JP3568914B2 - Ｄ−アスパラギン誘導体の新規製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、式Ｉ
【０００２】
【化６】
【０００３】
〔式中、Ｒ１はアミノ保護基であり、Ｒ２はアルキル、置換されたアルキル又は式Ａ
Ｒ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ− Ａ
〔式中、Ｒ３は水素又は低級アルキル基であり、ｎは１、２又は３である〕
の基である〕
のＤ−アスパラギン誘導体の調製のための新規な方法に関する。
【０００４】
式Ｉの化合物は既知である。化合物Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステルは、Ｊ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍ． （１９９４）， １７（１３）， ２７５９に記載されている。この化合物の化学合成は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ （１９９７）， ５３（６）， ２０７５に記載されており、その中で、それは、既にキラルの（Ｓ）−アスパラギンを出発原料とした２段階反応により達成されている。同様に、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ （１９９２）， ３（１９） １２３９に記載のように、Ｎ−保護された（Ｓ）−アスパラギンメチルエステルは、既にキラルの（Ｓ）−アスパラギンを出発原料とした２段階反応において調製されている。Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １（１９８３）， ２２８７には、やはりキラルの反応体を出発原料とした前記化合物の合成が記載されている。
【０００５】
ＥＰ０９５０７０６及びＥＰ０８９６０５７には、それぞれ、セベキア（Ｓｅｂｅｋｉａ）属又はアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属する微生物由来の新規なＤ−アミノアシラーゼの作製及び精製が記載されている。これらの酵素は、ラセミのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を出発原料としたキラルＤ−アミノ酸の工業的製造に有用である。Ｄ−アミノアシラーゼ（セベキア属）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン（１００％）と比較して１．４％のＮ−アセチル−Ｄ−アスパラギンに対する活性を有する。Ｄ−アミノアシラーゼ（アミコラトプシス属）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン（１００％）と比較して１９％のＮ−アセチル−Ｄ−アスパラギンに対する特異的活性を有する。
【０００６】
Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８７）， ５１ （３）， ７２１ 及びＤＥ２８２５２４５には、Ｄ，Ｌ−５−置換ヒダントインから出発するＤ−アミノ酸の酵素的調製が記載されている。Ｄ−アスパラギンの合成は、２段階反応（第１段階：Ｄ−ヒダントインヒドロラーゼによるＤ，Ｌ−５−置換ヒダントインのＤ−Ｎ−カルバミルアミノ酸への開環、続いて第２段階のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属ＡＪ−１１２２を使用したＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ヒドロラーゼによるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸のＤ−アミノ酸への切断）、又はそれぞれシュードモナス属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、マラキセラ（Ｍａｒａｘｅｌｌａ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属又はアルスロバクタ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属を使用した１段階反応において達成されている。
【０００７】
アスパラギンエステル誘導体の調製のための技術的な酵素反応は、文献に記載されていない。これは、ヒドロラーゼ反応に使用される一般的な反応ｐＨ値（７〜８．５）における、アスパラギン誘導体のラセミ化及び分解の容易さのためであるかもしれない。より高い、より技術的に適切な基質濃度を使用した場合には、酵素の急速な不活化が観察された。
【０００８】
驚くべきことに、有機共溶媒を利用することにより、この不活化が克服されうることが、本発明において見出された（反応が停止した後に溶媒を添加した場合、反応は再開しないため、溶媒の効果は、「基質可溶化剤」の効果ではない）。式Ｉの化合物は、式Ｉ
【０００９】
【化７】
【００１０】
〔式中、Ｒ１はアミノ保護基であり、Ｒ２はアルキル、置換されたアルキル又は式Ａ
Ｒ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ− Ａ
〔式中、Ｒ３は水素又は低級アルキル基であり、ｎは１、２又は３である〕
の基である〕
のＤ−アスパラギン誘導体の調製のための新規な方法を提供する本発明の方法〔該方法は、有機共溶媒と組み合わされたｐＨ６．０〜７．５の水性系において、式ＩＩ
【００１１】
【化８】
【００１２】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記定義と同様である〕
の化合物をプロテアーゼと反応させ、続いて式Ｉの鏡像異性体的に純粋な（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｐｕｒｅ）生成物を抽出することを含む〕により、改良された様式で製造されうる。
【００１３】
本明細書において表される構造式において、くさび形の結合
【００１４】
【化９】
【００１５】
は、置換基が紙面よりも上にあることを示す。
【００１６】
本明細書において表される構造式において、点線の結合
【００１７】
【化１０】
【００１８】
は、置換基が紙面よりも下にあることを示す。
【００１９】
「アミノ保護基」という用語は、本明細書において使用されるように、アシルオキシカルボニル基（ＡＬＬＯＣ）、低級アルコキシカルボニル基（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ））、置換された低級アルコキシカルボニル基（例えば、トリクロロエトキシカルボニル）、場合により置換されていてもよいアリルオキシカルボニル基（例えば、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）又はフェニルオキシカルボニル）、アリルアルキル基（例えば、トリフェニルメチル（トリチル）、ベンズヒドリル又はベンジル）、アルカノイル基（例えば、ホルミル、アセチル）、アロイル基（例えば、ベンゾイル）、ハロゲン−アルカノイル基（例えば、トリフルオロアセチル）又はシリル保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）のような、Ｇｒｅｅｎ Ｔ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ５， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９８１）， ２１８−２８７頁に記載のような、ペプチド化学において利用される基のような基をさす。
【００２０】
好ましいアミノ保護基は、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、特に好ましいアミノ保護基はベンジルオキシカルボニル又はベンゾイルである。
【００２１】
「アルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル（それらの異なる異性体を含む）のような、１個から８個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状の炭化水素残基をさす。好ましくは、「アルキル」という用語は、１個から５個の炭素原子を含有する、場合により置換されていてもよい直鎖状又は分岐状の炭化水素残基をさす。
【００２２】
Ｒ２におけるアルキルは、好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル又はペンチルであり、より好ましくはメチル又はエチルである。
【００２３】
「低級アルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ−ブチルのような、１個から４個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状の炭化水素残基をさす。
【００２４】
「置換されたアルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、一つ又は複数の水素原子が、一つ又は複数のヒドロキシ基、低級アルコキシ基、シクロアルキル基、アリル基により、又は一つ又は複数のハロゲン原子により置換されている、１個から８個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状の炭化水素残基をさす。例は、３−ヒドロキシブチル、４−メトキシブチル、３−エトキシプロピル、３−シクロヘキシルプロピル、ベンジル、２−フェニルエチル、１−フルオロメチル、２−クロロエチル、２，２−ジクロロエチル、３−ブロモプロピル又は２，２，２−トリフルオロエチル等である。
【００２５】
Ｒ２における置換されたアルキルは、好ましくは、ベンジルである。
【００２６】
「シクロアルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、３〜６員の飽和炭素環部分、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル、好ましくはシクロヘキシルをさす。
【００２７】
「低級アルコキシ」という用語は、本明細書において使用されるように、直鎖状又は分岐状の低級アルキル−オキシ基（ここで、「低級アルキル」部分は前記定義と同様である）をさす。例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソ−ブチルオキシ又はｔｅｒｔ−ブチルオキシである。本発明に含まれる、より好ましい低級アルコキシ基は、メトキシ又はエトキシである。
【００２８】
「アリール」という用語は、本明細書において使用されるように、一つ又は複数のアリール水素原子が、一つ又は複数のフェニル基、アルキル基、低級アルコキシ基又はハロゲン化アルキル基により置換されていてもよい、場合により置換されたフェニル基をさす。置換されたフェニル基の例は、ビフェニル、ｏ−メチルフェニル、ｍ−メチルフェニル、ｐ−メチルフェニル、ｏ−メトキシフェニル、ｍ−メトキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｏ−フルオロメチルフェニル、ｍ−フルオロメチルフェニル、ｐ−フルオロメチルフェニル、ｏ−クロロメチルフェニル、ｍ−クロロメチルフェニル、ｐ−クロロメチルフェニル、ｏ−ブロモメチルフェニル、ｍ−ブロモメチルフェニル又はｐ−ブロモメチルフェニルである。
【００２９】
「アリールオキシ」という用語は、酸素原子を介して結合された前記定義のようなアリール基を意味する。例は、フェニルオキシ、ベンジルオキシ等である。
【００３０】
「低級アルコキシカルボニル」という用語は、カルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）に付着した低級アルコキシ残基をさす。例は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル等である。好ましい低級アルコキシカルボニルは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。
【００３１】
「アリールオキシカルボニル」という用語は、カルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）に付着したアリールオキシ残基をさす。例は、ニトロベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）又はフェニルオキシカルボニルである。
【００３２】
Ｒ１におけるアリールオキシカルボニルは、ニトロベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）又はフェニルオキシカルボニルであり、より好ましくはベンジルオキシカルボニル（Ｚ）である。
【００３３】
「アリールアルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、一つ又は複数のアルキル水素原子が、トリチル、ベンズヒドリル又はベンジルのようなアリール基により置換されている、炭化水素基をさす。
【００３４】
ハロゲンという用語は、フッ素、塩素又は臭素を表す。
【００３５】
式ＩＩの化合物は、有機化学に関する参考書、例えば、Ｊ． Ｍａｒｃｈ （１９９２）， ”Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）からの既知の方法に従い調製されうる。例えば、Ｎ−保護されたＤ，Ｌ−アスパラギン誘導体が、塩化チオニルの存在下で、対応するアルコール（例えばメタノール）によりエステル化される。
【００３６】
本発明に従い、式Ｉの化合物は、有機共溶媒と組み合わせられたｐＨ６．０〜７．５の水性系における、式ＩＩ〔ここで、Ｒ１及びＲ２は前記定義と同様であり、好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、Ｒ２はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル又はベンジルである〕の化合物のプロテアーゼとの反応により調製される。Ｌ−アスパラギン誘導体の酵素的加水分解の後、鏡像異性体的に純粋な式ＩのＤ−アスパラギン誘導体が、抽出により分離される。
【００３７】
反応の触媒として適当な酵素は、プロテアーゼ、好ましくは安価な大量の微生物由来プロテアーゼであり、より好ましくはバチルス・プロテアーゼ（ノボノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）のサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）等）又はズブチリシン、例えばノボノルディスク（アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ））又はソルベイ（Ｓｏｌｖａｙ）（プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）−Ｌ）のズブチリシン・カールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）である。
【００３８】
別法として、酵素を、固定化された形態で使用してもよい。
【００３９】
本発明に従い、反応は、水と混和性の溶媒（最大２５％、好ましくは１０〜２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度）又は水と非混和性の有機共溶媒（任意の比率）を利用した水性−有機系で実施される。
【００４０】
水相に関して、例えば、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムのような、生化学的変換のため使用されることが既知の一般的な緩衝溶液が、最大１Ｍ、好ましくは約５ｍＭと約５０ｍＭの間の濃度で使用される。そのような緩衝溶液は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ＬｉＳＣＮ、Ｎａ２ＳＯ４のような通常の塩のうちの一つ、又は多価アルコール、例えば糖を、最大１Ｍ、好ましくは０．１Ｍの濃度で、さらに含有していてもよい。反応ｐＨは、６．０から７．５までの範囲であり、好ましくは、反応ｐＨは６．０から７．０までの範囲である。特に好ましい反応ｐＨは、６．４から６．６までの範囲である。
【００４１】
適当な共溶媒は、技術的に一般的な溶媒である。例は、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン又はｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ））、低級アルコール、エステル（例えば、酢酸エチル）、極性非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はアセトン）である。好ましいのは、水と混和性の共溶媒（例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、低級アルコール、酢酸エチル又はアセトン）である。
【００４２】
「低級アルコール」という用語は、本明細書において使用されるように、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール又はオクタノール、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールのような、１つのヒドロキシ基を有する、１個から８個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状のアルキル残基をさし、より好ましいアルコールは、メタノール又はエタノールである。最も好ましいアルコールは、エタノールである。
【００４３】
基質は、好適には、懸濁液として、５〜１５％の全体濃度（ｗ／ｗ）で適用される。より好ましい全体濃度は、８〜１２％である。
【００４４】
酵素の添加後、激しく攪拌しながら、塩基の調節された添加により、反応混合物のｐＨが選択されたｐＨ値に維持される。好ましい塩基は、水性のＮａＯＨ溶液又はＫＯＨ溶液である。
【００４５】
反応の終了後、一般的には、適当な有機溶媒による反応混合物の抽出により、鏡像異性体的に純粋な式Ｉの生成物がワークアップ（ｗｏｒｋ ｕｐ）される。好ましい有機溶媒は、ジクロロメタンである。
【００４６】
場合により、対応するＮ−保護されたＬ−アスパラギンを得るため、残存する水層をワークアップしてもよい。これは、一般的には、保持された水相の酸性化、及び形成された沈殿物の濾過による除去、又は適当な有機溶媒によるその抽出により達成される。
【００４７】
従って、式ＩＩＩ
【００４８】
【化１１】
【００４９】
〔式中、Ｒ１は前記定義と同様であり、好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルである〕
のＮ−保護されたＬ−アスパラギンの調製のための方法〔該方法は、
ａ）有機共溶媒、より好ましくはテトラヒドロフラン、ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、低級アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はアセトン、最も好ましくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、低級アルコール、酢酸エチル又はアセトンと組み合わされたｐＨ６．０〜７．５、好ましくはｐＨ６．０〜７．０、最も好ましくはｐＨ６．４〜６．６の水性系において、式ＩＩ
【００５０】
【化１２】
【００５１】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記定義と同様であり、好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、Ｒ２はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ペンチル又はベンジルである〕
の化合物を、プロテアーゼ、好ましくは微生物プロテアーゼ、より好ましくはズブチリシン又はバチルス・プロテアーゼと反応させ、続いて式Ｉの鏡像異性体的に純粋な生成物を抽出すること；及び
ｂ）対応する式ＩＩＩのＮ−保護されたＬ−アスパラギンを得るため、残存する水層をワークアップすることを含む〕も、本発明の一部である。
【００５２】
場合により、式Ｉ又はＩＩＩの生成物の高い化学的純度を得るため、式Ｉ又はＩＩＩの生成物が安定性のため実質的に不溶性である適当な有機溶媒の存在下で、それを練ることができる。
【００５３】
該方法は、好ましくは、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステルの調製のため実施され、ＴＢＭＥの存在下で練られる。
【００５４】
本発明の方法に従い調製される式Ｉの化合物は、式ＩＶ
【００５５】
【化１３】
【００５６】
〔式中、Ｒ１はアミノ保護基であり、Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ１２−アルキル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１２−アルケニル、フェニル、トリル、ナフチル、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン又はベンジルであり、好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８−アルケニル、フェニル、トリル、ナフチル、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン又はベンジルであり、最も好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、Ｒはベンジルである〕
の光学活性を有する３−アミノピロリジン誘導体の調製のため使用されうる。
【００５７】
式ＩＶの光学活性を有する３−アミノピロリジン誘導体の調製のための反応は、ＥＰ−Ａ０９２８７８７に記載のようにして実施されうる。
【００５８】
式ＩＶの光学活性を有する３−アミノピロリジン誘導体は、化学工業、農芸工業、及び医薬品工業における有用な生成物の作製のための重要な素材である。特に、それらは、ＷＯ９９／６５９２０、ＥＰ−Ａ０６２０２２５又はＥＰ−Ａ０８４９２６９に記載のような、例えばビニルピロリジノン−セファロスポリン誘導体のような抗菌物質の作製に有用である。
【００５９】
以下の実施例において、使用された略語は、以下の意味を有する。
ＩＳＰ−ＭＳ イオンスプレー陽性質量分析（ｉｏｎ ｓｐｒａｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）
ＩＳＮ−ＭＳ イオンスプレー陰性質量分析（ｉｏｎ ｓｐｒａｙ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）
ＥＩ−ＭＳ 電子衝撃質量分析
ＳＦＣ 超臨界流体クロマトグラフィ
ＮＭＲ 核磁気共鳴分析
ＩＲ 赤外分析
ＨＶ 高度の真空（ｈｉｇｈ ｖａｃｕｕｍ）
ｍｉｎ 分（単数又は複数）
【００６０】
実施例１（反応体の調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステル
１８．８５ｇ（７０．８ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギン〔ベイケム（Ｂａｃｈｅｍ）〕を、２３０ｍｌのメタノールに溶解／懸濁させ、次いで該溶液／懸濁液を０℃に冷却した。１６．０ｍｌの塩化チオニルを滴下により添加し、温度が１０℃未満に維持されるようにした。完了時に、透明な溶液が形成され、それを１５分間攪拌した。反応混合物を５５０ｍｌのトルエンと共に蒸発させた（約１５０ｍｌの容量に達した後、１００ｍｌのメタノールを添加し、蒸発を続行した；４０℃浴槽温度）。得られた白色の結晶状の残渣を２００ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中で一夜粉砕／消化した。残渣を濾過にて除去し、ＨＶで乾燥させたところ、１８．７ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステルが、白色の結晶状の粉末として得られた（収率：９２％）。ＩＳＰ−ＭＳ：３０３．２（Ｍ＋Ｎａ＋）、３８１．２（Ｍ＋Ｈ＋）、２３７．２（Ｍ−ＣＯ２）。ＳＦＣ：９７．７％面積。
【００６１】
実施例２（生成物の大規模製造）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステル
１８．５ｇ（６５．７ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステル（９９．５％）を、１９０ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液、４０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）及び２５ｍｌのＴＨＦに、激しく攪拌しながら懸濁させた。１．０ｍｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕を添加し、激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。３２．０ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（１６．３ｈ；８ｈ後に４９％変換）、反応混合物を３５０ｍｌのジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機相を５００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で簡単に洗浄し、硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させた（２５℃浴槽温度）。残渣を２００ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中で一夜粉砕した。懸濁液を濾過し、濾過ケークをＨＶで乾燥させたところ、８．２ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステルが、白色の結晶状の粉末として得られた（収率：４６％）。エナンチオマー過剰率：＞９９．５％（キラセル（Ｃｈｉｒａｃｅｌ）ＯＤＨ、１５ｃｍ×３００μｍ、８５％ｎ−ヘキサン＋１５％イソプロパノール、６μｌ／ｍｉｎ、０．５ＭＰａ、３０℃、２１０ｎｍ）。ＥＩ−ＭＳ：２８０．２（Ｍ）、２２１．１（Ｍ−ＣＯ２Ｍｅ）。ＳＦＣ：９８．８％面積。ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ）：３３４９、１７４１、１６６５、１５５０、７３３、６９８ｃｍ−１。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．７６（ｄｄ、Ｊ１＝４Ｈｚ、Ｊ２＝１６Ｈｚ、１Ｈ、−ＣＨＣＨ−）、２．９８（ｄｄ、Ｊ１＝４Ｈｚ、Ｊ２＝１６Ｈｚ、１Ｈ、−ＣＨＣＨ−）、３．７６（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ３）、４．６０（ｍ、１Ｈ、−ＣＨＣＯＯ−）、５．１３（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ）、５．４２及び５．５３（２×ｂｓ、２Ｈ、ＣＯＮＨ２）、６．００（ｂｄ、＜１Ｈ、ＯＣＯＮＨ）、７．２９〜７．３７（スタック（ｓｔａｃｋ）、５Ｈ、Ｐｈ）。
【００６２】
実施例３（異なるプロテアーゼを用いた生成物の小規模調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンエチルエステル
０．５ｇ（１．７ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンエチルエステル（実施例１と同様にして調製）を、激しく攪拌しながら、２３ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、４ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の存在下又は非存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、プロテアーゼ（名称、起源、及び量については、下記表を参照）の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。不完全な変換（下記表を参照）を示すＴＨＦなしの実験は、ワークアップせず、ＴＨＦを用いた実験は以下のように処理した。およそ５０％の変換後（０．８５ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費に相当）、反応混合物を２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた（３５℃浴槽温度）。保持されたエステルを含有する残渣を、ｅｅ測定に付した（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％イソプロパノール＋０．１％ＴＦＡ、０．１ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。
【００６３】
【表１】
【００６４】
実施例４（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギンも得るための後続ワークアップを含む、生成物の大規模製造）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンエチルエステル
１０．０ｇ（３４．０ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンエチルエステル（実施例１と同様にして調製）を、激しく攪拌しながら、４６０ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び４０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、８０ｍｌのテトラヒドロフランの存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、１．０ｍｌのサビナーゼ１６Ｌ〔ノボノルディスクのバチルス・プロテアーゼ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。１６．４５ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４８．２％変換；１７時間後）、反応混合物を５００ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）、残渣をＨＶで乾燥させたところ、５．０２ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンエチルエステルが、白色の結晶として得られた（収率：５０％）。エナンチオマー過剰率：９８．９％（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％イソプロパノール＋０．１％ＴＦＡ、１００μｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋１２．２゜（ｃ＝１．０；ＥｔＯＨ）。ＩＳＰ−ＭＳ：３１７．２（Ｍ＋Ｎａ＋）、２９５．３（Ｍ＋Ｈ＋）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１．１６（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．４２〜２．５８（スタック、〜２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．０７（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、４．３９（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．０３（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、６．９３（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３１〜７．３７（スタック、６Ｈ、Ｐｈ及びＣＯＮＨ２）、７．６０（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）。
【００６５】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン
水相を、２５％塩酸でｐＨ２に酸性化し、５００ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ、残渣をＨＶで乾燥させたところ、３．１３ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギンが、白色の結晶として得られた（収率：３４％）。エナンチオマー過剰率：＞９９％（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％イソプロパノール＋０．１％ＴＦＡ、１００μｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝−６．７゜（ｃ＝１．１；ＤＭＳＯ）。ＩＳＰ−ＭＳ：２８９．２（Ｍ＋Ｎａ＋）、２６７．０（Ｍ＋Ｈ＋）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．４１〜２．５８（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．３４（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．０３（ｓ、２Ｈ、−ＯＣＨ２−）、６．９２（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３５（ｂｓ、６Ｈ、Ｐｈ及びＣＯＮＨ２）、７．４５（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）、１２．６（ｓ、１Ｈ、ＣＯＯＨ）。
【００６６】
実施例５（異なるプロテアーゼを用いた生成物の小規模調製）
Ｎα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンエチルエステル
０．５ｇ（１．８９ｍｍｏｌ）のＮα−ベンゾイル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンエチルエステル（一般的な方法により調製：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２， ２４６６と同様のＮ−保護；実施例１と同様のエステル化）を、激しく攪拌しながら、２３ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、４ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の存在下又は非存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、プロテアーゼ（名称、起源、及び量については、下記表を参照）の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。不完全な変換（下記表を参照）を示すＴＨＦなしの実験は、ワークアップせず、ＴＨＦを用いた実験は以下のように処理した。およそ５０％の変換後（約０．９５ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費に相当）、反応混合物を２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させた（３５℃浴槽温度）。保持されたエステルを含有する残渣を、ｅｅ測定にかけた（ＢＧＢ−１７６−ＳＥキャピラリーカラム（１５ｍ×０．２５ｍｍ、ＢＧＢ−アナリティック（Ａｎａｌｙｔｉｋ）ＡＧ， Ａｎｗｉｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｈ２；１００ｋＰａ；１＃／ｍｉｎで１４０〜２００℃；ｉｎｊ． ２１０℃、ｄｅｔ． ２２０℃）。
【００６７】
【表２】
【００６８】
実施例６（Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギンも得るための後続ワークアップを含む、生成物の大規模製造）
Ｎα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンエチルエステル
３．５ｇ（１３．２ｍｍｏｌ）のＮα−ベンゾイル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンエチルエステル（一般的な方法により調製：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２， ２４６６と同様のＮ−保護；実施例１と同様のエステル化）を、激しく攪拌しながら、５５ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び５ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、８ｍｌのテトラヒドロフランの存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、３５０μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。６．４４ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４９％変換；２３時間後）、反応混合物を５０ｍｌのジクロロメタンで３回、５０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）、残渣をＨＶで乾燥させたところ、１．６３ｇのＮα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンエチルエステルが、白色の固体として得られた（収率：４７％）。エナンチオマー過剰率：９８．２％（キラルパック（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ）−ＡＤ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ、７５％ｎ−ヘプタン＋２５％ＥｔＯＨ＋０．２％ＴＦＡ、１ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋１２．０゜（ｃ＝１．１；ＤＭＳＯ）。ＩＳＰ−ＭＳ：２８７．１（Ｍ＋Ｎａ＋）、２６５．３（Ｍ＋Ｈ＋）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１．１７（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．５７〜２．７２（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．１９（ｑ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、４．７５（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、６．９５（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．４０（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．４６〜７．８５（スタック、５Ｈ、Ｐｈ）、８．７５（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）。
【００６９】
Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギン
水相を、１．０Ｎ塩酸でｐＨ２に酸性化した。形成された白色の沈殿物を濾過にて除去し、５０ｍｌの１０ｍＭ塩酸で洗浄した。濾過ケークを２５ｍｌのＴＢＭＥで洗浄し、ＨＶで乾燥させたところ、１．２８ｇのＮα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギンが、白色の粉末として得られた（収率：４１％）。エナンチオマー過剰率：＞９９％（キラルパック−ＡＤ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ、８５％ｎ−ヘプタン＋１５％ＥｔＯＨ＋０．１２％ＴＦＡ、０．７ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。ＩＳＮ−ＭＳ：２３５．２（Ｍ−Ｈ−）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．５７〜２．７２（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．７２（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、６．９４（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３９（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．４６〜７．８５（スタック、５Ｈ、Ｐｈ）、８．６４（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）、１２．６（ｓ、１Ｈ、ＣＯＯＨ）。
【００７０】
実施例７（生成物の小規模調製）
Ｎα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンベンジルエステル
０．５ｇ（１．５３ｍｍｏｌ）のＮα−ベンゾイル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンベンジルエステル（一般的な方法により調製：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２， ２４６６と同様のＮ−保護；酸塩化物を介したエステル化）を、激しく攪拌しながら、２３ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、４ｍｌのアセトンの存在下又は非存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、５０μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ）の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。およそ５０％の変換後、反応混合物を２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）。保持されたエステルを含有する残渣を、ｅｅ測定に付した（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％イソプロパノール＋０．１％ＴＦＡ、０．１ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。
【００７１】
【表３】
【００７２】
実施例８（Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギンも得るための後続ワークアップを含む、生成物の大規模製造）
Ｎα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンベンジルエステル
２．５０ｇ（７．６６ｍｍｏｌ）のＮα−ベンゾイル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンベンジルエステル（実施例１０のような一般的な方法により調製）を、激しく攪拌しながら、１１５ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び１０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、２０ｍｌのアセトンの存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、２５０μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。３．４７９ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４６％変換；１７．９時間後）、反応混合物を１２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）、残渣を２０ｍｌのＴＢＭＥ中で一夜粉砕した。固体を濾過にて除去し、ＨＶで乾燥させたところ、１．１０ｇのＮα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンベンジルエステルが、白色の固体として得られた（収率：４４％）。エナンチオマー過剰率＞９９％（キラセル−ＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％ｉＰｒＯＨ＋０．１％ＴＦＡ、０．１ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋１３．２゜（ｃ＝１．２；ＤＭＳＯ）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。ＩＳＰ−ＭＳ：３４９．５（Ｍ＋Ｎａ＋）、３２７．３（Ｍ＋Ｈ＋）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．６１〜２．７８（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．８４（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．１４（ｓ、２Ｈ、−ＯＣＨ２−）、６．９７（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３２〜７．８４（スタック、１１Ｈ、２×Ｐｈ及びＣＯＮＨ２）、８．８３（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）。
【００７３】
Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギン
水相を、２５％塩酸でｐＨ２に酸性化した。形成された沈殿物を１℃で一夜攪拌し、濾過にて除去した。濾過ケークを１０ｍｌの１０ｍＭ塩酸で洗浄し、ＨＶで乾燥させたところ、０．７７ｇのＮα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギンが、白色の粉末として得られた（収率：４３％）。エナンチオマー過剰率：＞９９％（キラルパック−ＡＤ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ、８５％ｎ−ヘプタン＋１５％ＥｔＯＨ＋０．１２％ＴＦＡ、０．７ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝−１６．５゜（ｃ＝１．０；ＤＭＳＯ）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。ＩＳＮ−ＭＳ：２３５．２（Ｍ−Ｈ−）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．５７〜２．７２（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．７２（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、６．９４（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３９（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．４６〜７．８５（スタック、５Ｈ、Ｐｈ）、８．６４（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）、１２．６（ｓ、１Ｈ、ＣＯＯＨ）。
【００７４】
実施例９（異なる溶媒を用いた生成物の調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステル
２．０ｇ（７．０ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステル（９８．４％）を、激しく攪拌しながら、２８ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液、４ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び８ｍｌの有機溶媒（下記表を参照；有機溶媒の非存在下での参照実験においては、高い粘度のため、２８ｍｌではなく４６ｍｌの塩化ナトリウム溶液を使用した）に懸濁させた。ｐＨを６．５に調整し、１００μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕を添加することにより反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。およそ３．５ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費の後（約５０％変換；表を参照）、反応混合物を３０ｍｌのジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させた（３５℃浴槽温度）。残渣を、５０ｍｌのｔｅｒｔブチルメチルエーテル中で一夜粉砕した。懸濁液を濾過し、濾過ケークをＨＶで乾燥させたところ、０．８４〜０．８９ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステルが、白色の結晶状の粉末として得られた（表を参照）。分析：下記表を参照（ｃｆ．実施例２）。
【００７５】
【表４】
【００７６】
実施例１０（異なるプロテアーゼを用いた生成物の調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステル
有機溶媒としてＴＨＦを用いた実験を、１００μｌのアルカラーゼ２．４Ｌの代わりに１００μｌのサビナーゼ１６Ｌ〔ノボノルディスクのアルカリ・バチルス・プロテアーゼ〕を使用したこと、及び反応をＴＨＦの非存在下又は存在下で実施したことを除けば、実施例９と全く同様にして実施した。
【００７７】
【表５】
【００７８】
実施例１１（（Ｌ）−アスパラギン誘導体の大規模製造）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｌ）−アスパラギン
実施例２と同様にして、１０．０ｇ（３５．１ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステル（９８％）を、１４０ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液、２０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）及び４０ｍｌのＴＨＦに、激しく攪拌しながら懸濁させた。０．５ｍｌのアルカラーゼ２．４Ｌを添加し、激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。２．１時間後の１６．４２ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４７％変換に相当）、反応混合物を２００ｍｌのジクロロメタンで３回抽出し、切断されていないメチルエステルを除去した。２００ｍｌのトルエンをエントレイナー（ｅｎｔｒａｉｎｅｒ）として使用して、水相をおよそ５０ｍｌの容量に濃縮した。ｐＨを２５％塩酸で３．５に調整した。形成された沈殿物を濾過にて除去し、３００ｍｌの脱イオン水中で一夜粉砕した。懸濁液を濾過し、濾過ケークをＨＶで乾燥させたところ、４．０７ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギンが、白色の結晶として得られた（収率：４４％）。エナンチオマー過剰率：＞９９％（キラセルＯＤＨ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ、８５％ｎ−ヘプタン＋１５％イソプロパノール、０．８ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋５．４゜（ｃ＝２．０；ＡｃＯＨ）。ＩＳＮ−ＭＳ：２６５．３（Ｍ−Ｈ−）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ）：３３３７、１６９７、１６４３、１５３６、１２６８、７３７、６９５ｃｍ−１。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．４１〜２．５８（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．３４（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．０３（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、６．９２（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．２６〜７．４０（スタック、６Ｈ、Ｐｈ及び−ＣＯＮＨ２）、７．４４（ｂｄ、１Ｈ、−ＯＣＯＮＨ−）、１２．６７（ｂｓ、１Ｈ、−ＣＯＯＨ）。
【００７９】
実施例１２（生成物の小規模調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ）−アスパラギンｎ−ブチルエステル
０．５ｇ（１．５５ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンｎ−ブチルエステル（実施例１と同様にして調製）を、激しく攪拌しながら、２３ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、４ｍｌのジオキサンの存在下又は非存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、５０μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。およそ５０％変換後、反応混合物を２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させた（３５℃浴槽温度）。保持されたエステルを含有する残渣を、ｅｅ測定にかけた（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×０．３ｍｍ、９０％ｎ−ヘプタン＋１０％イソプロパノール、５μｌ／ｍｉｎ、３０℃、２１０ｎｍ）。
【００８０】
【表６】
【００８１】
実施例１３（生成物の大規模製造）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ）−アスパラギンｎ−ブチルエステル
４．０ｇ（１２．４１ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンｎ−ブチルエステル（実施例１と同様にして調製）を、激しく攪拌しながら、１８０ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び１６ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、３０ｍｌのジオキサンの存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、４００μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。およそ６６時間後及び８７時間後に、さらに２００μｌのアルカラーゼ溶液を、ほぼ停止しつつある反応へ添加した。５．７３ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４６％変換、全部で９１時間後）、反応混合物を２００ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）、残さを５０ｍｌのＴＢＭＥ中で一夜粉砕した。固体を濾過にて除去し、濾過ケークをＴＢＭＥで洗浄し、ＨＶで乾燥させたところ、１．６１ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンブチルエステルが、白色の固体として得られた（収率：４０％）。ＨＰＬＣ：＞９９％（面積）。エナンチオマー過剰率：９５％（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×０．３ｍｍ、９０％ｎ−ヘプタン＋１０％イソプロパノール、５μｌ／ｍｉｎ、３０℃、２１０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋１９．９゜（ｃ＝１．０；ＤＭＳＯ）。ＩＳＰ−ＭＳ：３４５．３（Ｍ＋Ｎａ＋）、３２３．３（Ｍ＋Ｈ＋）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：０．８７（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．３１（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−）、１．５２（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−）、２．４３〜２．５９（スタック、〜２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．０３（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、４．４０（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．０３（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、６．９３（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．２９〜７．３９（スタック、６Ｈ、Ｐｈ及びＣＯＮＨ２）、７．６０（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）。
本発明は、式Ｉ
【０００２】
【化６】
〔式中、Ｒ１はアミノ保護基であり、Ｒ２はアルキル、置換されたアルキル又は式Ａ
Ｒ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ− Ａ
〔式中、Ｒ３は水素又は低級アルキル基であり、ｎは１、２又は３である〕
の基である〕
のＤ−アスパラギン誘導体の調製のための新規な方法に関する。
【０００４】
式Ｉの化合物は既知である。化合物Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステルは、Ｊ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍ． （１９９４）， １７（１３）， ２７５９に記載されている。この化合物の化学合成は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ （１９９７）， ５３（６）， ２０７５に記載されており、その中で、それは、既にキラルの（Ｓ）−アスパラギンを出発原料とした２段階反応により達成されている。同様に、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ （１９９２）， ３（１９） １２３９に記載のように、Ｎ−保護された（Ｓ）−アスパラギンメチルエステルは、既にキラルの（Ｓ）−アスパラギンを出発原料とした２段階反応において調製されている。Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １（１９８３）， ２２８７には、やはりキラルの反応体を出発原料とした前記化合物の合成が記載されている。
【０００５】
ＥＰ０９５０７０６及びＥＰ０８９６０５７には、それぞれ、セベキア（Ｓｅｂｅｋｉａ）属又はアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属する微生物由来の新規なＤ−アミノアシラーゼの作製及び精製が記載されている。これらの酵素は、ラセミのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を出発原料としたキラルＤ−アミノ酸の工業的製造に有用である。Ｄ−アミノアシラーゼ（セベキア属）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン（１００％）と比較して１．４％のＮ−アセチル−Ｄ−アスパラギンに対する活性を有する。Ｄ−アミノアシラーゼ（アミコラトプシス属）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン（１００％）と比較して１９％のＮ−アセチル−Ｄ−アスパラギンに対する特異的活性を有する。
【０００６】
Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８７）， ５１ （３）， ７２１ 及びＤＥ２８２５２４５には、Ｄ，Ｌ−５−置換ヒダントインから出発するＤ−アミノ酸の酵素的調製が記載されている。Ｄ−アスパラギンの合成は、２段階反応（第１段階：Ｄ−ヒダントインヒドロラーゼによるＤ，Ｌ−５−置換ヒダントインのＤ−Ｎ−カルバミルアミノ酸への開環、続いて第２段階のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属ＡＪ−１１２２を使用したＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ヒドロラーゼによるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸のＤ−アミノ酸への切断）、又はそれぞれシュードモナス属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、マラキセラ（Ｍａｒａｘｅｌｌａ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属又はアルスロバクタ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属を使用した１段階反応において達成されている。
【０００７】
アスパラギンエステル誘導体の調製のための技術的な酵素反応は、文献に記載されていない。これは、ヒドロラーゼ反応に使用される一般的な反応ｐＨ値（７〜８．５）における、アスパラギン誘導体のラセミ化及び分解の容易さのためであるかもしれない。より高い、より技術的に適切な基質濃度を使用した場合には、酵素の急速な不活化が観察された。
【０００８】
驚くべきことに、有機共溶媒を利用することにより、この不活化が克服されうることが、本発明において見出された（反応が停止した後に溶媒を添加した場合、反応は再開しないため、溶媒の効果は、「基質可溶化剤」の効果ではない）。式Ｉの化合物は、式Ｉ
【０００９】
【化７】
〔式中、Ｒ１はアミノ保護基であり、Ｒ２はアルキル、置換されたアルキル又は式Ａ
Ｒ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ− Ａ
〔式中、Ｒ３は水素又は低級アルキル基であり、ｎは１、２又は３である〕
の基である〕
のＤ−アスパラギン誘導体の調製のための新規な方法を提供する本発明の方法〔該方法は、有機共溶媒と組み合わされたｐＨ６．０〜７．５の水性系において、式ＩＩ
【００１１】
【化８】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記定義と同様である〕
の化合物をプロテアーゼと反応させ、続いて式Ｉの鏡像異性体的に純粋な（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｐｕｒｅ）生成物を抽出することを含む〕により、改良された様式で製造されうる。
【００１３】
本明細書において表される構造式において、くさび形の結合
【００１４】
【化９】
は、置換基が紙面よりも上にあることを示す。
【００１６】
本明細書において表される構造式において、点線の結合
【００１７】
【化１０】
は、置換基が紙面よりも下にあることを示す。
【００１９】
「アミノ保護基」という用語は、本明細書において使用されるように、アシルオキシカルボニル基（ＡＬＬＯＣ）、低級アルコキシカルボニル基（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ））、置換された低級アルコキシカルボニル基（例えば、トリクロロエトキシカルボニル）、場合により置換されていてもよいアリルオキシカルボニル基（例えば、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）又はフェニルオキシカルボニル）、アリルアルキル基（例えば、トリフェニルメチル（トリチル）、ベンズヒドリル又はベンジル）、アルカノイル基（例えば、ホルミル、アセチル）、アロイル基（例えば、ベンゾイル）、ハロゲン−アルカノイル基（例えば、トリフルオロアセチル）又はシリル保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）のような、Ｇｒｅｅｎ Ｔ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ５， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９８１）， ２１８−２８７頁に記載のような、ペプチド化学において利用される基のような基をさす。
【００２０】
好ましいアミノ保護基は、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、特に好ましいアミノ保護基はベンジルオキシカルボニル又はベンゾイルである。
【００２１】
「アルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル（それらの異なる異性体を含む）のような、１個から８個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状の炭化水素残基をさす。好ましくは、「アルキル」という用語は、１個から５個の炭素原子を含有する、場合により置換されていてもよい直鎖状又は分岐状の炭化水素残基をさす。
【００２２】
Ｒ２におけるアルキルは、好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル又はペンチルであり、より好ましくはメチル又はエチルである。
【００２３】
「低級アルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ−ブチルのような、１個から４個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状の炭化水素残基をさす。
【００２４】
「置換されたアルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、一つ又は複数の水素原子が、一つ又は複数のヒドロキシ基、低級アルコキシ基、シクロアルキル基、アリル基により、又は一つ又は複数のハロゲン原子により置換されている、１個から８個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状の炭化水素残基をさす。例は、３−ヒドロキシブチル、４−メトキシブチル、３−エトキシプロピル、３−シクロヘキシルプロピル、ベンジル、２−フェニルエチル、１−フルオロメチル、２−クロロエチル、２，２−ジクロロエチル、３−ブロモプロピル又は２，２，２−トリフルオロエチル等である。
【００２５】
Ｒ２における置換されたアルキルは、好ましくは、ベンジルである。
【００２６】
「シクロアルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、３〜６員の飽和炭素環部分、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル、好ましくはシクロヘキシルをさす。
【００２７】
「低級アルコキシ」という用語は、本明細書において使用されるように、直鎖状又は分岐状の低級アルキル−オキシ基（ここで、「低級アルキル」部分は前記定義と同様である）をさす。例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソ−ブチルオキシ又はｔｅｒｔ−ブチルオキシである。本発明に含まれる、より好ましい低級アルコキシ基は、メトキシ又はエトキシである。
【００２８】
「アリール」という用語は、本明細書において使用されるように、一つ又は複数のアリール水素原子が、一つ又は複数のフェニル基、アルキル基、低級アルコキシ基又はハロゲン化アルキル基により置換されていてもよい、場合により置換されたフェニル基をさす。置換されたフェニル基の例は、ビフェニル、ｏ−メチルフェニル、ｍ−メチルフェニル、ｐ−メチルフェニル、ｏ−メトキシフェニル、ｍ−メトキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｏ−フルオロメチルフェニル、ｍ−フルオロメチルフェニル、ｐ−フルオロメチルフェニル、ｏ−クロロメチルフェニル、ｍ−クロロメチルフェニル、ｐ−クロロメチルフェニル、ｏ−ブロモメチルフェニル、ｍ−ブロモメチルフェニル又はｐ−ブロモメチルフェニルである。
【００２９】
「アリールオキシ」という用語は、酸素原子を介して結合された前記定義のようなアリール基を意味する。例は、フェニルオキシ、ベンジルオキシ等である。
【００３０】
「低級アルコキシカルボニル」という用語は、カルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）に付着した低級アルコキシ残基をさす。例は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル等である。好ましい低級アルコキシカルボニルは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。
【００３１】
「アリールオキシカルボニル」という用語は、カルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）に付着したアリールオキシ残基をさす。例は、ニトロベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）又はフェニルオキシカルボニルである。
【００３２】
Ｒ１におけるアリールオキシカルボニルは、ニトロベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）又はフェニルオキシカルボニルであり、より好ましくはベンジルオキシカルボニル（Ｚ）である。
【００３３】
「アリールアルキル」という用語は、本明細書において使用されるように、一つ又は複数のアルキル水素原子が、トリチル、ベンズヒドリル又はベンジルのようなアリール基により置換されている、炭化水素基をさす。
【００３４】
ハロゲンという用語は、フッ素、塩素又は臭素を表す。
【００３５】
式ＩＩの化合物は、有機化学に関する参考書、例えば、Ｊ． Ｍａｒｃｈ （１９９２）， ”Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）からの既知の方法に従い調製されうる。例えば、Ｎ−保護されたＤ，Ｌ−アスパラギン誘導体が、塩化チオニルの存在下で、対応するアルコール（例えばメタノール）によりエステル化される。
【００３６】
本発明に従い、式Ｉの化合物は、有機共溶媒と組み合わせられたｐＨ６．０〜７．５の水性系における、式ＩＩ〔ここで、Ｒ１及びＲ２は前記定義と同様であり、好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、Ｒ２はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル又はベンジルである〕の化合物のプロテアーゼとの反応により調製される。Ｌ−アスパラギン誘導体の酵素的加水分解の後、鏡像異性体的に純粋な式ＩのＤ−アスパラギン誘導体が、抽出により分離される。
【００３７】
反応の触媒として適当な酵素は、プロテアーゼ、好ましくは安価な大量の微生物由来プロテアーゼであり、より好ましくはバチルス・プロテアーゼ（ノボノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）のサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）等）又はズブチリシン、例えばノボノルディスク（アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ））又はソルベイ（Ｓｏｌｖａｙ）（プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）−Ｌ）のズブチリシン・カールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）である。
【００３８】
別法として、酵素を、固定化された形態で使用してもよい。
【００３９】
本発明に従い、反応は、水と混和性の溶媒（最大２５％、好ましくは１０〜２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度）又は水と非混和性の有機共溶媒（任意の比率）を利用した水性−有機系で実施される。
【００４０】
水相に関して、例えば、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムのような、生化学的変換のため使用されることが既知の一般的な緩衝溶液が、最大１Ｍ、好ましくは約５ｍＭと約５０ｍＭの間の濃度で使用される。そのような緩衝溶液は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ＬｉＳＣＮ、Ｎａ２ＳＯ４のような通常の塩のうちの一つ、又は多価アルコール、例えば糖を、最大１Ｍ、好ましくは０．１Ｍの濃度で、さらに含有していてもよい。反応ｐＨは、６．０から７．５までの範囲であり、好ましくは、反応ｐＨは６．０から７．０までの範囲である。特に好ましい反応ｐＨは、６．４から６．６までの範囲である。
【００４１】
適当な共溶媒は、技術的に一般的な溶媒である。例は、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン又はｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ））、低級アルコール、エステル（例えば、酢酸エチル）、極性非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はアセトン）である。好ましいのは、水と混和性の共溶媒（例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、低級アルコール、酢酸エチル又はアセトン）である。
【００４２】
「低級アルコール」という用語は、本明細書において使用されるように、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール又はオクタノール、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールのような、１つのヒドロキシ基を有する、１個から８個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状のアルキル残基をさし、より好ましいアルコールは、メタノール又はエタノールである。最も好ましいアルコールは、エタノールである。
【００４３】
基質は、好適には、懸濁液として、５〜１５％の全体濃度（ｗ／ｗ）で適用される。より好ましい全体濃度は、８〜１２％である。
【００４４】
酵素の添加後、激しく攪拌しながら、塩基の調節された添加により、反応混合物のｐＨが選択されたｐＨ値に維持される。好ましい塩基は、水性のＮａＯＨ溶液又はＫＯＨ溶液である。
【００４５】
反応の終了後、一般的には、適当な有機溶媒による反応混合物の抽出により、鏡像異性体的に純粋な式Ｉの生成物がワークアップ（ｗｏｒｋ ｕｐ）される。好ましい有機溶媒は、ジクロロメタンである。
【００４６】
場合により、対応するＮ−保護されたＬ−アスパラギンを得るため、残存する水層をワークアップしてもよい。これは、一般的には、保持された水相の酸性化、及び形成された沈殿物の濾過による除去、又は適当な有機溶媒によるその抽出により達成される。
【００４７】
従って、式ＩＩＩ
【００４８】
【化１１】
〔式中、Ｒ１は前記定義と同様であり、好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルである〕
のＮ−保護されたＬ−アスパラギンの調製のための方法〔該方法は、
ａ）有機共溶媒、より好ましくはテトラヒドロフラン、ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、低級アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はアセトン、最も好ましくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、低級アルコール、酢酸エチル又はアセトンと組み合わされたｐＨ６．０〜７．５、好ましくはｐＨ６．０〜７．０、最も好ましくはｐＨ６．４〜６．６の水性系において、式ＩＩ
【００５０】
【化１２】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記定義と同様であり、好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、Ｒ２はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ペンチル又はベンジルである〕
の化合物を、プロテアーゼ、好ましくは微生物プロテアーゼ、より好ましくはズブチリシン又はバチルス・プロテアーゼと反応させ、続いて式Ｉの鏡像異性体的に純粋な生成物を抽出すること；及び
ｂ）対応する式ＩＩＩのＮ−保護されたＬ−アスパラギンを得るため、残存する水層をワークアップすることを含む〕も、本発明の一部である。
【００５２】
場合により、式Ｉ又はＩＩＩの生成物の高い化学的純度を得るため、式Ｉ又はＩＩＩの生成物が安定性のため実質的に不溶性である適当な有機溶媒の存在下で、それを練ることができる。
【００５３】
該方法は、好ましくは、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステルの調製のため実施され、ＴＢＭＥの存在下で練られる。
【００５４】
本発明の方法に従い調製される式Ｉの化合物は、式ＩＶ
【００５５】
【化１３】
〔式中、Ｒ１はアミノ保護基であり、Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ１２−アルキル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１２−アルケニル、フェニル、トリル、ナフチル、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン又はベンジルであり、好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８−アルケニル、フェニル、トリル、ナフチル、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン又はベンジルであり、最も好ましくは、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、Ｒはベンジルである〕
の光学活性を有する３−アミノピロリジン誘導体の調製のため使用されうる。
【００５７】
式ＩＶの光学活性を有する３−アミノピロリジン誘導体の調製のための反応は、ＥＰ−Ａ０９２８７８７に記載のようにして実施されうる。
【００５８】
式ＩＶの光学活性を有する３−アミノピロリジン誘導体は、化学工業、農芸工業、及び医薬品工業における有用な生成物の作製のための重要な素材である。特に、それらは、ＷＯ９９／６５９２０、ＥＰ−Ａ０６２０２２５又はＥＰ−Ａ０８４９２６９に記載のような、例えばビニルピロリジノン−セファロスポリン誘導体のような抗菌物質の作製に有用である。
【００５９】
以下の実施例において、使用された略語は、以下の意味を有する。
ＩＳＰ−ＭＳ イオンスプレー陽性質量分析（ｉｏｎ ｓｐｒａｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）
ＩＳＮ−ＭＳ イオンスプレー陰性質量分析（ｉｏｎ ｓｐｒａｙ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）
ＥＩ−ＭＳ 電子衝撃質量分析
ＳＦＣ 超臨界流体クロマトグラフィ
ＮＭＲ 核磁気共鳴分析
ＩＲ 赤外分析
ＨＶ 高度の真空（ｈｉｇｈ ｖａｃｕｕｍ）
ｍｉｎ 分（単数又は複数）
【００６０】
実施例１（反応体の調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステル
１８．８５ｇ（７０．８ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギン〔ベイケム（Ｂａｃｈｅｍ）〕を、２３０ｍｌのメタノールに溶解／懸濁させ、次いで該溶液／懸濁液を０℃に冷却した。１６．０ｍｌの塩化チオニルを滴下により添加し、温度が１０℃未満に維持されるようにした。完了時に、透明な溶液が形成され、それを１５分間攪拌した。反応混合物を５５０ｍｌのトルエンと共に蒸発させた（約１５０ｍｌの容量に達した後、１００ｍｌのメタノールを添加し、蒸発を続行した；４０℃浴槽温度）。得られた白色の結晶状の残渣を２００ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中で一夜粉砕／消化した。残渣を濾過にて除去し、ＨＶで乾燥させたところ、１８．７ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステルが、白色の結晶状の粉末として得られた（収率：９２％）。ＩＳＰ−ＭＳ：３０３．２（Ｍ＋Ｎａ＋）、３８１．２（Ｍ＋Ｈ＋）、２３７．２（Ｍ−ＣＯ２）。ＳＦＣ：９７．７％面積。
【００６１】
実施例２（生成物の大規模製造）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステル
１８．５ｇ（６５．７ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステル（９９．５％）を、１９０ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液、４０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）及び２５ｍｌのＴＨＦに、激しく攪拌しながら懸濁させた。１．０ｍｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕を添加し、激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。３２．０ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（１６．３ｈ；８ｈ後に４９％変換）、反応混合物を３５０ｍｌのジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機相を５００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で簡単に洗浄し、硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させた（２５℃浴槽温度）。残渣を２００ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中で一夜粉砕した。懸濁液を濾過し、濾過ケークをＨＶで乾燥させたところ、８．２ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステルが、白色の結晶状の粉末として得られた（収率：４６％）。エナンチオマー過剰率：＞９９．５％（キラセル（Ｃｈｉｒａｃｅｌ）ＯＤＨ、１５ｃｍ×３００μｍ、８５％ｎ−ヘキサン＋１５％イソプロパノール、６μｌ／ｍｉｎ、０．５ＭＰａ、３０℃、２１０ｎｍ）。ＥＩ−ＭＳ：２８０．２（Ｍ）、２２１．１（Ｍ−ＣＯ２Ｍｅ）。ＳＦＣ：９８．８％面積。ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ）：３３４９、１７４１、１６６５、１５５０、７３３、６９８ｃｍ−１。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．７６（ｄｄ、Ｊ１＝４Ｈｚ、Ｊ２＝１６Ｈｚ、１Ｈ、−ＣＨＣＨ−）、２．９８（ｄｄ、Ｊ１＝４Ｈｚ、Ｊ２＝１６Ｈｚ、１Ｈ、−ＣＨＣＨ−）、３．７６（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ３）、４．６０（ｍ、１Ｈ、−ＣＨＣＯＯ−）、５．１３（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ）、５．４２及び５．５３（２×ｂｓ、２Ｈ、ＣＯＮＨ２）、６．００（ｂｄ、＜１Ｈ、ＯＣＯＮＨ）、７．２９〜７．３７（スタック（ｓｔａｃｋ）、５Ｈ、Ｐｈ）。
【００６２】
実施例３（異なるプロテアーゼを用いた生成物の小規模調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンエチルエステル
０．５ｇ（１．７ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンエチルエステル（実施例１と同様にして調製）を、激しく攪拌しながら、２３ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、４ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の存在下又は非存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、プロテアーゼ（名称、起源、及び量については、下記表を参照）の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。不完全な変換（下記表を参照）を示すＴＨＦなしの実験は、ワークアップせず、ＴＨＦを用いた実験は以下のように処理した。およそ５０％の変換後（０．８５ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費に相当）、反応混合物を２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた（３５℃浴槽温度）。保持されたエステルを含有する残渣を、ｅｅ測定に付した（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％イソプロパノール＋０．１％ＴＦＡ、０．１ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。
【００６３】
【表１】
実施例４（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギンも得るための後続ワークアップを含む、生成物の大規模製造）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンエチルエステル
１０．０ｇ（３４．０ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンエチルエステル（実施例１と同様にして調製）を、激しく攪拌しながら、４６０ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び４０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、８０ｍｌのテトラヒドロフランの存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、１．０ｍｌのサビナーゼ１６Ｌ〔ノボノルディスクのバチルス・プロテアーゼ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。１６．４５ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４８．２％変換；１７時間後）、反応混合物を５００ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）、残渣をＨＶで乾燥させたところ、５．０２ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンエチルエステルが、白色の結晶として得られた（収率：５０％）。エナンチオマー過剰率：９８．９％（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％イソプロパノール＋０．１％ＴＦＡ、１００μｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋１２．２゜（ｃ＝１．０；ＥｔＯＨ）。ＩＳＰ−ＭＳ：３１７．２（Ｍ＋Ｎａ＋）、２９５．３（Ｍ＋Ｈ＋）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１．１６（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．４２〜２．５８（スタック、〜２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．０７（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、４．３９（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．０３（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、６．９３（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３１〜７．３７（スタック、６Ｈ、Ｐｈ及びＣＯＮＨ２）、７．６０（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）。
【００６５】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン
水相を、２５％塩酸でｐＨ２に酸性化し、５００ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ、残渣をＨＶで乾燥させたところ、３．１３ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギンが、白色の結晶として得られた（収率：３４％）。エナンチオマー過剰率：＞９９％（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％イソプロパノール＋０．１％ＴＦＡ、１００μｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝−６．７゜（ｃ＝１．１；ＤＭＳＯ）。ＩＳＰ−ＭＳ：２８９．２（Ｍ＋Ｎａ＋）、２６７．０（Ｍ＋Ｈ＋）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．４１〜２．５８（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．３４（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．０３（ｓ、２Ｈ、−ＯＣＨ２−）、６．９２（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３５（ｂｓ、６Ｈ、Ｐｈ及びＣＯＮＨ２）、７．４５（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）、１２．６（ｓ、１Ｈ、ＣＯＯＨ）。
【００６６】
実施例５（異なるプロテアーゼを用いた生成物の小規模調製）
Ｎα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンエチルエステル
０．５ｇ（１．８９ｍｍｏｌ）のＮα−ベンゾイル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンエチルエステル（一般的な方法により調製：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２， ２４６６と同様のＮ−保護；実施例１と同様のエステル化）を、激しく攪拌しながら、２３ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、４ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の存在下又は非存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、プロテアーゼ（名称、起源、及び量については、下記表を参照）の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。不完全な変換（下記表を参照）を示すＴＨＦなしの実験は、ワークアップせず、ＴＨＦを用いた実験は以下のように処理した。およそ５０％の変換後（約０．９５ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費に相当）、反応混合物を２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させた（３５℃浴槽温度）。保持されたエステルを含有する残渣を、ｅｅ測定にかけた（ＢＧＢ−１７６−ＳＥキャピラリーカラム（１５ｍ×０．２５ｍｍ、ＢＧＢ−アナリティック（Ａｎａｌｙｔｉｋ）ＡＧ， Ａｎｗｉｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｈ２；１００ｋＰａ；１＃／ｍｉｎで１４０〜２００℃；ｉｎｊ． ２１０℃、ｄｅｔ． ２２０℃）。
【００６７】
【表２】
実施例６（Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギンも得るための後続ワークアップを含む、生成物の大規模製造）
Ｎα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンエチルエステル
３．５ｇ（１３．２ｍｍｏｌ）のＮα−ベンゾイル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンエチルエステル（一般的な方法により調製：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２， ２４６６と同様のＮ−保護；実施例１と同様のエステル化）を、激しく攪拌しながら、５５ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び５ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、８ｍｌのテトラヒドロフランの存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、３５０μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。６．４４ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４９％変換；２３時間後）、反応混合物を５０ｍｌのジクロロメタンで３回、５０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）、残渣をＨＶで乾燥させたところ、１．６３ｇのＮα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンエチルエステルが、白色の固体として得られた（収率：４７％）。エナンチオマー過剰率：９８．２％（キラルパック（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ）−ＡＤ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ、７５％ｎ−ヘプタン＋２５％ＥｔＯＨ＋０．２％ＴＦＡ、１ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋１２．０゜（ｃ＝１．１；ＤＭＳＯ）。ＩＳＰ−ＭＳ：２８７．１（Ｍ＋Ｎａ＋）、２６５．３（Ｍ＋Ｈ＋）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１．１７（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．５７〜２．７２（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．１９（ｑ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、４．７５（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、６．９５（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．４０（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．４６〜７．８５（スタック、５Ｈ、Ｐｈ）、８．７５（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）。
【００６９】
Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギン
水相を、１．０Ｎ塩酸でｐＨ２に酸性化した。形成された白色の沈殿物を濾過にて除去し、５０ｍｌの１０ｍＭ塩酸で洗浄した。濾過ケークを２５ｍｌのＴＢＭＥで洗浄し、ＨＶで乾燥させたところ、１．２８ｇのＮα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギンが、白色の粉末として得られた（収率：４１％）。エナンチオマー過剰率：＞９９％（キラルパック−ＡＤ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ、８５％ｎ−ヘプタン＋１５％ＥｔＯＨ＋０．１２％ＴＦＡ、０．７ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。ＩＳＮ−ＭＳ：２３５．２（Ｍ−Ｈ−）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．５７〜２．７２（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．７２（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、６．９４（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３９（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．４６〜７．８５（スタック、５Ｈ、Ｐｈ）、８．６４（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）、１２．６（ｓ、１Ｈ、ＣＯＯＨ）。
【００７０】
実施例７（生成物の小規模調製）
Ｎα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンベンジルエステル
０．５ｇ（１．５３ｍｍｏｌ）のＮα−ベンゾイル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンベンジルエステル（一般的な方法により調製：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２， ２４６６と同様のＮ−保護；酸塩化物を介したエステル化）を、激しく攪拌しながら、２３ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、４ｍｌのアセトンの存在下又は非存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、５０μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ）の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。およそ５０％の変換後、反応混合物を２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）。保持されたエステルを含有する残渣を、ｅｅ測定に付した（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％イソプロパノール＋０．１％ＴＦＡ、０．１ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。
【００７１】
【表３】
実施例８（Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギンも得るための後続ワークアップを含む、生成物の大規模製造）
Ｎα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンベンジルエステル
２．５０ｇ（７．６６ｍｍｏｌ）のＮα−ベンゾイル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンベンジルエステル（実施例１０のような一般的な方法により調製）を、激しく攪拌しながら、１１５ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び１０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、２０ｍｌのアセトンの存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、２５０μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。３．４７９ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４６％変換；１７．９時間後）、反応混合物を１２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）、残渣を２０ｍｌのＴＢＭＥ中で一夜粉砕した。固体を濾過にて除去し、ＨＶで乾燥させたところ、１．１０ｇのＮα−ベンゾイル−Ｄ−アスパラギンベンジルエステルが、白色の固体として得られた（収率：４４％）。エナンチオマー過剰率＞９９％（キラセル−ＯＤＨ、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、８７％ｎ−ヘプタン＋１３％ｉＰｒＯＨ＋０．１％ＴＦＡ、０．１ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋１３．２゜（ｃ＝１．２；ＤＭＳＯ）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。ＩＳＰ−ＭＳ：３４９．５（Ｍ＋Ｎａ＋）、３２７．３（Ｍ＋Ｈ＋）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．６１〜２．７８（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．８４（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．１４（ｓ、２Ｈ、−ＯＣＨ２−）、６．９７（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３２〜７．８４（スタック、１１Ｈ、２×Ｐｈ及びＣＯＮＨ２）、８．８３（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）。
【００７３】
Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギン
水相を、２５％塩酸でｐＨ２に酸性化した。形成された沈殿物を１℃で一夜攪拌し、濾過にて除去した。濾過ケークを１０ｍｌの１０ｍＭ塩酸で洗浄し、ＨＶで乾燥させたところ、０．７７ｇのＮα−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギンが、白色の粉末として得られた（収率：４３％）。エナンチオマー過剰率：＞９９％（キラルパック−ＡＤ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ、８５％ｎ−ヘプタン＋１５％ＥｔＯＨ＋０．１２％ＴＦＡ、０．７ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝−１６．５゜（ｃ＝１．０；ＤＭＳＯ）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。ＩＳＮ−ＭＳ：２３５．２（Ｍ−Ｈ−）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．５７〜２．７２（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．７２（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、６．９４（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．３９（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．４６〜７．８５（スタック、５Ｈ、Ｐｈ）、８．６４（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）、１２．６（ｓ、１Ｈ、ＣＯＯＨ）。
【００７４】
実施例９（異なる溶媒を用いた生成物の調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステル
２．０ｇ（７．０ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステル（９８．４％）を、激しく攪拌しながら、２８ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液、４ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び８ｍｌの有機溶媒（下記表を参照；有機溶媒の非存在下での参照実験においては、高い粘度のため、２８ｍｌではなく４６ｍｌの塩化ナトリウム溶液を使用した）に懸濁させた。ｐＨを６．５に調整し、１００μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕を添加することにより反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。およそ３．５ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費の後（約５０％変換；表を参照）、反応混合物を３０ｍｌのジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させた（３５℃浴槽温度）。残渣を、５０ｍｌのｔｅｒｔブチルメチルエーテル中で一夜粉砕した。懸濁液を濾過し、濾過ケークをＨＶで乾燥させたところ、０．８４〜０．８９ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステルが、白色の結晶状の粉末として得られた（表を参照）。分析：下記表を参照（ｃｆ．実施例２）。
【００７５】
【表４】
実施例１０（異なるプロテアーゼを用いた生成物の調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンメチルエステル
有機溶媒としてＴＨＦを用いた実験を、１００μｌのアルカラーゼ２．４Ｌの代わりに１００μｌのサビナーゼ１６Ｌ〔ノボノルディスクのアルカリ・バチルス・プロテアーゼ〕を使用したこと、及び反応をＴＨＦの非存在下又は存在下で実施したことを除けば、実施例９と全く同様にして実施した。
【００７７】
【表５】
実施例１１（（Ｌ）−アスパラギン誘導体の大規模製造）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｌ）−アスパラギン
実施例２と同様にして、１０．０ｇ（３５．１ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンメチルエステル（９８％）を、１４０ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液、２０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）及び４０ｍｌのＴＨＦに、激しく攪拌しながら懸濁させた。０．５ｍｌのアルカラーゼ２．４Ｌを添加し、激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。２．１時間後の１６．４２ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４７％変換に相当）、反応混合物を２００ｍｌのジクロロメタンで３回抽出し、切断されていないメチルエステルを除去した。２００ｍｌのトルエンをエントレイナー（ｅｎｔｒａｉｎｅｒ）として使用して、水相をおよそ５０ｍｌの容量に濃縮した。ｐＨを２５％塩酸で３．５に調整した。形成された沈殿物を濾過にて除去し、３００ｍｌの脱イオン水中で一夜粉砕した。懸濁液を濾過し、濾過ケークをＨＶで乾燥させたところ、４．０７ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギンが、白色の結晶として得られた（収率：４４％）。エナンチオマー過剰率：＞９９％（キラセルＯＤＨ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ、８５％ｎ−ヘプタン＋１５％イソプロパノール、０．８ｍｌ／ｍｉｎ、ｒ．ｔ．、２２０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋５．４゜（ｃ＝２．０；ＡｃＯＨ）。ＩＳＮ−ＭＳ：２６５．３（Ｍ−Ｈ−）。ＨＰＬＣ：＞９９％面積。ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ）：３３３７、１６９７、１６４３、１５３６、１２６８、７３７、６９５ｃｍ−１。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．４１〜２．５８（スタック、２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．３４（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．０３（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、６．９２（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．２６〜７．４０（スタック、６Ｈ、Ｐｈ及び−ＣＯＮＨ２）、７．４４（ｂｄ、１Ｈ、−ＯＣＯＮＨ−）、１２．６７（ｂｓ、１Ｈ、−ＣＯＯＨ）。
【００７９】
実施例１２（生成物の小規模調製）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ）−アスパラギンｎ−ブチルエステル
０．５ｇ（１．５５ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンｎ−ブチルエステル（実施例１と同様にして調製）を、激しく攪拌しながら、２３ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、４ｍｌのジオキサンの存在下又は非存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、５０μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。およそ５０％変換後、反応混合物を２５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させた（３５℃浴槽温度）。保持されたエステルを含有する残渣を、ｅｅ測定にかけた（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×０．３ｍｍ、９０％ｎ−ヘプタン＋１０％イソプロパノール、５μｌ／ｍｉｎ、３０℃、２１０ｎｍ）。
【００８０】
【表６】
実施例１３（生成物の大規模製造）
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ）−アスパラギンｎ−ブチルエステル
４．０ｇ（１２．４１ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｄ，Ｌ）−アスパラギンｎ−ブチルエステル（実施例１と同様にして調製）を、激しく攪拌しながら、１８０ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び１６ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、３０ｍｌのジオキサンの存在下で懸濁させた。ｐＨを１．０Ｎ塩酸で６．５に調整し、４００μｌのアルカラーゼ２．４Ｌ〔ノボノルディスクのズブチリシン・カールスバーグ〕の添加により反応を開始させた。激しく攪拌しながら、１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の調節された添加（ｐＨ−スタット）により、ｐＨを６．５に維持した。およそ６６時間後及び８７時間後に、さらに２００μｌのアルカラーゼ溶液を、ほぼ停止しつつある反応へ添加した。５．７３ｍｌの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の消費後（４６％変換、全部で９１時間後）、反応混合物を２００ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム無水物上で乾燥させ、蒸発させ（３５℃浴槽温度）、残さを５０ｍｌのＴＢＭＥ中で一夜粉砕した。固体を濾過にて除去し、濾過ケークをＴＢＭＥで洗浄し、ＨＶで乾燥させたところ、１．６１ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラギンブチルエステルが、白色の固体として得られた（収率：４０％）。ＨＰＬＣ：＞９９％（面積）。エナンチオマー過剰率：９５％（キラセルＯＤＨ、１５ｃｍ×０．３ｍｍ、９０％ｎ−ヘプタン＋１０％イソプロパノール、５μｌ／ｍｉｎ、３０℃、２１０ｎｍ）。〔α〕Ｄ＝＋１９．９゜（ｃ＝１．０；ＤＭＳＯ）。ＩＳＰ−ＭＳ：３４５．３（Ｍ＋Ｎａ＋）、３２３．３（Ｍ＋Ｈ＋）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：０．８７（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．３１（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−）、１．５２（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−）、２．４３〜２．５９（スタック、〜２Ｈ、−ＣＨ２−）、４．０３（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、４．４０（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−）、５．０３（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２Ｏ−）、６．９３（ｂｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ２）、７．２９〜７．３９（スタック、６Ｈ、Ｐｈ及びＣＯＮＨ２）、７．６０（ｄ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）。
Claims (10)
- 式Ｉ
Ｒ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）n− Ａ
〔式中、Ｒ3は水素又は低級アルキル基であり、ｎは１、２又は３である〕
の基である〕
のＤ−アスパラギン誘導体の調製のための方法であって、有機共溶媒と組み合わされたｐＨ６．０〜７．５の水性系において、式II
の化合物をプロテアーゼと反応させ、続いて式Ｉの鏡像異性体的に純粋な生成物を抽出することを含む方法。 - Ｒ1がベンジルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又はベンゾイルであり、Ｒ2がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、１−sec−ブチル、イソブチル、ペンチル又はベンジルである、請求項１に記載の方法。
- プロテアーゼが、微生物のプロテアーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
- プロテアーゼがバチルス・プロテアーゼ又はズブチリシンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 有機共溶媒が２５％までの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 反応がｐＨ６．０〜７．０で実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 反応がｐＨ６．４〜６．６で実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 有機共溶媒がテトラヒドロフラン、ジオキサン、tert−ブチルメチルエーテル、低級アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はアセトンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 式III
のＮ−保護されたＬ−アスパラギンの調製のための方法であって、
ａ）有機共溶媒と組み合わされたｐＨ６．０〜７．５の水性系において、式II
の化合物をプロテアーゼと反応させ、続いて式Ｉ
の鏡像異性体的に純粋な生成物を抽出すること；及び
ｂ）残存する水性層をワークアップして、対応する式IIIのＮ−保護されたＬ−アスパラギンを得ることを含む方法。 - 式IV
の光学活性を有する３−アミノピロリジン誘導体の調製のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法の使用。
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