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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines neuen Verfahrens
zur Herstellung von D-Asparaginderivaten mit der Formel I zur Herstellung
von D-Asparaginderivaten mit der Formel I
worin R
1 eine
Aminoschutzgruppe ist und R
2 ein Alkyl,
ein substituiertes Alkyl oder eine Gruppe mit der Formel A ist,
worin R
3 Wasserstoff
oder eine niedere Alkylgruppe ist und n 1, 2 oder 3 ist.
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Verbindungen
mit der Formel I sind bekannt. Die Verbindung N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester
wird in J. Liq. Chrom. (1994), 17 (13), 2759 beschrieben. Eine chemische
Synthese dieser Verbindung wird in Tetrahedron (1997), 53 (6), 2075
beschrieben, wo diese durch eine Zweischrittreaktion ausgehend von bereits
chiralem (S)-Asparagin erreicht wird. In J. Chem. Soc. Perkin Trans
1 (1983), 2287 wird die Synthese der oben erwähnten Verbindung ebenfalls
ausgehend von einem chiralen Reaktanden beschrieben.
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J.
MADDALUNO ET AL.: „Handy
access to chiral N,N'-disubstituted
3-aminopyrrolidines",
Tetrahedron Asymmetry (1992), 3 (10), 1239-1242 offenbaren die Herstellung
von N-geschütztem
(S)-Asparaginmethylester in einer Zweischrittreaktion, ausgehend
von bereits chiralem N-geschütztem
(S)-Asparagin. Diese Referenz beschreibt weiterhin eine Synthese
von (S)-3-Aminopyrrolidinen aus dem Asparaginderivat, welche eine
Cyclisierung von Methyl-N-Z-(S)-Asparaginat (1 in Schema 1 dieser
Referenz), gefolgt von einer Eintopf-N-Benzylierung einschließt, was
zu (S)-Aminosuccinimid (3) führt,
welches nach Abspaltung der N-Schutzgruppe Z in ein entsprechendes
Imin umgewandelt wird und zu dem chiralen N,N'-disubstituierten 3-Aminopyrrolidin
reduziert wird.
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Die
Herstellung und Reinigung von neuen D-Aminoacylasen aus einem Mikroorganismus,
welcher zu der Gattung Sebekia bzw. Amycolatopsis gehört, wird
in
EP 0 950 706 und
in
EP 0 896 057 beschrieben.
Die Enzyme sind für
die industrielle Produktion von chiralen D-Aminosäuren ausgehend
von racemischen N-Acetyl-D,L-aminosäuren nützlich. Die D-Aminoacylase (Gattung
Sebekia) weist eine Aktivität
gegenüber
N-Acetyl-D-asparagin von 1,4% im Vergleich zu N-Acetyl-D-methionin
(100%) auf. Die D-Aminoacylase (Gattung Amycolatopsis) weist eine
spezifische Aktivität
gegenüber
N-Acetyl-D-asparagin von 19% im Vergleich zu N-Acetyl-D-methionin
(100%) auf.
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In
Agric. Biol. Chem. (1987), 51 (3), 721 und in
DE 2825245 wird die enzymatische Herstellung
von D-Aminosäuren
ausgehend von D,L-5-substituiertem Hydantoin beschrieben. Die Synthese
von D-Asparagin wird in einer Zweischrittreaktion (1. Ringöffnung von
D,L-5-substituierten
Hydantoinen zu D-N-Carbamylaminosäuren durch D-Hydantoinhydrolase,
gefolgt von 2. der Spaltung von N-Carbamyl-D-aminosäuren zu D-Aminosäuren durch
N-Carbamyl-D-aminosäurehydrolase
unter Verwendung der Gattung Pseudomonas AJ-1122) oder in einer
Einschrittreaktion unter Verwendung der Gattung Pseudomonas, Achromobacter,
Alcaligenes, Maraxella, Paracoccus bzw. Arthrobacter erreicht.
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Die
EP-A-0 182 517 beschreibt die stereoselektive enzymatische Hydrolyse
einer L- und D-Mischung von N-acyliertem alpha-Aminosäureester
mit der Formel
worin X der Rest einer natürlich vorkommenden
alpha-Aminosäure
ist und das C-Atom, welches die -NHCOR, -COOR' und X-Gruppen trägt, chiral ist, wobei die Mischung
selektiv zu einer Mischung von L-alpha-Aminosäure und D-N-acyliertem alpha-Aminosäureester
hydrolysiert wird, wobei eine Mischung einer Aclyase und einer Esterase
verwendet wird.
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Weiterhin
beschreiben CHEN ET AL.; „Kinetic
resolution of N-protected amino acid esters in organic solvents
catalysed by a stable industrial alkaline protease" Biotechnology letters,
Bd. 13, Nr. 11, 1991 (11-1991), 773-778 die Möglichkeit der Verwendung von
Proteasen als Katalysatoren in organischen Lösungsmitteln für die Auftrennung
von N-geschützten Aminosäuren.
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WONG
C-H ET AL.: „Enzymes
in organic synthesis":
Use of subtilisin and a highly stable mutant derived from multiple
site-specific mutations",
Journal of the American Chemical Society, Bd. 112, Nr. 3, 1990, 945-953
beschreiben die Verwendung von Subtilisin als einer in hohem Maße stabilen
Mutante, die durch mehrere gezielte Mutationen in organischen Reaktionen
abgeleitet wurde. Die Anwendung des Mutentenenzyms und des Wildtypenzyms
auf die organische Synthese wurde bei der enantioselektiven Hydrolyse
N-geschützter Aminosäureester
in Wasser mit 85–98%
Enantioselektivität
für das
L-Isomer demonstriert.
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KIJIMA
T ET AL.: „Facile
optical resolution of amino acid esters via hydrolysis by an industrial
enzyme in organic solvents",
Journal of chemical Technology and Biotechnology, Bd. 59, Nr. 1,
1994, 61–65
offenbaren, dass racemische Aminosäureester über eine Hydrolyse in organischen
Lösungsmitteln
durch Katalyse einer industriellen alkalischen Protease optisch
aufgetrennt werden können.
Es wurde gefunden, dass oberhalb von 70% (v/v) Wassergehalt der
Enantiomerenüberschuss
scharf abfiel. Im Allgemeinen wurden bei niedrigen Wassergehalten
hohe Werte des Enantiomerenüberschusses
erhalten.
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Es
ist keine technische enzymatische Reaktion zur Herstellung von Asparaginesterderivaten
in der Literatur beschrieben worden. Dieses könnte auf der Leichtigkeit der
Racemisierung und dem Abbau von Asparaginderivaten bei den herkömmlichen
pH-Werten der Reaktion (7–8,5)
beruhen, welche für
Hydrolasereaktionen verwendet werden. Eine schnelle Inaktivierung
der Enzyme wurde beobachtet, wenn höhere, technisch relevantere
Substratkonzentrationen verwendet wurden.
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Es
wurde gefunden, dass diese Inaktivierung überwunden werden konnte, indem
ein organisches Cosolvens eingesetzt wurde (die Wirkung des Lösungsmittels
ist nicht die eines „Substratsolubilisators", da, wenn es zugegeben
wird nachdem die Reaktion aufgehört
hat, die Reaktion nicht wieder anfängt). Die Verbindungen mit
der Formel I können
daher in einer verbesserten Weise hergestellt werden, indem ein
Verfahren zur Herstellung von D-Asparaginderivaten
mit der Formel I,
worin R
1 eine
Aminoschutzgruppe ist und R
2 ein Alkyl,
ein substituiertes Alkyl oder eine Gruppe mit der Formel A ist,
worin R
3 Wasserstoff
oder eine niedere Alkylgruppe ist und n 1, 2 oder 3 ist,
verwendet
wird, wobei das Verfahren umfasst:
Umsetzen einer Verbindung
mit der Formel II
worin R
1 und
R
2 wie oben definiert sind,
mit einer
Protease in einem wässrigen
System bei einem pH von 6,0–7,5
in Kombination mit einem organischen Cosolvens und anschließende Extraktion
des enantiomerenreinen Produkts mit der Formel I, und wobei das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminopyrrolidinderivaten
mit der Formel IV
verwendet wird, worin R
1 wie in Anspruch 1 definiert ist und R Wasserstoff,
C
1-12-Alkyl, C
3-8-Cycloalkyl,
C
3-12-Alkenyl, Phenyl, Tolyl, Naphthyl,
Pyridin, Pyrimidin, Pyridazin oder Benzyl ist.
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In
den Strukturformeln, die hierin angegeben sind, bedeutet eine keilförmige Bindung
dass sich
der Substituent oberhalb der Papierebene befindet.
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In
den Strukturformeln, die hierin angegeben sind, bedeutet eine gepunktete
Bindung
dass sich
der Substituent unterhalb der Papierebene befindet.
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Der
Ausdruck „Aminoschutzgruppe", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf Gruppen wie z.B. jene, die in der Peptidchemie
eingesetzt werden, wie in Green T. Protective Groups in Organic
Synthesis, Kapitel 5, John Wiley and Sons, Inc. (1981), Seiten 218-287
beschrieben wird, wie z.B. eine Allyloxycarbonylgruppe (ALLOC),
eine niedere Alkoxycarbonylgruppe (z.B. tert.-Butoxycarbonyl (t-BOC)),
eine substituierte niedere Alkoxycarbonylgruppe (z.B. Trichlorethoxycarbonyl),
eine wahlweise substituierte Aryloxycarbonylgruppe (z.B. p-Nitrobenzyloxycarbonyl,
Benzyloxycarbonyl (Z) oder Phenyloxycarbonyl), eine Arylalkylgruppe
(z.B. Triphenylmethyl (Trityl), Benzhydryl oder Benzyl), eine Alkanoylgruppe
(z.B. Formyl, Acetyl), eine Aroylgruppe (z.B. Benzoyl), eine Halogenalkanoylgruppe
(z.B. Trifluoracetyl) oder eine Silylschutzgruppe (z.B. tert.-Butyldimethylsilyl).
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Bevorzugte
Aminoschutzgruppen sind Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl,
Allyloxycarbonyl oder Benzoyl, besonders bevorzugte Aminoschutzgruppen
sind Benzyloxycarbonyl oder Benzoyl.
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Der
Ausdruck „Alkyl", wie er hierin verwendet
wird, bezeichnet gerade oder verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste,
die 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten, wie z.B. Methyl, Ethyl,
n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl,
Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, einschließlich deren verschiedener Isomeren. Vorzugsweise
bezeichnet der Ausdruck „Alkyl" einen wahlweise
substituierten geraden oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest,
welcher 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält.
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Alkyl
in R2 ist vorzugsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl,
Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl oder Pentyl und insbesondere
Methyl oder Ethyl.
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Der
Ausdruck „niederes
Alkyl", wie er hierin
verwendet wird, bezeichnet gerade oder verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste,
welche 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, wie z.B. Methyl, Ethyl,
n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl oder tert.-Butyl.
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Der
Ausdruck „substituiertes
Alkyl", wie er hierin
verwendet wird, bezeichnet einen geraden oder verzweigtkettigen
Kohlenwasserstoffrest, welcher 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthält, in welchem
ein oder mehrere Wasserstoffatome durch eine oder mehrere Hydroxygruppen,
niedere Alkoxygruppen, Cycloalkylgruppen, Arylgruppen oder durch
ein oder mehrere Halogenatome ersetzt sind. Beispiele sind 3-Hydroxybutyl,
4-Methoxybutyl, 3-Ethoxypropyl,
3-Cyclohexylpropyl, Benzyl, 2-Phenylethyl, 1-Fluormethyl, 2-Chlorethyl,
2,2-Dichlorethyl, 3-Brompropyl oder 2,2,2-Trifluorethyl und dergleichen.
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Das
substituierte Alkyl in R2 ist vorzugsweise
Benzyl.
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Der
Ausdruck „Cycloalkyl", wie er hierin verwendet
wird, bezeichnet einen 3–6gliedrigen
gesättigten carbocyclischen
Anteil, z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl,
vorzugsweise Cyclohexyl.
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Der
Ausdruck „niederes
Alkoxy", wie er
hierin verwendet wird, bezeichnet eine gerade oder verzweigtkettige
niedere Alkyloxygruppe, in welcher der „niedere Alkyl"-Anteil wie oben
definiert ist. Beispiele sind Methoxy, Ethoxy, n-Propyloxy, iso-Propyloxy,
n-Butyloxy, iso-Butyloxy oder tert.-Butyloxy. Noch bevorzugtere
niedere Alkoxygruppen innerhalb der Erfindung sind Methoxy oder
Ethoxy.
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Der
Ausdruck „Aryl", wie er hierin verwendet
wird, bezeichnet eine wahlweise substituierte Phenylgruppe, in welcher
ein oder mehrere Arylwasserstoffatome durch eine oder mehrere Phenylgruppen,
Alkylgruppen, niedere Alkoxygruppen oder halogenierte Alkylgruppen
substituiert sein können.
Beispiele für
substituierte Phenylgruppen sind Biphenyl, o-Methylphenyl, m-Methylphenyl,
p-Methylphenyl, o-Methoxyphenyl, m-Methoxyphenyl, p-Methoxyphenyl,
o-Fluormethylphenyl, m-Fluormethylphenyl, p-Fluormethylphenyl, o-Chlormethylphenyl,
m-Chlormethylphenyl, p-Chlormethylphenyl, o-Brommethylphenyl, m-Brommethylphenyl
oder p-Brommethylphenyl.
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Der
Ausdruck „Aryloxy" bedeutet eine Arylgruppe,
wie sie oben definiert ist, welche über ein Sauerstoffatom gebunden
ist. Beispiele sind Phenyloxy, Benzyloxy und dergleichen.
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Der
Ausdruck „niederes
Alkoxycarbonyl" bezeichnet
niedere Alkoxyreste, welche an einer Carbonylgruppe (>C=O) befestigt sind.
Beispiele sind Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl,
tert.-Butoxycarbonyl und dergleichen. Ein bevorzugtes niederes Alkoxycarbonyl
ist tert.-Butoxycarbonyl.
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Der
Ausdruck „Aryloxycarbonyl" bezeichnet Aryloxyreste,
die an einer Carbonylgruppe (>C=O)
befestigt sind. Beispiele sind Nitrobenzyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl
(Z) oder Phenyloxycarbonyl.
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Aryloxycarbonyl
in R1 ist Nitrobenzyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl
(Z) oder Phenyloxycarbonyl, insbesondere Benzyloxycarbonyl (Z).
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Durch
den Ausdruck „Arylalkyl", wie er hierin verwendet
wird, wird eine Kohlenwasserstoffgruppe bezeichnet, in welcher ein
oder mehrere Alkylwasserstoffatome durch eine Arylgruppe wie z.B.
Trityl, Benzhydryl oder Benzyl substituiert sind.
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Der
Ausdruck Halogen steht für
Fluor, Chlor oder Brom.
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Die
Verbindungen mit der Formel II können
gemäß bekannten
Verfahren aus Lehrbüchern über die
organische Chemie, z.B. von J. March (1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions,
Mechanisms and Structure",
4. Ausg., John Wiley and Sons), hergestellt werden. Beispielsweise
wird ein N-geschütztes
D,L-Asparaginderivat mit dem entsprechenden Alkohol (z.B. Methanol)
in der Gegenwart von Thionylchlorid verestert.
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Gemäß der Erfindung
werden Verbindungen mit der Formel I durch die Reaktion einer Verbindung
mit der Formel II, worin R1 und R2 wie oben definiert sind, worin vorzugs weise
R1 Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl,
Allyloxycarbonyl oder Benzoyl ist und R2 Methyl,
Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl,
Pentyl oder Benzyl ist, mit einer Protease in einem wässrigen
System bei einem pH von 6,0–7,5
in Kombination mit einem organischen Cosolvens hergestellt. Nach
der enzymatischen Hydrolyse des L-Asparaginderivats wird das enantiomerenreine
D-Asparaginderivat mit der Formel I durch Extraktion abgetrennt.
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Geeignete
Enzyme als Katalysatoren für
die Reaktionen sind Proteasen, vorzugsweise billige Massenproteasen
mikrobiellen Ursprungs, insbesondere Bacillus-Proteasen (wie Savinase
von Novo Nordisk) oder Subtilisine, z.B. Subtilisin Carlsberg von
Novo Nordisk (Alkalase) oder von Solvay (Protease-L).
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Als
Alternative können
die Enzyme in immobilisierter Form verwendet werden.
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Gemäß der Erfindung
wird die Reaktion in einem wässrig-organischen
System durchgeführt,
welches mit Wasser mischbare Lösungsmittel
(in einer Endkonzentration von bis zu 25%, vorzugsweise 10–25% (v/v)) oder
mit Wasser nicht mischbare organische Cosolventien (in irgendeinem
Verhältnis)
einsetzt.
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Was
die wässrige
Phase betrifft, so werden übliche
Pufferlösungen,
von denen bekannt ist, dass diese für biochemische Umwandlungen
verwendet werden, wie z.B. Natrium- oder Kaliumphosphat in einer
Konzentration von bis zu 1 M, vorzugsweise zwischen ca. 5 mM und
ca. 50 mM, verwendet. Eine solche Pufferlösung kann zusätzlich eines
der üblichen
Salze wie z.B. Natrium- oder Kaliumchlorid, LiSCN, Na2SO4 oder einen mehrwertigen Alkohol, z.B. einen
Zucker, in einer Konzentration bis zu 1 M, vorzugsweise 0,1 M, enthalten. Der
pH der Reaktion reicht von 6,0 bis 7,5, vorzugsweise reicht der
pH der Reaktion von 6,0 bis 7,0. Ein besonders bevorzugter pH der
Reaktion reicht von 6,4 bis 6,6.
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Geeignete
Cosolventien sind technisch übliche
Lösungsmittel.
Beispiele sind Ether (z.B. Tetrahydrofuran (THF), Dioxan oder tert.-Butylmethylether
(TBME)), niedere Alkohole, Esters (z.B. Ethylacetat), polare aprotische
Lösungsmittel
(z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid
(DMF) oder Aceton). Bevorzugt sind mit Wasser mischbare Cosolventien
(z.B. Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, tert.-Butylmethylether (TBME),
niedere Alkohole, Ethylacetat oder Aceton).
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Der
Ausdruck „niederer
Alkohol", wie er
hierin verwendet wird, bezeichnet gerade oder verzweigtkettige Alkylreste,
welche 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten, mit einer Hydroxygruppe
wie z.B. Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol,
tert.-Butanol, Pentanol, Hexanol, Heptanol oder Octanol, vorzugsweise
Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, tert.-Butanol,
und noch bevorzugtere Alkohole sind Methanol oder Ethanol. Der am
meisten bevorzugte Alkohol ist Ethanol.
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Das
Substrat wird geeigneterweise als eine Suspension in einer Gesamtkonzentration
von 5–15% (w/w)
aufgetragen. Eine noch bevorzugtere Gesamtkonzentration ist 8–12%.
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Nach
der Zugabe des Enzyms wird der pH der Reaktionsmischung unter kräftigem Rühren durch
die kontrollierte Zugabe einer Base bei dem ausgewählten pH-Wert
gehalten. Bevorzugte Basen sind wässrige NaOH- oder KOH-Lösungen.
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Nach
Beendigung der Reaktion wird das enantiomerenreine Produkt mit der
Formel I in herkömmlicher Weise
durch Extraktion der Reaktionsmischung mit einem geeigneten organischen
Lösungsmittel
aufgearbeitet. Ein bevorzugtes organisches Lösungsmittel ist Dichlormethan.
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Wahlweise
könnte
die verbleibende wässrige
Schicht aufgearbeitet werden, um das entsprechende N-geschützte L-Asparagin
zu ergeben. Dieses wird herkömmlicherweise
durch Ansäuerung
der zurückgehaltenen
wässrigen
Phase und Abfiltrieren des gebildeten Niederschlags oder deren Extraktion
mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel erreicht.
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Daher
ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung von N-geschütztem L-Asparagin
mit der Formel III
worin R
1 wie
oben definiert ist, worin R
1 vorzugsweise
Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder Benzoyl
ist,
wobei das Verfahren umfasst:
- a) Umsetzen
einer Verbindung mit der Formel II worin R1 und
R2 wie oben definiert sind, worin vorzugsweise
R1 Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl
oder Benzoyl ist und R2 Methyl, Ethyl, n-Propyl,
Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Benzyl ist,
mit
einer Protease, vorzugsweise mit einer mikrobiellen Protease, insbesondere
mit einem Subtilisin oder mit einer Bacillus-Protease, in einem
wässrigen
System bei einem pH von 6,0–7,5,
vorzugsweise bei einem pH von 6,0–7,0 und am meisten bevorzugt
bei einem pH von 6,4–6,6,
in Kombination mit einem organischen Cosolvens, insbesondere Tetrahydrofuran,
Dioxan, tert.-Butylmethylether, einem niederen Alkohol, Ethylacetat,
Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid oder Aceton
und am meisten bevorzugt Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, tert.-Butylmethylether
(TBME), niederen Alkoholen, Ethylacetat oder Aceton, und anschließende Extraktion
des enantiomerenreinen Produkts mit der Formel I; und
- b) Aufarbeiten der verbleibenden wässrigen Schicht, um das entsprechende
N-geschützte
L-Asparagin mit der Formel III zu ergeben.
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Um
eine hohe chemische Reinheit für
das Produkt mit der Formel I oder III zu erhalten, kann dieses wahlweise
in der Gegenwart eines geeigneten organischen Lösungsmittels verrieben werden,
in welchem das Produkt mit der Formel I oder III, aus Gründen der
Stabilität,
praktisch unlöslich
ist.
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Das
Verfahren wird vorzugsweise zur Herstellung von N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester durchgeführt, und
es wird in der Gegenwart von TBME verrieben.
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Die
Verbindungen mit der Formel I, welche gemäß dem erfinderischen Verfahren
hergestellt werden, können
zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminopyrrolidinderivaten mit
der Formel IV
worin R
1 eine
Aminoschutzgruppe ist und R Wasserstoff, C
1-12-Alkyl,
C
3-8-Cycloalkyl, C
3-12-Alkenyl,
Phenyl, Tolyl, Naphthyl, Pyridin, Pyrimidin, Pyridazin oder Benzyl
ist, worin vorzugsweise
R
1 Benzyloxycarbonyl,
tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder Benzoyl ist und R Wasserstoff,
C
1-8-Alkyl, C
3-8-Cycloalkyl,
C
3-8-Alkenyl, Phenyl, Tolyl, Naphthyl, Pyridin,
Pyrimidin, Pyridazin, Benzyl ist, und worin am meisten bevorzugt
R
1 Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl,
Allyloxycarbonyl oder Benzoyl ist und R Benzyl ist,
verwendet
werden.
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Die
Reaktion zur Herstellung der optisch aktiven 3-Aminopyrrolidinderivate
mit der Formel IV kann durchgeführt
werden, wie in der EP-A-0 928 787 beschrieben wird.
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Die
optisch aktiven 3-Aminopyrrolidinderivate mit der Formel IV sind
wichtige Bausteine für
die Herstellung von nützlichen
Produkten in der chemischen, landwirtschaftlichen und in der pharmazeutischen
Industrie. Insbesondere sind sie nützlich zur Herstellung von
antibakteriellen Substanzen wie z.B. Vinylpyrrolidinon-Cephalosporin-Derivaten,
wie in der WO 99/65920, der EP-A 0 620 225 oder in der EP-A 0 849
269 beschrieben wird.
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In
den folgenden Beispielen haben die verwendeten Abkürzungen
die folgenden Bedeutungen.
- ISP-MS
- positive Ionenspray-Massenspektroskopie
- ISN-MS
- negative Ionenspray-Massenspektroskopie
- EI-MS
- Elektronenstoß-Massenspektroskopie
- SFC
- Chromatographie mit
superkritischem Fluid
- NMR
- Kernmagnetresonanzspektroskopie
- IR
- Infrarotspektroskopie
- HV
- Hochvakuum
- min
- Minute(n)
-
Beispiel 1 (Herstellung
des Reaktanden)
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N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester
-
18,85
g (70,8 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparagin [Bachem] wurden
in 230 ml Methanol gelöst/suspendiert,
und die Lösung/Suspension
wurde dann auf 0°C
abgekühlt.
6,0 ml Thionylchlorid wurden tropfenweise zugegeben, so dass die
Temperatur unter 10°C
blieb. Am Ende wurde eine klare Lösung gebildet, welche für 15 min
gerührt
wurde. Die Reaktionsmischung wurde zusammen mit 550 ml Toluol verdampft
(nachdem ca. 150 ml Volumen erreicht waren wurden 100 ml Methanol
zugegeben und die Verdampfung fortgesetzt; 40°C Badtemperatur). Der resultierende
weiße,
kristalline Rückstand
wurde über
Nacht in 200 ml tert.-Butylmethylether verrieben/zersetzt. Der Rückstand
wurde abfiltriert und im HV getrocknet, was 18,7 g N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester
als ein weißes
kristallines Pulver ergab (Ausbeute: 92%). ISP-MS: 303,2 (M + Na+), 281,2 (M + H+),
237,2 (M-CO2). SFC: 97,7% Fläche.
-
Beispiel 2 (Herstellung
eines Produkts im großen
Maßstab)
-
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester
-
18,5
g (65,7 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester (99,5%)
wurden in 190 ml 0,1 M Natriumchloridlösung, 40 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer
pH 6,5 und 25 ml THF unter kräftigem
Rühren
suspendiert. 1,0 ml Alkalase 2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von
Novo Nordisk] wurde zugegeben, und der pH wurde unter kräftigem Rühren durch
die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) einer 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5
gehalten. Nach einem Verbrauch von 32,0 ml einer 1,0 N Natriumhydroxidlösung (16,3
h; 49% Umwandlung nach 8 h) wurde die Reaktionsmischung mit 3 × 350 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden
kurz mit 500 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 gewaschen, auf
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 25°C Badtemperatur).
Der Rückstand
wurde über
Nacht in 200 ml tert.-Butylmethylether
verrieben. Die Suspension wurde filtriert, und der Filterkuchen
bei HV getrocknet, um 8,2 g N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester
als ein weißes
kristallines Pulver zu ergeben (Ausbeute: 46%). Enantiomerenüberschuss: > 99,5% (Chiracel ODH,
15 cm × 300 μm, 85% n-Hexan
+ 15% Isopropanol, 6 μl/min,
0,5 MPa, 30°C,
210 nm). EI-MS: 280,2 (M), 221,1 (M-CO2Me).
SFC: 98,8% Fläche.
IR (Nujol): 3349, 1741, 1665, 1550, 733, 698 cm–1. 1H-NMR (CDCl3): 2,76
(dd, J1 = 4 Hz, J2 =
16 Hz, 1H, -CHCH-), 2,98 (dd, J1 = 4 Hz,
J2 = 16 Hz, 1H, -CHCH-), 3,76 (s, 3H, OCH3), 4,60 (m, 1H, -CHCOO-), 5,13 (s, 2H, -CH2O), 5,42 und 5,53 (2 × bs, 2H, CONH2),
6,00 (bd, < 1H,
OCONH), 7,29-7,37 (Stapel, 5H, Ph).
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Beispiel 3 (Herstellung
eines Produkts im kleinen Maßstab
mit verschiedenen Proteasen)
-
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginethylester
-
0,5
g (1,7 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginethylester (hergestellt
in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in 23 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und
2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart oder Abwesenheit
von 4 ml Tetrahydrofuran (THF) suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N
Salzsäure
auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch die Zugabe der Protease
gestartet (Name, Ursprung und Menge siehe Tabelle unten). Der pH
wurde unter kräftigem
Rühren
durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Die Experimente ohne THF, welche eine unvollständige Umwandlung
zeigten (siehe Tabelle unten), wurden nicht aufgearbeitet, die Experimente
mit THF wurden wie folgt behandelt: Nach ungefähr 50% Umwandlung (entspricht
einem Verbrauch von 0,85 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung) wurde
die Reaktionsmischung mit 2 × 25
ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei
35°C Badtemperatur). Der
Rückstand,
welcher den zurückgehaltenen
Ester enthielt, wurde einer ee-Bestimmung unterzogen (Chiracel ODH,
15 cm × 2,1
mm, 87% n-Heptan + 13% Isopropanol + 0,1% TFA, 0,1 ml/min, r.t.,
220 nm).
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-
Beispiel 4 (Herstellung
eines Produkts im großen
Maßstab
einschließlich
anschließender
Aufarbeitung, um ebenfalls N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin zu ergeben)
-
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginethylester
-
10,0
g (34,0 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginethylester (hergestellt
in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in 460 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und
40 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart von 80
ml Tetrahydrofuran suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf
6,5 eingestellt und die Reaktion durch die Zugabe von 1,0 ml Savinase
16 L [eine Bacillus-Protease von Novo Nordisk] gestartet. Der pH
wurde unter kräftigem
Rühren
durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von 16,45 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (48,2%
Umwandlung; nach 17h) wurde die Reak tionsmischung mit 2 × 500 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden
auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft (bei 35°C Badtemperatur)
und der Rückstand
bei HV getrocknet, was 5,02 g N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginethylester
als weiße
Kristalle ergab (Ausbeute: 50%). Enantiomerenüberschuss: 98,9% (Chiracel
ODH, 15 cm × 2,1
mm, 87% n-Heptan + 13% Isopropanol + 0,1% TFA, 100 μl/min, r.t.,
220 nm). [α]D = +12,2° (c
= 1,0; EtOH). ISP-MS: 317,2 (M + Na+), 295,3
(M + H+). HPLC: >99% Fläche. 1H-NMR (DMSO): 1,16 (t, 3H, CH3),
2,42-2,58 (Stapel, ~2H, -CH2-), 4,07 (m,
2H, -CH2O-), 4,39 (m, 1H, -CH-), 5,03 (m,
2H, -CH2O-), 6,93 (bs, 1H, CONH2),
7,31-7,37 (Stapel, 6H, Ph und CONH2), 7,60
(d, 1H, -CONH-).
-
N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin
-
Die
wässrige
Phase wurde mit 25% Salzsäure
auf pH 2 angesäuert
und mit 2 × 500
ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft und
der Rückstand
bei HV getrocknet, was 3,13 g N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin
als weiße
Kristalle ergab (Ausbeute: 34%). Enantiomerenüberschuss: > 99% (Chiracel ODH, 15 cm × 2,1 mm,
87% n-Heptan + 13% Isopropanol + 0,1% TFA, 100 μl/min, r.t., 220 nm). [α]D = –6,7° (c = 1,1;
DMSO). ISP-MS: 289,2 (M + Na+), 267,0 (M
+ H+). HPLC: > 99% Fläche. 1H-NMR
(DMSO): 2,41-2,58 (Stapel, 2H, -CH2-), 4,34
(m, 1H, -CH-), 5,03 (s, 2H, -OCH2-), 6,92
(bs, 1H, CONH2), 7,35 (bs, 6H, Ph und CONH2), 7,45 (d, 1H, -CONH-), 12,6 (s, 1H, COOH).
-
Beispiel 5 (Herstellung
eines Produkts im kleinen Maßstab
mit verschiedenen Proteasen)
-
Nα-Benzoyl-D-asparaginethylester
-
0,5
g (1,89 mmol) Nα-Benzoyl-(D,L)-asparaginethylester
(hergestellt durch herkömmliche
Verfahren: N-Schutz in Analogie zu Zhang et al. (1997), J. Org.
Chem. 62, 2466; Veresterung in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter
kräftigem
Rühren
in 23 ml 0,1 M Natriumchloridlösung
und 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart oder
Abwesenheit von 4 ml Tetrahydrofuran (THF) suspendiert. Der pH wurde
mit 1,0 N Salzsäure
auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe der Protease gestartet
(Name, Ursprung und Menge siehe Tabelle unten). Der pH wurde unter
kräftigem
Rühren
durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Die Experimente ohne THF, welche eine unvollständige Umwandlung
zeigten (siehe Tabelle unten), wurden nicht aufgearbeitet, und die
Experimente mit THF wurden wie folgt behandelt: Nach ungefähr 50% Umwandlung
(entspricht einem Verbrauch von ca. 0,95 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung) wurde
die Reaktionsmischung mit 2 × 25
ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei
35°C Badtemperatur).
Der Rückstand,
welcher den zurückgehaltenen
Ester enthielt, wurde einer ee-Bestimmung unterzogen (BGB-176-SE Kapillarsäule (15
m × 0,25
mm, BGB-Analytik AG, Anwil, Schweiz); H2;
100 kPa; 140–200°C mit 1°/min; inj.
210°C; det.
220°C).
-
-
Beispiel 6 (Herstellung
eines Produkts im großen
Maßstab
einschließlich
anschließender
Aufarbeitung, um ebenfalls Nα-Benzoyl-L-asparagin zu
er ergeben)
-
Nα-Benzoyl-D-asparaginethylester
-
3,5
g (13,2 mmol) Nα-Benzoyl-(D,L)-asparaginethylester
(hergestellt durch herkömmliche
Methoden: N-Schutz in Analogie zu Zhang et al. (1997), J. Org. Chem.
62, 2466; Veresterung in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in
55 ml 0,1 M Natriumchloridlösung
und 5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart von
8 ml Tetrahydrofuran suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf
6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe von 350 μl Alkalase
2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der
pH wurde unter kräftigem
Rühren
durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von 6,44 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (49%
Umwandlung; nach 23 h) wurde die Reaktionsmischung mit 3 × 50 ml
Dichlormethan und 3 × 50
ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden
auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft (bei 35°C Badtemperatur)
und der Rückstand
bei HV getrocknet, was 1,63 g Nα-Benzoyl-D-asparaginethylester als
einen weißen
Feststoff ergab (Ausbeute: 47%). Enantiomerenüberschuss: 98,2% (Chiralpak-AD,
25 cm × 4,6
mm, 75% n-Heptan + 25% EtOH + 0,2% TFA, 1 ml/min, r.t., 220 nm).
[α]D = +12,0° (c
= 1,1; DMSO). ISP-MS: 287,1 (M + Na+), 265,3
(M + H+). HPLC: > 99% Fläche. 1H-NMR
(DMSO): 1,17 (t, 3H, CH3), 2,57-2,72 (Stapel,
2H, -CH2-), 4,19 (q, 2H, -CH2O-),
4,75 (m, 1H, -CH-), 6,95 (bs, 1H, CONH2),
7,40 (bs, 1H, CONH2), 7,46-7,85 (Stapel,
5H, Ph), 8,75 (d, 1H, -CONH-).
-
Nα-Benzoyl-L-asparagin
-
Die
wässrige
Phase wurde mit 1,0 N Salzsäure
auf pH 2 angesäuert.
Der gebildete weiße
Niederschlag wurde abfiltriert und mit 50 ml 10 mM Salzsäure gewaschen.
Der Filterkuchen wurde mit 25 ml TBME gewaschen und bei HV getrocknet,
was 1,28 g Nα-Benzoyl-L-asparagin als ein
weißes
Pulver ergab (Ausbeute: 41%). Enantiomerenüberschuss: > 99% (Chiralpak-AD, 25 cm × 4,6 mm,
85% n-Heptan + 15% EtOH + 0,12% TFA, 0,7 ml/min, r.t., 220 nm).
ISN-MS: 235,2 (M-H–). HPLC: > 99% Fläche. 1H-NMR (DMSO): 2,57-2,72 (Stapel, 2H, -CH2-), 4,72 (m, 1H, -CH-), 6,94 (bs, 1H, CONH2), 7,39 (bs, 1H, CONH2),
7,46-7,85 (Stapel, 5H, Ph), 8,64 (d, 1H, -CONH-), 12,6 (s, 1H, COOH).
-
Beispiel 7 (Herstellung
eines Produkts im kleinen Maßstab)
-
Nα-Benzoyl-D-asparaginbenzylester
-
0,5
g (1,53 mmol) Nα-Benzoyl-(D,L)-asparaginbenzylester
(hergestellt durch herkömmliche
Methoden: N-Schutz in Analogie zu Zhang et al. (1997), J. Org. Chem.
62, 2466; Veresterung über
das Säurechlorid)
wurden unter kräftigem
Rühren
in 23 ml 0,1 M Natriumchloridlösung
und 2 ml 0,1 M Natriumphosphatbuffer pH 7,0 in der Gegenwart oder
Abwesenheit von 4 ml Aceton suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N
Salzsäure
auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch die Zugabe von 50 μl Alcalase
2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der
pH wurde unter kräftigem
Rühren
durch die kon trollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Nach ungefähr
50% Umwandlung wurde die Reaktionsmischung mit 2 × 25 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden
auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 35°C Badtemperatur).
Der Rückstand,
welcher den zurückgehaltenen
Ester enthielt, wurde einer ee-Bestimmung unterzogen (Chiracel ODH,
15 cm × 2,1
mm, 87% n-Heptan + 13% Isopropanol + 0,1% TFA, 0,1 ml/min, r.t.,
220 nm).
-
-
Beispiel 8 (Herstellung
eines Produkts im großen
Maßstab
einschließlich
anschließender
Aufarbeitung, um ebenfalls Nα-Benzoyl-L-asparagin zu
ergeben)
-
Nα-Benzoyl-D-asparaginbenzylester
-
2,50
g (7,66 mmol) Nα-Benzoyl-(D,L)-asparaginbenzylester
(hergestellt durch herkömmliche
Methoden wie in Beispiel 10) wurden unter kräftigem Rühren in 115 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und
10 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart von 20
ml Aceton suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf
6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe von 250 μl Alcalase
2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der
pH wurde unter kräftigem
Rühren
durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von 3,479 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (46%
Umwandlung; nach 17,9h) wurde die Reaktionsmischung mit 2 × 125 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden
auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft (bei 35°C Badtemperatur)
und der Rückstand über Nacht
in 20 ml TBME verrieben. Der Feststoff wurde abfiltriert und bei HV
getrocknet, was 1,10 g Nα-Benzoyl-D-asparaginbenzylester
als einen weißen
Feststoff ergab (Ausbeute: 44%). Enantiomerenüberschuss > 99% (Chiracel-ODH, 15 cm × 2,1 mm,
87% n-Heptan + 13% iPrOH + 0,1% TFA, 0,1 ml/min, r.t., 220 nm).
[α]D = +13,2° (c
= 1,2; DMSO). HPLC: > 99%
Fläche.
ISP-MS: 349,5 (M + Na+), 327,3 (M + H+). 1H-NMR (DMSO):
2,61-2,78 (Stapel, 2H, -CH2-), 4,84 (m,
1H, -CH-), 5,14 (s, 2H, -OCH2-), 6,97 (bs,
1H, CONH2), 7,32-7,84 (Stapel, 11H, 2 × Ph und
CONH2), 8,83 (d, 1H, -CONH-).
-
Nα-Benzoyl-L-asparagin
-
Die
wässrige
Phase wurde mit 25% Salzsäure
auf pH 2 angesäuert.
Der gebildete Niederschlag wurde über Nacht bei 1 °C gerührt und
abfiltriert. Der Filterkuchen wurde mit 10 ml 10 mM Salzsäure gewaschen
und bei HV getrocknet, was 0,77 g Nα-Benzoyl-L-asparagin
als ein weißes
Pulver ergab (Ausbeute: 43%). Enantiomerenüberschuss: > 99% (Chiralpak-AD, 25 cm × 4,6 mm, 85% n-Heptan + 15%
EtOH + 0,12% TFA, 0,7 ml/min, r.t., 220 nm). [α]D = –16,5° (c = 1,0;
DMSO). HPLC: 99% Fläche.
ISN-MS: 235,2 (M-H). 1H-NMR (DMSO): 2,57-2,72 (Stapel, 2H, -CH2-), 4,72 (m, 1H, -CH-), 6,94 (bs, 1H, CONH2), 7,39 (bs, 1H, CONH2),
7,46-7,85 (Stapel, 5H, Ph), 8,64 (d, 1H, -CONH-), 12,6 (s, 1H, COOH).
-
Beispiel 9 (Herstellung
eines Produkts mit verschiedenen Lösungsmitteln)
-
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester
-
2,0
g (7,0 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester (98,4%)
wurden unter kräftigem Rühren in
28 ml 0,1 M Natriumchloridlösung,
4 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 und 8 ml eines organischen
Lösungsmittels
(siehe Tabelle unten; in einem Referenzexperiment in der Abwesenheit
eines organischen Lösungsmittels
wurden aufgrund der breiigen Konsistenz 46 ml Natriumchloridlösung anstelle
von 28 ml verwendet) suspendiert. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt
und die Reaktion durch Zugeben von 100 μl Alkalase 2.4 L [ein Subtilisin
Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch
die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) einer 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von ungefähr 3,5 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (ca.
50% Umwandlung; siehe Tabelle) wurde die Reaktionsmischung mit 3 × 30 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden
auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 35°C Badtemperatur).
Der Rückstand
wurde über
Nacht in 50 ml tert.-Butylmethylether verrieben. Die Suspension
wurde filtriert und der Filterkuchen bei HV getrocknet, was 0,84–0,89 g
N-Benzyloxycarbonyl- D-asparaginmethylester
als ein weißes
kristallines Pulver ergab (siehe Tabelle). Analytik: siehe Tabelle
unten (vgl. Beispiel 2).
-
-
Beispiel 10 (Herstellung
eines Produkts mit einer anderen Protease)
-
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester
-
Ein
Experiment mit THF als organischem Lösungsmittel wurde exakt wie
in Beispiel 9 durchgeführt, nur
dass 100 μl
Savinase 16 L [eine alkalische Bacillus-Protease von Novo Nordisk]
anstelle von 100 μl
Alkalase 2.4 L verwendet wurden und die Reaktion in der Abwesenheit
oder in der Gegenwart von THF durchgeführt wurde.
-
-
Beispiel 11 (Herstellung
eines (L)-Asparaginderivats im großen Maßstab)
-
N-Benzyloxycarbonyl-(L)-asparagin
-
In
Analogie zu Beispiel 2 wurden 10,0 g (35,1 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester (98%)
in 140 ml 0,1 M Natriumchloridlösung,
20 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6,5 und 40 ml THF unter kräftigem Rühren suspendiert.
0,5 ml Alkalase 2.4 L wurden zugegeben und der pH unter kräftigem Rühren durch
die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von 16,42 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung nach
2,1 h (entspricht 47% Umwandlung) wurde die Reaktionsmischung mit
3 × 200
ml Dichlormethan extrahiert, um den ungespaltenen Methylester zu
entfernen. Die wässrige
Phase wurde auf ungefähr
50 ml Volumen konzentriert, indem 200 ml Toluol als Schleppmittel verwendet
wurden. Der pH wurde mit 25% Salzsäure auf 3,5 eingestellt. Der
gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und über Nacht in 300 ml entionisiertem
Wasser verrieben. Die Suspension wurde filtriert und der Filterkuchen
bei HV getrocknet, was 4,07 g N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin als
weiße
Kristalle ergab (Ausbeute: 44%). Enantiomerenüberschuss: > 99% (Chiracel ODH, 25 cm × 4,6 mm,
85% n-Heptan + 15% Isopropanol, 0,8 ml/min, r.t., 220 nm). [α]D = +5,4° (c
= 2,0; AcOH). ISN-MS: 265,3 (M-H–).
HPLC: > 99% Fläche. IR (Nujol):
3337, 1697, 1643, 1536, 1268, 737, 695 cm–1. 1H-NMR (DMSO): 2,41-2,58 (Stapel, 2H, -CH2-), 4,34 (m, 1H, -CH-), 5,03 (s, 2H, -CH2O-), 6,92 (bs, 1H, CONH2),
7,26-7,40 (Stapel, 6H, Ph und -CONH2), 7,44
(bd, 1H, -OCONH-), 12,67 (bs, 1H, -COOH).
-
Beispiel 12 (Herstellung
eines Produkts im kleinen Maßstab)
-
N-Benzyloxycarbonyl-(D)-asparagin-n-butylester
-
0,5
g (1,55 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparagin-n-butylester (hergestellt
in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in 23 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und
2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart oder Abwesenheit
von 4 ml Dioxan suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf
6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe von 50 μl Alcalase
2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der
pH wurde unter kräftigem
Rühren
durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Nach ungefähr
50% Umwandlung wurde die Reaktionsmischung mit 2 × 25 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden
auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 35°C Badtemperatur).
Der Rückstand,
welcher den zurückgehaltenen
Ester enthielt, wurde einer ee-Bestimmung unterzogen (Chiracel ODH,
15 cm × 0,3
mm, 90% n-Heptan +
10% Isopropanol, 5 μl/min,
30°C, 210
nm).
-
-
Beispiel 13 (Herstellung
eines Produkts im großen
Maßstab)
-
N-Benzyloxycarbonyl-(D)-asparagin-n-butylester
-
4,0
g (12,41 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparagin-n-butylester
(hergestellt in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in
180 ml 0,1 M Natriumchloridlösung
und 16 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart von
30 ml Dioxan suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf
6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe von 400 μl Alcalase
2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der
pH wurde unter kräftigem
Rühren
durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei
6,5 gehalten. Nach 66 h und 87 h wurden zusätzliche 200 μl Alcalase-Lösung zu der
fast stoppenden Reaktion zugegeben. Nach einem Verbrauch von 5,73
ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (46%
Umwandlung; nach insgesamt 91 h) wurde die Reaktionsmischung mit
2 × 200
ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft (bei 35°C Badtemperatur)
und der Rückstand über Nacht
in 50 ml TBME verrieben. Der Feststoff wurde abfiltriert, der Filterkuchen
mit TBME gewaschen und bei HV getrocknet, was 1,61 g N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginbutylester
als weißen
Feststoff ergab (Ausbeute: 40%). HPLC: 98,9% (Fläche). Enantiomerenüberschuss: 95%
(Chiracel ODH, 15 cm × 0,3
mm, 90% n-Heptan + 10% Isopropanol, 5 μl/min, 30°C, 210 nm). [α]D = +19,9° (c
= 1,0; DMSO). ISP-MS: 345,3 (M + Na+), 323,3
(M + H+). 1H-NMR
(DMSO): 0,87 (t, 3H, CH3), 1,31 (m, 2H, -CH2-), 1,52 (m, 2H, -CH2-),
2,43-2,59 (Stapel, ~2H, -CH2-), 4,03 (m,
2H, -CH2O-), 4,40 (m, 1H, -CH-), 5,03 (m, 2H,
-CH2O-), 6,93 (bs, 1H, CONH2),
7,29-7,39 (Stapel, 6H, Ph und CONH2), 7,60
(d, 1H, -CONH-).