ES2278061T3 - Proceso enzimatico para preparacion del acido 2-amino-3-(2-amino-fenilsulfanil)-propionico sustituido. - Google Patents

Proceso enzimatico para preparacion del acido 2-amino-3-(2-amino-fenilsulfanil)-propionico sustituido. Download PDF

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Abstract

Un proceso para la preparación de los compuestos de la fórmula I en donde R1 es hidrógeno o alquilo; R2 es un grupo protector amino; cada uno de R3 es independientemente halógeno, carboxilo, alcoxicarbonilo, alqueniloxicarbonilo o benciloxicarbonilo; n es 1 ó 2, cuyo proceso comprende: hacer reaccionar los compuestos de la fórmula II en donde R1, R2, R3 y n son como se definen anteriormente y R4 es alquilo o bencilo, con una proteasa en un sistema acuoso que contiene un co-solvente orgánico.

Description

Proceso enzimático para preparación del ácido 2-amino-3-(2-amino-fenilsulfanil)-propiónico sustituido.
La presente invención se refiera a un proceso enzimático para la preparación de los compuestos de la fórmula I
1
en donde
R^{1}
es hidrógeno o alquilo;
R^{2}
es un grupo protector amino;
cada uno de R^{3} es independientemente halógeno, carboxilo, alcoxicarbonilo, alqueniloxicarbonilo o benciloxicarbonilo;
n
es 1 ó 2.
En EP 0407033 a se describe una hidrólisis estereo-selectiva enzimática de mezclas racémicas de ésteres de ácidos 2-sustituidos, además de ácidos 2-halo propiónico, en los ácidos enantioméricos correspondientes. La reacción se lleva a cabo en presencia de isoenzimas de lipasa de Candida rugosa, un solvente orgánico (e.g. tolueno) y un agente reductor. El proceso es especialmente útil para la producción estereoselectiva de S-quetoprofeno, S-ibuprofeno, S-fenoprofeno, ácido S-2-fenilpropiónico y s-indoprofeno.
En EP 0178553 a se describe la preparación de L-aminoácidos sustituidos aromáticamente por hidrólisis selectiva de los ésteres de alquilo correspondientes con quimiotripsina.
En DE 2804892 se describe la preparación de N-acil-L-treonina ópticamente pura por hidrólisis del éster de N-acil-D-treonina con serina proteasa, especialmente subtilisina Carlsberg.
Se ha descrito en la literatura la reacción no enzimática para la preparación de compuestos de la fórmula I.
Intentos para la síntesis de compuestos de la fórmula I mediante la hidrólisis química resultaron en bajos rendimientos y la descomposición del material iniciador.
Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es un proceso nuevo e inventivo para la preparación de ácidos 2-amino-3-(2-amino-fenilsulfanil)-propiónico sustituidos.
Los compuestos de la fórmula I pueden manufacturarse mediante el proceso de la presente invención, el cual proporciona un nuevo proceso para la preparación del ácido 2-amino-3-(2-amino-fenilsulfanil)-propiónico de la fórmula I
2
en donde
R^{1}
es hidrógeno o alquilo;
R^{2}
es un grupo protector amino;
cada uno de R^{3} es independientemente halógeno, carboxilo, alcoxicarbonilo, alqueniloxicarbonilo o benciloxicarbonilo;
n
es 1 ó 2,
cuyo proceso comprende: hacer reaccionar los compuestos de la fórmula II
3
en donde R^{1}, R^{2}, R^{3} y n son como se definieron anteriormente y R^{4} es alquilo o bencilo, con una proteasa en un sistema acuoso que contiene un co-solvente orgánico.
Con el método enzimático descrito en la presente es posible una hidrólisis selectiva del éster bajo condiciones de reacción moderadas.
En la fórmula estructural presentada en la presente un enlace acuñado (\blacktriangleleft) denota que el sustituyente está por encima del plano del papel.
El término "alquilo" como se usa en la presente representa un residuo de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido que contiene 1 a 12 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, ter-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo incluyendo sus diferentes isómeros.
Los sustituyentes apropiados para la cadena de alquilo pueden seleccionarse de 1-3 halógenos tales como flúor o cloro o alcoxi C_{1-4} tales como metoxi o etoxi. Ejemplos para el alquilo sustituidos son 2-cloroetilo, 2-fluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo o 2-metoxietilo.
Alquilo en R^{1} es como se define anteriormente y de preferencia un residuo de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que contiene 1 a 7 átomos de carbono. Alquilo en R^{1} es más preferido metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo o ter-butilo.
Alquilo en R^{4} es como se define anteriormente y de preferencia un residuo de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido que contiene 1 a 7 átomos de carbono. Los sustituyentes apropiados para la cadena alquilo pueden seleccionarse de 1-3 halógenos tales como flúor o cloro o alcoxi C_{1-4}, tales como metoxi o etoxi- Son ejemplos para el alquilo sustituido 2-cloroetilo, 2-fluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo o 2-metoxietilo. Alquilo en R^{4} se prefiere más un residuo de hidrocarburo de cadena lineal que contiene 1 a 7 ó 1 a 4 átomos de carbono. Son ejemplos metilo, etilo, propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo. Son ejemplos preferidos metilo, etilo o propilo. El alquilo más preferido en R^{4} es metilo.
El término "grupo protector amino" como se usa en la presente se refiere a grupos tales como los empleados en la química de péptidos como se describe en Green T. Protective Groups in Organic Síntesis, Capítulo 5, John Wiley and Sons, Inc. (1981), pp. 218-287, tal como un grupo aliloxicarbonilo (ALLOC), un grupo alcoxicarbonilo inferior (e.g. ter-butoxicarbonilo (t-BOC)), un grupo alcoxicarbonilo inferior sustituido (e.g. tricloroetoxicarbonilo), un grupo ariloxi-carbonilo opcionalmente sustituido (e.g. p-nitrobenciloxi-carbonilo, benciloxicarbonilo (Z) o feniloxicarbonilo), un grupo alcanoilo (e.g. formilo, acetilo), un grupo aroilo (e.g. benzoilo), un grupo halógeno-alcanoilo (e.g. tri-fluoroacetilo) o un grupo protector sililo (e.g. ter-butil-dimetilsililo). Los grupos protectores amino preferidos son benciloxicarbonilo, ter-butoxicarbonilo, aliloxicarbonilo o benzoilo, se prefiere especialmente el grupo protector amino ter-butoxicarbonilo.
El término "alcoxicarbonilo" representa un residuo alcoxi C_{1-7} unido a un grupo carbonilo (>C=O). Ejemplos para los grupos alcoxi son metoxi, etoxi, n-propiloxi, iso-propiloxi, n-butiloxi, 1-sec-butiloxi, iso-butiloxi, ter-butiloxi, pentiloxi, hexiloxi, heptiloxi incluyendo sus diferentes isómeros. Ejemplos para los grupos alcoxi-carbonilo son metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxi-carbonilo, ter-butoxicarbonilo y similares. El alcoxi-carbonilo inferior preferido es ter-butoxicarbonilo.
El término "alqueniloxicarbonilo" representa un residuo alquenil-oxi unido a un grupo carbonilo (>C=O). El término "alquenilo" como se usa en la presente representa un radical de cadena de hidrocarburo no sustituido o sustituido que tiene de 2 a 8 átomos de carbono, preferentemente de 2 a 4 átomos de carbono, y que tiene al menos un enlace doble olefínico, incluyendo sus diferentes isómeros. Son ejemplos vinilo, alilo o isopropenilo.
El "alqueniloxicarbonilo" preferido para R^{3} es aliloxicarbonilo o isopropeniloxicarbonilo, se prefiere más aliloxicarbonilo.
El término halógeno significa flúor, cloro, bromo o yodo. El halógeno preferido es bromo.
El número n puede ser ya sea 1 ó 2, preferentemente el número n es 1.
El sustituyente R^{3} puede estar en cualquier posición posible unido al anillo fenilo. Si n es 1, R^{3} puede estar en la posición 3, 4, 5 ó 6 del anillo fenilo. De preferencia, el sustituyente R^{3} está en la posición 4. Si n es 2, ambos sustituyentes R^{3} pueden estar en la forma independientemente uno de otro en la posición 3, 4, 5 ó 6 del anillo fenilo.
Una modalidad preferida de la invención es un proceso para la preparación de los compuestos de la fórmula I, caracterizado porque el compuesto de la fórmula II es
4
en donde R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y n son como se definieron anteriormente.
En una modalidad aún preferida del proceso de la invención
R^{1}
es hidrógeno o alquilo, más preferido
R^{1}
es hidrógeno;
R^{2}
es un grupo protector amino, más preferido
R^{2}
es un grupo protector amino; cada uno de R^{3} es independientemente halógeno, carboxilo o alqueniloxicarbonilo;
R^{4}
es alquilo o bencilo, más preferido
R^{4}
es alquilo;
n
es 1 ó 2, más preferido
n
es 1.
En otra modalidad preferida de la invención, el proceso se lleva a cabo con una proteasa en un sistema acuoso, que contiene un co-solvente orgánico, a un pH de 4,0-10, se prefiere 6,0-8,5.
Después de la hidrólisis enzimática del sustrato de la fórmula II, el producto puro enantiomérico de la fórmula I se separa por acidificación y la extracción subsecuente.
El compuesto de la fórmula II puede usarse en cualquier mezcla posible de los enantiómeros L o D. La conversión se realiza de preferencia con una mezcla racémica o con una mezcla que sólo contiene el isómero L.
Cuando se emplea una mezcla de isómeros, el D-éster restante sin reaccionar se separa mediante una etapa de extracción antes de la acidificación del medio de reacción y la extracción subsecuente del L-ácido.
Las enzimas apropiadas como catalizadores para las reacciones son proteasas, de preferencia proteasas de poca masa de origen microbiano, se prefieren más las proteasas de Bacillus (como Sabinaza de Novo Nordisk) o subtilisinas e.g. subtilisina Carlsberg de Novo Nordisk (Alcalasa) o de Solvay Proteasa-L) o proteasas de Arpergillus (como Prozima 6 de Amano) o proteasas de Tritachium (Proteinasa K de Fluka). La enzima más preferida como catalizador para las reacciones es la subtilisina Carlsberg (e.g. Alcalasa de Novo Nordisk).
Como una alternativa las enzimas pueden usarse en la forma inmovilizada.
La reacción se lleva a cabo en un sistema acuoso con un co-solvente orgánico, tal como un solvente inmiscible en agua o un co-solvente orgánico miscible en agua. El solvente inmiscible en agua puede usarse en cualquier relación con la fase acuosa, se prefiere la relación 25-75% (v/v). El co-solvente orgánico miscible en agua puede usarse en una cantidad tan alta como sea tolerada por la enzima, típicamente 5-25% (v/v), pero la cual puede exceder a un 50% (v/v), e.g. en caso de la subtilisina Carlsberg.
La reacción se lleva a cabo a una temperatura de reacción de 0°C a 50°C, se prefiere a una temperatura de reacción entre 15°C y 40°C, y se prefiere más a una temperatura de reacción entre 15°C y 25°C.
Como para la fase acuosa, pueden usarse las soluciones amortiguadoras comunes conocidas en la técnica para las conversiones biológicas, tales como fosfato de sodio o potasio en una concentración de hasta 1 M, preferentemente entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 50 mM. Tal solución amortiguadora puede contener adicionalmente una de las sales usuales como e.g. cloruro de sodio o potasio y también LiSCN, Na_{2}SO_{4} o un alcohol polihídrico e.g. un azúcar; en una concentración hasta 1M.
Los co-solventes orgánicos apropiados son los solventes técnicamente comunes. Son ejemplos éteres (e.g. tetra-hidrofurano (THF), dioxano o ter-butil metil éter (TBME), alcoholes inferiores, ésteres (e.g. acetato de etilo), solventes apróticos polares (e.g. dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida, N,N-dimetilformamida (DMF) o acetona). Los co-solventes orgánicos preferidos son tetrahidrofurano (THF), ter-butil metil éter (TBME) y acetato de etilo.
El término "alcohol inferior" como se usa en la presente representa residuos alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene 1 a 8 átomos de carbono con un grupo hidroxi, tal como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, ter-butanol, pentanol, hexanol, heptanol u octanol, preferentemente metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, ter-butanol y los alcoholes más preferidos son metanol o etanol.
El sustrato se aplica apropiadamente como una solución en una concentración global de 0,1-25% (p/p). Una concentración global más preferida es 1-10%.
Después de la adición de la enzima, el pH de la mezcla de reacción se mantiene bajo agitación vigorosa al valor de pH seleccionado por la adición controlada de una base. Las bases preferidas son soluciones acuosas de NaOH acuoso o KOH.
Después de la terminación de la reacción, el producto enantioméricamente puro de la fórmula I se elabora convencionalmente después de la separación de fase, mediante acidificación de la fase acuosa con un ácido apropiado y la extracción subsecuente con un solvente orgánico apropiado.
Los compuestos de la fórmula I se sintetizan, de acuerdo con la presente invención, a pureza enantiomérica alta, lo cual significa que pueden lograrse excesos enantioméricos de 90% o más, se prefiere un exceso enantiomérico de 95% o mayor.
Los compuestos de la fórmula II se preparan de acuerdo con el siguiente esquema de reacción o de una manera convencional conocida por el experto en la técnica.
Esquema de reacción 1
\vskip1.000000\baselineskip
5
en donde R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son como se describen para los compuestos de la fórmula I y II.
En el esquema de reacción 1, el fluoro-aromático 2-nitro sustituido de la fórmula a) se hace reaccionar con la cisteína protegida (e.g. BOC-Cisteína-metiléster) de la fórmula b) para obtener la cisteína protegida nitro-fenil sustituida correspondiente de la fórmula c). La reacción se lleva a cabo convenientemente bajo condiciones básicas (con una diisopropilamina, e.g. etildiisopropilamina) en un solvente orgánico apropiado, tal como hexano, diisopropil-éter, acetato de etilo, metanol, etanol, propanol, diclorometano, DMF o DMSO. La temperatura de reacción es preferentemente entre -30°C a +150°C. Más preferido, la reacción se lleva a cabo con BOC-cisteína-metiléster en etanol en presencia de etildiisopropilamina a una temperatura de 110°C.
Los compuestos de fórmula a) y la cisteína protegida (e-g. BOC-cisteína-metiléster) de la fórmula g) son comercialmente disponibles o se sintetizan de acuerdo con los métodos conocidos de los manuales acerca de la química orgánica e.g. de J. March (1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure", 4th ed. John Wiley & Sons).
La segunda etapa de reacción se lleva a cabo en la que el grupo nitro de la cisteína protegida nitro-fenil sustituida de la fórmula c) se reduce a la cisteína protegida amino-fenil sustituida correspondiente de la fórmula II. La reacción de reducción se lleva a cabo de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica por ejemplo se conocen en los manuales de la química orgánica e.g. J. March (1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanims, and Structure", 4th ed. John Wiley & Sons). La reacción se lleva a cabo convenientemente con un agente reductor apropiado (e.g. Zinc y NH_{4}Cl opcional) en medios ácidos con solventes orgánicos tales como hexano, diisopropiléter, acetato de etilo, metanol, etanol, propanol, diclorometano, DMF, DMSO, de preferencia metanol. La temperatura de reacción es preferentemente de -30°C a +150°C.
El grupo NH_{2} del compuesto de la cisteína protegida amino-fenil sustituida de la fórmula II puede alquilarse con R_{1}Hal, en donde R_{1} es como se define anteriormente y Hal es cloro o bromo.
Los compuestos de la fórmula II-a y II-b (ver abajo) son nuevos intermediarios y por lo tanto, también son objeto de la presente invención
6
o
7
Los compuestos de la fórmula I son bloques de construcción versátiles para la síntesis de 1,5-benzotiazepinas. Tales estructuras de benzotiazepinas se han usado como un dipéptido encerrado que imita en varios inhibidores enzimáticos (proteasa, enzima que convierte la interleucina-1\beta, elastasa o enzima que convierte la angiotensina, pero también como antagonistas de GPCR (colecistoquinina, receptor de la angiotensina II). Los posibles diferentes usos se describen en G.C. Morton et al., Tet. Lett., 41 (2000) 3029-3033.
Las benzotiazepinas se preparan de acuerdo con el esquema de reacción 2:
Esquema de reacción 2
8
en donde R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} y n son como se describen para los compuestos de la fórmula I y II.
La reacción de ciclización del compuesto de la fórmula I para obtener la benzotiazepina de la formula III se lleva a cabo térmicamente o en presencia de un reactivo apropiado, por ejemplo como se describe en G.C. Morton et al., Tet. Lett., 41 (2000) 3029-3033). La reacción se lleva a cabo convenientemente con una carbodiimida en un solvente apropiado tal como hexano, xileno, diisopropiléter, acetato de etilo, metanol, etanol, propanol, diclorometano, DMF o DMSO. La temperatura de reacción es preferentemente entre -30°C a +150°C. La reacción se lleva a cabo preferentemente a temperatura ambiente en DMF en presencia de EDAC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida).
En los siguientes ejemplos las abreviaciones usadas tienen los siguientes significados.
ISP-EM
espectroscopia de masas positiva de atomización iónica
ESN-EM
espectroscopia de masas negativa de atomización iónica
EI-EM
espectroscopia de masas de impacto de electrones
SFC
cromatografía de fluido supercrítico
RMN
espectroscopia de resonancia magnética nuclear
IR
espectroscopia de infrarrojo
H
alto vacío
Min
minuto(s)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Preparación del material iniciador Metil éster del ácido (S)-3-(4-bromo-2-nitro-fenilsulfanil)-2-ter-butoxicarbonilamino-propiónico
9
La reacción se lleva a cabo como se describe en M.K. Schwarz et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 2219-2231. A una solución de BOC-cisteína-metiléster comercialmente disponible (27,38 g, 116,35 mmol, 1 eq), N-etildiisopropilamina (DIPEA)(4,4 mL, 25,75 mmol, 2,5 eq) en EtOH (310 mL) se adicionó 5-bromo-2-fluoronitrobenceno (25,62 g; 116,45 mmol, 1 eq) y se calentó a 110°C durante 3 h. El progreso de la reacción se monitoreó por CLAR. El solvente se evaporó hasta un aceite rojo-pardo y éste se repartió entre agua (600 mL) y acetato de etilo (3 x 300 ml). El secado (Na_{2}SO_{4}) y la evaporación dio el producto crudo que se recristalizó con ciclohexano para dar cristales amarillos (38,75 g, 77%). Datos analíticos: ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 M Hz): 1.430 (s, 9H, O(CH_{3})); 3.350 (dd, 1H, H(4'), J_{4'-4''} = 5,2 Hz, J_{4'-5} = 14,4 Hz); 3.500 (dd, 1H, H(4''), J_{4''-4'} = 5,2 Hz, J_{4''-5} = 14,4 Hz); 3,775 (s, 3H, OCH_{3}); 4.621 (m, 1H, H(5)); 5.301 (d, 1H, H(6), J_{6-5} = 6,4 Hz); 7.449 (d, 1H, H(1), J_{1-2} = 8,8 Hz); 7.670 (dd, 1H, H(2), J_{1-2} = 8,8 Hz, J_{2-3} = 2,0 Hz); 8.278 (d, 1H, H(3), J_{2-3} = 2 Hz). IR: 3.353 cm^{-1} (NH); 1.765 cm^{-1} (éster-C=O); 1.686 cm^{-1} (carbamato-C=O); 1.546 cm^{-1} (Amida-C=O); 1.460 y 1.329 cm^{-1} (NO2); 1.229 cm^{-1} (éster). EM: m/z = 452,3 [M+MH_{4}^{+}] con 9Br; m/z = 454,3 [M+NH_{4}^{+}] con ^{81}Br; m/z = 457,3 [M+Na^{2}] con ^{79Br}; m/z = 459,3 [M+Na^{+}] con ^{81}Br. Rf = 0,38 en acetato de etilo/hexano 1:2 sobre SiO_{2}.
Ejemplo 2
Metil éster del ácido (S)-3-(2-amino-4-bromo-fenilsulfanil)-2-ter-butoxicarbonilamino-propiónico
10
La reacción se lleva a cabo como se describe en J. Slade et al., J. Med. Chem. 1985, 28, 1517-1521). Una mezcla del nitro compuesto de arriba (40,34 g, 92,6 mmol, 1 eq), NH_{4}Cl (19,81 g, 370,6 mmol, 4 eq) se adiciona y Zn (79,37 g, 1.204 mmol, 13 eq) en MeOH (950 mL) se calentó a reflujo durante 16 h y la mezcla resultante se filtró a través de Celite y se lavó con MeOH hirviente. Después de la concentración, el producto crudo se dividió entre acetato de etilo y CaHCO_{3} (ac.). El aceite resultante se cromatografió usando acetato de etilo/hexano/3% de trietilamina) para dar el producto (21,11 g, 56%). Datos analíticos: ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 M Hz): 1.395 (s, 9H, O(CH_{3})); 3.185 (d, 2H, H(4), J_{4-5} = 4 Hz); 3.617 (s, 3H, OCH_{3}); 4.446 (s, 2H, H(7)); 4.528 (m, 1H, H(5)); 5.502 (d, 1H, H(6), J_{6-5} = 8 Hz); 6.793 (dd, 1H, H(3), J_{3-2} = 2 Hz, J_{3-1} = 8,4 Hz); 6.868 (d, 1H, H(3), J_{3-2} = 2 Hz); 7.225 (d, 1H, H(1), J_{1-2} = 8,4 Hz). IR: 3.356 cm^{-1} (-NH2, NH); 1.744 cm^{-1} (éster-C=O); 1.707 cm^{-1} (carbamato-C=O); 1.504 cm^{-1} (amida); 1.250 cm^{-1} (éster). EM: m/z = 405,3 [M+H^{+}] con ^{79}Br; m/z = 407,3 [M+H^{+}] con ^{81}Br. Rf = 0,47 en acetato de etilo/hexano 1:2 sobre SiO_{2}.
Ejemplo 3.1
Hidrólisis enzimática a gran escala Ácido (S)-3-(2-amino-4-bromo-fenilsulfanil)-2-ter-butoxicarbonilamino-propiónico
11
19,9 g (48,02 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-(2-amino-4-bromofeniltio)-L-alanina (97,8%) se disolvió en 750 ml de TBME y se emulsificó en solución de amortiguador 31 (cloruro de sodio 0,1 M, fosfato de sodio 20 mM pH 7,5) bajo agitación vigorosa. 12,0 ml de alcalasa 2,4 L y 30 mg de subtilisina A [ambas preparaciones enzimáticas son subtilisina Carlsberg de Novo Nordisk] se adicionaron y el pH se mantuvo a 7,5 bajo agitación vigorosa mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 1,0 N. Después de 7d 44,75 ml de solución de hidróxido de sodio 1,0 N se consumió y el grado de conversión fue >99% (análisis de CLAR). La mezcla de reacción bifásica se separó. La fase acuosa se lavó brevemente con TBME 11 para la separación de pequeñas cantidades de impurezas lipofílicas y trazas del sustrato restante. Las fases orgánicas combinadas se extrajeron con amortiguador de fosfato de potasio 0,1 M 1 x 250 ml pH 7,6. Las fases acuosas combinadas se acidificaron a pH 2 con ácido clorhídrico al 32% y se extrajeron con acetato de etilo 1,51. La emulsión resultante se separó mediante la adición de 10% de dicalita bajo agitación y una filtración subsecuente. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo 2 x 11. Las fases de acetato de etilo combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporaron. El residuo se disolvió en diclorometano, se evaporó y se secó a HV para dar 18,79 g de N-ter-butoxicarbonil-3-(2-amino-4-bromofeniltio)-L-alanina como un sólido amarillo pálido (rendimiento 81,8%). Datos analíticos: ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 M Hz): 1.399 (s, 9H, OC(CH_{3})); 3.184 (dd, 1H, SCH_{2}, J = 14,2 Hz, J = 6,6 Hz); 3.235 (dd, 1H, SCH_{2}, J = 14,2 Hz, J = 6,6 Hz); 4.515 (m, 1H, COCHNH); 5.517 (d, 1H, CONHCH, J = 6,8 Hz); 6.796 (dd, 1H, arom., J = 2 Hz, J = 8,4 Hz); 6.876 (d, 1H, arom., J = 2 Hz); 7.250 (d, 1H, arom., J = 8,4 Hz). IR (ATR-IR) 3.445 y 3.355 cm^{-1} (-NH, -NH2); 2.978 y 2.929 cm^{-1} ancho (-COOH); 1.693 cm^{-1} (COOH-C=O, carbamato -C=O); 1.508 cm^{-1} (amida-CO-NH); 1.247 y 1.157 cm^{-1} (COOH). EM (ionización positiva ESI) m/z = 391,1 [M+H^{+}] con ^{79}Br; m/z = 393,1 [M+H^{+}] con ^{81}Br; m/z = 413,2 [M+Na^{+}] con ^{79}Br; m/z = 415,2 [M+Na^{+}] con ^{81}Br. OR [\alpha]_{D} = +53,3° (CHCl_{3}; c = 1,0). Análisis CLAR: columna: ABZ+plus; fase móvil: A: TFA al 0,1% en H_{2}O; B: MeCN; gradiente B: 30-80% 0-15 min, 80-30% 15-16 min, 30% 16-19,5 min; flujo: 1 ml/min; presión 50-80 bar; detección: UV, 300 nm; tiempos de retención: 12,1 min (producto-ácido) 13,5 min (sustrato-éster).
Ejemplo 3.2.
Hidrólisis enzimática a pequeña escala Ácido (S)-3-(2-amino-4-bromo-fenilsulfanil)-2-ter-butoxicarbonilamino-propiónico
1,65 g (3,99 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-(2-amino-4-bromofeniltio)-L-alanina (98%) se disolvió en 65 ml de TBME y se emulsificó en 240 ml de solución amortiguadora (cloruro de sodio 0,1 M; fosfato de sodio 20 mM pH 7,5) bajo agitación vigorosa. Se adicionó 0,75 ml de alcalasa 2,4 L [una subtilisina Carlsberg de Novo Nordisk] y el pH se mantuvo a 7,5 bajo agitación vigorosa mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 1,0 N. Después de 33 h 4,23 ml de solución de hidróxido de sodio 1,0 N se consumió y el grado de conversión fue >99% (análisis CLAR). La mezcla de reacción se acidificó a pH 2 con ácido clorhídrico al 32%, se filtró sobre decalita. Después de la separación de la fase, la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo 3 x 275 ml. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporaron. El residuo se disolvió en diclorometano, se evaporó y se secó a HV para dar 1,56 g de N-ter-butoxicarbonil-3-(3-(2-amino-4-bromofeniltio)-L-alanina como un sólido amarillo pálido (rendimiento: 99,8%).
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Ejemplo 3.3
Hidrólisis enzimática con diferentes solventes Ácido (S)-3-(2-amino-4-bromo-fenilsulfanil)-2-ter-butoxicarbonilamino-propiónico
100 mg (0,242 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-(2-amino-4-bromofeniltio)-L-alanina (98%) se adicionó a un sistema que consistió de 20% de co-solvente orgánico (ver la siguiente tabla) y 80% de solución amortiguadora (cloruro de sodio 0,1 M; fosfato de sodio 3 mM pH 7,5) bajo agitación vigorosa. Se adicionó 100 ul de alcalasa 2,4 L [una subtilisina Carlsberg de Novo Nordisk] y el pH se mantuvo a 7,5 bajo agitación vigorosa mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Al final de la reacción el grado de conversión se determinó por CLAR.
12
^{a} La conversión se calculó del área del pico del análisis CLAR a 300 nm.
Ejemplo 3.4
Hidrólisis enzimática con otras enzimas Ácido (S)-3-(2-amino-4-bromo-fenilsulfanil)-2-ter-butoxi-carbonilamino-propiónico
200 mg (0,493 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-(4-bromo-2-aminofeniltio)-L-alanina (93,8%) se adicionó a un sistema que consistió de 5 ml de TBME y 20 ml de solución amortiguadora (cloruro de sodio 0,1 M; fosfato de sodio 3 mM pH 7,0) bajo agitación vigorosa. La enzima [ver la siguiente tabla] se adicionó y el pH se mantuvo a 7,0 bajo agitación vigorosa mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Después de la terminación de la reacción, la mezcla de reacción se lavó dos veces con 25 ml de TBME se acidificó a pH 2,5 con HCl al 25% y se extrajo con 3 x 25 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, el solvente se evaporó y el residuo se secó a un alto vacío.
13 
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Ejemplo 4
Ter-butil éster del ácido (S)-(7-bromo-4-oxo-2,3,4,5-tetrahidro-benzo[b][1,4]tiazepin-3-il)-carbámico
14
La reacción se lleva a cabo como se describe en G.C. Morton et al., Tet. Lett., 41 (2000) 3.029-3.033). El producto de la hidrólisis enzimática (15,2 g, 38,8 mmol, 1 eq) y EDAC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) (7,44 g, 38,8 mmol, 1 eq) en DMF (500 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 h, se concentró y el residuo se disolvió en acetato de etilo (500 ml) y se extrajo con NaHCO_{3} ac. (1 M) (500 ml) y agua (500 mL). Se secó (NaSO_{4}) y se concentró para dar el producto (14,5 g, cuantitativo). Datos analíticos: ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 M Hz): 1.409 (s, 9H, O(CH_{3})); 2.939 (t, 1H, H(4'), J = 11,6 Hz); 3.794 (dd, 1H, H(4''), J_{4''-5} = 11 Hz, J_{4''-4'} = 6,4 Hz); 4.439 (m, 1H, H(5)); 5.567 (d, 1H, H(6), J_{6-5} = 8 Hz); 7.306 (d, 1H, H(2), J_{2-1} = 8 Hz, J_{2-3} = 2 Hz); 7.337 (d, 1H, H(3), J_{3-2} = 2 Hz); 7.748 (d, 1H, H(1), J_{1-2} = 8 Hz); 8.042 (s, 1H, H(7)). IR: 3.284 y 3.184 cm^{-1} (-NH); 1.729 cm^{-1} (carbamato -C=O); 1.678 cm^{-1}(amida -C=O); 1.574 cm^{-1} (amida); 1.251 cm^{-1} (éster). EM: m/z = 373,3 [M+H^{+}] con ^{79}Br; m/z = 375,3 [M+H^{+}] con ^{81}Br; m/z = 395 [M+Na^{+}] con ^{79}Br; m/z = 397 [M+Na^{+}] con ^{81}Br. Rf = 0,23 en acetato de etilo/hexano 1:2 sobre SiO_{2}.
Ejemplo 5
Alil éster del ácido (S)-4-(2-ter-butoxicarbonilamino-2-metoxicarbonil-etilsulfanil)-3-nitro-benzoico
15
Se disolvió ácido 4-fluoro-3-nitrobenzoico (49,95 g, 269,8 mmol, 1 eq) en metanol (350 mL) y se adicionó Cs_{2}CO_{3} (44,06 g, 135,2 mmol, 0,5 eq) y el solvente se evaporó. Después la sal de Cs se disolvió en DMF, se calentó a 50°C y se trató con bromuro de alilo (22,8 mL, 269,8 mmol, 1 eq). Después de 5 mins, el solvente se evaporó y el sólido resultante se tituló en Et_{2}O. La filtración y evaporación dio el alil éster crudo cuantitativamente. La siguiente etapa de reacción se lleva a cabo de acuerdo con M.K. Schwarz et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 2.219-2.231. El alil éster (30 g, 133,2 mmol, 1 eq), BOC-Cisteina-Metiléster (31,35 g, 133,2 mmol, 1 eq) y DIPEA (68,3 mL, 399,6 mmol, 3 eq) se adiciona lentamente (se observa reacción exotérmica) en EtOH se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, y se concentró para dar un sólido que se recristalizó a partir de diisopropiléter (46,16 g, 79%) Datos analíticos: ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 M Hz): 1.443 (s, 9H, O(CH_{3})); 3.401 (dd, 1H, H(7'), J_{7'-7''} = 2,4 Hz, J_{7'-8} = 6 Hz); .506 (dd, 1H, H(7''), J_{7''-7'} = 2,4 Hz, J_{7''-8} = 6 Hz); 3.777 (s, 3H, OCH^{3}); 4.608 (m, 1H, H(8)); 4.860 (dt, 2H, H(3',3''), J_{3-2} = 5,6 Hz; J_{3-1} = 1,6 Hz); 5.322 (q, 1H, H(1'), J = 0,8 Hz); 5.347 (t, 1H, H(1''), J = 0,8 Hz); 5.406 (d, 1H, H(9), J_{9-8} = 1,6 Hz); 6.032 (m, 1H, H(2)); 7.625 (d, 1H, H(5), J_{5-4} = 8,4 Hz); 8.201 (dd, 1H, H(4), J_{4-5} = 8,4 Hz, J_{4-6} = 1,6 Hz); 8.830 (d, 1H, H(6), J_{6-4} = 1,6 Hz). IR: 3.350 cm^{-1} (-NH); 1.742 cm^{-1} (éster -C=O); 1.719 cm^{-1} (Conj. Éster -C=O); 1.686 cm^{-1} (carbamato -C=O); 1.523 y 1.334 cm^{-1} (-NO_{2}); 1.245 cm^{-1} (éster). EM: m/z = 441,3 [M+H^{+}]; m/z = 458,4 [M+NH_{4}^{+}]; m/z = 463,2 [M+Na^{+}]. Rf = 0,40 en acetato de etilo/hexano 1:2 sobre SiO_{2}.
Ejemplo 6
Alil éster del ácido (S)-3-amino-4-(2-ter-butoxi-carbonilamino-2-metoxicarbonil-etilsulfanil)-benzoico
16
La reacción se lleva a cabo como se describe en J. Slade et al., J. Med. Chem. 1985, 28, 1.517-1.521. El producto anterior (506 mg, 1,15 mmol, 1 eq), NH_{4}Cl acuoso (20 mL) y Zn (976 mg, 14,9 mmol, 13 eq) en DME (15 mL) se agitó y se calentó a 80°C durante 16 h. El solvente se evaporó y el residuo se disolvió en acetato de etilo (250 mL) y se extrajo con NaHCO_{3} (ac.) (1 M) (3 X 50 mL). La fase orgánica se secó con Na_{2}SO_{4} y se evaporó para dar un aceite amarillo que cristalizó después de unos cuantos días (276 mg, 60%). Datos analíticos: ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 M Hz): 1.380 (s, 1H, O(CH_{3})); 3.283 (d, 2H, H(7'-7''), J_{7-8} = 4,4 Hz); 3.579 (s, 3H, OCH_{3}); 4.445 (s, 2H, H(10',10'')); 4.554 (m, 1H, H(8)); 4.787 (ddd, 2H, H(2',2''), J = 1,2 Hz); 5.283 (dd, 1H, H(1'), J_{1'-2} = 10,6 Hz, J_{1'-1} = 1,2 Hz); 5.390 (dd, 1H, H(1''), J_{1''-2} = 17,8 Hz, J_{1''-1'} = 1,2 Hz); 5.506 (d, 1H, H(9), J_{9-8} = 7,6 Hz); 6.015 (m, 1H, H(8)); 7.360 (dd, 1H, H(2), J_{4-5} = 8 Hz, J_{4-6} = 1,6 Hz); 7.398 (d, 1H, H(6), J_{6-4} = 1,6 Hz); 7.425 (d, 1H, H(5), J_{5-4} = 8 Hz). IR: 3.378 cm^{-1} (-NH, -NH_{2}); 1.751 cm^{-1} (éster -C=O); 1.713 cm^{-1} (Conj. Éster -C=O); 1.685 cm^{-1} (carbamato -C=O); 1.511 cm^{-1} (-amida); 1.220 cm^{-1} (éster). EM: m/z = 411,3 [M+H^{+}]; m/z = 433,3 [M+Na^{+}]. Rf = 0,27 en acetato de etilo/hexano 1:2 sobre SiO_{2}.
Ejemplo 7.1
Hidrólisis enzimática a gran escala Alil éster del ácido (S)-3-amino-4-(2-ter-butoxicarbonilamino-2-carboxi-etilsulfanil)benzoico
17
6,4 g (15,658 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-(4-aloxicarbonil-2-aminofenil-tio)-L-alanina (99%) se disolvió en 480 ml de TBME y se emulsificó en solución amortiguadora 1,51 (cloruro de sodio 0,1 M; fosfato de sodio 160 mM, pH 7,5) bajo agitación vigorosa. Se adicionó 12,0 ml de alcalasa 2,4 L [una subtilisina Carlsberg de Novo Nordisk] y el pH se mantuvo a 7,5 bajo agitación vigorosa mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 1,0 N. Después de 48,5 h, 16,6 ml de solución de hidróxido de sodio 1,0 N se consumió y el grado de conversión fue >97% (análisis CLAR). Después de la separación de la fase, la fase acuosa se extrajo una vez con TBME 11. Las fases de TBME combinadas se extrajeron con amortiguador de fosfato de potasio 0,1 M 2 x 0,41 pH 7,6. Las fases acuosas combinadas se acidificación a pH 2 con ácido clorhídrico al 32% y se extrajeron con acetato de etilo 3 x 0,51. En el caso de que se formara una emulsión estable, la separación de la fase se logró por filtración sobre Dicalita. Las fases de acetato de etilo combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporaron. El residuo se disolvió en diclorometano, se evaporó se secó a HV para dar 5,85 g de N-ter-butoxicarbonil-3-(4-aloxicarbonil-2-aminofeniltio)-L-alanina como un aceite amarillo altamente viscoso (rendimiento: 94,6%). Datos analíticos: ^{1}H-RMN (DMSO, 400 M Hz): 1.338 (s, 9H, OC(CH_{3})); 3.077 (dd, 1H, SCH_{2}, J = 12,8 Hz, J = 6,8 Hz); 3.238 (dd, 1H, SCH_{2}, J = 13,8 Hz, J = 4,6 Hz); 3.867 (m, 1H, COCHNH); 4.753 (d, 2H, COOCH_{2}, J = 5,2 Hz); 5.526 (d, 1H, CH=CH_{2}, J = 10 Hz); 5.538 (d, 1H, CH=CH_{2}, J = 17,6 Hz); 5.595 (m, 2H, NH_{2}); 6.018 (ddtr, 1H, CH_{2}CH=CH_{2}, J = 16,6 Hz, J = 10,6 Hz, J = 5,6 Hz); 6.519 (m, 1H, CONHCH); 6.876 (d, 1H, arom. CSCH, J = 8,4 Hz); 7.330 (d, 1H, arom. CSCHCH, J = 8,4 Hz); 7.338 (s, 1H, arom. CHCNH_{2}. IR (ATR-IR) 3.420 y 3.355 cm^{-1}(-NH, -NH_{2}); 2.980 y 2.935 cm^{-1} ancho (-COOH); 1.705 cm^{-1} (COOH -C=O, carbamato -C=O); 1.510 cm^{-1} (amida -CO-NH); 1.486 cm^{-1} aromato; 1.229 y 1.160 cm^{-1}(COOH); 982 y 932 cm^{-1} (vinilo, -C=CH_{2}). EM (ionización positiva ESI) m/z = 397,1 [M+H^{+}]; m/z = 419,4 [M+Na^{+}]. OR [\alpha]_{D} = +16,6° (CHCl_{3}; c = 1,0). Análisis CLAR: columna: ABZ+plus; fase móvil: A: TFA al 0,1% en H_{2}O; B: MeCN; gradiente B: 30-80% 0-15 min, 80-30% 15-16 min, 30% 16-19,5 min; flujo: 1 ml/min; presión 50-80 bar; detección: UV, 300 nm; tiempos de retención: 11,2 min (producto-ácido) 12,7 min (sustrato-éster).
Ejemplo 7.2
Hidrólisis enzimática a pequeña escala Alil éster del ácido (S)-3-amino-4-(2-ter-butoxi-carbonilamino-2-carboxi-etilsulfanil)-benzoico
0,769 mg (1.658 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-(4-aloxicarbonil-2-aminofenil-tio)-L-ala-nina se disolvió en 40 ml de TBME y se emulsificó en 220 ml de solución de cloruro de sodio 0,1 M; amortiguador de fosfato de sodio 3 mM pH 7,5 bajo agitación vigorosa. Se adicionó 1,0 ml de Alcalasa 2,4 L [una subtilisina Carlsberg de Novo Nordisk] y el pH se mantuvo a 7,5 bajo agitación vigorosa mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 1,0 N. Después de 45,4 h 23,6 ml de solución de hidróxido de sodio 1,0 N se consumió y el grado de conversión fue >97% (análisis CLAR). La mezcla de reacción se extrajo con 100 ml de TBME. Después de la separación de la fase, la fase acuosa se acidificó a pH 2,3 con ácido clorhídrico al 32% y se extrajo con acetato de etilo 3 x 250 ml. En el caso de que se formara una emulsión estable, la separación de la fase se logró por filtración sobre dicalita. Los extractos combinados de acetato de etilo se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporaron. El residuo se disolvió en diclorometano, se evaporó y se secó a HV para dar 604 mg de N-ter-butoxicarbonil-3-(4-alcoxicarbonil-2-aminofeniltio)-L-alanina como un sólido amarillo pálido (rendimiento: 93,9%, pureza: 95%).
Ejemplo 7.3
Hidrólisis enzimática con diferentes solventes Alil éster del ácido (S)-3-amino-4-(2-ter-butoxi-carbonilamino-2-carboxi-etilsulfanil)-benzoico
200 mg (0,487 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-(4-aloxicarbonil-2-aminofeniltio)-L-alanina (96,7%) se adicionó a un sistema constituido por 2 a 5 ml de un co-solvente orgánico (ver la siguiente tabla) y 20 ml de solución amortiguadora (cloruro de sodio 0,1 M; fosfato de sodio 3 mM pH 7,0) bajo agitación vigorosa. Se adicionó alcalasa 2,4 L [una subtilisina Carlsberg de Novo Nordisk, cantidad ver la siguiente tabla] y el pH se mantuvo a 7,0 bajo agitación vigorosa mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 0,1 N. La reacción se monitoreó por el consumo del agente de titulación, y la formación del producto se confirmó por CLAR.
18
Ejemplo 7.4
Hidrólisis enzimática con otras enzimas Alil éster del ácido (S)-3-amino-4-(2-ter-butoxi-carbonilamino-2-carboxi-etilsulfanil)-benzoico
200 mg (0,487 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-4-aloxicarbonil-2-aminofeniltio)-L-alanina (96,7%) se adicionó a un sistema constituido por 5 ml de TBME y 20 ml de solución amortiguadora (cloruro de sodio 0,1 M; fosfato de sodio 3 mM pH 7,0) bajo agitación vigorosa. Se adicionó la enzima [ver la siguiente tabla] y la pH se mantuvo a 7,0 bajo agitación vigorosa mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 0,1 N. La reacción se monitoreó por el consumo del agente de titulación, y la formación del producto se confirmó por CLAR.
19
Ejemplo 7.5
Hidrólisis enzimática a temperatura superior Alil éster del ácido (S)-3-amino-4-(2-ter-butoxi-carbonilamino-2-carboxi-etilsulfanil)-benzoico
200 mg (0,487 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-(4-aloxicarbonil-2-aminofeniltio)-L-alanina (96,7%) se adicionó a un sistema constituido por 5 ml de TBME y 20 ml de solución amortiguadora (cloruro de sodio 0,1 M; fosfato de sodio 3 mM pH 7,0) bajo agitación vigorosa a 40°C. Se adicionó 100 \mul de Alcalasa 2,4 L [una subtilisina Carlsberg de Novo Nordisk] y el pH se mantuvo a 7,0 bajo agitación vigorosa a 40°C mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Después de un consumo de 5,44 ml del agente de titulación (112% de teoría, después de 17,4 h) la mezcla de reacción se lavó con 25 ml de TBME, se acidificó a pH 2,5 con HCl 1 N y se extrajo con acetato de etilo 3 x 25 ml. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio el solvente se evaporó y el residuo se secó a un alto vacío para dar 190 mg (0,479 mmol; 98%) del producto ácido en 94,5% de pureza por CLAR (área-%).
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Ejemplo 8
Alil éster del ácido (S)-3-ter-butoxicarbonilamino-4-oxo-2,3,4,5-tetrahidro-benzo[b][1,4]tiazepin-7-carboxílico 
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20 
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La reacción se lleva a cabo como se describe en G.C. Morton et al., Tet. Lett., 41 (2000) 3.029-3.033. El producto de la hidrólisis enzimática (5,6 g, 14,1 mmol, 1 eq) se disolvió en DMF (75 mL) y se trató con EDAC (2,70 g, 14,1 mmol, 1 eq) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Después de la concentración, el residuo se disolvió en acetato de etilo (500 mL) y se extrajo con NaHCO_{3} (ac.) (1 M) (3 x 150 mL) y agua (3 x 150 mL). La fase orgánica se secó (NaSO_{4}) y se evaporó para dar el aceite amarillo. Después de la cromatografía con acetato de etilo/hexano 1:2 se obtuvieron cristales amarillos (4,96 g, 93%). Datos analíticos: ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 M Hz): 1.400 (s, 1H, O(CH_{3})); 3.014 (t, 1H, H(7' o 7''), J = 12 Hz); 3.815 (dd, 1H, H(7' o 7''), J_{7-8} = 12 Hz, J_{7'-7''} = 6,4 Hz); 4.466 (m, 1H, H(8)); 4.835 (d, 2H, H(3'-3''), J_{3-2} = 5,7 Hz); 5.316 (dd, 1H, H(1'), J_{1'-2} = 10,5 Hz, J_{1'-1''} = 1,2 Hz); 5.413 (dd, 1H, H(1''), J_{1''-2} = 17,2 Hz, J_{1''-1'} = 1,2 Hz); 5.581 (d, 1H, H(9), J_{9-8} = 8 Hz); 6.013 (m, 1H, H(8)); 7.338 (d, 1H, H(5), J_{5-4} = 11,1 Hz); 7.704 (s, 1H, H(10)); 7.751 (d, 1H, H(6), J_{6-4} = 1,8 Hz); 7.338 (dd, 1H, H(2), J_{4-5} = 11,1 Hz, J_{4-6} = 1,8 Hz). IR: 3.206 cm^{-1} (-NH); 1.720 cm^{-1} (Carbamato -C=O); 1.671 cm^{-1} (Amida -C=O); 1.500 cm^{-1} (Amida-CO-NH); 1.209 cm^{-1}(Éster). EM: m/z = 379,3 [M+H^{+}]: m/z = 401,4 [M+Na^{+}]. Rf = 0,36 en acetato de etilo/hexano 1:2 sobre SiO_{2}.
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Ejemplo 9
Ácido (S)-3-amino-4-(2-ter-butoxicarbonilamino-2-carboxi-etilsulfanil)-benzoico 
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21 
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200 mg (0,540 mmol) de metil éster de N-ter-butoxicarbonil-3-(4-carboxi-2-aminofeniltio)-L-alanina se adicionó a un sistema que consistía de 5 ml de TBME y 20 ml de solución amortiguadora (cloruro de sodio 0,1 M; fosfato de sodio 3 mM pH 7,0) bajo agitación vigorosa. Se adicionó 100 \mul de Alcalasa 2,5 L [una subtilisina Carlsberg de Novo Nordisk] y el pH se mantuvo a 7,0 bajo agitación vigorosa mediante la adición controlada (pH estático) de solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Después de un consumo de 5.847 ml del agente de titulación (108% de teoría, después de 1,5 h) la mezcla de reacción se lavó dos veces con 25 ml de TBME, se acidificó a pH 2,5 con HCl al 25% y se extrajo con acetato de etilo 3 x 25 ml. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, el solvente se evaporó y el residuo se secó a un HV para dar 187 mg (0,479 mmol) de N-ter-butoxicarbonil-3-(2-amino-4-carboxifeniltio)-L-alanina como cristales amarillos (rendimiento: 93,4%). Datos analíticos: CLAR-pureza: 96,4% (área). ^{1}H-RMN (DMSO, 400 M Hz): 1.378 (s, 9H, OC(CH_{3})); 2.982 (dd, 1H, SCH_{2}, J = 13,2 Hz, J = 9,6 Hz); 3.150 (dd, 1H, SCH_{2}, J = 13,2 Hz, J = 4,4 Hz); 3.950 (m, 1H, COCHNH); 5.542 (m, 2H, -NH_{2}); 7.067 (dd, 1H, CONHCH, J = 8,0 Hz, J = 1,6 Hz); 7.201 (d, 1H, arom. SCCH, J = 8,0 Hz); 7.298 (d, 1H, arom. SCCHCH, J = 8,0 Hz); 7.323 (d, 1H, arom. CHCNH_{2}; J = 1,6 Hz); 12,73 (bs, 2H, 2-COOH). IR: 3.445 y 3.347 cm^{-1} (-NH, -NH2); 2.977 y 2.930 cm^{-1} ancho (-COOH); 1.720 y 1.692 cm^{-1} (COOH-C=O, carbamato -C=O); 1.608 cm^{-1} (-COO^{-}); 1.509 cm^{-1} (amida -CO-NH); 1.486 cm^{-1} (Aromato); 1.247 y 1.163 cm^{-1} (COOH). ISN-EM: m/z = 335,1 [M+H^{+}]. OR [\alpha]_{D} = +13,00° (EtOH;
c = 1,0).

Claims (9)

1. Un proceso para la preparación de los compuestos de la fórmula I
22
en donde
R^{1}
es hidrógeno o alquilo;
R^{2}
es un grupo protector amino;
cada uno de R^{3} es independientemente halógeno, carboxilo, alcoxicarbonilo, alqueniloxicarbonilo o benciloxicarbonilo;
n
es 1 ó 2,
cuyo proceso comprende:
hacer reaccionar los compuestos de la fórmula II
23
en donde R^{1}, R^{2}, R^{3} y n son como se definen anteriormente y
R^{4}
es alquilo o bencilo,
con una proteasa en un sistema acuoso que contiene un co-solvente orgánico.
2. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1,, caracterizado porque dicho compuesto de la fórmula II es
24
en donde R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y n son como se definen en la reivindicación 1.
3. Un proceso de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque
R^{1}
es hidrógeno o alquilo;
R^{2}
es un grupo protector amino;
cada uno de R^{3} es independientemente halógeno, carboxilo, alqueniloxicarbonilo;
R^{4}
es alquilo o bencilo;
n
es 1 ó 2.
4. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque
R^{1}
es hidrógeno;
R^{2}
es un grupo protector amino;
R^{3}
es halógeno, carboxilo o alqueniloxicarbonilo;
R^{4}
es alquilo:
n
es 1.
5. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo a pH de 6,0-8,5.
6. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo con proteasa de Bacillus, subtilisina, una proteasa de Aspergillus o una proteasa de Tritachium.
7. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el co-solvente orgánico es tetrahidrofurano, dioxano, ter-butil metil éter, un alcohol C_{1-8}, acetato de etilo, dimetilsulfóxido, dimetilacetamida o acetona.
8. Compuesto de fórmula
25
o
26
9. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el compuesto de la fórmula I se procesa además a una benzotiazepina de fórmula III
27
en donde R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y n son como se describen para los compuestos de la formula I y II.
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