DE2804892A1 - Verfahren zur herstellung von l-threonin und dessen n-acylderivat - Google Patents
Verfahren zur herstellung von l-threonin und dessen n-acylderivatInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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Description
2604892
Unsere Nr. 21 564 P/La
The Procter & Gamble Company Cincinnati, Ohio, V.St.A.
Verfahren zur Herstellung von L-Threonin und dessen N-Acylderivat.
Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch reinem N-Acyl-L-threonin sowie L-Threonin.
Threonin ist eine der essentiellen Aminosäuren für die menschliche und tierische Ernährung. Threonin hat die
Struktur einer oL-Amino-ß-hydroxy-buttersäure:
CH^CH*-CH*COOH
OH NH2
Diese Verbindung enthält 2 asymmetrische Kohlenstoffatome;
infolgedessen existieren 4 optische Isomere, nämlich L-Threonin,
D-Threonin, L-AlIothreonin und D-AlIothreonin.
L-Threonin ist eine natürlich vorkommende d,-Aminosäure und
ernährungsmäßig zugänglich. N-acyliertes L-Threonin ist
ebenfalls durch die Ernährung zugänglich, im Gegensatz zu D-Threonin und D,L-Allothreonin, die keine natürlich vorkommenden
Verbindungen sind. Infolgedessen müssen, wenn man oL-Amino-fö=putUersäure für Ernährungs zwecke synthetisiert,
die optischen Isomeren abgetrennt werden, will man optisch reines L-Threonin oder N-acyliertes L-Threonin erhalten.
809832/0883
28 Ο.·4 8 32
Bei der Synthese von d-Amino-ß-hydroxybuttersäure bilden
sich alle 4 optischen Isomeren. Verfahren zur Überführung von D,L-Allothreonin zum D,L-Threonin sind bekannt (vgl.
z.B. US-PSn 2 986 578, 2 846 439 und 2 446 192).
Die überführung von Amiden des D-Threonins in L-Threonin
ist in J. Chem. Soc, Bd. 62 (1950) von Elliott beschrieben.
Die Aufspaltung von N-Acyl-D,L-methioninestern in die
optisch aktiven Komponenten durch Hydrolyse unter Verwendung proteolytischer Enzyme ist in der US-PS 3 963 573 beschrieben.
Hierbei bleibt der H-Acyl-D-methioninester unverändert,
während der N-Acyl-L-methioninester zum N-Acyl-L-methionin
hydrolysiert wird. Die in vorgenannter US-PS offenbarten Enzyme sind die gleichen, welche beim vorliegenden Verfahren
verwendet werden.
Ziel vorliegender Erfindung ist die Herstellung von optisch reinem L-Threonin und/oder N-Acyl-L-threonin, welche zur
Ergänzung der Ernährung verwendet werden können.
Weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese von L-Threonin und/oder N-Acyl-L-threonin
nach einem mehrstufigen Verfahren, ausgehend von einem Acetessigsäureester.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von optisch
reinem N-Acyl-L-threonin umfaßt: (1) die Einwirkung einer
Serinproteinase als proteolytisches Enzym auf einen N-Acyl-D,L-threoninester,
und (2) die Abtrennung des erhaltenen N-Acyl-L-threonins von dem nicht-umgesetzten N-Acyl-D-threoninester,
wie in nachfolgendem Schema I veranschaulicht.
809832/0883
Schema I
(1) Gemisch von N-Acyl-D,L-threoninester
<=> (2) N-Acyl-L-threonin +
CD OO CO
N-Acyl-D-threonmester
N-Acyl-L-threonin +
N-Acyl-D-threoninester
N-Acyl-L-threonin
CD CC)
-V-
Durch Entfernung der N-Aeylgruppe wird L-Threonin erhalten.
Die im vorliegenden als Ausgangsverbindungen verwendeten
N-Acyl-D,L-threoninester können entweder nach einem herkömmlichen Verfahren durch Veresterung eines Gemisches von
N-Aeyl-DjL-threonin mit einem Alkohol mit etwa 1 bis 10
Kohlenstoffatomen oder erfindungsgemäß, ausgehend von einem
Acetessigsäurealkylester, nach einem 5-stufigen Verfahren hergestellt werden, welches folgende Stufen umfaßt:
(1) Umsetzung eines Acetessigsäureesters mit Natriumnitrit in Gegenwart einer Säure;
(2) Hydrierung des in Stufe (1) erhaltenen cC-Oxlmino-acetessigsäureesters
in Gegenwart eines Acylanhydrids;
(3) Umsetzung des in Stufe (2) gebildeten Gemisches von N-Acyl-ß-hydroxybutyratestern mit einem De'hydratisierungs·
mittel unter wasserfreien Bedingungen;
(4) Isomerisierung des in Stufe (3) gebildeten cis-D,L-2-
Acyl-5-methyl-A -oxazolin-^-carboxylats zum trans-DaL-2-Acyl-5-methyl-Ä
oxazolin-^-carboxylat; und
(5) Hydrolyse des Produktes der Stufe (1I) mit verdünnter
Säure.
Dieses Verfahren ist im nachfolgenden Schema II veranschaulicht (wobei die Stufen (1) und (2) des Schemas I als die
beiden letzten Stufen mit einbezogen sind).
8Ü9832/0883
Schema II
II.
CH3C-CH2-C-OR
S Λ ■'■■■
CH,C-C-C-0R Il N-OH
O QO CO
OH CH3-CH-CH-C-OH
NHC-R1 ■ tt 0
OH i
I Il
CH3CH-CH-C-OR
NHC-R1
L-threo
Hydrolyse
ti
O D-threo OH ' 0
I Il
I Il
CH3-CH-CH-C-OR
NHC-R'
■ . Λ 0
I
Dehydratisierungsmittel
| CH3 I c |
CH3-r- •R1 + |
> | NaOR" . | c"'^N | trans | verd ^ -- |
| J R0/ ^ | • Ro'\ | RO^ ^O | Säure | |||
| 100% | ||||||
| ._ _ | ||||||
| -R' | ||||||
OH
| CH3 | CH-CH-C-OR I |
| NHC-R' η |
|
| Il O |
|
| D | ,L-threo |
Enzym· _
OH CH7-CH-CH-S-OH
L-Threonin R - Alkyl mit 1 bis 9 C-Atomen oder Aryl
R'= Alkyl mit 1 bis 9 C-Atomen oder Aryl R"= Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen
CO O
OO
Das Verfahren zur Herstellung von optisch reinem N-Acyl-L-threonin
zeichnet sich dadurch aus, daß man (1) das Ausgangsgemisch enzymatisch mit einer von Mikroben abgeleiteten
Serinprotease behandelt, und (2) das erhaltene N-Aeyl-L-threonin
abtrennt.
Es wurde ferner gefunden, daß die als Ausgangsprodukt dienenden N-Acyl~D,L-threoninester nach einem Syntheseverfahren
hergestellt werden können, bei dem man von Acetessigsäureestern
ausgeht.
Im vorliegenden wird unter dem Begriff "optisch reines N-Acyl-L-threonin"
ein solches verstanden, welches im wesentlichen frei vom D-Isomeren ist. Unter PAcyl-" wird im vorliegenden
ein Substituent der allgemeinen Formel -COR' verstanden, worin R' eine Alkyl-oder Arylgruppe darstellt.
Unter "Alkylgruppe" ist eine Kohlenwasserstoffgruppe zu verstehen,
welche entweder gerad- oder verzweigtkettig sein kann.
Unter "Arylgruppe" ist eine Kohlenwasserstoffgruppe zu verstehen,
welche einen aromatischen Substituenten umfaßt. Hierunter fallen solche Gruppen, wie die Phenyl-, Benzyl-,U-Phenylethyl-,
ß-Phenylethyl- oder Naphthylgruppe.
Der im vorliegenden benutzte Begriff "Serinprotease" umfaßt alle anerkannten (recognized) Serinproteasen, insbesondere
die bevorzugten, von weiter oben offenbarten Mikrobenstämmen und -mutanten abgeleiteten.
Unter dem Begriff "enthaltend" bzw. "umfassend" ist zu verstehen, daß verschiedene andere verträgliche Bestandteile in
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den Zusammensetzungen in einem solchen Anteil vorliegen können,
der die Bildung des optisch reinen N-Acyl-L-threonins oder
L-Threonins nicht nachteilig beeinflußt. Es wurde gefunden, daß bestimmte, leicht erhältliehe, von Mikroben abstammende
Serinproteasen eine hohe Esteraseaktivität für N-Acyl-L-threoninester
und eine sehr geringe Esteraseaktivität für N-Aeyl-D-threoninester zeigen. Es wurde weiter gefunden, daß
die hohe Esteraseaktivität bezüglich des L-Isomeren nicht
durch die Anwesenheit des D-Isomeren gehemmt wird. Wenn man ein Gemisch aus N-Acyl-D-threoninestern und N-Acyl-L-threoninestern
der Einwirkung einer von Mikroben abstammenden Serinprotease
unterwirft, erhält man ein Gemisch von nicht-umgesetztem
N-Acyl-D-threoninester und "freiem", d.h. verseiftem) N-Acyl-L-threonin. Letzteres kann leicht aus dem Gemisch nach
herkömmlichen Verfahren abgetrennt werden, beispielsweise, indem man den pH-Wert eines wässrigen Gemisches einstellt
und mit einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform, Ethylacetat oder Butylacetat, extrahiert.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Vielzahl von
speziellen N-Acyl-D,L-threoninestern verwendet werden. Vorzugsweise
leitet sich die Acylgruppe von einer Fettsäure mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen oder einer Arylsäure ab. insbesondere
ist die N-ständige Acylgruppe eine Formyl-, Acetyl-,
Propionyl-, Butanoyl-, Pentanoyü-, Hexanoyl-, Heptanoyl-,
Octanoyl-, Nonanoyl-, Benzoyl- oder Phenylmethanoylgruppe.
Die Estergruppe kann sich von einer Vielzahl von Alkoholen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ableiten, vorzugsweise von
solchen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen. Beispiele für speziell geeignete Estergruppen sind die Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-,
Isopropyl-, η-Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl- und Benzylgruppe. Die am meisten bevorzugten Verbindungen sind die
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- Ii -
N-Acetyl-threonin-methyl-, -ethyl- und -benzylester. Insbesondere
wird racemischer N-Acetyl-D,L-methylester beim erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt.
Bevorzugt werden die von Mikroben abgeleiteten Serinproteasen.
Diese Proteasen sind verhältnismäßig leicht zugänglich, preiswert,
und im Handel erhältlich. Ein Beispiel für die im vorliegenden bevorzugten Serinproteasen sind diejenigen, welche
von dem Bakterium Bacillus sub^tilis abgeleitet sind. Diese
Serinproteasen werden als Subtilisine bezeichnet.
Ein für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugtes Subtilisin
ist der vom Bacillus subtilis abgeleitete Carlsberg-Stamm. Der am meisten bevorzugte Carlsberg-Stamm ist ein bekannter
Subtilisin-Stamm. Die Aminosäuresequenz dieses Subtilisins ist in J. Biol. Chem., Bd. 241, Seite 597^ (1966) beschrieben.
Er zeichnet sich durch ein Verhältnis von Tyrosin zu Tryptophan von etwa 13:1 aus. Auf die zuvor genannte Publikation,
einschließlich ihrer Beschreibung der Aminosäuresequenz des Carlsberg-Subtilisins, wird ausdrücklich verwiesen. Ein
anderes bevorzugtes Subtilisin für das erfindungsgemäße Verfahren
ist dasjenige, welches von einem durch Röntgenstrahlen mutierten Bacillus subtilis stammt. Diese Mutation kann gemäß
der US-PS 3 031 38O durch Bestrahlung von Bacillus subtilis mit Röntgenstrahlen erreicht werden. Eine nachfolgende
Behandlung auf herkömmliche Weise kann zur Herstellung einer enzymatischen Zusammensetzung benutzt werden. Diese
Druckschrift beschreibt ein Verfahren, bei dem eine enzymatisehe
Zusammensetzung hergestellt wird, indem Bacillus subtilis Röntgenstrahlen einer Intensität von im wesentlichen
24-50 Röntgen während zumindest einer halben Stunde ausgesetzt, und von der den Röntgenstrahlen derart unterworfenen
Kolonie ein Stamm ausgesondert wird, welcher durch Zellen identifiziert wird, die haarlos, rauü(rough), gezackt, gefleckt
und matt-weiß sind, wonach dieser Stamm abgetrennt und
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sodann in eine Kultur aus Weizenkleie und Maismehl gebracht wird; die Kultur während zumindest 40 Stunden unter im
wesentlichen kontinuierlicher Belüftung gehalten und sodann getrocknet wird. Auf das US-PS 3 031 38O wird ausdrücklich
hingewiesen.
Andere Beispiele für geeignete Serxnproteinasen sind folgende:
Serinproteinasen, die sich von Aspergillus oryzae ableiten; Verfahren zur Herstellung und Abtrennung dieser von dem
Schimmelpilz abstammenden Enzyme sind bekannt <£vgl. z.B.
Biochemistry, Bd. 3, Nr. 12, Seiten 1861-1874 (196-4) und Agr. Biol. Chem., Bd. 34, Mr. 9, Seiten 1383-1392 (197O)J.
Ferner Serinproteinasen, die sich von Streptomyces griseus (ATCC 3463) ableiten; derartige Serinproteinasen sind im
Handel unter der Bezeichnung "Pronase" von der Firma Kaken Chemical Co., . Japan, erhältlich; die Verfahren zur Herstellung
und Abtrennung der Proteinasen sind bekannt: vgl. z.B. The J. Biochem., Bd. 62, Nr. 6, Seiten 633 - 641 (I967).
Auch die von Aspergillus sydowi abgeleitete Serinproteinase ist geeignet: Verfahren zur Herstellung und Abtrennung dieser
von einem Fungus abgeleiteten Serinproteinase sind bekannt /vgl. z.B. Agr. Biol. Chem., Bd. 31, Nr. 10, Seiten 1151-II58
(1967).7.
Beispiele für andere von Mikroben abstammende Serinproteinasen sind die alkalische Aspergillus-Proteinase (E.C. 3.4.21.15),
Alternaria-Endopeptidase (E.C. 3.4.21.16) sowie Arthrobacter-Serinproteinase
(E.C. 3.4.21.17). Diese speziellen Enzyme wurden gemäß einer systematischen Nomenklatur mit einer
"E.C.rZahl" identifiziert; vgl. "Enzyme Nomenclature",
Commission of Biochemical Nomenclature, Verlag Elsevier Publishing Company, 1973» U.S. Library of Congress Card No.
73-78247.
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Die Einwirkungen des proteolytischen Enzyms auf den N-Acyl-D,L-threoninester
wird auf sehr geeignete Weise in einem wässrigen Medium bei einem pH-Wert von etwa 5 bis etwa 10,
vorzugsweise etwa 7 bis etwa 8, durchgeführt. Eine Temperatur von etwa 10 bis etwa 60 C ist annehmbar. Vorzugsweise wird
die Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa ^JO0C aufrechterhalten.
Aufgrund der hohen selektiven Esteraseaktivität der im erfindungsgemäßen
Verfahren verwendeten speziellen proteolytischen Enzyme hinsichtlich. N-Acyl-L-threoninester und der Gemische
aus N-Acyl-DjL-threoninester sind zur schnellen Herstellung
von N-Acyl-L-threonin nur geringe Mengen an proteolytischem Enzym erforderlich. Beispielsweise werden wässrige
Lösungen mit einem Gehalt an etwa 0,5 bis etwa 5*0, vorzugsweise
etwa la0 bis etwa 2,0 Gew.-? an Enzymen verwendet.
(Die im vorliegenden genannten Enzymmengen beziehen sich auf reines kristallines Enzym.)
Die benutzte Menge an dem N-Acyl-D,L-threoninester beträgt
in der Regel zumindest etwa 5 bis etwa 15 Gew.-% der wässrigen Lösung. Vorzugsweise werden größere Mengen verwendet, beispielsweise
Mengen bis zur maximalen Löslichkeit des N-Acyl-D,L-threoninesters
in dem wässrigen Medium, und noch mehr. (Mengen, welche die maximale Löslichkeit überschreiten,
können deshalb verwendet werden, weil der L-Ester durch die Einwirkung des Enzyms verbraucht wird, so daß mehr in Lösung
geht.)
Die Geschwindigkeit der Einwirkung des Enzyms auf das Material hängt von der Enzymkonzentration und dem Ester in Lösung ab.
In dieser Hinsicht sind N-Acetyl-D,L-threonin-methyl- oder -ethylester aufgrund ihrer guten Wasserlöslichkeit sehr geeignet .
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28QA892
Das racemische Gemisch der N-Acyl-DjL-threoninester, welche
im vorliegenden als Ausgangsmaterial verwendet werden, kann
in guten Ausbeuten, d.h. einer Gesamtausbeute von etwa 65 %»
bezogen auf den Acetessigsäureester, nach dem Mehrstufenverfahren wie folgt hergestellt werden:
In der ersten Stufe des Verfahrens wird ein Acetessigsäureester der allgemeinen Formel
CH3CO CH2CO2R
worin R eine C^- bis Cg-Alkyl- oder eine Arylgruppe bedeutet,
in Gegenwart einer Säure, vorzugsweise von Eisessig, mit Natriumnitrit umgesetzt. Die Alkylgruppe kann gerad- oder
verzweigtkettig sein, während unter dem Begriff "Arylgruppe"
eine Kohlenwasserstoffgruppe mit einem aromatischen Substituenten verstanden wird; dieser Begriff umfaßt Gruppen wie die
Phenyl-, Benzyl-, cC-Phenylethyl-, ß-Phenylethyl- und
Naphthylgruppe.
Das Natriumnitrit wird in wässriger Lösung langsam zum Acetessigsäurealkylester in Lösung bei einer Temperatur von
etwa -30 bis etwa +300C zugegeben. Das Gemisch wird mehrere
Stunden nach dieser Zuagbe bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 35°C gerührt. Der ct-Oximino-acetessigsäureester,
welcher sich in einer Ausbeute von etwa 85 % bildet, wird nach herkömmlichen Verfahren abgetrennt.
In der zweiten Verfahrensstufe wird der in Stufe 1 hergestellte eC-Oximino-acetessigsäureester in Gegenwart eines
Acylanhydrids der allgemeinen Formel
(R1CO)2O
worin R' eine C^- bis C^-Alkylgruppe oder eine Arylgruppe
bedeutet, hydriert. Es kann jede herkömmliche Hydrierungs-
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methode angewandt werden. Bei einem bevorzugten Verfahren wird der in Stufe 1 gebildete ci-Oximino-acetessigsäureester
in einer Parr-Hydriervorrichtung unter Verwendung von Platinauf pulverisierter Holzkohle mit einer Ausbeute von etwa 95 %
hydriert.
Es kann auch ein Gemisch des Acylanhydrids und der entsprechenden
Carbonsäure verwendet werden. Das bevorzugte Anhydrid ist Acetanhydrid. Eine bevorzugte Zusammensetzung ist ein Gemisch
von Acetanhydrid und Eisessig.
In der Verfahrensstufe 3 wird das Gemisch aus den bei der
Hydrierung des öt-Oximino-acetessigsäureesters gebildeten.
N-Acyl-ß-hydroxy-buttersäureestern mit einem Dehydratisierungsmittel,
vorzugsweise Thionylchlorid, unter wasserfreien Bedingungen umgesetzt. Andere für diese Reaktion
brauchbare Reagentien sind Sulfonsäure-Ionenaustauscherharze, Derivate von Sulfonsäure, d.h. wasserfreie Ester oder Amide,
Sulfonylchlorid sov/ie Methansulfonsäure.
Diese Umsetzung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa -IQ bis etwa +1IO0C durchgeführt. In einer Ausbeute von
etwa 85 % bildet sich das cis-D,L-2-Acyl-5-methyl-A -oxazolin-^-carboxylat
und das trans-Isomere in einem Verhältnis von 1 Teil eis- zu etwa 1I Teilen trans-Isomeren. Es ist das
trans-Isomere, welches bei saurer Hydrolyse den N-Acyl-D,L-threoninester liefert.
Bei dieser Verfahrensstufe kann der N-Acyl-D-threoninester,
welcher bei der enzymatischen Hydrolyse des Gemisches der N-Acyl-D,L-threoninester
anfällt, rückgeführt werden.
809832/0883
In der Verfahrensstufe h wird das Gemisch der eis- und transisomeren
mit einer kalten alkoholischen Lösung von einem Natriumalkoholatj vorzugsweise Natriummethylat in Methanol,
unter einer inerten Atmosphäre etwa eine halbe Stunde vermischt. Unter diesen Bedingungen wird das eis-Isomere zum
trans-Isomeren isomerisiert.
In der Verfahrensstufe 5 wird das in der vorhergehenden Stufe
isomerisierte Oxazolin durch Umsetzung mit verdünnter Säure
zum entsprechenden N-Acyl-D,L-threoninester hydrolysiert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird zur Hydrolysierung
des Oxazolins zum entsprechenden N-Acyl-D,L-threoninester
1 η Salzsäure verwendet.
Der durch diese Reaktionsfolge gebildete Ester wird sodann durch das zuvor beschriebene enzymatische Hydrolyseverfahren
in N-Acy1-L-threonin übergeführt.
Das zuvor beschriebene Verfahren ist ein wirksames Verfahren zur Herstellung der N-Acyl-DjL-threoninesterj die als Ausgangsprodukte
für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
von N-Acyl-L-threonin und L-Threonin dienen; die Quelle für diese Ester ist nicht kritisch. Es kann ein beliebiges Gemisch
von D,L-Threonin acyliert, verestert und sodann verwendet
werden; die Reihenfolge der Acylierung und Veresterung ist nicht kritisch.
Das ernährungsmäßig bedeutsame N-Acyl-L-threonin kann mit verdünnter Säure oder einem Acylase-Enzym zur Herstellung
von optisch reinem L-Threonin hydrolysiert werden.
Nachfolgende Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.
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- IT -
2804832
Eine wässrige, mit Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 7S5
gepufferte Lösung wurde mit N-Acetyl-DsL-threoninmethylester
versetzt, wonach auf 5 g des Threoninesters etwa 0,35 g
Subtilisin Carlsberg zugegeben wurden. Nach 2 1/2 Stunden bei 25 C war die Umsetzung zu etwa 78 % vollständig.
Zur Entfernung des nicht-umgesetzten N-Acetyl-D-threoninmethylesters
und eventuell nicht-umgesetzten L-Methylester^
wurde das Reaktionsgemisch mit 20 gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Lösung wurde sodann auf einen pH-Wert
von 1,5 angesäuert, und das N-Acetyl-L-threonin wurde mit 5 gleichen Volumina Ethylacetat extrahiert. Die Aktivität
des N-Acetyl-threoninmethylesters war bei Verwendung von
Subtilisin Carlsberg H8 μιη/Min/mg des Enzyms.
Bei Vervrendung des N-Acetyl-D,L-threonin-benzylesters war die Aktivität 80 μΐη/Min./mg des Enzyms, bei Verwendung des
Ethylesters betrug die Aktivität 40 jum/Min./mg des Enzyms,
während bei Verwendung des Isopropy!esters die Aktivität
12 pm/Min./mg war.
Wenn in der obigen Reaktion N-Benzoyl-D,L-threoninmethylester verwendet wurde, war die Aktivität 32 μΐη/Min./mg des Enzyms.
Bei Verwendung von Subtilisin BPN anstelle des Subtilisins
Carlsberg wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.
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Ein unter einer Inertatmosphäre gerührtes, gekühltes Gemisch von 1 Mol (116 g) Acetessigsäuremethylester und 2,5 Mol
(151 g) Essigsäure wurde innerhalb von 45 Minuten bis 1 Stunde mit einer Lösung von 1,1 Mol (76 g) Natriumnitrit in 170 ml
Wasser versetzt. Es wurde dafür gesorgt, daß die Temperatur des Reaktionsgemisches 25°C nicht üherschritt. Nach Zugabe
des Natriumnitrits wurde das Reaktionsgemisch etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das Gemisch wurde sodann mit etwa 200 ml Wasser verdünnt und
wiederholt mit Diethylether extrahiert. Die vereinten Etherextrakte wurden von der wässrigen Lösung abgetrennt und mit
einer 10 bis 20 SSigen Natriumcarbonatlösung zur Entfernung
von Säure aus den Etherextrakten gewaschen. Die Etherextrakte wurden sodann über Magnesiumsulfat getrocknet; und der Ether
abgedampft. Der Rückstand (121 g) war ein gelbes öl, was einer 84 /Sigen Ausbeute von d-Oximino-acetessigsäuremethylester
entsprach. Das Produkt wurde durch NMR-Spektroskopie in Deuterochloroform identifiziert (Singlet-Peaks bei 2,4
und 3,85 ppm), ferner durch das IR-Spektrum (Resonanzfre-
— 1 quenzen bei 1745, I690 und I63O cm ).
Ein Gemisch aus 3*2 g des wie oben beschrieben hergestellten
ct-Oximino-acetessigsäuremethylesters, 5 ml Acetanhydrid,
5 ml Essigsäure und 1,0 g von 5 % Platin auf pulverisierter Holzkohle wurde in ein Hydrierungs-Standgefäß gebracht. Die
Hydrierung wurde bei einem Druck von etwa 3,45 bar während etwa 20 Stunden in einer Parr-Hydriervorrichtung vorgenommen.
Der Katalysator wurde abfiltriert,und das Lösungsmittel wurde
unter Vakuum abgezogen, wobei 3}63 S (Ausbeute: 94 %) eines
gelben Öls erhalten wurden. Das Produkt wurde durch sein NMR- und IR-Spektrum identifiziert.
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2 g des wie zuvor beschrieben hergestellten N-Acetyl-eO-aminoß-hydroxybuttersäuremethylesters
wurden in 25 ml Acetonitril gelöst. Unter einer Argonatmosphäre wurde der gekühlte Ester
unter Rühren mit 2,09 g Thionylchlorid langsam versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann 6 bis 8 Stunden bei 5 C und
etwa 12 Stunden bei Raumtmperatur gerührt. Das Reaktionsge^·
misch wurde sodann langsam zu 75 ml einer 10 #igen Natriumcarbonat
lösung zugegeben; der pH-Wert des Reaktionsmediums
wurde über 7 gehalten. Die organische Schicht wurde abgetrennt^ und die wässrige Phase wurde mit Chloroform extrahiert; Die
vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung
entfernt, wobei 1,53 g (Ausbeute: 86 %) Methyl-D,L-2,5-dimethyl-A
-oxazolin-4-carboxylat erhalten wurden. Das
Produkt wurde durch IR- und NMR-Spektren identifiziert.
Das Methyl-D,L-2,5-dimethyl-^, -oxazolin-^t-carboxylat wurde
in trockenem Methanol aufgelöst. Die Methanollösung des cis-Isomeren
wurde bei 5°C unter Rühren und unter einer Inertatmosphäre mit einer kalten methanolischen Lösung von
Natriummethylat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde nach
der Zugabe etwa 30 Minuten weiter gerührt, wonach zum Abbruch
der Reaktion ein Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,3 zugegeben wurde.
Die Extraktion des wässrigen Gemisches mit Chloroform und nachfolgendes Eindampfen führte zu einem dunkelgelben öl,
das aufgrund seiner NMR- und IR-Spektren als Methyl-trans-D,L-
2,5-dimethyl- -oxazolin-4-carboxylat identifiziert wurde.
Dieses Carboxylat kann in einer wässrigen Lösung mit einer In Salzsäure zum N-Acetyl-D,L-threoninmethylester hydrolysiert
werden.
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Das Oxazolin braucht nicht isoliert zu werden. Zur öffnung
zum H-Acetyl-ester .
des Oxazolmrmges/innerhalb von etwa 1/2 Stunde kann zur methanolischen Lösung des Oxazolins eine Mineralsäurelösung, beispielsweise Phosphor- oder Salzsäure, zugegeben werden. Die Säure wird sodann neutralisiert^ und das Methanol wird abdestilliert.
des Oxazolmrmges/innerhalb von etwa 1/2 Stunde kann zur methanolischen Lösung des Oxazolins eine Mineralsäurelösung, beispielsweise Phosphor- oder Salzsäure, zugegeben werden. Die Säure wird sodann neutralisiert^ und das Methanol wird abdestilliert.
Der N-Acetyl-DjL-threoninmethylester wurde nach dem Verfahren
des Beispiels 1 hydrolysiert.
Nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestelltes N-Acetyl-L-threonin
wurde unter Verwendung einer In Salzsäure v/ährend 2 Stunden bei 100 C hydrolysiert, wobei optisch reines
L-Threonin erhalten wurde.
Für: The Procter & Gamble Company Cincinnati, Qhio, V.St.A.
Df.fi. J. Wolff Rechtsanwalt
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Claims (15)
1.!Verfahren zur Herstellung von optisch reinem N-Acyl-
^ ' L-threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man
(1) ein Gemisch von N-Acyl-L-threoninester und N-Acyl-D-threoninester
der Einwirkung einer Serinprotease als proteolytisches Enzym unterwirft, und
(2) das erhaltene N-Acyl-L-threonin von dem nichtumgesetzten
N-Acyl-D-threoninester abtrennt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe eine Alkanoylgruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen
oder eine Aroy!gruppe ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Estergruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält.
1J. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man Subtilisin Carlsberg oder Subtilisin BPN als Serinprotease verwendet.
5. Verfahren gemäß Anspruch ^, dadurch gekennzeichnet, daß
die Acylgruppe die Acetyl- oder Benzoylgruppe, und der Ester ein Methyl-, Ethyl- oder Benzylester ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von reinem N-Acetyl-L-threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man
(1) ein Gemisch aus N-Acetyl-L-threonin-methylester und
N-Acetyl-D-threonin-methylester bei einem pH-Wert von
5 bis 10 einer von Mikroben abgeleiteten Serinprotease als proteolytisches Enzym unterwirft, und
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ORIGINAL INSPECTED
28Ü4892
(2) das erhaltene N-Acetyl-L-threonin abtrennt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Subtilisin Carlsberg als Serinprotease verwendet.
8. Verfahren zur Herstellung von N-Acyl-L-threonin, dadurch
gekennzeichnet, daß man
(1) einen Acetessigsäureester mit Natriumnitrit in Gegenwart einer Säure umsetzt;
(2) den hierbei erhaltenen cL-Oximino-acetessigsäureester
in Gegenwart eines Acylanhydrids hydriert;
(3) das hierbei erhaltene Gemisch aus N-Acyl-ß-hydroxybutyratester
mit einem Dehydratisierungsmittel unter wasserfreien Bedingungen umsetzt;
(4) das hierbei gebildete cis-D,L-2-Acyl-5-methyl-A oxazolin-4-carboxylat
zum trans-D,L-2-Acyl-5-methyl-Δ -oxazolin-^-carboxylat isomerisiert;
(5) das Produkt der Stufe (4) mit verdünnter Säure hydrolysiert;
(6) das Gemisch aus N-Acyl-L-threoninester und N-Acyl-D-threoninester
der Einwirkung einer Serinprotease als proteolytisches Enzym unterwirft; und
(7) das erhaltene N-Acyl-L-threonin von dem nicht-umgesetzten
N-Acyl-D-threoninester abtrennt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acetessigsäurealkylester in Stufe (1) Acetessigsäuremethylester,
und als Acylanhydrid in Stufe (2) Essigsäureanhydrid verwendet.
10. Verfahren gemäß Anspruch 93 dadurch gekennzeichnet, daß
man als Serinprotease Subtilisin Carlsberg oder Subtilisin BPN verwendet.
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11. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den N-Acyl-D-threoninester der Stufe (7) niit den
N-Acyl-ß-hydroxybutyratestern in Stufe (3) im Umlauf
führt.
12. Verfahren zur Herstellung von optisch reinem L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man
(1) ein Gemisch von N-Acyl-L-threoninester und N-Acyl-D-threoninester
der Einwirkung einer Serinprotease als proteolytisches Enzym unterwirft;
(2) das erhaltene N-Acyl-L-threonin von dem nicht-umgesetzten
N-Acyl-D-threoninester abtrennt; und
(3) das N-Acyl-L-threonin zum L-Threonin hydrolysiert.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Serinprotease Subtilisin Carlsberg oder Subtilisin BPN verwendet.
14. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die Acylgruppe eine Alkanoylgruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen
oder eine Aroylgruppe ist.
15. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Estergruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist.
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| GB (1) | GB1593963A (de) |
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| NL (1) | NL7801485A (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US4906773A (en) * | 1987-12-22 | 1990-03-06 | Takasago International Corporation | Process for preparing optically active threonine |
| WO2003029477A1 (en) * | 2001-09-25 | 2003-04-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Enzymatic process for the preparation of substituted 2-amino-3-(2-amino-phenylsulfanyl)-propionic acid |
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| US3963573A (en) * | 1975-03-03 | 1976-06-15 | The Procter & Gamble Company | Process for producing N-acyl-L-methionine |
-
1978
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- 1978-02-08 FR FR7803567A patent/FR2380251A1/fr not_active Withdrawn
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- 1978-02-09 BE BE185027A patent/BE863797A/xx unknown
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| GB1593963A (en) | 1981-07-22 |
| NL7801485A (nl) | 1978-08-11 |
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|---|---|---|---|
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