuhilfenahme üblicher mikrobiologischer Techniken isoliert werden Die Mikroorganismen sind aus derartigen Proben durch Selektion erhaltlich, insbesondere durch selektive Züchtung mit einem geeigneten Medium enthaltend ein oder mehrere N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate der allgemeinen Formel I, in Form des Racemats oder eines der optisch aktiven Isomeren, __
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die genannte Bedeutung haben, und zwar
• als einziger C- und N-Quelle oder
• als einziger N-Quelle mit einer geeigneten C-Quelle oder
• als einziger C-Quelle mit einer geeigneten N-Quelle
Dabei werden die Mikroorganismen zweckmäßig zunächst in einer entsprechenden Flüssigkultur angereichert und aus der erhaltenen Kultur werden dann die anaeroben oder aeroben Mikroorganismen isolieπ, die die gewünschten N-geschutzten cychschen Aminosaurederivate als einzige N-Quelle, als einzige C-Quelle oder als einzige C- und N- Quelle verwerten können und/oder befähigt sind, diese zu hydrolysieren
Beispiele für gegebenenfalls substituierte gesattigte 4-gliedrige heterocyclische Ringe sind Azetidin. Methylazetidin, Diazetidin
Beispiele für gegebenenfalls substituierte gesattigte 5-gliedrige heterocyclische Ringe sind Prolin, Hydroxyprolin, Pyrazolidin, Methylpyrazolidin, Imidazolidin, Pyroglutamat, Oxazolidin, Isoxazolan, Thiazolidin und Triazolidin
Beispiele für gegebenenfalls substituierte gesättigte 6-gliedrige heterocyclische Ringe sind Piperidin. 3-Methylpιperidin, Piperazin, Pipecolin, 3-Methylpiperazin, Morpholin
Beispiele für gegebenenfalls substituierte 7-gliedrige heterocyclische Ringe sind ε-Capiolactam und Azetin Der Rest R1 im N-geschutzten cychschen Aminosaurederivat der allgemeinen Formel 1 bedeutet Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy
Alkyl bedeutet dabei eine substituierte oder unsubstituierte Cι-ι_-Alkylgruppe, vorzugsweise eine substituierte oder unsubstituierte Cι- - Alkyl gruppe Geeignete Substituenten sind z. B Hydroxy oder Halogene wie F, Cl. Br oder J Beispiele für eine Ci-is-Alkylgruppe sind Methyl, Chlormethyl, Trifluormethyl, co-Hydroxyalkyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Iso-butyl, Iso-propyl und Stearyl ω-Hydroxyalkylgruppe bedeutet im folgenden eine Hydroxymethyl-, Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Hydroxybutylgruppe Vorzugsweise bedeutet Alkyl Methyl
Alkoxy bedeutet eine substituierte oder unsubstituierte Cι.]8-Alkoxygruppe, vorzugsweise eine substituierte oder unsubstituierte Cι-4-Alkoxygruppe Geeignete Substituenten sind beispielsweise die für Alkyl genannten Substituenten Beispiele für eine Alkoxygruppe sind Methoxy, Chlormethoxy, Trifluormethoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy, Tert-butoxy, Iso-butoxy und Stearoxy
Als Aryl wird eine Phenyl- oder Benzylgruppe, substituiert oder unsubstituiert, beispielsweise 4-Methoxybenzyl oder 4-Methoxyphenyl, eingesetzt. Als Aryloxy wird eine Phenyloxy- oder Benzyloxygruppe, substituiert oder unsubstituiert, eingesetzt. Beispiele für eine Aryloxygruppe sind Benzvloxy, 4-Methoxybenzyloxy oder 4-Nitrobenzyloxy. Bevorzugt bedeutet Aryloxy Benzyloxy
Bevorzugt handelt es sich bei den Verbindungen der allgemeinen Formel I um N-geschutzte cyclische D-Aminosaurederivate
Besonders bevorzugte N-geschutzte cyclische D-Aminosaurederivate sind N-geschutzte D-Prolinderivate, beispielsweise N-Acetyl- und/oder N-Benzyloxycarbonyl-D-Prolin (N-Z-D- Prolin), und N-geschutzte D-Pipecolinsaurederivate
Als geeignete C-Quelle können die Mikroorganismen beispielsweise Zucker, Zuckeralkohole, oder Carbonsauren als Wachstumssubstrat nützen Als Zucker können Hexose, beispielsweise Glucose und Fructose, Pentosen, beispielsweise Ribose, oder Disaccharide, beispielsweise Saccharose, verwendet werden Als Carbonsauren können Aminocarbonsauren, Mono-, Di- oder Tricarbonsauren bzw deren Salze verwendet werden Als Zuckeralkohole können beispielsweise Mannit oder Glycerin Verwendung finden Als Aminocarbonsauren können beispielsweise Prolin, Glutamat, Lysin, Glycin bzw deren Salze verwendet werden Als Mono-, Di- oder Tricarbonsauren können Essigsaure, Acetat, Milchsaure. Lactat, Bernsteinsaure, Succinat, Apfelsaure, Malat, Citronensaure, Citrat bzw deren Salze verwendet werden
Als geeignete N-Quelle können die Mikroorganismen beispielsweise Ammonium, Nitrat, Harnstoff. Glycin oder Lysin nutzen
Als Selektions- und Anzuchtmedium können die in der Fachwelt üblichen Medien, beispielsweise das in Tabelle 1 beschriebene Medium verwendet werden Vorzugsweise wird das in Tabelle 1 beschriebene Medium verwendet
Wahrend der Anzucht und Selektion werden zweckmassig die wirksamen Enzyme der Mikroorganismen induziert Als Enzyminduktor wird zweckmassig ein N-geschutztes cyclisches Aminosaurederivat gemäss Formel I, bevorzugt dessen D-Isomeres, verwendet
Üblicherweise erfolgt die Anzucht und Selektion bei einer Temperatur von 5 bis 100 °C, zweckmassig von 10 bis 75°C, vorzugsweise von 15 bis 40°C, insbesondere von 20 bis 35 °C und bei einem pH-Wert zwischen pH 0 und pH 12, zweckmassig von pH 4 bis 10, vorzugsweise zwischen pH 5 und pH 9
Bevorzugte Mikroorganismen sind Mikroorganismen entsprechend den Mikroorganismen mit der Bezeichnung MIS1 12, MIS125, MIS132, MIS211 , MIS213, MIS221, MIS222. MIS231, MIS242, MIS253 Besonders bevorzugt sind Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, wie der Spezies Arthrobacter oxydans GS121, Arthrobacter sp GS132, Arthrobacter pascens oder ramosus GS131 (DSM 1 1637), Arthrobacter pascens oder ramosus GS134, sowie deren fünktionell äquivalente Varianten und Mutanten Die Mikroorganismen GS131 wurden am 30 06 1997 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapest er Vertrag unter der Hinterlegungsnummer DSM 1 1637 hinterlegt Unter "flinktionell äquivalenten λ^arianten und Mutanten" werden Mikroorganismen verstanden, die sich von den beschriebenen Ursprungsorganismen ableiten und in ihren erfindungswesentlichen Eigenschaften und Funktionen im wesentlichen mit diesen übereinstimmen Derartige Varianten und Mutanten können zufallig, z B durch UV-Be- Strahlung, gebildet werden
Eigenschaften der Mikroorganismen Arthrobacter oxydans GS121
Charakterisierung Gram-positive, coryneforme Stabchen, strikt aerob, keine Saure- oder Gasbildung aus Glucose Beweglichkeit Sporen
Katalase + meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein Peptidoglycan-Typ A3α, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala
16S rDNA Sequenz- Ah nlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 100,0 % mit Arthrobacter oxydans
Eigenschaften der Mikroorganismen Arthrobacter pascens bzw. ramosus GS131 (DSM 11637)
Charakterisierung Gram-positive, coryneforme Stabchen, strikt aerob, keine
Saure- oder Gasbildung aus Glucose Beweglichkeit Sporen
Katalase +
Starkehydrolyse meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein Peptidoglycan-Typ A3α, L-Lys-L-Ala2.3
16S rDNA Sequenz-Ähnlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 98,3 % mit Arthrobacter pascens / A ramosus (höchster Wert)
Eine einigermassen zuverlässige Artzuordnung ist bei der Gattung Arthrobacter in vielen Fallen nicht möglich Die Beschreibungen basieren meist nur auf den Typ-Stamm. Der Stamm gehört mit Sicherheit in die engere Arthrobacter globiformis / Arthrobacter ramosus Gruppe Die 16S rDNA Sequenzen sind identisch mit denen vom Stamm GS134
Eigenschaften der Mikroorgansi en Arthrobacter oxydans GS132
Charakterisierung Gram-positive, coryneforme Stabchen, strikt aerob, keine
Saure- oder Gasbildung aus Glucose Beweglichkeit Sporen
Katalase + meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein Peptidoglycan-Typ A3 . L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala
16S rDNA Sequenz-Ähnlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 97,2 % mit Arthrobacter nicotinovorans (höchster Wert)
Der gefundene Peptidoglycan-Typ wurde bisher nur für Arthrobacter oxydans beschrieben Zellwand und 16S rDNA Sequenzdaten deuten daraufhin, dass der Stamm einer bisher nicht beschriebene Art der Gattung Arthrobacter repräsentiert
Eigenschaften der Mikroorganismen Arthrobacter pascens bzw. ramosus GS134
Charakterisierung Gram-positive, coryneforme Stabchen, strikt aerob, keine
Saure- oder Gasbildung aus Glucose
Beweglichkeit
Sporen
Katalase + meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein
Peptidoglycan-Typ A3 , L-Lys-L-Ala2-3
16S rDNA Sequenz- Ähnlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 98,3 % mit Arthrobacter pascens / Arthrobacter ramosus (höchster Wert)
Eine einigermassen zuverlässige Artzuordnung ist bei der Gattung Arthrobacter in vielen Fallen nicht möglich Die Beschreibungen basieren meist nur auf dem Typ-Stamm Der Stamm gehört mit Sicherheit in die engere Arthrobacter globiformis / Arthrobacter ramosus Gruppe Die 16S rDNA Sequenzen sind identisch mit denen von Stamm GS131
Das erfindungsgemasse Verfahren zur Herstellung von N-geschutzten cychschen L-Amino- saurederivaten der allgemeinen Formel II und/oder von einer cychschen D-Aminosaure der allgemeinen Formel III
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die genannte Bedeutung haben, umfasst die Umsetzung eines racemischen N-geschutzten cychschen Aminosaurederivats der allgemeinen Formel
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die genannte Bedeutung haben, mittels den bereits beschriebenen Mikroorganismen und/oder eines Enzympraparats davon, in eine cyclische D-Aminosaure (Formel III) und/oder die bei dieser Umsetzung anfallenden N-geschutzten cychschen L-Aminosaurederivate (Formel II), sowie gegebenenfalls Isolierung dieser Verbindungen
Als N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate der Formel I werden die zuvor beschriebenen racemischen Verbindungen eingesetzt. Besonders bevorzugte N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate sind N-Z-Prolin (R = Benzyloxy), N-Acetyl-Prolin (R1 = Methyl) und N-Z-Pipecolinsaure Die Edukte, die racemischen N-geschutzten cychschen Aminosaurederivate der allgemeinen Formel I wie beispielsweise N-Z-(DL)-Prolin, sind kaufliche Verbindungen
Prinzipiell ist die Biotransformation mit allen Mikroorganismen möglich, die ein N-geschutztes cyclisches Aminosaurederivat in Form des Racemats oder seiner optisch aktiven Isomere als einzige N-Quelle, als einzige C-Quelle oder als einzige C- und N-Quelle verwerten und/oder hydrolysieren Ebenfalls geeignet sind Enzymextrakte aus diesen Mikroorganismen Vor- zugsweise wird die Biotransformation mit den zuvor beschriebenen Mikroorganismen, insbesondere mit den zuvor beschriebenen Mikroorganismen der Spezies Arthrobacter pascens oder ramosus GS131 (DSM 1 1637) oder mit deren fünktionel! aequivalenten Varianten und Mutanten durchgeführt
Die Biotransformation kann nach üblichem Anzuchten der Mikroorganismen mit ruhenden Zellen (nicht wachsende Zellen, die keine Kohlenstoff- und Energiequelle mehr benotigen) oder mit wachsenden Zellen unter aeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt werden Vorzugsweise wird die Biotransformation mit ruhenden Zellen unter aeroben Bedingungen durchgeführt
Für die Biotransformation können fachmannisch übliche Medien eingesetzt werden, beispielsweise niedermolare Puffer wie niedermolare Phosphatpuffer, Tris-Puffer, oder das in Tabelle 1 beschriebene Medium Vorzugsweise wird die Biotransformation in dem Medium gemäss Tabelle 1 durchgeführt
Zweckmassig wird die Biotransformation durch Zugabe eines N-geschutzten Amino- saurederivats so durchgeführt, dass die Konzentration 50 Gew %, vorzugsweise 20 Gew %, nicht übersteigt Zweckmäßig erfolgt die Zugabe des N-geschutzten Aminosaurederivats einmalig oder kontinuierlich
Der pH- Wert des Mediums kann in einem Bereich von 3 bis 12, vorzugsweise von 5 bis 9 liegen Zweckmassig wird die Biotransformation bei einer Temperatur von 10 bis 70 °C, vorzugsweise von 20 bis 50 °C, durchgeführt Gemäss dem erfindungsgemassen Verfahrens wird ein N-geschutztes cyclisches Aminosaure- derivat in eine cyclische D-Aminosaure überführt Dabei fallt ein N-geschutztes L-Amino- saurederivat an Die cyclische D-Aminosaure und das N-geschutzte L-Aminosaurederivat können in guter Ausbeute und Enantiomeren-Reinheit (ee grosser als 98 %) isoliert werden
Das auf diese Weise gewonnene N-geschutzte L-Aminosaurederivat und/oder die auf diese Weise gewonnene D-Aminosaure kann durch übliche Aufarbeitungsmethoden wie z B durch Extraktion isoliert werden
Beispiele
Beispiel 1: Selektion von N-Z-D-Prolin-verwertenden Mikroorganismen
Zunächst wurde ein Minimalmedium (vgl Tabelle 1 ) hergestellt, das die Wachstumsanspruche vieler Mikroorganismen erfüllt
Tabelle 1:
Minimalmedium
Na2S04 0, 1 g/1
Na HP0 -2 H20 2,5 g/1
KH P04 1 ,0 g/1
NaCl 3,0 g/1
MgClrό H20 0,4 g/1
CaCl2-2 H20 14,5 mg/1
FeCl3-6 H20 0,8 mg/1
Spurenelementlosung 1 ,0 ml/1
Vitaminlosung 1 ,0 ml/1 pH 7,0 Um Mikroorganismen anzureichern, die in der Lage sind, N-geschutzte Formen cyclischer D- Aminosauren zu hydrolysieren, wurden diesem Grundmedium folgende C- und N-Quellen zugesetzt
(A) N-Acetyl-D-Prohn (5 g/1), Ammoniumsulfat (2 g/1) (B) Fructose (10 g/1), N-Z-D-Prolin (2 g/1)
Verschiedene Ansätze wurden dann jeweils mit Erdproben unterschiedlicher Standorte inokuliert und solange inkubiert (30 °C, 120 rpm), bis deutlich sichtbares Wachstum zu erkennen war Ein Aliquot dieser Kulturen wurde dann in ein gleich großes Volumen frischen Mediums ubeπmpft und erneut bis zu deutlicher Trübung inkubiert Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt Die angereicherten Mikroorganismen wurden anschließend auf einem Festmedium (gleiche Zusammensetzung wie Flussigmedium, nur Zusatz von 20 g/1 Agar-Agar) vereinzelt und gereinigt Auf diese Weise wurden jeweils etwa 20 verschiedene bakterielle Isolate erhalten, die befähigt waren,
(A) N-Acetyl-D-Prolin als einzige C-Quelle oder
(B) N-Z-D-Prolin als einzige N-Quelle
zu verwerten
Beispiel 2:
Test der selektierten Mikroorganismen auf hydrolytische Aktivität gegenüber N-geschützten cychschen Aminosäuren
(A) Test mit Mikroorganismen, die N-Acetyl-D-Pro5in als einzige C-Quelle verwerten
Die mit der in Beispiel 1 (A) beschriebenen Methode erhaltenen Isolate wurden in dem dort beschriebenen Medium vermehrt Die so hergestellten Zellen wurden durch Zen- trifügation geerntet und anschliessend in Kochsalzlosung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlosung wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-geschutzten cychschen Aminosäuren getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit je 25 mM N-Acetyl-(DL)-Prolin, N-Z- (DL)-Prolin und N-Z-(DL)-Pipecolinsaure bzw 12,5 mM N-Acetyl-(DL)- Pipecolinsaure in Pufferlosung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) unter Schuttein in- kubiert (30 °C) Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über Dunnschichtchromatographie auf die Freisetzung von Prolin bzw Pipecolinsaure hin überprüft Da in Gegenwart von Luft-Sauerstoff die durch die Hydrolyse freigesetzte Prolin verstoffwechselt wurde, wurde die Mehrzahl der Versuche in Abwesenheit von Sauerstoff (Reaktion in gasdichten Rohrchen unter Stickstoff-Atmosphäre) durchgeführt
Zehn Isolate (die Bakterienstamme MIS112, MIS125, MIS132, MIS211, MIS213, MIS221, MIS222, M1S231, MIS242, MIS253) zeigten grundsatzlich die Fähigkeit, verschiedene dieser Substrate zu hydrolysieren Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst
Tabelle 2:
Enzymatische Aktivität gegenüber N-geschützten Derivaten cyclischer
Aminosäuren
Aktivität +++ sehr gut, ++ gut, + massig, (+) kaum, - keine, ng nicht getestet Die verschiedenen Stamme zeigten durchaus unterschiedliche Substrat-Muster Wahrend die meisten Stamme N-Z-Derivate bevorzugten, reagierte MIS221 nur mit N- Acetyl-Derivaten Auch anhand von makroskopischen (Koloniemorphologie und -far- bung), mikroskopischen (Zellmorphologie, Beweglichkeit) und physiologischen (API- Test der Firma BioMerieux) Analysen unterschieden sich alle diese Stamme voneinander Alle Stamme zeigten grundsatzlich höhere Aktivität in Gegenwart von Sauerstoff und bevorzugten Prolin- gegenüber Pipecolinsaure-Derivaten
Anschiiessend wurde per HPLC (N-Z-Prolin, N-Z-Pipecolinsaure) bzw GC (Prolin, Pipecolinsaure, N-Acetyl-Proiin) die Enantiomeren-Reinheit sowohl der N-geschutzten als auch der freien Aminosäuren bestimmt Der Umsatz der einzelnen Reaktionen, bezogen auf das racemische Edukt, wurde anhand der Daten aus der Enantiomeren- Bestimmung abgeschätzt, wobei mit diesen Methoden keine exakte Quantifizierung möglich ist Die ee-Werte, die mit einigen Stammen erreicht werden konnten, sind in den Tabellen 3 und 4 wiedergegeben
Tabelle 3:
Enantioseiektivität gegenüber N-Acetyl-Prolin
- kein Produkt vorhanden In allen Fallen ist eine klare Selektivität der Hydrolyse gegenüber N-Acetyl-D-Prolin zu erkennen Unter aeroben Bedingungen lauft die Reaktion besser ab und führt in einigen Ansätzen zur Bildung von enantiomerenreinem N-Acetyl-L-Prolin Wahrscheinlich begünstigt die Verwertung des freigesetzten Prolins durch die Bakterienzellen die Umsetzung In Abwesenheit von Sauerstoff kommt es dann auch zur Anhäufung von D-Prolin In einem Fall (MIS231) konnte enantiomerenreines D-Prolin beobachtet werden, in den anderen Ansätzen erfolgte zumindest eine Anreicherung des gewünschten Enantiomers Effektiv handelte es sich dabei wahrscheinlich eher um eine Abreicherung von D-Prolin verursacht durch die Racemisierung von D-Prolin, da die Hydrolyse des Acetyl-Derivats sehr selektiv zu erfolgen scheint
Tabelle 4:
Enantioselektivität gegenüber N-Z-Prolin
Praktisch alle Ansätze zeigten sehr selektive Hydrolyse von N-Z-D-Prolin In Anwesenheit von Sauerstoff lauft die Reaktion absolut selektiv, so dass am Ende das gesamte, in die Reaktion eingesetzte N-Z-L-Prolin in enantiomerenreiner Form vorlag
Die Spezifitat der enzymatischen Reaktion ist auch mit Derivaten von anderen Aminosäuren als Prolin zu beobachten Wie Abbildung 1 zeigt, verlauft die Reaktion mit N- Z-(DL)-Pipecolinsaure relativ langsam, es wird aber auch hier selektiv das D- Enantiomere von den Stammen MIS132 und MIS222 hydrolysiert
Abbildung 1 zeigt die Reaktion von MIS132 und MIS222 mit N-Z-(DL)-Pipecolin- saure
Dies wird auch durch Versuche mit den Stammen MIS21 1 und MIS242 bestätigt, wo D-Pipecolinsaure mit hoher optischer Reinheit (ee > 95 %) gebildet wird Die Umsätze in diesen Versuchen waren allerdings relativ gering (< 10 %)
(B) Test mit Mikroorganismen, die N-Z-D-Prolin als einzige N-Quelle verwerten
Die mit der in Beispiel 1 (B) beschriebenen Methode erhaltenen Isolate wurden in dem dort beschriebenen Medium vermehrt Die so hergestellten Zellen wurden durch Zen- trifugation geerntet und anschliessend in Kochsalzlösung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlösung wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-geschutzten cychschen Aminosäuren getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit je 100 mM N-Z-DL-Prolin bzw. 50 mM N-Z-DL-Pipecolinsaure in Pufferlosung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) unter
Schütteln inkubiert (30 °C). Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über Dunnschichtchromatographie auf die Freisetzung von Prolin bzw Pipecolinsaure hin überprüft Vier Isolate (die Bakterienstamme GS121 , GS131 , GS132 und GS134) wiesen hydrolytische Aktivität sowohl gegenüber N-Z-Prolin als auch gegenüber N-Z-Pipecolinsaure auf. Da GS131 die höchste Aktivität aufwies, wurde dieses Isolat genauer untersucht. Beispiel 3:
Wachstum von Bakterienstamm GS131 (DSM 11637)
Um Bakterienstamm GS131 näher zu charakterisieren, wurde das Wachstum dieses Stammes mit verschiedenen C- und N-Quellen untersucht. Hierzu wurde das in Tabelle 1 beschriebene Grundmedium verwendet und die C-Quellen auf jeweils 10 g/1 sowie die N-Quellen auf eine Endkonzentration von 40 mM zugesetzt. Die Inkubation der Kulturen erfolgte dann bei 30 °C. GS131 konnte dabei eine breite Vielfalt von C- und N-Quellen verwerten und zeigte in den meisten untersuchten Medien sogar gutes Wachstum.
Tabelle 5:
Wachstum von Bakterienstamm GS131 mit verschiedenen C- und N-Quellen.
Beispiel 4:
Induktion der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS131 (DSM 11637)
Bakterienstamm GS131 wurde unter Variation von verschiedenen Medienkomponemen bzw deren Konzentration bei 30 °C angezogen. Die so hergestellten Zellen wurden durch Zentrifü- gation geerntet und anschliessend in Kochsalzlosung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlösung wurde mit ruhenden Zellen unter aeroben Bedingungen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-Z-D-Prolin untersucht.
Tabelle 6:
Induktion der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS131
Wachstum +++ gut, ++ massig, + schlecht Aktivität + vorhanden, - keine, ng nicht getestet
Dabei zeigte sich, dass die Anwesenheit N-geschutzter cyclischer Aminosäuren das Wachstum nahezu durchgehend verlangsamt, wobei N-Z-D-Prolin in geringer Konzentration noch am besten toleriert wurden Ahnlich konnte die D-Aminoacylase nur durch Gabe von N-Z-D- Prolin in geringer Konzentration induziert werden, wobei sowohl Glucose als auch L-Prolin als C-Quelle akzeptiert wurden Beispiel 5:
Enantioselektivität der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS131 (DSM 11637)
Bakterienstamm GS131 wurde in dem in Beispiel 1 (B) beschriebenen Medium vermehrt Die so hergestellten Zellen wurden durch Zentrif gation geerntet und anschließend in Kochsalzlosung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlosung wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-geschutzten cychschen Aminosäuren getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit dem jeweiligen Substrat ( 10 mM N-Z-L-Prolin oder N-Z-D-Prolin bzw 5 mM N-Z-L-Pipecolinsaure oder N- Z-D-Pipecolinsaure) in Pufferlosung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) inkubiert (30 °C) Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über HPLC wurde die Urnsetzung der Substrate verfolgt
Abbildung 2 zeigt die Enantioselektivität der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS 131
Für beide getesteten N-geschutzten Aminosäuren wurde das D-Enantiomer hydrolysiert, wahrend das L-Enantiomer unangetastet blieb Das Enzym zeigt also sehr gute Enantioselektivität N-Z-D-Prolin wurde allerdings erheblich schneller hydrolysiert als N-Z-D-Pipecolin- saure
Beispiel 6:
Herstellung von N-Z-L-Prolin durch Racemat-Spaltung mit Hilfe der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS131 Bakterienstamm GS131 wurde in dem in Beispiel 1 (B) beschriebenen Medium vermehrt Die so hergestellten Zellen wurden durch Zentrifügation geerntet und anschließend in Kochsalzlosung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlosung wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-geschutzten cychschen Aminosäuren getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit 10 mM N-Z-(DL)- Prolin in Pufferlosung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) inkubiert (30 °C) Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über HPLC wurde die Umsetzung des Substrats verfolgt Abbildung 3 zeigt die Herstellung von N-Z-L-Prolin aus N-Z-(DL)-Prolin mit Hilfe der D- Aminoacylase von Bakterienstamm GS 131
Bereits nach drei Stunden war die gesamte Menge an N-Z-D-Prolin vollständig hydrolysiert, wahrend N-Z-L-Prolin über 26 Stunden unangetastet blieb Am Ende des Versuchs lag damit N-Z-L-Proiin in Losung in hoher Enantiomeren-Reinheit (ee >98 % nach HPLC) vor
Beispiel 7: Synthese von N-Benzyloxycarbonyl-Derivaten cyclischer Aminosäuren
(A) Synthese von N-Z-(DL)-Prolin
100,0 g (DL)-Prolin wurden in 217 ml 4 N NaOH gelost Zu dieser Losung wurde unter Thermostatisierung (5 - 10 °C) und pH-Stase (pH = 10,0 - 1 1,0) Chlorameisensaure- benzylester (Z-Cl) zugetropft Insgesamt wurden dabei 158, 1 g Z-Cl und 251 ,2 g 4 N
NaOH zugesetzt Außerdem wurden 150 ml destilliertes Wasser beigefügt, um die Ruhr- barkeit der Reaktionsmischung aufrecht zu erhalten Mit konzentrierter Salzsaure (76 ml) wurde dann auf pH = 2,4 angesäuert und anschliessend wurde N-Z-(DL)-Prolin in mehreren Schritten mit insgesamt 584 ml Butylacetat extrahiert Die vereinigten organischen Phasen wurden unter Vakuum eingeengt und das erhaltene N-Z-(DL)-Prolin wurde in
Ethylacetat gelost und durch Zugabe von Hexan auskristallisiert Auf diese Weise wurden 187,4 g N-Z-(DL)-Prolin (86,5 % d Th ) erhalten
Zur Synthese von N-Z-D-Prolin bzw N-Z-L-Prolin wurde analog vorgegangen
(B) Synthese von N-Z-L-Pipecolinsäure
10,0 g L-Pipecolinsaure wurden in 13 ml 4 N NaOH gelost. Zu dieser Losung wurden unter Thermostatisierung (5 - 10 °C) 14,5 g Chlorameisensaurebenzylester (Z-Cl) zugetropft Über einen pH-Staten wurde durch entsprechende Zugabe von 4 N NaOH der pH- Wert bei 1 1 ,5 gehalten Nach Abschluss der Reaktion wurden 10 ml Wasser zugegeben, um die Ruhrbarkeit bei der Aufarbeitung zu erleichtern, und durch Zugabe von konzentrierter Salzsaure (ca 1 g) wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Durch zweimalige Extraktion mit je 40 ml Butylacetat wurden Verunreinigungen entfernt Anschliessend wurde der pH der wassrigen Phase durch Zugabe von weiteren 6,67 g konzentrierter Salzsaure auf pH 2,01 gebracht N-Z-L-Pipecolinsaure wurde dann durch dreimalige Extraktion (je 40 ml) mit Butylacetat gewonnen Die organischen Phasen wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und schliesslich bis zur Trockene eingeengt Nach Losen des Feststoffs in 10 ml Ethylacetat und Zugabe von 9 ml Hexan wurde N-Z-L-Pipecolinsaure durch Abkühlen auf eine Temperatur < 10 °C kristallisiert Nach Filtration und Trocknung wurden letztlich 13,22 g N-Z-L-Pipecolinsaure (64,9 % d Th ) erhalten
Zur Svnthese von N-Z-(DL)-Pipecolinsaure bzw N-Z-D-Pipecolinsaure wurde analog vorgegangen

Claims

Patentansprüche:
Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass sie befähigt sind, ein oder mehrere N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate, ausgewählt aus Verbindungen der allgemeinen Formel I
worin A zusammen mit -N- und -CH einen gegebenenfalls substituierten 4-, 5-, 6- oder 7-gliedrigen gesattigten heterocyciischen Ring bedeutet und R1 jeweils gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy bedeutet, in Form des Racemats oder eines der optischen Isomeren als einzige C-Quelle, als einzige N-Quelle oder als einzige C- und N-Quelle zu verwerten und/oder zu hydrolysieren,
sowie Enzymextrakte daraus
Mikroorganismen nach Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel I ein N-geschutztes cyclisches D-Aminosaurederivat ist
Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Verbindung der Formel I ein N-geschutztes D-Prolinderivat, vorzugsweise N-Acetyl- oder N-Benzyloxycar- bonyl-D-Prolin, oder ein N-geschutztes D-Pipecolinsaurederivat ist Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welche befähigt sind, ein N-geschutztes D-Prolinderivat, vorzugsweise N-Acetyl- oder N-Benzyloxycarbonyl-D- Pro n, als einzige C-Quelle, als einzige N-Quelle oder als einzige C- und N-Quelle zu verwerten, und/oder befähigt sind ein N-geschutztes D-Prolinderivat, vorzugsweise N- oder N-Benzyloxycarbonyl-D-Prolin und/oder ein N-geschutztes D-Pipe- colinsaurederivat zu hydrolysieren
Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 der Gattung Arthrobacter
Mikroorganismen nach Anspruch 5 der Spezies Arthrobacter ramosus GS131 (DSM 11637), sowie dessen fünktionell äquivalente Varianten und Mutanten
Verfahren zur Herstellung von N-geschutzten cychschen L-Aminosaurederivaten der allgemeinen Formel II und/oder von cychschen D-Aminosauren der allgemeinen Formel III
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, umfassend die Umsetzung eines racemischen N-geschutzten cychschen Aminosaurederivats der allgemeinen Formel
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die genannte Bedeutung haben, mittels Mikroorganismen und/oder Enzympraparaten nach Anspruch 1 zu den Verbindungen der Formel III und/oder den bei dieser Umsetzung anfallenden N-geschutzten cychschen L- Aminosaurederivaten der Formel II, sowie gegebenenfalls Isolierung dieser Verbindungen
. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotransformation mittels Mikroorganismen der Spezies Arthrobacter pascens oder ramosus GS131 (DSM 1 1637) oder mit deren fünktionell aequivalenten Varianten und Mutanten durchgeführt wird
) Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotransformation unter Zugabe der N-geschutzten Aminosaurederivate so durchgeführt wird, dass die Konzentration 50 Gew % nicht übersteigt
0 Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotransformation bei einer Temperatur von 10 bis 70 °C und bei einem pH von 3 bis 12 durchgeführt wird
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