DE60123513T2

DE60123513T2 - Verfahren zur Herstellung von D-Asparaginderivaten

Info

Publication number: DE60123513T2
Application number: DE60123513T
Authority: DE
Inventors: Hans Iding; Mark Rogers-Evana; Beat Wirz
Original assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Current assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Priority date: 2000-04-19
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: EP1148140A1; DK1148140T3; ATE341642T1; US20010049127A1; ES2272372T3; DE60123513D1; JP3568914B2; JP2001309798A; EP1148140B1; US6420166B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von D-Asparaginderivaten mit der Formel I zur Herstellung von D-Asparaginderivaten mit der Formel I
worin R¹ eine Aminoschutzgruppe ist und R² ein Alkyl, ein substituiertes Alkyl oder eine Gruppe mit der Formel A ist,
worin R³ Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe ist und n 1, 2 oder 3 ist.
Verbindungen mit der Formel I sind bekannt. Die Verbindung N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester wird in J. Liq. Chrom. (1994), 17 (13), 2759 beschrieben. Eine chemische Synthese dieser Verbindung wird in Tetrahedron (1997), 53 (6), 2075 beschrieben, wo diese durch eine Zweischrittreaktion ausgehend von bereits chiralem (S)-Asparagin erreicht wird. In J. Chem. Soc. Perkin Trans 1 (1983), 2287 wird die Synthese der oben erwähnten Verbindung ebenfalls ausgehend von einem chiralen Reaktanden beschrieben.
J. MADDALUNO ET AL.: „Handy access to chiral N,N'-disubstituted 3-aminopyrrolidines", Tetrahedron Asymmetry (1992), 3 (10), 1239-1242 offenbaren die Herstellung von N-geschütztem (S)-Asparaginmethylester in einer Zweischrittreaktion, ausgehend von bereits chiralem N-geschütztem (S)-Asparagin. Diese Referenz beschreibt weiterhin eine Synthese von (S)-3-Aminopyrrolidinen aus dem Asparaginderivat, welche eine Cyclisierung von Methyl-N-Z-(S)-Asparaginat (1 in Schema 1 dieser Referenz), gefolgt von einer Eintopf-N-Benzylierung einschließt, was zu (S)-Aminosuccinimid (3) führt, welches nach Abspaltung der N-Schutzgruppe Z in ein entsprechendes Imin umgewandelt wird und zu dem chiralen N,N'-disubstituierten 3-Aminopyrrolidin reduziert wird.
Die Herstellung und Reinigung von neuen D-Aminoacylasen aus einem Mikroorganismus, welcher zu der Gattung Sebekia bzw. Amycolatopsis gehört, wird in EP 0 950 706 und in EP 0 896 057 beschrieben. Die Enzyme sind für die industrielle Produktion von chiralen D-Aminosäuren ausgehend von racemischen N-Acetyl-D,L-aminosäuren nützlich. Die D-Aminoacylase (Gattung Sebekia) weist eine Aktivität gegenüber N-Acetyl-D-asparagin von 1,4% im Vergleich zu N-Acetyl-D-methionin (100%) auf. Die D-Aminoacylase (Gattung Amycolatopsis) weist eine spezifische Aktivität gegenüber N-Acetyl-D-asparagin von 19% im Vergleich zu N-Acetyl-D-methionin (100%) auf.
In Agric. Biol. Chem. (1987), 51 (3), 721 und in DE 2825245 wird die enzymatische Herstellung von D-Aminosäuren ausgehend von D,L-5-substituiertem Hydantoin beschrieben. Die Synthese von D-Asparagin wird in einer Zweischrittreaktion (1. Ringöffnung von D,L-5-substituierten Hydantoinen zu D-N-Carbamylaminosäuren durch D-Hydantoinhydrolase, gefolgt von 2. der Spaltung von N-Carbamyl-D-aminosäuren zu D-Aminosäuren durch N-Carbamyl-D-aminosäurehydrolase unter Verwendung der Gattung Pseudomonas AJ-1122) oder in einer Einschrittreaktion unter Verwendung der Gattung Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, Maraxella, Paracoccus bzw. Arthrobacter erreicht.
Die EP-A-0 182 517 beschreibt die stereoselektive enzymatische Hydrolyse einer L- und D-Mischung von N-acyliertem alpha-Aminosäureester mit der Formel
worin X der Rest einer natürlich vorkommenden alpha-Aminosäure ist und das C-Atom, welches die -NHCOR, -COOR' und X-Gruppen trägt, chiral ist, wobei die Mischung selektiv zu einer Mischung von L-alpha-Aminosäure und D-N-acyliertem alpha-Aminosäureester hydrolysiert wird, wobei eine Mischung einer Aclyase und einer Esterase verwendet wird.
Weiterhin beschreiben CHEN ET AL.; „Kinetic resolution of N-protected amino acid esters in organic solvents catalysed by a stable industrial alkaline protease" Biotechnology letters, Bd. 13, Nr. 11, 1991 (11-1991), 773-778 die Möglichkeit der Verwendung von Proteasen als Katalysatoren in organischen Lösungsmitteln für die Auftrennung von N-geschützten Aminosäuren.
WONG C-H ET AL.: „Enzymes in organic synthesis": Use of subtilisin and a highly stable mutant derived from multiple site-specific mutations", Journal of the American Chemical Society, Bd. 112, Nr. 3, 1990, 945-953 beschreiben die Verwendung von Subtilisin als einer in hohem Maße stabilen Mutante, die durch mehrere gezielte Mutationen in organischen Reaktionen abgeleitet wurde. Die Anwendung des Mutentenenzyms und des Wildtypenzyms auf die organische Synthese wurde bei der enantioselektiven Hydrolyse N-geschützter Aminosäureester in Wasser mit 85–98% Enantioselektivität für das L-Isomer demonstriert.
KIJIMA T ET AL.: „Facile optical resolution of amino acid esters via hydrolysis by an industrial enzyme in organic solvents", Journal of chemical Technology and Biotechnology, Bd. 59, Nr. 1, 1994, 61–65 offenbaren, dass racemische Aminosäureester über eine Hydrolyse in organischen Lösungsmitteln durch Katalyse einer industriellen alkalischen Protease optisch aufgetrennt werden können. Es wurde gefunden, dass oberhalb von 70% (v/v) Wassergehalt der Enantiomerenüberschuss scharf abfiel. Im Allgemeinen wurden bei niedrigen Wassergehalten hohe Werte des Enantiomerenüberschusses erhalten.
Es ist keine technische enzymatische Reaktion zur Herstellung von Asparaginesterderivaten in der Literatur beschrieben worden. Dieses könnte auf der Leichtigkeit der Racemisierung und dem Abbau von Asparaginderivaten bei den herkömmlichen pH-Werten der Reaktion (7–8,5) beruhen, welche für Hydrolasereaktionen verwendet werden. Eine schnelle Inaktivierung der Enzyme wurde beobachtet, wenn höhere, technisch relevantere Substratkonzentrationen verwendet wurden.
Es wurde gefunden, dass diese Inaktivierung überwunden werden konnte, indem ein organisches Cosolvens eingesetzt wurde (die Wirkung des Lösungsmittels ist nicht die eines „Substratsolubilisators", da, wenn es zugegeben wird nachdem die Reaktion aufgehört hat, die Reaktion nicht wieder anfängt). Die Verbindungen mit der Formel I können daher in einer verbesserten Weise hergestellt werden, indem ein Verfahren zur Herstellung von D-Asparaginderivaten mit der Formel I,
worin R¹ eine Aminoschutzgruppe ist und R² ein Alkyl, ein substituiertes Alkyl oder eine Gruppe mit der Formel A ist,
worin R³ Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe ist und n 1, 2 oder 3 ist,
verwendet wird, wobei das Verfahren umfasst:
Umsetzen einer Verbindung mit der Formel II
worin R¹ und R² wie oben definiert sind,
mit einer Protease in einem wässrigen System bei einem pH von 6,0–7,5 in Kombination mit einem organischen Cosolvens und anschließende Extraktion des enantiomerenreinen Produkts mit der Formel I, und wobei das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminopyrrolidinderivaten mit der Formel IV
verwendet wird, worin R¹ wie in Anspruch 1 definiert ist und R Wasserstoff, C_1-12-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, C_3-12-Alkenyl, Phenyl, Tolyl, Naphthyl, Pyridin, Pyrimidin, Pyridazin oder Benzyl ist.
In den Strukturformeln, die hierin angegeben sind, bedeutet eine keilförmige Bindung
dass sich der Substituent oberhalb der Papierebene befindet.
In den Strukturformeln, die hierin angegeben sind, bedeutet eine gepunktete Bindung
dass sich der Substituent unterhalb der Papierebene befindet.
Der Ausdruck „Aminoschutzgruppe", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Gruppen wie z.B. jene, die in der Peptidchemie eingesetzt werden, wie in Green T. Protective Groups in Organic Synthesis, Kapitel 5, John Wiley and Sons, Inc. (1981), Seiten 218-287 beschrieben wird, wie z.B. eine Allyloxycarbonylgruppe (ALLOC), eine niedere Alkoxycarbonylgruppe (z.B. tert.-Butoxycarbonyl (t-BOC)), eine substituierte niedere Alkoxycarbonylgruppe (z.B. Trichlorethoxycarbonyl), eine wahlweise substituierte Aryloxycarbonylgruppe (z.B. p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl (Z) oder Phenyloxycarbonyl), eine Arylalkylgruppe (z.B. Triphenylmethyl (Trityl), Benzhydryl oder Benzyl), eine Alkanoylgruppe (z.B. Formyl, Acetyl), eine Aroylgruppe (z.B. Benzoyl), eine Halogenalkanoylgruppe (z.B. Trifluoracetyl) oder eine Silylschutzgruppe (z.B. tert.-Butyldimethylsilyl).
Bevorzugte Aminoschutzgruppen sind Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder Benzoyl, besonders bevorzugte Aminoschutzgruppen sind Benzyloxycarbonyl oder Benzoyl.
Der Ausdruck „Alkyl", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet gerade oder verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten, wie z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, einschließlich deren verschiedener Isomeren. Vorzugsweise bezeichnet der Ausdruck „Alkyl" einen wahlweise substituierten geraden oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest, welcher 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält.
Alkyl in R² ist vorzugsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl oder Pentyl und insbesondere Methyl oder Ethyl.
Der Ausdruck „niederes Alkyl", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet gerade oder verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste, welche 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, wie z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl oder tert.-Butyl.
Der Ausdruck „substituiertes Alkyl", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen geraden oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest, welcher 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthält, in welchem ein oder mehrere Wasserstoffatome durch eine oder mehrere Hydroxygruppen, niedere Alkoxygruppen, Cycloalkylgruppen, Arylgruppen oder durch ein oder mehrere Halogenatome ersetzt sind. Beispiele sind 3-Hydroxybutyl, 4-Methoxybutyl, 3-Ethoxypropyl, 3-Cyclohexylpropyl, Benzyl, 2-Phenylethyl, 1-Fluormethyl, 2-Chlorethyl, 2,2-Dichlorethyl, 3-Brompropyl oder 2,2,2-Trifluorethyl und dergleichen.
Das substituierte Alkyl in R² ist vorzugsweise Benzyl.
Der Ausdruck „Cycloalkyl", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen 3–6gliedrigen gesättigten carbocyclischen Anteil, z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl, vorzugsweise Cyclohexyl.
Der Ausdruck „niederes Alkoxy", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine gerade oder verzweigtkettige niedere Alkyloxygruppe, in welcher der „niedere Alkyl"-Anteil wie oben definiert ist. Beispiele sind Methoxy, Ethoxy, n-Propyloxy, iso-Propyloxy, n-Butyloxy, iso-Butyloxy oder tert.-Butyloxy. Noch bevorzugtere niedere Alkoxygruppen innerhalb der Erfindung sind Methoxy oder Ethoxy.
Der Ausdruck „Aryl", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine wahlweise substituierte Phenylgruppe, in welcher ein oder mehrere Arylwasserstoffatome durch eine oder mehrere Phenylgruppen, Alkylgruppen, niedere Alkoxygruppen oder halogenierte Alkylgruppen substituiert sein können. Beispiele für substituierte Phenylgruppen sind Biphenyl, o-Methylphenyl, m-Methylphenyl, p-Methylphenyl, o-Methoxyphenyl, m-Methoxyphenyl, p-Methoxyphenyl, o-Fluormethylphenyl, m-Fluormethylphenyl, p-Fluormethylphenyl, o-Chlormethylphenyl, m-Chlormethylphenyl, p-Chlormethylphenyl, o-Brommethylphenyl, m-Brommethylphenyl oder p-Brommethylphenyl.
Der Ausdruck „Aryloxy" bedeutet eine Arylgruppe, wie sie oben definiert ist, welche über ein Sauerstoffatom gebunden ist. Beispiele sind Phenyloxy, Benzyloxy und dergleichen.
Der Ausdruck „niederes Alkoxycarbonyl" bezeichnet niedere Alkoxyreste, welche an einer Carbonylgruppe (>C=O) befestigt sind. Beispiele sind Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl und dergleichen. Ein bevorzugtes niederes Alkoxycarbonyl ist tert.-Butoxycarbonyl.
Der Ausdruck „Aryloxycarbonyl" bezeichnet Aryloxyreste, die an einer Carbonylgruppe (>C=O) befestigt sind. Beispiele sind Nitrobenzyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl (Z) oder Phenyloxycarbonyl.
Aryloxycarbonyl in R¹ ist Nitrobenzyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl (Z) oder Phenyloxycarbonyl, insbesondere Benzyloxycarbonyl (Z).
Durch den Ausdruck „Arylalkyl", wie er hierin verwendet wird, wird eine Kohlenwasserstoffgruppe bezeichnet, in welcher ein oder mehrere Alkylwasserstoffatome durch eine Arylgruppe wie z.B. Trityl, Benzhydryl oder Benzyl substituiert sind.
Der Ausdruck Halogen steht für Fluor, Chlor oder Brom.
Die Verbindungen mit der Formel II können gemäß bekannten Verfahren aus Lehrbüchern über die organische Chemie, z.B. von J. March (1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure", 4. Ausg., John Wiley and Sons), hergestellt werden. Beispielsweise wird ein N-geschütztes D,L-Asparaginderivat mit dem entsprechenden Alkohol (z.B. Methanol) in der Gegenwart von Thionylchlorid verestert.
Gemäß der Erfindung werden Verbindungen mit der Formel I durch die Reaktion einer Verbindung mit der Formel II, worin R¹ und R² wie oben definiert sind, worin vorzugs weise R¹ Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder Benzoyl ist und R² Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl, Pentyl oder Benzyl ist, mit einer Protease in einem wässrigen System bei einem pH von 6,0–7,5 in Kombination mit einem organischen Cosolvens hergestellt. Nach der enzymatischen Hydrolyse des L-Asparaginderivats wird das enantiomerenreine D-Asparaginderivat mit der Formel I durch Extraktion abgetrennt.
Geeignete Enzyme als Katalysatoren für die Reaktionen sind Proteasen, vorzugsweise billige Massenproteasen mikrobiellen Ursprungs, insbesondere Bacillus-Proteasen (wie Savinase von Novo Nordisk) oder Subtilisine, z.B. Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk (Alkalase) oder von Solvay (Protease-L).
Als Alternative können die Enzyme in immobilisierter Form verwendet werden.
Gemäß der Erfindung wird die Reaktion in einem wässrig-organischen System durchgeführt, welches mit Wasser mischbare Lösungsmittel (in einer Endkonzentration von bis zu 25%, vorzugsweise 10–25% (v/v)) oder mit Wasser nicht mischbare organische Cosolventien (in irgendeinem Verhältnis) einsetzt.
Was die wässrige Phase betrifft, so werden übliche Pufferlösungen, von denen bekannt ist, dass diese für biochemische Umwandlungen verwendet werden, wie z.B. Natrium- oder Kaliumphosphat in einer Konzentration von bis zu 1 M, vorzugsweise zwischen ca. 5 mM und ca. 50 mM, verwendet. Eine solche Pufferlösung kann zusätzlich eines der üblichen Salze wie z.B. Natrium- oder Kaliumchlorid, LiSCN, Na₂SO₄ oder einen mehrwertigen Alkohol, z.B. einen Zucker, in einer Konzentration bis zu 1 M, vorzugsweise 0,1 M, enthalten. Der pH der Reaktion reicht von 6,0 bis 7,5, vorzugsweise reicht der pH der Reaktion von 6,0 bis 7,0. Ein besonders bevorzugter pH der Reaktion reicht von 6,4 bis 6,6.
Geeignete Cosolventien sind technisch übliche Lösungsmittel. Beispiele sind Ether (z.B. Tetrahydrofuran (THF), Dioxan oder tert.-Butylmethylether (TBME)), niedere Alkohole, Esters (z.B. Ethylacetat), polare aprotische Lösungsmittel (z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid (DMF) oder Aceton). Bevorzugt sind mit Wasser mischbare Cosolventien (z.B. Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, tert.-Butylmethylether (TBME), niedere Alkohole, Ethylacetat oder Aceton).
Der Ausdruck „niederer Alkohol", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet gerade oder verzweigtkettige Alkylreste, welche 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten, mit einer Hydroxygruppe wie z.B. Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, tert.-Butanol, Pentanol, Hexanol, Heptanol oder Octanol, vorzugsweise Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, tert.-Butanol, und noch bevorzugtere Alkohole sind Methanol oder Ethanol. Der am meisten bevorzugte Alkohol ist Ethanol.
Das Substrat wird geeigneterweise als eine Suspension in einer Gesamtkonzentration von 5–15% (w/w) aufgetragen. Eine noch bevorzugtere Gesamtkonzentration ist 8–12%.
Nach der Zugabe des Enzyms wird der pH der Reaktionsmischung unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe einer Base bei dem ausgewählten pH-Wert gehalten. Bevorzugte Basen sind wässrige NaOH- oder KOH-Lösungen.
Nach Beendigung der Reaktion wird das enantiomerenreine Produkt mit der Formel I in herkömmlicher Weise durch Extraktion der Reaktionsmischung mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel aufgearbeitet. Ein bevorzugtes organisches Lösungsmittel ist Dichlormethan.
Wahlweise könnte die verbleibende wässrige Schicht aufgearbeitet werden, um das entsprechende N-geschützte L-Asparagin zu ergeben. Dieses wird herkömmlicherweise durch Ansäuerung der zurückgehaltenen wässrigen Phase und Abfiltrieren des gebildeten Niederschlags oder deren Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel erreicht.
Daher ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von N-geschütztem L-Asparagin mit der Formel III
worin R¹ wie oben definiert ist, worin R¹ vorzugsweise Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder Benzoyl ist,
wobei das Verfahren umfasst:

a) Umsetzen einer Verbindung mit der Formel II
worin R¹ und R² wie oben definiert sind, worin vorzugsweise R¹ Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder Benzoyl ist und R² Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Benzyl ist, mit einer Protease, vorzugsweise mit einer mikrobiellen Protease, insbesondere mit einem Subtilisin oder mit einer Bacillus-Protease, in einem wässrigen System bei einem pH von 6,0–7,5, vorzugsweise bei einem pH von 6,0–7,0 und am meisten bevorzugt bei einem pH von 6,4–6,6, in Kombination mit einem organischen Cosolvens, insbesondere Tetrahydrofuran, Dioxan, tert.-Butylmethylether, einem niederen Alkohol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid oder Aceton und am meisten bevorzugt Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, tert.-Butylmethylether (TBME), niederen Alkoholen, Ethylacetat oder Aceton, und anschließende Extraktion des enantiomerenreinen Produkts mit der Formel I; und
b) Aufarbeiten der verbleibenden wässrigen Schicht, um das entsprechende N-geschützte L-Asparagin mit der Formel III zu ergeben.

Um eine hohe chemische Reinheit für das Produkt mit der Formel I oder III zu erhalten, kann dieses wahlweise in der Gegenwart eines geeigneten organischen Lösungsmittels verrieben werden, in welchem das Produkt mit der Formel I oder III, aus Gründen der Stabilität, praktisch unlöslich ist.
Das Verfahren wird vorzugsweise zur Herstellung von N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester durchgeführt, und es wird in der Gegenwart von TBME verrieben.
Die Verbindungen mit der Formel I, welche gemäß dem erfinderischen Verfahren hergestellt werden, können zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminopyrrolidinderivaten mit der Formel IV
worin R¹ eine Aminoschutzgruppe ist und R Wasserstoff, C_1-12-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, C_3-12-Alkenyl, Phenyl, Tolyl, Naphthyl, Pyridin, Pyrimidin, Pyridazin oder Benzyl ist, worin vorzugsweise
R¹ Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder Benzoyl ist und R Wasserstoff, C_1-8-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, C_3-8-Alkenyl, Phenyl, Tolyl, Naphthyl, Pyridin, Pyrimidin, Pyridazin, Benzyl ist, und worin am meisten bevorzugt
R¹ Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder Benzoyl ist und R Benzyl ist,
verwendet werden.
Die Reaktion zur Herstellung der optisch aktiven 3-Aminopyrrolidinderivate mit der Formel IV kann durchgeführt werden, wie in der EP-A-0 928 787 beschrieben wird.
Die optisch aktiven 3-Aminopyrrolidinderivate mit der Formel IV sind wichtige Bausteine für die Herstellung von nützlichen Produkten in der chemischen, landwirtschaftlichen und in der pharmazeutischen Industrie. Insbesondere sind sie nützlich zur Herstellung von antibakteriellen Substanzen wie z.B. Vinylpyrrolidinon-Cephalosporin-Derivaten, wie in der WO 99/65920, der EP-A 0 620 225 oder in der EP-A 0 849 269 beschrieben wird.
In den folgenden Beispielen haben die verwendeten Abkürzungen die folgenden Bedeutungen.

ISP-MS: positive Ionenspray-Massenspektroskopie
ISN-MS: negative Ionenspray-Massenspektroskopie
EI-MS: Elektronenstoß-Massenspektroskopie
SFC: Chromatographie mit superkritischem Fluid
NMR: Kernmagnetresonanzspektroskopie
IR: Infrarotspektroskopie
HV: Hochvakuum
min: Minute(n)

Beispiel 1 (Herstellung des Reaktanden)
N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester
18,85 g (70,8 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparagin [Bachem] wurden in 230 ml Methanol gelöst/suspendiert, und die Lösung/Suspension wurde dann auf 0°C abgekühlt. 6,0 ml Thionylchlorid wurden tropfenweise zugegeben, so dass die Temperatur unter 10°C blieb. Am Ende wurde eine klare Lösung gebildet, welche für 15 min gerührt wurde. Die Reaktionsmischung wurde zusammen mit 550 ml Toluol verdampft (nachdem ca. 150 ml Volumen erreicht waren wurden 100 ml Methanol zugegeben und die Verdampfung fortgesetzt; 40°C Badtemperatur). Der resultierende weiße, kristalline Rückstand wurde über Nacht in 200 ml tert.-Butylmethylether verrieben/zersetzt. Der Rückstand wurde abfiltriert und im HV getrocknet, was 18,7 g N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester als ein weißes kristallines Pulver ergab (Ausbeute: 92%). ISP-MS: 303,2 (M + Na⁺), 281,2 (M + H⁺), 237,2 (M-CO₂). SFC: 97,7% Fläche.
Beispiel 2 (Herstellung eines Produkts im großen Maßstab)
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester
18,5 g (65,7 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester (99,5%) wurden in 190 ml 0,1 M Natriumchloridlösung, 40 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6,5 und 25 ml THF unter kräftigem Rühren suspendiert. 1,0 ml Alkalase 2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] wurde zugegeben, und der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) einer 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von 32,0 ml einer 1,0 N Natriumhydroxidlösung (16,3 h; 49% Umwandlung nach 8 h) wurde die Reaktionsmischung mit 3 × 350 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden kurz mit 500 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 gewaschen, auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 25°C Badtemperatur). Der Rückstand wurde über Nacht in 200 ml tert.-Butylmethylether verrieben. Die Suspension wurde filtriert, und der Filterkuchen bei HV getrocknet, um 8,2 g N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester als ein weißes kristallines Pulver zu ergeben (Ausbeute: 46%). Enantiomerenüberschuss: > 99,5% (Chiracel ODH, 15 cm × 300 μm, 85% n-Hexan + 15% Isopropanol, 6 μl/min, 0,5 MPa, 30°C, 210 nm). EI-MS: 280,2 (M), 221,1 (M-CO₂Me). SFC: 98,8% Fläche. IR (Nujol): 3349, 1741, 1665, 1550, 733, 698 cm^–1. ¹H-NMR (CDCl₃): 2,76 (dd, J₁ = 4 Hz, J₂ = 16 Hz, 1H, -CHCH-), 2,98 (dd, J₁ = 4 Hz, J₂ = 16 Hz, 1H, -CHCH-), 3,76 (s, 3H, OCH₃), 4,60 (m, 1H, -CHCOO-), 5,13 (s, 2H, -CH₂O), 5,42 und 5,53 (2 × bs, 2H, CONH₂), 6,00 (bd, < 1H, OCONH), 7,29-7,37 (Stapel, 5H, Ph).
Beispiel 3 (Herstellung eines Produkts im kleinen Maßstab mit verschiedenen Proteasen)
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginethylester
0,5 g (1,7 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginethylester (hergestellt in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in 23 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart oder Abwesenheit von 4 ml Tetrahydrofuran (THF) suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch die Zugabe der Protease gestartet (Name, Ursprung und Menge siehe Tabelle unten). Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Die Experimente ohne THF, welche eine unvollständige Umwandlung zeigten (siehe Tabelle unten), wurden nicht aufgearbeitet, die Experimente mit THF wurden wie folgt behandelt: Nach ungefähr 50% Umwandlung (entspricht einem Verbrauch von 0,85 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung) wurde die Reaktionsmischung mit 2 × 25 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 35°C Badtemperatur). Der Rückstand, welcher den zurückgehaltenen Ester enthielt, wurde einer ee-Bestimmung unterzogen (Chiracel ODH, 15 cm × 2,1 mm, 87% n-Heptan + 13% Isopropanol + 0,1% TFA, 0,1 ml/min, r.t., 220 nm).
Beispiel 4 (Herstellung eines Produkts im großen Maßstab einschließlich anschließender Aufarbeitung, um ebenfalls N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin zu ergeben)
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginethylester
10,0 g (34,0 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginethylester (hergestellt in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in 460 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und 40 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart von 80 ml Tetrahydrofuran suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch die Zugabe von 1,0 ml Savinase 16 L [eine Bacillus-Protease von Novo Nordisk] gestartet. Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von 16,45 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (48,2% Umwandlung; nach 17h) wurde die Reak tionsmischung mit 2 × 500 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft (bei 35°C Badtemperatur) und der Rückstand bei HV getrocknet, was 5,02 g N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginethylester als weiße Kristalle ergab (Ausbeute: 50%). Enantiomerenüberschuss: 98,9% (Chiracel ODH, 15 cm × 2,1 mm, 87% n-Heptan + 13% Isopropanol + 0,1% TFA, 100 μl/min, r.t., 220 nm). [α]_D = +12,2° (c = 1,0; EtOH). ISP-MS: 317,2 (M + Na⁺), 295,3 (M + H⁺). HPLC: >99% Fläche. ¹H-NMR (DMSO): 1,16 (t, 3H, CH₃), 2,42-2,58 (Stapel, ~2H, -CH₂-), 4,07 (m, 2H, -CH₂O-), 4,39 (m, 1H, -CH-), 5,03 (m, 2H, -CH₂O-), 6,93 (bs, 1H, CONH₂), 7,31-7,37 (Stapel, 6H, Ph und CONH₂), 7,60 (d, 1H, -CONH-).
N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin
Die wässrige Phase wurde mit 25% Salzsäure auf pH 2 angesäuert und mit 2 × 500 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft und der Rückstand bei HV getrocknet, was 3,13 g N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin als weiße Kristalle ergab (Ausbeute: 34%). Enantiomerenüberschuss: > 99% (Chiracel ODH, 15 cm × 2,1 mm, 87% n-Heptan + 13% Isopropanol + 0,1% TFA, 100 μl/min, r.t., 220 nm). [α]_D = –6,7° (c = 1,1; DMSO). ISP-MS: 289,2 (M + Na⁺), 267,0 (M + H⁺). HPLC: > 99% Fläche. ¹H-NMR (DMSO): 2,41-2,58 (Stapel, 2H, -CH₂-), 4,34 (m, 1H, -CH-), 5,03 (s, 2H, -OCH₂-), 6,92 (bs, 1H, CONH₂), 7,35 (bs, 6H, Ph und CONH₂), 7,45 (d, 1H, -CONH-), 12,6 (s, 1H, COOH).
Beispiel 5 (Herstellung eines Produkts im kleinen Maßstab mit verschiedenen Proteasen)
N_α-Benzoyl-D-asparaginethylester
0,5 g (1,89 mmol) N_α-Benzoyl-(D,L)-asparaginethylester (hergestellt durch herkömmliche Verfahren: N-Schutz in Analogie zu Zhang et al. (1997), J. Org. Chem. 62, 2466; Veresterung in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in 23 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart oder Abwesenheit von 4 ml Tetrahydrofuran (THF) suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe der Protease gestartet (Name, Ursprung und Menge siehe Tabelle unten). Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Die Experimente ohne THF, welche eine unvollständige Umwandlung zeigten (siehe Tabelle unten), wurden nicht aufgearbeitet, und die Experimente mit THF wurden wie folgt behandelt: Nach ungefähr 50% Umwandlung (entspricht einem Verbrauch von ca. 0,95 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung) wurde die Reaktionsmischung mit 2 × 25 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 35°C Badtemperatur). Der Rückstand, welcher den zurückgehaltenen Ester enthielt, wurde einer ee-Bestimmung unterzogen (BGB-176-SE Kapillarsäule (15 m × 0,25 mm, BGB-Analytik AG, Anwil, Schweiz); H₂; 100 kPa; 140–200°C mit 1°/min; inj. 210°C; det. 220°C).
Beispiel 6 (Herstellung eines Produkts im großen Maßstab einschließlich anschließender Aufarbeitung, um ebenfalls N_α-Benzoyl-L-asparagin zu er ergeben)
N_α-Benzoyl-D-asparaginethylester
3,5 g (13,2 mmol) N_α-Benzoyl-(D,L)-asparaginethylester (hergestellt durch herkömmliche Methoden: N-Schutz in Analogie zu Zhang et al. (1997), J. Org. Chem. 62, 2466; Veresterung in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in 55 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und 5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart von 8 ml Tetrahydrofuran suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe von 350 μl Alkalase 2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von 6,44 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (49% Umwandlung; nach 23 h) wurde die Reaktionsmischung mit 3 × 50 ml Dichlormethan und 3 × 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft (bei 35°C Badtemperatur) und der Rückstand bei HV getrocknet, was 1,63 g N_α-Benzoyl-D-asparaginethylester als einen weißen Feststoff ergab (Ausbeute: 47%). Enantiomerenüberschuss: 98,2% (Chiralpak-AD, 25 cm × 4,6 mm, 75% n-Heptan + 25% EtOH + 0,2% TFA, 1 ml/min, r.t., 220 nm). [α]_D = +12,0° (c = 1,1; DMSO). ISP-MS: 287,1 (M + Na⁺), 265,3 (M + H⁺). HPLC: > 99% Fläche. ¹H-NMR (DMSO): 1,17 (t, 3H, CH₃), 2,57-2,72 (Stapel, 2H, -CH₂-), 4,19 (q, 2H, -CH₂O-), 4,75 (m, 1H, -CH-), 6,95 (bs, 1H, CONH₂), 7,40 (bs, 1H, CONH₂), 7,46-7,85 (Stapel, 5H, Ph), 8,75 (d, 1H, -CONH-).
N_α-Benzoyl-L-asparagin
Die wässrige Phase wurde mit 1,0 N Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Der gebildete weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit 50 ml 10 mM Salzsäure gewaschen. Der Filterkuchen wurde mit 25 ml TBME gewaschen und bei HV getrocknet, was 1,28 g N_α-Benzoyl-L-asparagin als ein weißes Pulver ergab (Ausbeute: 41%). Enantiomerenüberschuss: > 99% (Chiralpak-AD, 25 cm × 4,6 mm, 85% n-Heptan + 15% EtOH + 0,12% TFA, 0,7 ml/min, r.t., 220 nm). ISN-MS: 235,2 (M-H^–). HPLC: > 99% Fläche. ¹H-NMR (DMSO): 2,57-2,72 (Stapel, 2H, -CH₂-), 4,72 (m, 1H, -CH-), 6,94 (bs, 1H, CONH₂), 7,39 (bs, 1H, CONH₂), 7,46-7,85 (Stapel, 5H, Ph), 8,64 (d, 1H, -CONH-), 12,6 (s, 1H, COOH).
Beispiel 7 (Herstellung eines Produkts im kleinen Maßstab)
N_α-Benzoyl-D-asparaginbenzylester
0,5 g (1,53 mmol) N_α-Benzoyl-(D,L)-asparaginbenzylester (hergestellt durch herkömmliche Methoden: N-Schutz in Analogie zu Zhang et al. (1997), J. Org. Chem. 62, 2466; Veresterung über das Säurechlorid) wurden unter kräftigem Rühren in 23 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und 2 ml 0,1 M Natriumphosphatbuffer pH 7,0 in der Gegenwart oder Abwesenheit von 4 ml Aceton suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch die Zugabe von 50 μl Alcalase 2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kon trollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Nach ungefähr 50% Umwandlung wurde die Reaktionsmischung mit 2 × 25 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 35°C Badtemperatur). Der Rückstand, welcher den zurückgehaltenen Ester enthielt, wurde einer ee-Bestimmung unterzogen (Chiracel ODH, 15 cm × 2,1 mm, 87% n-Heptan + 13% Isopropanol + 0,1% TFA, 0,1 ml/min, r.t., 220 nm).
Beispiel 8 (Herstellung eines Produkts im großen Maßstab einschließlich anschließender Aufarbeitung, um ebenfalls N_α-Benzoyl-L-asparagin zu ergeben)
N_α-Benzoyl-D-asparaginbenzylester
2,50 g (7,66 mmol) N_α-Benzoyl-(D,L)-asparaginbenzylester (hergestellt durch herkömmliche Methoden wie in Beispiel 10) wurden unter kräftigem Rühren in 115 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und 10 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart von 20 ml Aceton suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe von 250 μl Alcalase 2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von 3,479 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (46% Umwandlung; nach 17,9h) wurde die Reaktionsmischung mit 2 × 125 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft (bei 35°C Badtemperatur) und der Rückstand über Nacht in 20 ml TBME verrieben. Der Feststoff wurde abfiltriert und bei HV getrocknet, was 1,10 g N_α-Benzoyl-D-asparaginbenzylester als einen weißen Feststoff ergab (Ausbeute: 44%). Enantiomerenüberschuss > 99% (Chiracel-ODH, 15 cm × 2,1 mm, 87% n-Heptan + 13% iPrOH + 0,1% TFA, 0,1 ml/min, r.t., 220 nm). [α]_D = +13,2° (c = 1,2; DMSO). HPLC: > 99% Fläche. ISP-MS: 349,5 (M + Na⁺), 327,3 (M + H⁺). ¹H-NMR (DMSO): 2,61-2,78 (Stapel, 2H, -CH₂-), 4,84 (m, 1H, -CH-), 5,14 (s, 2H, -OCH₂-), 6,97 (bs, 1H, CONH₂), 7,32-7,84 (Stapel, 11H, 2 × Ph und CONH₂), 8,83 (d, 1H, -CONH-).
N_α-Benzoyl-L-asparagin
Die wässrige Phase wurde mit 25% Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Der gebildete Niederschlag wurde über Nacht bei 1 °C gerührt und abfiltriert. Der Filterkuchen wurde mit 10 ml 10 mM Salzsäure gewaschen und bei HV getrocknet, was 0,77 g N_α-Benzoyl-L-asparagin als ein weißes Pulver ergab (Ausbeute: 43%). Enantiomerenüberschuss: > 99% (Chiralpak-AD, 25 cm × 4,6 mm, 85% n-Heptan + 15% EtOH + 0,12% TFA, 0,7 ml/min, r.t., 220 nm). [α]_D = –16,5° (c = 1,0; DMSO). HPLC: 99% Fläche. ISN-MS: 235,2 (M-H). ¹H-NMR (DMSO): 2,57-2,72 (Stapel, 2H, -CH₂-), 4,72 (m, 1H, -CH-), 6,94 (bs, 1H, CONH₂), 7,39 (bs, 1H, CONH₂), 7,46-7,85 (Stapel, 5H, Ph), 8,64 (d, 1H, -CONH-), 12,6 (s, 1H, COOH).
Beispiel 9 (Herstellung eines Produkts mit verschiedenen Lösungsmitteln)
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester
2,0 g (7,0 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester (98,4%) wurden unter kräftigem Rühren in 28 ml 0,1 M Natriumchloridlösung, 4 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 und 8 ml eines organischen Lösungsmittels (siehe Tabelle unten; in einem Referenzexperiment in der Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels wurden aufgrund der breiigen Konsistenz 46 ml Natriumchloridlösung anstelle von 28 ml verwendet) suspendiert. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugeben von 100 μl Alkalase 2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) einer 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von ungefähr 3,5 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (ca. 50% Umwandlung; siehe Tabelle) wurde die Reaktionsmischung mit 3 × 30 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 35°C Badtemperatur). Der Rückstand wurde über Nacht in 50 ml tert.-Butylmethylether verrieben. Die Suspension wurde filtriert und der Filterkuchen bei HV getrocknet, was 0,84–0,89 g N-Benzyloxycarbonyl- D-asparaginmethylester als ein weißes kristallines Pulver ergab (siehe Tabelle). Analytik: siehe Tabelle unten (vgl. Beispiel 2).
Beispiel 10 (Herstellung eines Produkts mit einer anderen Protease)
N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginmethylester
Ein Experiment mit THF als organischem Lösungsmittel wurde exakt wie in Beispiel 9 durchgeführt, nur dass 100 μl Savinase 16 L [eine alkalische Bacillus-Protease von Novo Nordisk] anstelle von 100 μl Alkalase 2.4 L verwendet wurden und die Reaktion in der Abwesenheit oder in der Gegenwart von THF durchgeführt wurde.
Beispiel 11 (Herstellung eines (L)-Asparaginderivats im großen Maßstab)
N-Benzyloxycarbonyl-(L)-asparagin
In Analogie zu Beispiel 2 wurden 10,0 g (35,1 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparaginmethylester (98%) in 140 ml 0,1 M Natriumchloridlösung, 20 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6,5 und 40 ml THF unter kräftigem Rühren suspendiert. 0,5 ml Alkalase 2.4 L wurden zugegeben und der pH unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Nach einem Verbrauch von 16,42 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung nach 2,1 h (entspricht 47% Umwandlung) wurde die Reaktionsmischung mit 3 × 200 ml Dichlormethan extrahiert, um den ungespaltenen Methylester zu entfernen. Die wässrige Phase wurde auf ungefähr 50 ml Volumen konzentriert, indem 200 ml Toluol als Schleppmittel verwendet wurden. Der pH wurde mit 25% Salzsäure auf 3,5 eingestellt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und über Nacht in 300 ml entionisiertem Wasser verrieben. Die Suspension wurde filtriert und der Filterkuchen bei HV getrocknet, was 4,07 g N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin als weiße Kristalle ergab (Ausbeute: 44%). Enantiomerenüberschuss: > 99% (Chiracel ODH, 25 cm × 4,6 mm, 85% n-Heptan + 15% Isopropanol, 0,8 ml/min, r.t., 220 nm). [α]_D = +5,4° (c = 2,0; AcOH). ISN-MS: 265,3 (M-H^–). HPLC: > 99% Fläche. IR (Nujol): 3337, 1697, 1643, 1536, 1268, 737, 695 cm^–1. ¹H-NMR (DMSO): 2,41-2,58 (Stapel, 2H, -CH₂-), 4,34 (m, 1H, -CH-), 5,03 (s, 2H, -CH₂O-), 6,92 (bs, 1H, CONH₂), 7,26-7,40 (Stapel, 6H, Ph und -CONH₂), 7,44 (bd, 1H, -OCONH-), 12,67 (bs, 1H, -COOH).
Beispiel 12 (Herstellung eines Produkts im kleinen Maßstab)
N-Benzyloxycarbonyl-(D)-asparagin-n-butylester
0,5 g (1,55 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparagin-n-butylester (hergestellt in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in 23 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart oder Abwesenheit von 4 ml Dioxan suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe von 50 μl Alcalase 2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Nach ungefähr 50% Umwandlung wurde die Reaktionsmischung mit 2 × 25 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft (bei 35°C Badtemperatur). Der Rückstand, welcher den zurückgehaltenen Ester enthielt, wurde einer ee-Bestimmung unterzogen (Chiracel ODH, 15 cm × 0,3 mm, 90% n-Heptan + 10% Isopropanol, 5 μl/min, 30°C, 210 nm).
Beispiel 13 (Herstellung eines Produkts im großen Maßstab)
N-Benzyloxycarbonyl-(D)-asparagin-n-butylester
4,0 g (12,41 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(D,L)-asparagin-n-butylester (hergestellt in Analogie zu Beispiel 1) wurden unter kräftigem Rühren in 180 ml 0,1 M Natriumchloridlösung und 16 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 in der Gegenwart von 30 ml Dioxan suspendiert. Der pH wurde mit 1,0 N Salzsäure auf 6,5 eingestellt und die Reaktion durch Zugabe von 400 μl Alcalase 2.4 L [ein Subtilisin Carlsberg von Novo Nordisk] gestartet. Der pH wurde unter kräftigem Rühren durch die kontrollierte Zugabe (pH-statisch) von 1,0 N Natriumhydroxidlösung bei 6,5 gehalten. Nach 66 h und 87 h wurden zusätzliche 200 μl Alcalase-Lösung zu der fast stoppenden Reaktion zugegeben. Nach einem Verbrauch von 5,73 ml 1,0 N Natriumhydroxidlösung (46% Umwandlung; nach insgesamt 91 h) wurde die Reaktionsmischung mit 2 × 200 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft (bei 35°C Badtemperatur) und der Rückstand über Nacht in 50 ml TBME verrieben. Der Feststoff wurde abfiltriert, der Filterkuchen mit TBME gewaschen und bei HV getrocknet, was 1,61 g N-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginbutylester als weißen Feststoff ergab (Ausbeute: 40%). HPLC: 98,9% (Fläche). Enantiomerenüberschuss: 95% (Chiracel ODH, 15 cm × 0,3 mm, 90% n-Heptan + 10% Isopropanol, 5 μl/min, 30°C, 210 nm). [α]_D = +19,9° (c = 1,0; DMSO). ISP-MS: 345,3 (M + Na⁺), 323,3 (M + H⁺). ¹H-NMR (DMSO): 0,87 (t, 3H, CH₃), 1,31 (m, 2H, -CH₂-), 1,52 (m, 2H, -CH₂-), 2,43-2,59 (Stapel, ~2H, -CH₂-), 4,03 (m, 2H, -CH₂O-), 4,40 (m, 1H, -CH-), 5,03 (m, 2H, -CH₂O-), 6,93 (bs, 1H, CONH₂), 7,29-7,39 (Stapel, 6H, Ph und CONH₂), 7,60 (d, 1H, -CONH-).

Claims

Verwendung eines Verfahrens zur Herstellung von D-Asparaginderivaten mit der Formel I
worin R¹ eine Aminoschutzgruppe ist und R² ein Alkyl, ein substituiertes Alkyl oder eine Gruppe mit der Formel A ist,
worin R³ Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe ist und n 1, 2 oder 3 ist, wobei das Verfahren umfasst: Umsetzen einer Verbindung mit der Formel II
worin R¹ und R² wie oben definiert sind, mit einer Protease in einem wässrigen System bei einem pH von 6,0–7,5 in Kombination mit einem organischen Cosolvens und anschließende Extraktion des enantiomerenreinen Produkts mit der Formel I zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminopyrrolidinderivaten mit der Formel IV
worin R¹ wie in Anspruch 1 definiert ist und R Wasserstoff, C_1-12-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, C_3-12-Alkenyl, Phenyl, Tolyl, Naphthyl, Pyridin, Pyrimidin, Pyridazin oder Benzyl ist.
Die Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder Benzoyl ist und R² Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, 1-sec-Butyl, Isobutyl, Pentyl oder Benzyl ist.
Die Verwendung eines Verfahrens wie in irgendeinem der Ansprüche 1–2 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion durchgeführt wird, in welcher die Protease eine mikrobielle Protease ist.
Die Verwendung eines Verfahrens wie in irgendeinem der Ansprüche 1–3 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion durchgeführt wird, in welcher die Protease eine Bacillus-Protease oder Subtilisin ist.
Die Verwendung eines Verfahrens wie in irgendeinem der Ansprüche 1–4 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion durchgeführt wird, in welcher das organische Cosolvens in einer Konzentration bis zu 25% vorliegt.
Die Verwendung eines Verfahrens wie in irgendeinem der Ansprüche 1–5 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei pH 6,0–7,0 durchgeführt wird.
Die Verwendung eines Verfahrens wie in irgendeinem der Ansprüche 1–6 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei pH 6,4–6,6 durchgeführt wird.
Die Verwendung eines Verfahrens wie in irgendeinem der Ansprüche 1–7 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Cosolvens Tetrahydrofuran, Dioxan, tert.-Butylmethylether, ein niederer Alkohol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid oder Aceton ist.
Die Verwendung eines Verfahrens wie in irgendeinem der Ansprüche 1–8 beansprucht, wobei die wässrige Schicht, die nach der Extraktion des enantiomerenreinen Produkts mit der Formel I zurückbleibt, aufgearbeitet wird, um das entsprechende N-geschützte L-Asparagin mit der Formel III
zu ergeben, worin R¹ wie in Anspruch 1 definiert ist.