DE68912504T2 - Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver beta-Halomilchsäure oder Glycidsäure. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver beta-Halomilchsäure oder Glycidsäure.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein effizientes Verfahren zur Synthese einer optisch aktiven β-Halogen-milchsäure oder optisch aktiven Glycidsäure, von denen jede ein wertvolles Zwischenprodukt zur Synthese von Arzneimitteln darstellt.
    • Hintergrund der Erfindung
  • β-Halogen-milchsäuren und Glycidsäure sind wichtig als Zwischenprodukte zur Synthese einer Vielzahl von Arzneimitteln, z.B. Leukotrienen, Prostaglandinen, β-Blockern und Carnitin. In der Vergangenheit sind die meisten synthetischen Arzneimittel in ihrer racemischen Form verwendet worden, aber nicht in ihrer optisch aktiven Form. In jüngster Zeit wurde jedoch gefunden, daß verschiedene Arzneimittel nur in ihrer optisch aktiven Form pharmazeutisch wirksam sind, während sie in ihrer racemischen Form pharmakologisch unwirksam sind. Z. Zt. besteht bei der Suche nach pharmakologisch wirksamen Verbindungen eine zunehmende Tendenz zur Synthese optisch aktiver Verbindungen. Aus dem Stand der Technik ist es jedoch allgemein bekannt, daß es sehr schwierig ist, optisch aktive Verbindungen mittels konventioneller organischer Syntheseverfahren zu synthetisieren, die im allgemeinen nur zu racemischen Produkten führen.
  • Bei der Herstellung optisch aktiver synthetischer Arzneimittel ist es eine häufige Praxis, eine optisch aktive Verbindung in einer Zwischenstufe der Synthese herzustellen oder zu isolieren und das Endprodukt daraus abzuleiten. Das ist auch bei β-Halogen-milchsäuren und Glycidsäure der Fall, die wichtige Zwischenprodukte in der Arzneimittelsynthese darstellen, und es wurden Versuche unternommen, um optisch aktive β-Halogen-milchsäuren und optisch aktive Glycidsäure herzustellen. In einem Verfahren [Verfahren (a)], über das von Hirschbein et al. [B. L. Hirschbein und G. M. Whitesides: J. Am. Chem. Soc., 104, 4458 (1982)] berichtet wurde, wird z.B. optisch aktive Glycidsäure synthetisiert durch Reduzieren von Chlorbrenztraubensäure in Gegenwart von Lactat-Dehydrogenase und Behandeln der erhaltenen β-Chlor-milchsäure mit Kaliumhydroxid zur Cyclisierung.
  • In einem anderen Verfahren [Verfahren (b)], über das Ohashi et al. [T. Ohashi und J. Hasegawa: Yuki Gosei Kagaku Kyokai Shi (J. Synth. Org. Chem., Japan), 45, 331 (1987); JP-A-61-268197 (der Ausdruck "JP-A", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine "ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung"): J. Ferment. Technol., 64, 251 (1986)] wird 3-Chlor-1,2-propandiol mikrobiell oxidiert, gefolgt von einer Cyclisierung durch Behandlung mit Kaliumhydroxid, wie von Hirschbein et al. beschrieben.
  • Es ist ebenfalls allgemein bekannt, daß 2-Halogen-Säuredehalogenase die Umwandlung einer L-2-Halogen-Säure in die entsprechende D-Hydroxy-Säure katalysiert [J. Biol. Chem., 243, 428 (1968); J. Eur. Biochem., 21, 99 (1971); Agric. Biol. Cheirt., 46, 837 (1982); JP-A-53-125690 und JP-A-57-125691]. Insbesondere die Herstellung von D-milchsäure aus L-Chlorproprionsäure kann vom industriellen Standpunkt aus ein effektives Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Milchsäure sein.
  • Eine weitere Methode, die zur Herstellung von optisch aktiver Milchsäure bekannt ist, geht von racemischer Chlorpropionsäure aus und verwendet 2-Halogen-Säuredehalogenase, die auf L-2-Halogen-Säure und D-2-Halogen-Säure wirkt (JP-A-59-31690). Es ist nicht bekannt, ob eine α,β-Dihalogen-propionsäure, die nicht nur am Kohlenstoffatom in α-Stellung, sondern auch am Kohlenstoffatom in β-Stellung halogeniert ist, nur am Kohlenstoffatom in α-Stellung einer Dehalogenierung unterliegt.
  • Das vorstehende Verfahren (a) ist insofern nachteilig, weil ein teures Coenzym, nämlich NADH, verwendet werden muß. Deshalb kann das Verfahren kein kommerzielles Verfahren zur Synthese einer optisch aktiven β-Halogen-milchsäure oder optisch aktiven Glycidsäure werden. Um diesen Nachteil zu überwinden, wurde ein Verfahren vorgeschlagen, das Glucose-6-phosphatdehydrogenase verwendet, oder, in anderen Worten, ein Coenzym-Reproduktionssystem in Konjugation. Dieses Verfahren hat jedoch bisher keine befriedigenden wirtschaftlichen Wirkungen erbracht, und ist außerdem insofern nachteilig, weil die zwei Enzyme und das Coenzym NADH im Reaktionssystem nebeneinander vorhanden sind, was das Reaktionssystem sehr kompliziert macht.
  • Das Verfahren (b) weist das Coenzym-Regenerationsproblem nicht auf, aber ist nachteilig, weil die Ausbeute eine niedrige, nämlich 10 bis 28 % ist.
  • Als Schlußfolgerung kann keines der bekannten Verfahren oder Methoden als ein kommerziell vorteilhafter Weg zur Herstellung einer optisch aktiven β-Halogen-milchsäure oder optisch aktiven Glycidsäure angesehen werden.
  • Obgleich es, wie vorstehend erwähnt, bekannt ist, daß 2-Halogen-Säuredehalogenase bei 2-Halogen-Säuren eine Dehalogenierung hervorruft, lehrt der Stand der Technik nichts über eine selektive Dehalogenierung von α,β-Dihalogen-propionsäuren in α-Stellung.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegenden Erfinder haben, um ein Verfahren zur Synthese einer optisch aktiven β-Halogen-milchsäure oder optisch aktiven Glycidsäure bereitzustellen, das mit geringen Kosten auf industriell vorteilhafte Weise durchgeführt werden kann, und zu einer hohen optischen Reinheit führt, intensive Forschungen durchgeführt und als Ergebnis gefunden, daß diese Aufgabenstellung gelöst werden kann, wenn 2-Halogen-Säuredehalogenase zur Synthese optisch aktiver β-Halogen-milchsäuren oder optisch aktiver Glycidsäure augehend von α,β-Dihalogen-propionsäuren verwendet wird. Die vorliegende Erfindung beruht auf dieser Erkenntnis.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Synthese optisch aktiver β-Halogen-milchsäuren bereitgestellt, das umfaßt: Einwirkenlassen von 2-Halogen-Säuredehalogenase auf eine α,β-Dihalogen-propionsäure unter Bedingungen, daß der pH-Wert 9 nicht übersteigt; ein Verfahren zur Synthese optisch aktiver Glycidsäure, umfassend das Einwirkenlassen von 2-Halogen-Dehalogenase auf eine α,β-Dihalogen-propionsäure unter Bedingungen, bei denen der pH-Wert 9 übersteigt; und ein Verfahren zur Synthese optisch aktiver Glycidsäure, umfassend die Umsetzung der auf vorherstehende Weise erhaltenen optisch aktiven β-Halogen-milchsäure mit einem Alkali in einem Lösungsmittel.
  • Die erfindungsgemäßen Auswirkungen sind weitreichend. So können optisch aktive β-Halogen-milchsäuren und optisch aktive Glycidsäure, die wichtige Zwischenprodukte für die Arzneimittelsynthese sind, auf effiziente Weise aus billigen Ausgangsmaterialien synthetisiert werden. Die hohen Produktionskosten, geringen Ausbeuten und komplizierten Verfahrensstufen, die mit den enzymatischen Verfahren des Standes der Technik verbunden sind, werden vermieden.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Als Beispiele für erfindungsgemäß verwendete α,β-Dihalogen-propionsäure können genannt werden α,β-dihalogenierte Propionsäuren wie z.B. Dichlor-propionsäure, Dibrom-propionsäure und Dijod-propionsäure, die kommerziell erhältlich sind.
  • Die vorstehenden, von billiger Acrylsäure abgeleiteten Halogenierungsprodukte können auch als Ausgangsmaterialien bei der praktischen Durchführung der Erfindung verwendet werden.
  • Das erfindungsgemäß verwendete Enzym 2-Halogen-Säuredehalogenase umfaßt Enzyme, die allgemein unter der Klasse E.C. 3.8.1. klassifizierbar sind, die dazu fähig sind, Dehalogenierung in α-Stellung von Halogen-substituierten Carbonsäuren zu katalysieren. Solche Enzyme können aus Pilzen oder Bakterien erhalten werden, z.B. aus Pilzen der Gattung Trichoderma, Acrostalagmus, Penicillium oder Cronostachys, oder Bakterien der Gattung Pseudomonas, Arthrobacter, Rhizobium, Agrobaterium, Bacillus, Alcaligenes, Nocardia, Micrococcus, Achromobacter oder Moraxella.
  • Insbesondere von Pseudomonas putida 109 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnr. FERM P-10262; nach Umwandlung in eine Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag FERM BP-2631) abgeleitete 2-Halogen-Säuredehalogenase wirkt nur auf die L-Porm von α,β-Dihalogen-propionsäure, hat eine hohe Spezifität und ist sehr wirksam (nachfolgend als "L-2-Halogen-Säuredehalogenase" bezeichnet). Dieser Stamm wurde aus einer trockenen Feldbodenprobe, die in Uji City, Kyoto, Japan, eingesammelt wurde, durch Anreicherungskultivierung in Teströhrchen isoliert unter Verwendung eines Mediums, das 0,3 G/V% α-Chlor-propionsäure als einzige Kohlenstoffquelle zusammen mit 0,5 G/V% Ammoniumsulfat, 0,1 G/V% Monokaliumphosphat und 0,1 G/V% Dinatriumphosphatdodecahydrat (pH = 7,0) enthielt. Von Pseudomonas sp. UK 113 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnr. FERM P-5666; nach Umwandlung in eine Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag FERM BP-2626) abgeleitete 2-Halogen-Säuredehalogenase hat die Eigenschaft, daß sie sowohl auf die D-Form und die L-Form von α,β-Dihalogen-propionsäure wirkt (nachfolgend als "D,L-2-Halogensäure-Dehalogenase" bezeichnet). Dieser UK 113-Stamm wurde auf gleiche Weise wie der vorherstehende 109-Stamm isoliert.
  • In einer erfindungsgemäßen Ausführungform kann eine optisch aktive β-Halogen-milchsäure, insbesondere D-β-Halogen-milchsäure, synthetisiert werden, indem man z.B. eine α,β-Dihalogen-propionsäure in einem Puffer löst, und diese Lösung mit L-2-Halogensäure-Dehalogenase, oder Bakterien- oder Pilz-Zellen, die L-2-Halogen-Säuredehalogenase enthalten, mischt, vorzugsweise in einer Menge von 10 Einheiten/g nasser Zellen oder mehr. Geeignete Puffer sind z.B. Citrat, Acetat, Phosphat, Tris, Imidazol, Collidin, Barbital, Carbonat und Borat-Puffer in einer Konzentration von 10 bis 500 mM, vorzugsweise von 20 bis 200 mM.
  • Die α,β-Dihalogen-propionsäurekonzentration (mM) liegt vorteilhafterweise im Bereich von 0,1 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 500, insbesondere 50 bis 300.
  • Die Menge an L-2-Halogen-Säuredehalogenase, die erforderlich ist, kann abhängig von der Menge an α,β-Dihalogen-propionsäure und von der Zeit, die zur Vervollständigung der Reaktion zur Verfügung steht, abhängen. Zur Umwandlung von 100 Millimol α,β-Dihalogen-propionsäure in die entsprechende D-β-Halogen-milchsäure in 8 Stunden sind z.B. ca. 210 Einheiten L-2-Halogen-Säuredehalogenase ausreichend. Um die Reaktionszeit zu verkürzen, wird die Menge des verwendeten Enzyms umgekehrt proportional zur Reaktionszeit erhöht. Der Ausdruck "1 Einheit", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine zur Umwandlung aus 1 umol α,β-Dichlor-propionsäure in β-Chlor-milchsäure während 1 Minute bei 30ºC verwendete Enzymmenge, die durch konventionelle Verfahren gemessen werden kann.
  • Wenn die Reaktion unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen der pH-Wert 9 übersteigt, wird Glycidsäure zusammen mit der β-Halogen-milchsäure angereichert. Deshalb wird der pH-Wert auf einen Wert von nicht höher als 9, vorzugsweise innerhalb des Bereichs von 7 bis 9, z.B. unter Verwendung eines pH-Stats, eingestellt. Es ist zweckmäßig, die Reaktion bei einer Temperatur von 10ºC bis 70ºC, vorzugsweise 20ºC bis 50ºC, insbesondere von 30ºC bis 40ºC, durchzuführen.
  • Auf diese Weise wird eine D-β-Halogen-milchsäure-enthaltende wäßrige Lösung erhalten. Die D-β-Halogen-milchsäure kann aus der wäßrigen Lösung isoliert werden, z.B. durch Einstellen des pH-Wertes der D-β-Halogen-milchsäure-enhaltenden wäßrigen Lösung auf einen Bereich von 1 bis 4, wenn erforderlich, unter Zugabe eines anorganischen Salzes, wie z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Natriumnitrat oder Kaliumbromid bis zur Sättigung, Extraktion der D-β-Halogen-milchsäure aus der wäßrigen Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Ethylacetat, Ether, Methylenchlorid, Chloroform oder Methylpropionat auf konventionelle Weise, und Trocknen und Aufkonzentrieren des Extraktes auf konventionelle Weise, um D-β-Halogen-milchsäure als Feststoff zu ergeben.
  • Optisch aktive Glycidsäure, insbesondere D-Glycidsäure, kann in einer Stufe hergestellt werden, indem man z.B. nach dem gleichen vorstehend beschriebenen Verfahren für D-β-Halogen-milchsäure arbeitet, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert des Reaktionssystems auf einen Wert von größer als 9, vorzugsweise von 9,5 bis 11, eingestellt wird. Zur Erhöhung der Umwandlungsrate in Glycidsäure ist es auch möglich, das Verfahren in zwei Stufen durchzuführen. In einer ersten Stufe wird β-Halogen-milchsäure aus α,β-Dihalogen-propionsäure auf gleiche Weise wie vorstehend angegeben erhalten und in der zweiten Stufe wird die resultierende optisch aktive β-Halogen-milchsäure in die optisch aktive Glycidsäure auf die nachstehende Weise überführt. In der zweiten Verfahrensstufe kann optisch aktive D-Glycidsäure erhalten werden, indem man eine optisch aktive D-β-Halogen-milchsäure, die als Feststoff in der vorstehend angegebenen Weise mit einem Alkali, wie z.B. Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid oder Lithiumhydroxid isoliert wurde, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. einem Alkohol (z.B. Methanol, Ethanol), einem Amid (z.B. Dimethylformamid (DMF)) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) umsetzt. Die Überführungsreaktion von β-Halogen-milchsäure in Glycidsäure wird auf konventionelle Weise durchgeführt, z.B. wie in N. F. Blau, J. W. Johnson und C. G. Struckwish J. Am. Chem. Soc., 76, 5106-5107 (1954) beschrieben.
  • Die in der obigen Reaktion verwendete Alkalikonzentration sollte zweckmäßigerweise innerhalb des Bereichs von 0,1 bis 20 Mol pro Liter, vorzugsweise 0,5 bis 10 Mol pro Liter Lösungsmittel, und insbesondere 1 bis 5 Mol pro Liter Lösungsmittel, liegen.
  • Die D-β-Halogen-milchsäure kann zum Reaktionssystem kontinuierlich, tropfenweise oder auf einmal zugegeben werden. Dabei sollte die Temperatur zweckmäßigerweise im Bereich von -50ºC bis 30ºC, vorzugsweise -30ºC bis 10ºC, insbesondere -20ºC bis 0ºC liegen. Nach Vervollständigung der β-Halogen-milchsäurezugabe sollte die Temperatur zweckmäßigerweise im Bereich von -30ºC bis 50ºC, vorzugsweise -20ºC bis 30ºC, und insbesondere -5ºC bis 20ºC gehalten werden.
  • Die so erhaltene Reaktionsmischung wird auf konventionelle Weise filtriert. Der Überstand enthält die gewünschte optisch aktive D-Glycidsäure.
  • Bei der praktischen Durchführung der Erfindung ist es auch möglich, L-β-Halogen-milchsäure und L-Glycidsäure zu synthetisieren, oder getrennt die L-Form und die D-Form einer β-Halogen-milchsäure, oder die L-Form und D-Form von Glycidsäure, z.B. nach den folgenden Verfahren.
  • Eine α,β-Dihalogen-propionsäure in racemischer Form wird als Ausgangsmaterial verwendet, und die entsprechende β-Halogen-milchsäure in der optisch aktiven D-Form oder Glycidform in der optisch aktiven D-Form wird zunächst unter Verwendung von L-2-Halogen-Säuredehalogenase, abgeleitet von Pseudomonas putida 109, die bei der Überführung von α,β-Dihalogen-propionsäuren nur in der L-Form wirksam ist, hergestellt.
  • Die optisch aktive D-Form einer β-Halogen-milchsäure, die optisch aktive D-Form von Glycidsäure und die unumgesetzte α,β-Dihalogen-propionsäure werden aus der Reaktionslösung auf konventionelle Weise, z.B. unter Verwendung eines Anionenaustauschharzes, wie z.B. von Dowex 1, Dowex WSG, Dowex MWA-1, Amberlite IRA-410, Amberlite IRA-45, DEAE-Cellulose, DEAE-Sephacel usw., abgetrennt. Wenn z.B. Amberlite IRA-45 verwendet wird, wird die D-β-Halogen-milchsäure zuerst mit 0,1 NH&sub4;Cl eluiert, und dann D-α,β-Dihalogen-propionsäure. Dann wird die D,L-2-Halogen-Säuredehalogenase abgeleitet von Pseudomonas so. UK 113, die auf die Überführung von α,β-Dihalogen-propionsäuren in sowohl die D- als auch die L-Formen wirkt, der D-Form von α,β-Dihalogen-propionsäure, die unter den gleichen Bedingungen wie im Fall der Herstellung von D-β-Halogen-milchsäure unter Verwendung von L-2-Halogen-Säuredehalogenase abgetrennt wurde, zugegeben, wobei die optisch aktive L-Form der β-Halogen-milchsäure oder Glycidsäure erhalten werden kann.
  • Bei der praktischen Durchführung der Erfindung kann L-2-Halogen-Säuredehalogenase und D,L-2-Halogen-Säuredehalogenase in Form eines gereinigten Enzyms, einer rohen Enzymlösung oder von Mikrobenzellen, die es enthalten, verwendet werden. Es ist auch möglich, das Enzym in Form eines auf einem makromolekularen Träger immobilisierten Enzyms oder in vernetzter, wasserunlöslicher Form zu verwenden, wie z.B. in den US-Patenten 4 797 358, 4 794 083 und 4 783 409 beschrieben. Als geeignete Beispiele für den makromolekularen Träger können genannt werden Gelatine, Polysaccharide und Derivate davon, wie z.B. Cellulose, Dextran und Agarose, Vinylpolymere und Derivate davon, wie z.B. Polystyrol, Ethylen-Maleinsäure-Copolymere und vernetzte Acrylpolymere, Polyaminosäuren oder Polyamidderivate, wie z.B. L-Alanin-L-glutaminsäure-Copolymere und Polyasparaginsäure, und anorganische Materialien, wie z.B. Glas, Aluminiumoxid, Hydroxyapatit und Celit. Das Enzym kann an solche makromolekulare Träger gebunden, eingeschlossen oder adsorbiert vorliegen.
  • Zur Vernetzung wird ein zweiwertiges Reagens, wie z.B. Glutaraldehyd, Diisocyanat (z.B. Hexamethylendiisocyanat, Toluoldiisocyanat oder Hexamethylendiisothiocyanat) oder Bisazobenzidin, mit dem Enzym in gereinigter Form, als roher Lösung oder in Form von Mikrobenzellen vermischt, wie z.B. im US-Patent 4 798 793 beschrieben, und die Vernetzungsreaktion wird durchgeführt.
  • Die immobilisierte oder vernetzte Form des Enzyms, wie sie z.B. vorstehend erwähnt wurde, kann für die beabsichtigte Synthese wiederholt verwendet werden, und außerdem macht sie es möglich, das Verfahren nicht nur ansatzweise, sondern auch kontinuierlich in einer Säule durchzuführen. Insbesondere wenn eine Säule verwendet wird, kann eine optisch aktive β-Halogen-milchsäure oder optisch aktive Glycidsäure sehr vorteilhaft kontinuierlich synthetisiert werden. In diesem Fall können die obigen Ansatzbedingungen auch für die kontinuierliche Verfahrensweise verwendet werden und die Lösung des Ausgangsmaterials kann in die Säule entweder an ihrem oberen Ende oder an ihrem Boden zugeführt werden. Die Durchflußrate kann abhängig von der Säulengröße und der Packung (immobilisiertes oder vernetztes Enzym oder Zellen) variieren. In einem typischen Beispiel, in dem 500 ml Säule mit immobilisierten und mittels Gelatine und Glutaraldehyd vernetzten Mikrobenzellen beschickt sind, sollte die Durchflußrate zweckmäßigerweise innerhalb des Bereichs von 0,5 ml bis 20 ml pro Minute, vorzugsweise 1 bis 10 ml pro Minute, insbesondere 2 bis 5 ml pro Minute betragen.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.
    • Beispiel 1
  • 20 Liter eines wäßrigen Mediums, das 0,5 % (Gew.-%) (nachfolgend trifft immer das gleiche zu) Ammoniumsulfat, 0,1 % Monokaliumphosphat, 0,1 Dinatriumphosphat, 0,01 % Magnesiumsulfat, 0, 0005 % Eisen(II)-sulfat, 0,0005 % Calciumhydroxid, 0,0001 % Mangansulfat, 0,0001 % Natriummolybdat und 0,3 % α,β-Dichlor-propionsäure, eingestellt auf pH = 7,0, wurde mit Pseudomonas putida 109 (FERM BP-2631) (ca. 2 g nasse Zellen) inokuliert, und die Kultivierung wurde bei 30ºC während 50 Stunden durchgeführt.
  • Die so gewachsenen Zellen wurden durch Zentrifugieren (8000 U.p.M.) während 15 Minuten isoliert und durch Beschallung (insonator model 200M, hergestellt von KUBOTA; Ltd., 1.5A) während 10 Minuten zerstört. Zum resultierenden Fluid wurde Ammoniumsulfat bis zur 40%igen Sättigung zugegeben. Der Niederschlag wurde dann entfernt. Zum Überstand wurde Ammoniumsulfat bis zur 70%igen Sättigung zugegeben. Der resultierende Niederschlag wurde gewonnen und in 25 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,5) gelöst. Die Lösung wurde 12 Stunden lang dialysiert und dann auf eine DEAE-Sephacel-Säule (6x50cm; hergestellt von Pharmacia) aufgebracht. Entwicklung/Elution wurde unter Verwendung von Phosphatpuffer (pH = 7,5) durchgeführt, wobei die Phosphatkonzentration von 50 mM bis 500 mM gemäß einer linearen gradienten Elutionsmethode variiert wurde. Die aktiven Eluatfraktionen wurden vereinigt, Ammoniumsulfat bis zur 70%igen Sättigung zugegeben, und der Niederschlag eingesammelt, gegen Phosphatpuffer 8pH = 7,5) in einer Konzentration von 50 mM 12 Stunden lang dialysiert, und auf eine Hydroxyapatitsäule (Biogel HR , hergestellt von Bio-Rad, Säulengröße: 4 cm∅ x 35 cm), die mit 5 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,5) pre-equilibriert war, appliziert. Entwicklung/Elution wurde mit 5 mM bis 100 mM Phosphatpuffer gemäß einem linearen gradienten Elutionsverfahren durchgeführt. Die Aktivfraktionen wurden vereinigt und auf die gleiche Weise wie vorstehend angegeben einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat unterworfen. Die Aktivfraktionen wurden auf eine Sephadex G-150 Säule (3 x 130 cm; hergestellt von Pharmacia), pre-equilibriert mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,5) appliziert und mit dem gleichen Puffer eluiert, und ergaben gereinigte L-2-Halogen-Säuredehalogenase.
  • 20 Einheiten des so gereinigten Enzyms wurden zu 30 ml 50 mM Carbonatpuffer (pH = 8,5), der 10 mg α,β-Dichlor-propionsäure (racemische Form) enthielt, zugegeben, und die enzymatische Reaktion wurde bei 30ºC während 10 Stunden ablaufen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde zur Wiedergewinnung des Enzyms einer Ultrafiltration unterworfen, das Filtrat wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von ca. 1. eingestellt, und Natriumchlorid wurde bis zur Sättigung zugegeben, und die resultierende Mischung wurde mit drei 300 ml-Portionen Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und dann zur trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus einer 1:9 (Volumen)-Mischung aus Tolol und Benzol umkristallisiert und ergab 2,8 mg D-β-Chlor-milchsäure als weiße Nadeln.
  • Die Elementaranalyse dieser Kristalle ergab die folgenden Ergebnisse: C, 28,93 %; H, 4,00 %; Cl, 28,44 %. Unter der Annahme, daß die Hälfte der verwendeten racemischen α,β-Dichlor-propionsäure in der L-Form vorlag, betrug die Ausbeute an D-β-Chlor-milchsäure 64 %. Eine Fraktionsbestimmung der obigen Kristalle unter Verwendung von D-Lactat-Dehydrogenase und L-Lactat-Dehydrogenase ergab für die D-β-Chlor-milchsäure eine optische Reinheit von 94 %, die wie folgt berechnet wurde:
  • Optische Reinheit (%) = [(D-β-Chlor-milchsäure - L-β-Chlor-milchsäure) / (D-β-Chlor-milchsäure + L-β-Chlor-milchsäure)] x 100
    • Beispiel 2
  • Ein flaches Ultrafiltrationsgefäß vom Membran-Typ (hergestellt von Millipore) wurde über Schläuche mit zwei Einläßen eines dreihalsigen enzymatischen Reaktionsgefäßes aus Glas (Kapazität 150 ml) verbunden. Dieses System wurde mit 150 ml 50 mM Tris-Sulfatpuffer (pH = 8,5) beschickt, der mit einer Geschwindigkeit von 5 Litern pro Stunde zirkulierte, während das Reaktionsgefäß auf einem Wasserbad bei 30ºC gehalten wurde.
  • L-2-Halogen-Säuredehalogenase (100 Einheiten), gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde durch den dritten Einlaß dem Reaktionsgefäß zugegeben. Der dritte Einlaß war außerdem mit einem Rohr versehen, und eine 50 mM-Lösung von α,β-Dichlor-propionsäure (racemische Form) gelöst in 3,5 l des gleichen Puffers wie der zirkulierende Puffer, gelagert bei 4ºC, wurde durch das Rohr mit einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml pro Stunde eingespeist.
  • Die D-β-Chlor-milchsäure-enthaltende Lösung, die die Ultrafiltrationsmembran passiert hatte, wurde kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 50 ml pro Stunde gewonnen und bei 4ºC gelagert. Diese Reaktion wurde ca. 3 Tage lang durchgeführt, wobei 3,2 Liter einer D-β-Chlor-milchsäure-enthaltenden Lösung erhalten wurden.
  • Diese Lösung wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 1 eingestellt, und dann Natriumchlorid bis zur Sättigung zugegeben, und die resultierende Mischung wurde mit mehreren Portionen Ethylacetat (insgesamt 5 Liter) extrahiert, und der gesamte Extrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur trockene eingedampft, und ergab rohe D-β-Chlor-milchsäure. Diese rohe D-β-Chlor-milchsäure wurde aus Benzol umkristallisiert und ergab 82 g D-β-Chlor-milchsäure als weiße Nadeln.
  • Die Elementaranalyse der Kristalle ergab die folgenden Ergebnisse: C, 28,91 %; H, 4,06 %; Cl 28,50 %. Die optische Reinheit der D-β-Chlor-milchsäure wurde bestimmt, indem man sie zur Methylierung mit Methanol umsetzte, und dann mit MTPA-Chloridreagens zur Überführung in ein MTPA-Derivat, und das Derivat einer ¹H NMR-Spectrometrie unterwarf. Als Ergebnis wurde die Reinheit mit 96 % gefunden.
  • Ein 50 g-Anteil der nach dem obigen Verfahren erhaltenen D-β-Chlor-milchsäure wurde in 100 ml Methanol gelöst, und die Lösung langsam tropfenweise zu einer Lösung von 50 g KOH in 500 ml Methanol in einem Kolben zugegeben. Dieses Verfahren wurde unter Eiskühlung durchgeführt, damit die Temperatur 10ºC nicht übersteigen konnte.
  • Nach Vervollständigung des Zutropfens wurde die Mischung bei Raumtemperatur (25ºC) ca. 3 Stunden lang gerührt. Das resultierende Kaliumchlorid wurde durch Filtration entfernt. Nach Entfernung des Methanols und Waschen mit eisgekühltem Methanol wurden 40,2 g Kalium-D-Glycidat erhalten. Die Ausbeute betrug 91 %.
  • Die optische Reinheit des Kalium-D-Glycidats wurde durch die gleiche vorstehend beschriebene Derivatisierung und nachfolgende ¹H NMR-Spectometrie bestimmt, und es wurde eine Reinheit von 88 % gefunden.
    • Beispiel 3
  • Der Bakterienstamm Pseudomonas UK 113 (FERM BP-2626) wurde in 20 Litern eines wäßrigen Mediums, das 0,3 % D,L-α,β-Dichlor-propionsäure, 0,5 Ammoniumsulfat, 0,1 % Monokaliumphosphat, 0,1 % Dinatriumphosphat und 0,01 % Magnesiumsulfat enthielt und auf pH = 7,0 eingestellt war, inokuliert und bei 30ºC ca. 50 Stunden lang kultiviert.
  • Die gewachsenen Zellen wurden durch Zentrifugation (8000 U.p.M.) während 15 Minuten gewonnen und in einer Dyno-Mühle (Typ DKL Willy A. Bachofen, hergestellt von Engineers, Glasperlengröße: 0,10 bis 0,20 mm∅) während 5 Minuten zerstört, um eine rohe Enzymlösung zu ergeben. Die D,L-2-Halogen-Säuredehalogenase wurde dann aus der rohen Enzymlösung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
  • D,L-α,β-Dichlor-propionsäure (0,05 Mol) wurde in 100 ml 50 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH = 8,5) gelöst. Zur resultierenden Lösung wurden zuerst 60 Einheiten L-2-Halogen-Säuredehalogenase, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, zugegeben und die Reaktion wurde bei 30ºC 24 Stunden lang durchgeführt, während der pH-Wert unter Verwendung eines pH-Staten mit 5 N NaOH bei 8,5 gehalten wurde.
  • Der pH-Wert wurde dann mit Chlorwasserstoffsäure auf 2 abgesenkt, und die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines Verdampfers auf konventionelle Weise eingedampft. D-α,β-Dichlor-propionsäure und D-β-Chlor-milchsäure wurden aus dem Konzentrat mit Ethylacetat auf konventionelle Weise extrahiert. Nach Entfernung des Ethylacetats auf konventionelle Weise unter Verwendung eines Verdampfers wurde die verbleibende Lösung auf eine Ameisensäure-equilibrierte Dowex 1-Säule (hergestellt von Muromachi Kagaku Kogyo; 5,0 x 50 cm) appliziert. D-β-Chlor-milchsäure wurde mit 0,5 M Ameisensäure eluiert, und dann D-α,β-Dichlor-propionsäure mit 2 M Ameisensäure. Die Ameisensäure wurde auf konventionelle Weise aus jeder Eluatfraktion unter Verwendung eines Verdampfers entfernt.
  • Die so konzentrierte D-α,β-Dichlor-propionsäure wurde unter Verwendung von Tris-Hydrochloridpuffer 8pH = 8,5) auf das 30fache verdünnt, die verdünnte Lösung wurde auf pH = 8,5 unter Verwendung von Natriumhydroxid eingestellt, 60 Einheiten D, L-2-Halogen-Säuredehalogenase wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 24 Stunden lang auf die gleiche umschriebene Weise durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Chlorwasserstoffsäure auf pH = 2 eingestellt und auf konventionelle Weise unter Verwendung eines Verdampfers zur trockenen eingedampft. Auf konventionelle Weise wurde aus dem getrockneten Feststoff L-β-Chlor-milchsäure mit Ethylacetat extrahiert.
  • Die so erhaltene D-β-Chlor-milchsäure bzw. L-β-Chlor-milchsäure wurden aus Benzol umkristallisiert, und ergaben 2,86 mg (23 Millimol) D-β-Chlor-milchsäure und 2,24 mg (18 Millimol) L-β-Chlor-milchsäure. Die Elementaranalyse der D-β-Chlor-milchsäure ergab die folgenden Ergebnisse:
  • C, 28,92 %; H, 3,99 %; Cl, 28,45 %. Die Ergebnisse der Elementaranalyse für L-β-Chlor-milchsäure waren die folgenden: C, 28,93 %; H, 4,01 %; Cl, 28,42%
  • Die Ausbeute an D-β-Chlor-milchsäure betrug 92 %, und die von L-β-Chlor-milchsäure 72 %. Die optische Reinheit der D-β-Chlor-milchsäure betrug 97 %, und die der L-β-Chlor-milchsäure 92 %.
  • 2 mg der nach dem obigen Verfahren erhaltenen D-β-Chlor-milchsäure wurden dann in 0,5 ml Methanol, das 0,1 g KOH enthielt, unter Eiskühlung gelöst, die Eiskühlung wurde dann unterbrochen, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur (25ºC) drei Stunden lang gerührt.
  • Das resultierende Kaliumchlorid wurde durch Zentrifugieren entfernt, dann wurde das Methanol entfernt, und es wurde mit auf ca. 0ºC gekühltem Methanol gewaschen. Auf diese Weise wurde Kalium-D-Glycidat erhalten.
  • Die L-β-Chlor-milchsäure wurde ebenfalls auf gleiche Weise in das Kalium-L-Glycidat überführt.
  • Die Ausbeute an Kalium-D-Glycidat und die an Kalium-L-Glycidat betrugen 95 % bzw. 96 %. Die gleiche in Beispiel 2 beschriebene Derivatisierung und die nachfolgende ¹H NMR-Spectrometrie ergaben, daß das Kalium-D-Glycidat das Kalium-L-Glycidat optische Reinheiten von 90 % bzw. 87 % besaßen.
    • Beispiel 4
  • Eine 10%ige Gelatinelösung (10 ml) wurde zu 60 g nasser Zellen von Pseudomonas putida 109 (FERM BP-2631) zugegeben. Die Mischung wurde geknetet und durch ein Drahtnetz hindurchgezwungen. Die granulare Zellmasse wurde in 5 % Glutaraldehyd bei 25ºC 4 Stunden lang eingetaucht, dann sorgfältig mit Wasser gewaschen und in eine Säule (20 mm Durchmesser, 250 mm Länge) eingefüllt.
  • Dann wurden 300 ml Boratpuffer (pH = 9,5), der 5 g α,β-Dibrom-propionsäure (racemische Form) enthielt, durch die Säule mit einer Durchfließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute hindurchgeführt. Die Säule wurde durch Zuführen von warmem Wasser (40ºC) zum Mantel der Säule bei einer konstanten Temperatur gehalten. Die resultierenden Eluatfraktionen wurden vereinigt und mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von ca. 4 eingestellt. Der resultierende Niederschlag wurde abfiltriert und 270 ml des Filtrats wurden auf eine Säule (Durchmesser 30 mm, Länge 500 mm) eines Anionenaustauschharzes (Dowex 1; hergestellt von Muromachi Kagaku Kogyo), equilibriert mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH = 4) appliziert. Die auf diese Weise adsorbierte, optisch aktive D-Glycidsäure wurde mit dem gleichen Puffer mit einem Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten, der durch Variierung der Natriumchloridkonzentration von 0 mM bis 100 mM in 50 mM Natriumacetatpuffer erhalten wurde, eluiert. Zur resultierenden D-Glycidsäurefraktion wurde Ether zugefügt und eine Extraktion durchgeführt. Verdampfung des Extraktes zur trockene ergab D-Glycidsäure.
  • Elementaranalyse für D-Glycidsäure ergab die folgenden Ergebnisse: C, 32,68%; H, 2,74%; K, 35,52%. Unter der Voraussetzung, daß die Hälfte der als Auszugsmaterial verwendeten α,β-Dibrom-propionsäure L-α,β-Dibrom-propionsäure war, wurde die Ausbeute mit 82 % berechnet. Die durch die gleiche wie in Beispiel 2 beschriebene Derivatisierung und ¹H NMR-Spectroskopie bestimmte optische Reinheit betrug 87 %.
  • Die Erfindung wurde ausführlich und unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon beschrieben; für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist daraus aber auch ableitbar, daß verschiedene Veränderungen und Abwandlungen gemacht werden können, ohne das Wesen und den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Claims (11)

1. Verfahren zur Synthese einer optisch aktiven β-Halogen-milchsäure, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer α,β-Dihalogen-propionsäure mit 2-Halogen-Säuredehalogenase unter Bedingungen, bei denen der pH-Wert 9 nicht übersteigt.
2. Verfahren zur Synthese einer optisch aktiven Glycidsäure, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer α,β-Dihalogen-propionsäure mit 2-Halogen-Säuredehalogenase unter Bedingungen, bei denen der pH-Wert 9 übersteigt.
3. Verfahren zur Synthese einer optisch aktiven Glycidsäure, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer α,β-Dihalogen-propionsäure mit 2-Halogen-Säuredehalogenase, und Umsetzung der so erhaltenen β-Halogen-milchsäure mit einem Alkali in einem Lösungsmittel.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die 2-Halogen-Säuredehalogenase L-2-Halogen-Säuredehalogenase ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die α,β-Dihalogen-propionsäure α,β-Dichlor-propionsäure, α,β-Dibrom-propionsäure oder Dijod-propionsäure ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die 2-Halogen-Säuredehalogenase eine mit bakteriellem oder Pilz-Ursprung ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die 2-Halogen-Säuredehalogenase abgeleitet ist von Pseudomonas putida 109 (FERM BP-2631) oder pseudomonas sp. UK 113. (FERM BP-2626).
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die 2-Halogen-Säuredehalogenase in Form eines gereinigten Enzyms, einer Roh- Enzymlösung, von Enzym enthaltenden mikrobiellen Zellen vorliegt, oder an einem makromolekularen Träger immobilisiert oder vernetzt ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß optisch aktive β-Halogen-milchsäure in der D-Form oder optisch aktive Glycidsäure in der D-Form zuerst durch Umsetzung unter Verwendung von L-2-Halogen-Säuredehydrogenase hergestellt werden, die optisch aktive β-Halogen-milchsäure in der D-Form oder optisch aktive Glycidsäure in der D-Form und eine optisch aktive α,β-Dihalogen-propionsäure in der D-Form aus der Reaktionslösung abgetrennt werden, und dann eine optisch aktive β-Halogen-milchsäure in der L-Form oder optisch aktive Glycidsäure in der L-Form durch Zugabe von D,L-2-Halogen-Säuredehalogenase zur optisch aktiven α,β-Dihalogen-propionsäure in der D-Form hergestellt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion in einem Puffer bei einer α,β-Dihalogen-propionsäurekonzentration von 0,1 bis 1000 mM durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion unter Verwendung einer Säule, die 2-Halogen-Säuredehalogenase in einer immobilisierten oder vernetzten Form enthält, durchgeführt wird.
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