DE2740348A1 - Verfahren zur optischen trennung von dl-lysin-verbindungen - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder dessen Saureadditionssalze durch optische Trennung eines DL-Lysinalkylesters oder dessen Säureadditionssalze mittels enzymatisch asymmetrischer Hydrolyse. Mit der Bezeichnung "optische Trennung" bzw. "optische Spaltung" soll die Trennung bzw. Spaltung eines Racemat-Gemisches in seine optischen Antipoden bezeichnet werden.

Eine synthetisch hergestellte Aminosäure liegt gewöhnlich in Form ihres Racemates vor. Die optische Trennung eines solchen Racemates stellt ein ernsthaftes Problem dar.

Soweit die Herstellung von optisch aktivem L-Lysin betroffen ist, sind bislang die nachfolgenden Verfahren bekannt geworden:

(1) Die Salzbildung von DL-Lysin mit einer anderen optisch aktiven Säure, gefolgt von der selektiven

München: R. Kramer Dipl.-Ing. · W. Weser Cipl.-Phys. Dr. rer. nat. · P. Hirsch Dipl.-Ing. · H. P. Brehm Dipl.-Chem. Dr. phil. nat. Wiesbaden: P. G. Blumbach Dipl.-Ing. . P. Bergen Dipl.-Ing. Dr. jur. · G. Zwirner Dipl.-Ing. Dipl.-W-Ing.

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Kristallisation von L-Lysin aus dem gebildeten Salz;

(2) die Immobilisierung einer optisch aktiven Verbindung an einem unlöslichen Träger, wonach aufgrund der unterschiedlichen Affinität der beiden Isomere das L-Isomeie chromatographisch von dem D-Isomeren getrennt wird;

(3) die Umwandlung von DL-Lysin in eine N-Acyl-Verbindung, gefolgt von der nachfolgenden optischen Trennung der N-Acyl-Verbindung mit einer Aminoacylase in L-Lysin und N-Acyl-D-Lysin; und

die Umwandlung von DL-Lysin in einen Alkylester oder dessen Säureadditionssalz, gefolgt von der enzymatischen, asymmetrischen Hydrolyse des Esters (bzw. Salzes) mit einer Esterase, um den Ester oder dessen Salz in L-Lysin und D-Lysinalkylester optisch zu trennen.

Es sind weiterhin verschiedene Anstrengungen unternommen worden, vm diese Verfahren unter wirtschaftlich tragbaren Bedingungen in größerem Maßstab durchzuführen. Hierbei haben sich bei den Verfahren (1) und (2) Schwierigkeiten ergeben, da die Produkte hinsichtlich Ausbeute und optischer Beinheit nicht befriedigt haben. Bas Verfahren (3) ist für die Herstellung zahlreicher Aminosäuren recht

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wirksam; im Falle von Lysin erweist sich das verwendete Enzym jedoch nur dann als wirksam, wenn die Aminogruppe in der £-Stellung dieser besonderen Aminosäure mit einem relativ großvolumigen Substituenten wie etwa einer Benzoylgruppe geschützt worden ist. Hinsichtlich dem Verfahren (4) ist die optische Trennung von DL-Lysin mittels immobilisiertem Trypsin vorgeschlagen worden (vgl. die offengelegte Japanische Patentpublikation Nr. 13390/1974).

In der Tat weist Trypsin Spezifität und hohe Aktivität gegenüber basischen Aminosäuren auf. Das durch Kristallisation gereinigte Trypsin ist jedoch sehr teuer, so daß Versuche zur Beschaffung von größeren Mengen an gereinigtem Trypsin sehr große Schwierigkeiten bereiten. Darüberhinaus ist dieses Enzym so unbeständig, daß es leicht inaktiviert wird, beispielsweise bereits durch Rühren, wenn das Enzym in Wasser eingebracht wird, um dessen Auflösung in Wasser zu erleichtern. Selbst in der Nähe seines optimalen pH-Wertes wird das Enzym ziemlich rasch inaktiviert. Deshalb kann nicht davon ausgegangen werden, daß dieses Enzym für ein im industriellen Maßstab arbeitendes Verfahren brauchbar ist. Weiterhin muß die nachfolgende Schwierigkeit bedacht werden; wird die optische Trennung mit solchen Esterasen, einschl. Trypsin durchgeführt, so läßt sich im Bereich des optimalen pH-Wertes eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit erzielen; unter diesen Bedingungen wird jedoch auch die D-Form des Aminosäureesters auf nicht-enzy-

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statischem Wege hydrolysiert, so daß es Schwierigkeiten bereitet, die angestrebte L-Aminosäure mit hoher optischer Reinheit zu erhalten. Gewöhnlich liegen die optimalen pH-Werte für Enzyme mit Esteraseaktivität bei 7 oder höher, und die enzymatische Reaktion wird in einem leicht alkalischen pH-Bereich durchgeführt; unter diesen Bedingungen tritt häufig auch eine nicht-enzymatische Hydrolyse der Ester auf. Deswegen muß die enzymatische Reaktion in einem leicht sauren pH-Bereich durchgeführt werden, wo die Enzyme jedoch geringe Aktivitäten aufweisen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist nun festgestellt worden, daß eine nicht-spezifische Protease, die von, zum Stamme der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt wird, eine starke Esteraseaktivität gegenüber einem Lysinalkylester aufweist, bei dem der Stickstoff in 6C-Stellung nicht acyliert ist; diese Aktivität ist so groß, daß sie zur optischen Trennung ausgenutzt werden kann. Bislang ist angenommen worden, daß Proteasen keine Spezifität hinsichtlich optischer Isomere von Aminosäureestern, bei denen der Stickstoff der Aminogruppe nicht acyliert ist, aufweisen würden. Darüberhinaus ist verschiedentlich festgestellt worden, daß Proteasen aus Microorganismen eine weniger genaue Spezifität hinsichtlich der Substrate aufweisen, als ähnliche Enzyme tierischen Ursprungs. Aus diesen Gründen sind die Beispiele für die optische Trennung mittels

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Proteasen aus Microorganismen nicht "besonders zahlreich. Demgegenüber ist nun mit der vorliegenden Erfindung festgestellt worden, daß nicht-spezifische, von zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugte Proteasen eine sehr hohe Aktivität gegenüber der L-Form von Lysinester aufweisen, verglichen mit der entsprechenden Aktivität gegenüber dem D-Isomeren. Weiterhin läßt eich die entsprechende enzymatische Reaktion sehr wirksam in einem leicht sauren pH-Bereich durchführen, so daß im wesentlichen keine nicht-enzymatische, spontane Hydrolyse auftritt. Bei der Hydrolyse von Lysinalkylestern mit nichtspezifischer Protease, die von Bakterien der Gattung Streptomyces erzeugt worden ist, liegt der optimale pH-Wert im Bereich um 5>7 herum.

Die vorliegende Erfindung ist somit auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder dessen Säureadditionssalze aus DL-Lysinalkylester oder deren Säureadditionssalze gerichtet. Das Verfahren beruht auf der enzymatischen Trennung bzw. Spaltung des Ausgangsgemisches in optische Antipoden. Die erfindungsgemäßen Maßnahmen sind dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung des DL-Lysinalkylesters oder dessen Säureadditionssalze mit einer nicht-spezifischen Protease zusammengebracht wird, welche DL-Lysinalkylester oder deren Säureadditionssalze in die optischen Antipoden zu trennen vermag und welche aus Streptomyces-Kulturen gewonnen worden ist; das Zusam-

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sienbringen der wässrigen Lösung mit der nicht-spezifischen Protease erfolgt unter schwach sauren Bedingungen bei einer Temperatur unter 60⁰C; aus dem Reaktionsgemisch wird das gebildete L-Lysin oder dessen Säureadditionssalze abgetrennt und isoliert.

Das Substrat, nämlich DL-Lysinalkylester oder dessen Säureadditionssalze werden nach bekannten Verfahren hergestellt. Beispielsweise kann der Ester aus DL-Lysin und einem Alkohol synthetisiert werden. Eine andere Synthese kann auch von Cyclohexanon ausgehen, um den Ester zu erhalten, so daß DL-Lysin selbst nicht isoliert werden muß. Die Anzahl der Kohlenstoffatome in der Alkylgruppe des Lysinesters soll 1 bis 6 betragen; vorzugsweise sind als Alkylgruppen dieses Esters Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, Sec.-Butyl- oder Tert.-Butyl-Gruppen vorgesehen; besonders bevorzugt werden die Methyl-Gruppe oder die Äthyl-Gruppe -als Alkylgruppe des DL-Lysinalkylesters. Sofern die Anzahl der Kohlenstoffatome in dieser Alkylgruppe des Esters zunimmt, nimmt die Löslichkeit des Esters und seiner Säureadditionssalze in Wasser ab; weiterhin nimmt dadurch die mit dem Enzym erreichbare Hydrolysegeschwindigkeit ab.

Als Reaktionsmedium wird zweckmäßigerweise Wasser verwendet, da Lysinalkylester oder deren Säureadditionssalze leicht in Wasser löslich sind. Zusätzlich können im Reaktionsmedium neben Wasser auch nicht-wässrige, mit Wasser misch-

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bare Lösungsmittel wie etwa Alkohole vorgesehen sein, sofern gewährleistet ist, daß deren Anwesenheit die enzymatische Aktivität nicht vermindert. Gewöhnlich ist im Reaktionsmedium auch ein oder mehrere neutrale Salze mit Pufferwirkung vorhanden, um die Einstellung des pH-Wertes des Reaktionssystems auf den vorgesehenen Wert zu erleichtern. Die Konzentration des Substrats in der wässrigen Lösung ist nicht besonders kritisch. Eine Steigerung der Substratkonzentration bis sehr nahe an die Löslichkeitsgrenze des Substrats im Reaktionsmedium hat die enzymati-Eche Aktivität der Reaktion nicht gesteigert; andererseits erleichtert dies die Abtrennung und Isolierung des angestrebten Reaktionsproduktes. Die zweckmäßige Substratkonzentration soll daher unter Berücksichtigung dieser Faktoren festgelegt werden; gute Ergebnisse wurden mit einer Substratkonzentration im Bereich von 100 bis 500 mg/ml erhalten.

Der Anteil an der eingesetzten, nicht-spezifischen Protease ist unterschiedlich und hängt vom Ausmaß der Reinheit und der Aktivität ab; es ist jedoch grundsätzlich nicht erforderlich, daß das Enzym in einem großen Anteil vorhanden ist; eine ausreichende Menge beträgt 0,03 bis 3 %» insbesondere 0,1 bis 1,5 %, bezogen auf das Gewicht des Substrates. Die nicht-spezifische Protease kann in immobilisierter Form, wobei das Enzym an einem unlöslichen Träger angebracht ist, verwendet werden. Das Gewicht der nicht-spezifischen Pro-

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tease relativ zu dem Gewicht der hergestellten Aminosäure iet wesentlich kleiner, als das in obigem Zusammenhang angegebene Gewicht, da das Enzym wiederholt verwendet werden kann.

Zur Herstellung der nicht-spezifischen Proteasen können irgendwelche Bakterien der Gattung Streptomyces verwendet werden, solange gewährleistet ist, daß diese ein enzymatisch wirksames Produkt bilden, welches gegenüber Lysinalkylestern Aktivität aufweist. Insbesondere werden zur Bildung der nicht-spezifischen Proteasen Bakterien der Stämme Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae, Streptomyces erythreus, Streptomyces rimosus und Streptomyces flavovirens mit gutem Erfolg eingesetzt, da diese Bakterien hoch aktive Lysinalkylester-Hydrolasen erzeugen.

Die Immobilisierung der nicht-spezifischen Protease kann mittels irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt werden, das dafür geeignet ist. Hierbei muß beachtet werden, in jedem Falle soll jedoch die Forderung erfüllt sein, daß die an dem unlöslichen Träger immobilisierte nichtspezifische Protease weiterhin eine Aktivität gegenüber der asymmetrischen Hydrolyse von DL-Lysinalkylestern oder deren Säureadditionssalze aufweist. Sofern das Enzym in gelöster Form in einem homogenen Reaktionssystem verwendet wird, wird es nach Beendigung der Reaktion in der Regel verworfen; demgegenüber ist es mit einem immobilisierten Enzym

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möglich, das Enzym wiederholt einzusetzen, unabhängig davon, ob die Reaktion absatzweise oder in kontinuierlicher Form durchgeführt wird. Die Immobilisierung des Enzyms bringt somit beachtliche wirtschaftliche Vorteile hinsichtlich dem Anteil an verbrauchtem Enzym; weiterhin wird der Anfall an Nebenprodukten und Abfall vermindert; schließlich läßt sich die Reinigung des angestrebten Produktes leichter durchführen.

Hinsichtlich der bekannten Immobilisierung von Enzymen sei auf die nachfolgenden Verfahren verwiesen, die auch von O.R. Zaborsky in "Immobilized Enzymes", CR.C. Press (1973) angegeben sind, nämlich:

(1) die physikalische Adsorption aufgrund von Ionenwechselwirkungen ;

(2) die Anbringung der Enzyme mittels kovalenter Bindung;

(3) das Einschließen der Enzyme in Hohlräume und dergleichen am Träger; und

(4) die Vernetzung des Enzyms innerhalb des und/oder mit dem Träger.

Das mittels ionischer oder physikalischer Adsorption arbei-

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tende Verfahren (1) ist für die industrielle Anwendung wegen seiner Einfachheit recht geeignet; andererseits besteht jedoch die Möglichkeit, daß das Enzym vom Träger wieder freigesetzt wird, wenn die Ionenstärke sowie die Konzentrationen an Substrat und/oder Produkt in der Reaktionslösung hoch sind. In dieser Hinsicht ist die Freisetzung von immobilisierten Enzymen, die mittels kovalenter Bindungen am Träger angebracht sind, kaum zu befürchten; andererseits bereitet die Herstellung dieser Art von immobilisierten Enzymen größere Schwierigkeiten. Sofern jedoch die Herstellung beherrscht wird, bringt diese Art von immobilisierten Enzymen größere Vorteile, sowohl hinsichtlich der Auswahl der Substrate wie der Produkte, als die ionisch gebundenen Enzyme. Aus diesem Grunde werden zur optischen Trennung der Lysinverbindungen vorzugsweise solche immobilisierten Enzyme eingesetzt, die entsprechend dem oben angegebenen Verfahren (2) erhalten worden sind. Hinsichtlich des angegebenen Verfahrens (3) ist es schwierig, die Aktivität des Enzymes nach der Immobilisierung beizubehalten, wenn es sich bei dem Enzym um eine Protease handelt. Bei der Immobilisierung nach dem Verfahren (4) lassen sich keinesfalls die guten Ergebnisse erzielen, die mit kovalent gebunden Enzymen erreicht worden sind. Im Hinblick auf die genannten Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen (1) bis (4) bringen somit für das erfindungsgemäße Verfahren diejenigen Eizyme die besten Ergebnisse, die über kovalente Bindungen an einem Träger angebracht

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und damit immobilisiert worden sind.

Zur Immobilisierung kann die nicht-spezifische Protease in ihrer gereinigten Form oder in ihrer rohen Form eingesetzt werden. Weiterhin kann diejenige Enzymkomponente, die Aktivität gegenüber dem Lysinalkylester aufweist, in ihrer isolierten Form oder in Form eines Gemisches eingesetzt werden, wobei in dem Gemisch die aktive Enzymkomponente zusammen mit anderen Proteasenkomponenten vorliegt. Die Reaktion des BL-Lysinalkylesters oder dessen Säureadditionssalze mit dem immobilisierten Enzym kann absatzweise durchgeführt werden; in diesem Falle wird nach Beendigung der Hydrolyse das immobilisierte Enzym mittels Filtrieren oder Zentrifugieren von der Reaktionslösung abgetrennt, so daß das immobilisierte Enzym für einen nachfolgenden Ansatz wieder zur Verfügung steht. Alternativ dazu kann die Hydrolyse kontinuierlich durchgeführt werden, wozu das immobilisierte Enzym vorteilhafterweise in einer Säule angeordnet wird, und das Substrat in Form einer Lösung kontinuierlich durch die Säule geführt wird; hierbei kann die Substratlösung in der senkrecht angeordneten Säule von oben nach unten oder von unten nach oben geführt werden. Sofern die Reaktion absatzweise durchgeführt wird, kann die pH-Wert-Einstellung der Reaktionslösung leicht durchgeführt werden. Bei der kontinuierlichen Verfahrensführung in einer Säule kann der Ablauf der Reaktion leicht kontrolliert und bis zum vorgesehenen Ausmaß durchgeführt werden.

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Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens soll die Beaktionstemperatur nicht mehr als 60⁰C betragen. Sofern die Reaktion bei einer höheren Temperatur durchgeführt wird, besteht die Gefahr einer Inaktivierung des Enzyms, selbst wenn eine höhere Reaktionsgeschwindigkeit erzielt werden kann. Darüberhinaus besteht die Gefahr der unerwünschten, nicht-enzymatischen Hydrolyse. Im Hinblick auf diese Faktoren soll eine solche Reaktionstemperatur ausgewählt werden, die einen Ausgleich all dieser Faktoren bringt. Als besonders vorteilhaft hat sich eine Reaktionstemperatur zwischen 20 und 45⁰C erwiesen. In dieem Temperaturbereich weist auch die immobilisierte, nichtspezifische Protease ihre größte Stabilität auf.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter schwach sauren Bedingungen durchgeführt, da der optimale pH-Wert für die nicht-spezifische Protease um 5>7 herum liegt.

Bei dieser Hydrolyse von Lysinalkylester mit nicht-spezifischer Protease fällt die Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmender Reaktionsdauer ab. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird außerordentlich niedrig, nachdem ungefähr 80 % des L-Isomeren hydrolysiert worden sind. Es ist deshalb vorteilhaft und auch vom wirtschaftlichen Standpunkt her anzustreben, die Reaktion dann abzubrechen, nachdem ungefähr 60 bis 90 % des L-Isomeren hydrolysiert worden sind, anstelle zu versuchen, die Reaktion bis zur 100 %igen

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Hydrolysierung des L-Isomeren fortschreiten zu lassen.

Unabhängig davon, ob das Enzym in Form einer Lösung oder in seiner immobilisierten Form angewandt wird, kann die Abtrennung und Isolierung des L-Lysin oder seiner Säureadditionsprodukte aus dem Hydrolysat, das D-Lysinalkylester oder dessen Säureadditionssalze, sowie nicht umgesetzten L-Lysinalkylester und dessen Säureadditionssalze enthält, nach verschiedenen bekannten Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann hierfür ein Verfahren vorgesehen werden, bei welchem der Reaktionslösung das zehnbis zwanzigfache Volumen Alkohol zugesetzt wird, die alkoholische Lösung anschließend eingeengt wird, um das Säureadditionsprodukt von L-Lysin auszufällen, und der ausgefällte Niederschlag anschließend durch Filtration abgetrennt wird. Alternativ dazu kann die Reaktionslösung zuerst eingeengt werden, anschließend Alkohol oder Aceton zugesetzt werden, um. das Säureadditionsprodukt von L-Lysin auszufällen, das anschließend mittels Filtration abgetrennt wird. Der nicht-umgesetzte Lysinalkylester kann durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel für Ester wiedergewonnen werden; nach einer anderen Ausführungsform werden die gesammelten Rückstände in Alkohol gelöst, anschließend Äther oder Toluol zugesetzt, um den Lysinalkylester auszufällen, wonach der Ester mittels Filtration abgetrennt wird. Das nach einem dieser Verfahren erhaltene Säureadditionssalz von Lysinalkylester kann razemisiert werden,

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sofern dies erforderlich ist und wieder der erneuten Verwendung zugeführt werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung,ohne diese einzuschränken.

Beispiel 1:

In 20 ml 0,004- m Monokaliumphosphat-Lösung werden 3jO g DL-Lysinmethylester-Dihydrochlorid gelöst. Mittels 1n Natriumhydroxid-Lösung wird der pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 6 eingestellt. Der erhaltenen Lösung wird 1 ml einer Enzymlösung zugesetzt, die als nicht-spezifische Protease 36 mg Pronase aus Streptomyces griseus enthält, um die enzymatische Reaktion in Gang zu setzen. Während des Fortganges der Hydrolyse wird die Temperatur des Reaktionsgemisches bei 30⁰C gehalten und der pH-Wert des Gemisches durch weiteren Zusatz von 1n Natriumhydroxid-Lösung bei 6,0 gehalten. Nach Ablauf von 25 Minuten (aus dem Verbrauch an Natriumhydroxid wurde errechnet, daß nach Ablauf dieser Zeitspanne etwa 39 % DL-Lysinmethylester verbraucht worden sind) wird die Reaktion angehalten, wozu der Reaktionslösung das doppelte Volumen Methanol zugesetzt wird. Das erhaltene Gemisch wird auf eine Temperatur bis nahe 50 C erwärmt und durch Verdampfung eingeengt; der nach der Verdampfung der flüchtigen Lösungsmittel zurückbleibende Rest wird in einer geringen Menge Methanol ge-

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löst, und die unlöslichen Anteile mittels Filtration abgetrennt. Die unlöslichen Anteile werden in Wasser gelöst un der erhaltenen Lösung 5 Gew.-% Trichloressigsaure zugesetzt. Daraufhin wird das unlösliche Enzym mittels Zentrifugieren abgetrennt. Weiterhin wird die wässrige Lösung bis auf ein Restvolumen von ungefähr 1 ml eingeengt; dieser Rückstand wird mit ungefähr 15 ml Methanol vermischt; der danach gebildete Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet und liefert 1,20 g gereinigte Kristalle aus L-Lysin-Dihydrochlorid. Dieses Produkt weist eine spezifische optische Drehung (X) Ι£₆° von +20,0 (C = 2, 6n HCl) auf; dies stimmt recht gut mit der spezifischen optischen Drehung (frO |?_Α von +20,4- (C = 2, 6n HCl) von einem Standardpräparat aus reinem L-Isomeren überein. Dies bedeutet, daß die Selektivität für das gereinigte L-Lysin 99 % beträgt.

Weiterhin wird der Ester, der hauptsächlich aus dem D-Lysinmethylester-Dihydrochlorid besteht, aus dem obengenannten Filtrat abgetrennt; hierzu wird dem Filtrat Äther zugesetzt, was zur Ausfällung des Dihydrochlorids führt; der Niederschlag fällt in kristalliner Form an. Die abgetrennten Kristalle weisen eine spezifische optische Drehung von -12,4 (C = 2, 6n HCl) auf.

Beispiel 2:

Im wesentlichen wird das Verfahren nach Beispiel 1 wiederholt; die einzige Abweichung besteht darin, daß anstelle des dort verwendeten Enzyms nunmehr als nicht-spezifische Protease 40 mg eines Enzyms verwendet werden, das wie nachfolgend angegeben erhalten worden ist.

Mittels üblicher Maßnahmen wird Strptomyces fradiae drei Tage lang in einem Basalmedium gezüchtet. Die Kulturbrühe wird filtriert, mit Ammoniumsulfat (60 %ige, gesättigte Lösung) auegesalzen, mit Aceton ausgefällt, daraufhin mittels DEAE-Zellulose chromatographisch gereinigt (entsprechend dem Verfahren, das in Biochim. Biophs. Acta, 139, 382 (1967) angegeben ist) und schließlich lyophilisiert. Die Reaktion wird angehalten, nachdem 78 % des L-Isomeren umgesetzt worden sind. Nach der Reinigung entsprechend Beispiel 1 werden 1,04 g gereinigtes L-Lysin-Dihydrochlorid erhalten. Dieses

or) Ci weist eine spezifische optische Drehung (6<) c^c von +19»8 (C « 2, 6n HCl) auf, was eine Selektivität von 98,5 % anzeigt. "

Beispiel 3^:

1 g Sephalose 4B und 1 g Bromcyanid werden bei pH 11 und 15 C 15 Minuten lang in 40 ml Wasser eingebracht, um aktivierte Sephalose 4B zu erhalten. Anschließend wird das Ge-

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misch 2 Stunden lang bei Raumtemperatur und pH 7 »4 mit dem Enzym Pronase zusammengebracht, wonach ein immobilisiertes Enzym erhalten wird, das 23 mg Enzym enthält. Die Aktivität dieses immobilisierten Enzyms gegenüber DL-Lysinmethylester-Dihydrochlorid beträgt bei 4O⁰C 2,5 li. Mol/mg, min, was 40 % der Aktivität des in Form einer Lösung vorliegenden Enzyms entspricht. Dieses immobilisierte Enzym wird in einer mit einer Ummantelung versehenen Säule angeordnet; die Säule wird bei 30⁰C gehalten; eine 10 %ige Lösung von DL-Lysinmethylester-Dihydrochlorid in Phosphat-Pufferlösung (pH 6,85) wird mit einem Durchsatz von 8,61/Std. von unten nach oben ansteigend durch die Säule geführt. In dem am Säulenkopf austretenden Effluat wird der Estergehalt quantitativ mittels dem Hydroxylaminsäureverfahren bestimmt; hierbei wird eine relative Umwandlung des DL-Lysinmethylesters von 40,5 % festgestellt; bezogen auf das L-Isomere entspricht das einer Umsetzung von 81 %. Das Effluat wird mit einem Mehrfachen an Alkohol vermischt, wonach die Salze ausgefällt werden; die ausgefällten Salze werden mittels Filtration abgetrennt; das zurückbleibende Filtrat wird eingeengt und mit dem 15fachen Volumen Alkohol versetzt, wobei der Niederschlag (I) gebildet wird. Dieser Niederschlag (I) weist eine spezifische optische Drehung (&O |°₆° von + 15,6 (C = 2, 6n HCl) auf; wird

dieser Niederschlag (I) durch Uinkristallisation aus Wasser/ Alkohol gereinigt, so weisen die erhaltenen Kristalle (II)

2O°C eine spezifische optische Drehung (oO r,. von +19,7 auf.

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Wird aus dem nach der Abtrennung des Niederschlags (I) zurückbleibenden Filtrat das Methanol verdampft, so weist der zurückbleibende Niederschlag eine spezifische optisehe Drehung (ö<) T^₆ von -6,7 auf.

Beispiel 4:

In Methanol werden 2 g macroporöses, schwach saures ifcationen-Austauscherharz aus Acrylsäure-Divenylbenzol-Copolymer (mit austauschenden -COOH-Gruppen und einer Teilchengröße von 0,7 mm) mit Thionylchlorid verestert und anschließend mittels Hydrazinhydrat in das entsprechende Hydrazid überführt. Dieses Kunstharz läßt man in 1n Salzsäure bei 2°C eine Stunde lang mit 2,1 g Natriumnitrit reagieren, um das entsprechende Azid zu erhalten. Daraufhin wird das Azid-Gruppen aufweisende Kunstharz in eine wässrige Enzym enthaltende Lösung (mit 155 mg nicht-spezifischer Protease aus Streptomyces fradiae) eingebracht und bei 4°C und einem pH-Wert von 7»5 vier Stunden lang gerührt, um das Enzym an dem Kunstharz zu immobiliseren. Das am Kunstharz immobilisierte Enzym wird daraufhin mit 0,2 m Pufferlösung und 5 η Natriumchlorid-Lösung gewaschen, wobei im Ergebnis ein immobilisiertes Enzym erhalten wird, das auf einem g Träger 47 mg Enzym enthält. Bei der Untersuchung der Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH-Wert zeigte sich, daß sich der optimale pH-Wert verschoben hatte, und nunmehr im Bereich von 6,5 bis 6,7 liegt.

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4,12 g DL-Lysinäthylester-Dihydrochlorid werden in 20 ml 0,1 η Kaliumchlorid-Lösung gelöst. Das nach obiger Vorschrift erhaltene immobilisierte Enzym wird dieser Lösung zugesetzt, und daraufhin das erhaltene Gemisch bei 35°C gerührt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 1 η Natriumhydroxid-Lösung bei 6,6 gehalten wird. Nach einer Rührdauer von 40 Minuten wird das immobilisierte Enzym mittels Filtration abgetrennt; die verbleibende Lösung wird durch Verdampfung auf ein Volumen von ungefähr 5 nil eingeengt; dem erhaltenen Konzentrat werden 95 ml Äthanol zugesetzt; der danach gebildete Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet und liefert 1,67 g L-Lysin-Dihydrochlorid, das eine spezifische optische Drehung (b<) l.r von 19,1 (C - 2, 6n HCl) aufweist.

Das bei der Abtrennung des Niederschlags zurückgebliebene Filtrat aus der 95-%-ig^en Äthanollösung wird eingeengt; der zurückbleibende (leicht hygroskopische) Rest weist eine spezifische optische Drehung (o<.) ^^ von -4,5 (C =2, 6n HCl) auf.

Beispiel 5:

2 g Sephadex G-25 (Dextran-Epichlorhydrin-Copolymer) werden in 1 η Natriumhydroxid-Lösung eingetaucht. Daraufhin wird das Copolymer abfiltriert, und 15 Sekunden lang mit Cyanurchlorid in Dioxan zur Reaktion gebracht; das Reaktionsgemisch wird mit kaltem Aceton und Eisvasser gevaschen; nach der Abtren-

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nung wird das gebildete s-Triazin-Derivat von Sephadex G-25 in Borat-Pufferlösung mit 200 mg Enzym, nämlich Pronase E zusammengebracht und bei pH 8,0 und 4°C 5 Stunden lang mäßig gerührt, um das Enzym zu immobilisieren. Danach weist das immobilisierte Enzym pro g Träger einen Anteil von 67 mg Enzym auf; die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms beträgt bei 40⁰C und pH 6,0 2,53 Ji.Mol/mg.min. Der optimale pH-Wert dieses immobilisierten Enzyms für die Reaktion mit DL-Lysinmethylester-Dihydrochlorid liegt bei etwa 6,1. Dieses immobilisierte Enzym wird in eine mit einem Mantel versehene Säule eingebracht. Die Temperatur der Säule wird bei 40⁰C gehalten; $0 ml einer 10-%-igen DL-Lysinmethylester-Dihydrochloridlösung (pH 6,8) werden am Säulenkopf aufgegeben und von oben nach unten mit einem Durchsatz von 13 1 /Stunde durch die Säule geführt. Mit fortschreitender Reaktion wird der pH-Wert auf 5»75 abgesenkt. An dem aus der Säule austretenden Effluat wird mittels der Ninhydrin-Reaktion der Umwandlungsgrad bestimmt; für die Prüfung werden solche Bedingungen gewählt, daß Aminosäuren eine Färbung verursachen, während Aminosäureester keine Färbung verursachen; hierbei wird festgestellt, daß 40 % des DL-Ausgangsgemisches reagiert haben. Das austretende Effluat wird mit dem 4-fachen Volumen an Methanol vermischt, und das dabei ausgefällte Salz abgetrent. Das zurückbleibende Filtrat wird durch Verdampfung der Lösungsmittel auf ein Volumen von ungefähr 20 ml eingeengt; diesem Konzentrat werden 100 ml Aceton zu-

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gesetzt, wonach 2,02 g L-Lysin-Dihydrochlorid in Form eines Niederschlags anfallen. Dieses anfallende Salz weist eine spezifische optische Drehung (⁶Oc/,^ von +15*8 (C = 2, 6n HCl) auf. Nach der ^kristallisation aus Wasser/ Methanol weist das gereinigte Produkt eine spezifische optische Drehung von +19»2 auf.

Mit der "beschriebenen Säule wird das genannte Trennverfahren im Verlauf von 15 Tagen insgesamt zehnmal wiederholt, wobei jeweils der gleiche Durchsatz stattfindet. Im Verlauf dieser Zeitspanne bleibt die spezifische optische Drehung des anfallenden Niederschlags unverändert, obwohl der mittels der Ninhydrin-Reaktion festgestellte Umwandlungsgrad schließlich bis auf eine Umwandlung von 30 % des eingesetzten DL-Ausgangsgemisches abnimmt.

Beispiele 6-10:

Das verwendete Enzym wird nach verschiedenen Verfahren immobilisiert, wie das der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen ist; mit den erhaltenen immobilisierten Enzymen wird DL-Lysinmethylester-Dihydrochlorid in die optischen Antipoden getrennt. Die Maßnahmen zur Durchführung der Trennung und die erhaltenen Produkte sind ebenfalls in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt; darüberhinaus erfolgt die Immobilisierung, die Bestimmung des Anteils an gebundenem Enzym, die Ausfällung des L-Lysin-Dihydrochlorid und die Umkristallisierung des Niederschlags nach den gleichen Verfahren, wie sie

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oben in den Beispielen 1 bis 5 angegeben sxnd.

O CC OC

Beispiel Nr.

Träger

Immobilisierung des Enzyms

Enzy^mg) Verfahrenspro 1 g Ehrung
Träger

Reaktionstempe ratur (⁸C)

Reaktions- dauer (min)

Duorit A-4 Azid-Verfahren

Sephalose 4B Bromcyanid-Verf,

Duorit A-6 s-Triazin-Verf.

Duorit A-7 s-Triazin-Verf.

Duorit S-37 s-Triazin-Verf.

55
40
87
83
223

absatzweise 30

in der Säule 40

absatzweise 30

in der Säule 40

absatzweise 40

	Menge Substrat	Ester konzen	Spez.Drehung	Spez.Drehung	Spez.Drehung	ro	PO OD I
Durch setz	lösung	tration	(ö< ) c». des	f &£. 1 Hqb / C Λ C "	CtOc4C des	+ 18,8 .ρ*.
(1/Std.)	(ml)	(%)	ersten Nieder	Rückstandes nach	umkristallisier	CD
			schlags	Einengung des	ten Niederschlags	+19,9 CO
			(C = 2, 6n HCl)	Filtrats	(C = 2, 6n HCl)	+18,3 CO
				(C = 2, 6n HCl)		+ 20,0
	40	10	+ 18,7	-8,7
-	50	10	+ 15,2	-5,7
9,0
	50	10	+ 18,1	-9,5
	50	20	+ 13,8	-4,6
12,5	50	20	+ 17,2	-9.1
-

Claims (20)

1. Patentansprüche:

   M. [Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder dessen Saureadditionssalze aus DL-Lysinalkylestern oder deren Saureadditionssalze,
   dadurch gekennzeichnet, daß

   eine wässrige Lösung der DL-Lysinalkylester oder deren Saureadditionssalze unter schwach sauren Bedingungen mit einer nicht-spezifischen Protease zusammengebracht wird, welche DL-Lysinalkylester oder deren Saureadditionssalze in die optischen Antipoden zu trennen vermag

   München: R. Kramer Dipl.-Ing. . W. Weser Dipl.-Phys. Dr. (er. nat. · P. Hirsch Dipl.-Ing. · H. P. Brehm Dipl.-Chem. Dr. phil. nat. Wiesbaden: P. G. Blumbach Dipl.-Ing. . P. Bergen Dipl.-Ing. Dr. jur. . G. Zwirner Dipl.-(ng. Dipl.-W.-Ing.

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   und von Bakterien der Gattung Streptomyces erzeugt worden ist; und

   das dabei gebildete L-Lysin oder dessen Säureadditionssalze abgetrennt und isoliert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

   die nicht-spezifische Protease von Bakterien erzeugt worden ist, die zu einem der nachfolgenden Stämme gehören, nämlich Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae, Streptomyces erythreus, Streptomyces rimosus oder Streptomyces flavovirens.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

   das Zusammenbringen der wässrigen Lösung mit der nichtspezifischen Protease beendet wird, bevor die Gesamtmenge an L-Lysinalkylester oder dessen Säureadditionssalze verbraucht worden ist.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß

   das Zusammenbringen der wässrigen Lösung mit der nichtspezifischen Protease beendet wird, nachdem 60 bis 90 % des L-Lysinalkylesters oder dessen Säureadditionssalze verbraucht worden sind.

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5. 5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 his 4-, dadurch gekennzeichnet, daß

   während des Zusammenbringens der wässrigen Lösung mit der nicht-spezifischen Protease der pH-Wert bei etwa 5»7 gehalten wird.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß

   die Alkylgruppe der DL-Lysinalkylester 1 bis 6 Kohlenstoff atome aufweist.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß

   die Alkylgruppe der DL-Lysinalkylester 1 bis 4· Kohlenstoff atome aufweist.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß

   die Alkylgruppe der DL-Lysinalkylester 1 oder 2 Kohlenstoff atome aufweist.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß

   die Konzentration der DL-Lysinalkylester oder deren Säureadditionssalze in der wässrigen Lösung zwischen 100 und 500 mg/ml gehalten wird.

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10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß

    in der wässrigen Lösung zusätzlich ein neutrales Salz oder Salze mit Pufferwirkung vorgesehen werden, um den pH-Wert des Reaktionsgemisches zu steuern.
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,

    dadurch gekennzeichnet, daß

    das Zusammenbringen der wässrigen Lösung mit der nichtspezifischen Protease bei einer Temperatur unterhalb 60°C durchgeführt wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur zwischen 20 und 45 C gehalten wird.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß

    die wässrige Lösung nicht-wässrige, mit Wasser mischbare Lösungsmittel enthält.
14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine nicht-spezifische Protease verwendet wird, die an einem festen Träger immobilisiert ist.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 14,

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    dadurch gekennzeichnet, daß

    die Protease über eine kovalente Bindung an dem festen

    Träger angebracht ist.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß

    das Zusammenbringen der wässrigen Lösung mit der immobilisierten nicht-spezifischen Protease absatzweise durchgeführt wird.
17. 17· Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß

    das Zusammenbringen der immobilisierten nicht-spezifischen Protease mit der wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von 5,0 bis 7,0 durchgeführt wird.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß

    das Zusammenbringen der immobilisierten nicht-spezifischen Protease mit der wässrigen Lösung in kontinuierlicher Form durchgeführt wird, nämlich unter Verwendung einer oder mehrerer Säulen, innerhalb der die immobilisierte Protease angeordnet ist.
19. 19· Verfahren nach Anspruch 18,
    dadurch gekennzeichnet, daß
    die der Säule zugeführte wässrige Lösung einen pH-Wert

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    von 5,0 bis 7,0 aufweist.
20. 20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß

    in der wässrigen, der Säule zugeführten Lösung Salze mit Pufferwirkung enthalten sind.

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