DE68925002T2

DE68925002T2 - Verfahren zur Herstellung von optisch-aktiven alpha-substituierten organischen Säuren und Mikroorganismen und Enzyme, die dafür verwendet werden.

Info

Publication number: DE68925002T2
Application number: DE68925002T
Authority: DE
Inventors: Kazuhiko Oishi; Kazumasa Otsubo; Keizou Yamamoto
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1988-06-27
Filing date: 1989-06-27
Publication date: 1996-08-29
Anticipated expiration: 2009-06-28
Also published as: EP0348901A2; EP0348901B1; JPH0284198A; DK314989D0; DE68925002D1; EP0348901A3; JP2623345B2; DK314989A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven α-substituierten organischen Säure und eines Mikroorganismus und eines Enzymes, das dafür verwendet wird.
Optisch aktive α-substituierte organische Säuren, die mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, sind Verbindungen, die als pharmazeutisch aktive Substanzen nützlich sind, wie antipyretische, analgetische, antiphlogistische Mittel; sowie ihre Ausgangsstoffe, wie Antibiotika und β-Blocker; wie landwirtschaftliche Chemikalien, wie Herbizide und Insektizide oder ihre Ausgangsstoffe; sowie Ausgangsstoffe für Verbindungen, die überragende dielektrische Eigenschaften haben; und als optische Auflösungsreagenzien.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bekannte Verfahren zur Herstellung optisch aktiver α- substituierter organischer Säuren aus racemischen α- substituierten Nitrilen oder α-substituierten Amiden mittels biochemischer Wirkung von Mikroorganismen oder ihren Zubereitungen schließen solche Verfahren ein, die, zum Beispiel in der PCT Patentanmeldung Nr. 500004/1988 (WO 8607386) und in JP-A-60-188355 (US-Patent 4,812,403) offenbart sind (der Ausdruck "JP-A", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine "ungeprüfte veröffentlichte japanische patentanmeldung"). Diese Veröffentlichungen offenbaren auch, daß die Mikroorganismen, die für diese Verfahren verwendet werden, für die Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren aus Aminonitrilen oder Aminoamidsäuren verwendet werden.
Jedoch gibt kaum bekannte Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven α-substituierten organischen Säuren, außer Aminosäuren, aus den korrespondierenden racemischen Nitrilen oder Amiden mittels biochemischer Wirkung. Es sind nur Verfahren zur Herstellung optisch aktiver α-Oxysäuren aus α- Oxysäureamidverbindungen und speziellen Hydroxynitrilen bekannt. Es gibt nur drei bekannte Mikroorganismen, die für diese Verfahren verwendet werden. Dabei handelt es sich um ein Bakterium, das zur Gattung der Aeromonas gehört, einem Bakterium, das zur Gattung der Moraxella gehört und einer Hefe, die zur Gattung der Torulopsis gehört (siehe JP-A-61- 88894 und JP-B-54-14668 (der Ausdruck "JP-B", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine "geprüfte japanische Patentanmeldung")).
Die Herstellung von optisch aktiven α-substituierten Carbonsäuren aus verschiedenen α-substituierten Nitrilen oder Amiden ist kürzlich vorgeschlagen worden, vergleiche EP-A-0 344 044, EP-A-0 330 529 und EP-A-0 326 482. Die dort verwendeten Mikroorganismen sind jedoch auf nur 3 Stämmme beschränkt, vic Brevibacterium R312, Corynebacterium N771 und Corynebacterium N774 und diese Verfahren sind per se auf den Fall beschränkt, in dem eine enantioselektive Amidase verwendet wird.
Des weiteren beschreibt WO 86/07 386 ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminosäure oder eines Aminosäureamids der allgemeinen Formel R-CH(NH&sub2;)COX, das eine Aminogruppe in α-Stellung hat. Es gibt jedoch noch eine Nachfrage nach einem Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven α-substituierten organischen Säure, ohne eine Aminogruppe in α-Position.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver α-substituierter organischer Säuren zur Verfügung zu stellen, die als Ausgangssubstanzen in medizinischen, landwirtschaftlichen und industriellen Gebieten aus den korrespondierenden racemischen α-substituierten Nitrilen oder α-substituierten Amiden mittels der Wirkung von Mikroorganismen oder ihren Zubereitungen nützlich sind.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, die für das oben beschriebene Verfahren verwendet werden.
Die Erfinder haben Mikroorganismen entdeckt, die ausschließlich in der Lage sind diese optisch aktiven α- substituierten organischen Säuren zu bilden, um die oben beschriebenen Aufgaben zu lösen. Als Ergebnis haben die Erfinder Mikroorganismen gefunden, die in der Lage sind die racemischen α-substituierten Nitrile oder Amide, die durch die Formel (I) wiedergegeben werden, in die optisch aktiven α- substituierten organischen Säure umzuwandeln, die durch die Formel (II) wiedergegeben werden. Des weiteren ist gefunden worden, daß die optisch aktiven α-substituierten organischen Säuren, die mittels der Wirkung von Mikroorganismen gebildet werden, kaum racemisiert, zersetzt oder verwertet werden. Die vorliegende Erfindung ist auf der Basis dieser Feststellung vollendet worden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von einer aktiven organischen Säuren zur Verfügung, die durch die Formel (II) wiedergegeben werden, das (a) Behandeln eines racemischen α-substituierten Nitrils oder Amids der Formel (I) mit einem Mikroorganismus aus der durch Mikroorganismen der Gattung Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium sp. Stamm KO-2-4 (FERM BP- 2353), Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus und Candida oder ihren Zubereitungen gebildeten Gruppe ausgewählt wird; und
(b) Gewinnen der resultierenden optisch aktiven α- substituierten organischen Säuren umfaßt, die durch die Formel (II)
wiedergeben wird.
In Formel (I) bedeutet X eine Nitrugruppe oder eine Amidogruppe. In Formel (I) und (II) bedeuten R&sub1; und R&sub2; jeweils ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe, eine Cycloalkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Arylgruppe, eine Aryloxygruppe oder eine heterocyclische Gruppe mit der Maßgabe, daß die Gruppen R&sub1; und R&sub2; immer verschieden von einander sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Die Figur ist eine graphische Darstellung, die den Fortschritt der Herstellung von 2-(4'-Isobutylphenyl)propionsäure unter Verwendung gereinigter Nitrilase zeigt, worin die Ordinatenachse die Konzentration und die Abszissenachse die Reaktionszeit wiedergibt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird unten detaillierter diskutiert.
Beispiele für Halogene, die durch R&sub1; und R&sub2; in der Formel (I) und (II) wiedergeben werden, schließen Fluor, Chlor, Iod und Brom ein. Als Alkylgruppe Lind Alkoxygruppe sind solche bevorzugt, die 1 bis 8 Kohlenstoffatom haben und solche die 1 bis 3 Kohlenstoffatome haben sind besonders bevorzugt. Bevorzugte Beispiele für die Cycloalkylgruppe sind solche die 3 bis 8 Kohlenstoffatomen haben und solche, die 3 bis 6 Kohlenstoffatom haben, sind besonders bevorzugt. Beispiel der Arylgruppe schließen Phenyl und Naphtyl ein. Beispiele der Aryloxygruppe schließen Phenyloxy und Naphthyloxy ein.
Bevorzugte Beispiele der hetereocyclischen Gruppe sind solche, die ein oder mehrere Heteroatome haben, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt werden und die 3 bis 15 Kohlenstoffatome habe, besonders bevorzugt sind solche, die 1 bis 4 Heteroatome haben. Beispiel der heterocyclischen Gruppen schließen Thiophen, Indol,
ein.
Wasserstoffatome, die an Kohlenstoffatome der Alkylgruppe, Alkoxygruppe, Cycloalkylgruppe, Arylgruppe und Aryloxygruppe gebunden sind und Wasserstoffatome, die an Kohlenstoffatome und das Stickstoffatom der heterocyclischen Gruppe gebunden sind, können gegebenenfalls mit einer oder mehreren Substituentengruppen substituiert sein. Beispiele für geeignete Substituentengruppen schließen ein Halgenatom, wie Flour, Chlor, Iod und Brom, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Nitrogruppe, eine Aminogruppe, eine Arylgruppe (zum Beispiel eine Phenyl-, oder Naphthylgruppe), eine Aryloxygruppe (zum Beispiel Phenyloxy- oder Naphthyloxygruppe), eine heterocyclische Gruppe, die eines oder mehrere Heteroatome enthält, wie ein Stickstoffatom, ein Sauerstoffatom und ein Schwefelatom und 3 bis 15 Kohlenstoffatome hat, eine Alkylgruppe, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome hat, eine Alkoxygruppe, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome hat und eine Acylgruppe ein, die 1 bis 10 Kohlenstoffatom hat. Wasserstoffatome, die an die Kohlenstoffatome der oben beschriebenen Substituentengruppen gebunden sind und Wasserstoffatome, die an die Kohlenstoffatome und das Stickstoffatom der obigen heterocyclischen Gruppe gebunden sind, können weiter mit einer oder mehreren der oben beschriebenen Substituentengruppen substituiert sein. Falls irgendeines von R&sub1; und R&sub2; eine stark sterisch gehinderte Gruppe, wie ein Halogenatom, eine Arylgruppe, eine Aryloxygruppe oder ein Rest eines heterocyclischen Ringes oder wenn irgendeines von der R&sub1; und R&sub2; eine Gruppe ist, die mit einer stark sterisch gehinderten Gruppe substituiert ist, können Produkte mit einer sehr hohen optischen Reinheit erhalten werden.
Typische Verbindungen der Formel (II), die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden, werden in der folgenden Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Allgemeiner Name der Verbindung Ibuprofen Naproxen Pranoprofen Flurbiprofen Tiaprofensäure Fenoprofen Tiaprofensäure α-Phenylpropionsäure Loxoprofen Suprofen Indoprofen Protizinsäure Alminaprofen Benoxaprofen Miroprofen Flunoxaprofen 2-Phenylbuttersäure 2-Chloropropionsäure 4-Chloro-α-(1-methylethyl)penyl-essigsäure 2-Bromopropionsäure β-phenylmilchsäure 2-Methylbuttersäure Mandelsäure 3-Chloro-2-methylpropionsäure 2,3-Dibromopropionsäure 3-Trifluoro-2-methylpropionsäure 2-Phenoxypropionsäure 2-(2-Metyl-4-chlorophenoxy)-propionsäure 2-(2,4-Dichlorophenoxy)propionsäure
Die Verbindungen, die durch die Formel (I) wiedergegeben werden, die als erfindungsgemäße Ausgangsmaterialien verwendet werden, können mittels üblicher Verfahren, wie beschrieben, hergestellt werden, zum Beispiel in JP-A-51-70744; JP-A-51- 122036, US-Patent 4,186,270 und Synthesis, 8 645 (1986).
Die Mikroorganismen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind solche, die aus der Gruppe, die aus Mikroorganismen der Gattung Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus und Candida besteht, ausgewählt werden.
Insbesondere können die folgenden Mikroorganismen verwendet werden.
Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Pseudomonas fluorescens NRRL B-981 (IFO 3925) (der Ausdruck IFO, wie er hierin verwendet wird, bedeutet der Mikroorganismus, wie er im Institut für Fermentation, Osaka, Japan hinterlegt ist), Psudornonas fluorescens IFO 3081, Rhodopseudomoas sphaeroides ATCC 11167, Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419, Corynebacterium sp. KO-2-4 (FERM BP -2353), Acinetobacter sp. AK 226 (FERM BP-2451), Bacillus subtilis CN5 (FERM BP-2354), Rhodococcus sp. AK 32 (FERM BP-1046), Pseudornonas vesbularis ATCC 11426 und Candida tropicalis ATCC 20331.
Eine Lebendkultur des Mikroorganismus Rhodococcus sp. AK 32 ist am Fermentation Research Institute, Japan unter der oben bezeichneten Nummer hinterlegt worden. Die mykologischen Eigenschaften werden in dem EP-Patent 204 555 (1986) beschrieben.
Corynebacterium sp. KO-2-4, Badilus subtilis CN5 und Mycobacterium sp. AC777 wurden neulich als Nitril nutzende Bakterien aus dem Boden isoliert und sind am Fermentation Research Institute, Japan unter der oben bezeichneten Nummern hinterlegt worden.
Acinetobacter sp. AK 226 ist schon isoliert worden, um ungesattigte organische Säuren, wie Acrylsäure oder Methacrylsäure aus den korrespondierenden Nitrilverbindungen zu bilden (siehe JP-B-63-2596 (der Ausdruck "JP-B", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine "geprüfte japanische Patentanmeldung")). Dieser Stamm ist am Fermentation Research Institute, Japan hinterlegt worden.
Die mykologischen Eigenschaften des Corynebacterium sp. KO-2- 4, Bacillus subtilis CN5, Mycobacterium sp. AC777 und Acinetobacter sp. AK 226 sind wie folgt. Gegenstand Stamm (a) Morphologische Eigenschaften 1. Gestalt und Größe der Zelle 2. Polrmorphismus der Zelle 3. Motilität 4. Sporulation 5. Gramfäbung 6. Säurfeste Färbung Stabförmig Längliche und eine Gelenk-Teilung werden beobachet keine flagellatenbeweglich gebildet hauptsächlich + Gegenstand b) Wachstumszustand in verschiedenen Kultturmedien 1. Bouillonager-Plattenkultur 2. Bouillonager-Schrägkultur 3. Bouillonflüssigkultur 4, Bouillon-Gelatine-Stichkultur kreisförmig, glänzend, leicht gelblich-weiß mäßiges Wachstum, glänzende Oberfläche, leicht geldlich-weiß mäßiges Wachstum ohne Bildung von einem Häutchen. keine Bildung eines Niderschlags während des Wachstums gutes Wachstum auf der Oberfläche, keine Verflüssigung der Gelatine kreisförmig, glänzend, leicht gelblich-weiß, durchsichtig gutes Wachstum, glänzend, leicht geldlich-weiß durchsichtig gutes Wachstum mit keiner Bildung von einem Häutchen. Keine Bildung eines Niederschlages während des Wachstums kreisförmig, glatt, nicht glänzend, leicht gelblich-weiß Gegenstand 5. Lackmusmilch (c) physiologishe Eigenschaften 1. reduktion des Nitrats 2. Denitrifikationsreaktion 3. MR-Test 4. VP-Test 5. Bildung des Indols 6. Bildung von Schwefelwasserstoff 7. Hydrolyse der Stärke 8. Verwendung von Zitronensäure kiene Änderung Koser's Kultrurmedium Wechsel zu durchsichtig Simon's Kulturmedium Gegenstand 9. Verwendung der anorganischen Stickstoffquelle Nitrat Ammoniumsalz 10. Bildung des Pigments King A medium 11. Urease 12. Oxidase 13. Katalase 14. Bereich des Wachstums 16. Verhalten gegen Sauerstoff 17. OF-Test pH Temperatur ºC fakultativ anearob aerob oxidativ Gegenstand 18. Bildung von Säuren und Gesan aus Zucker Bildung der Säure Bildung des Gases L-Arabincse D-Xylose D-Glucose D-Mannose D-Fruktose Maltose Sucrose Laktose Trehalose D-Sorbitol D-Mannitol Inositol Glyzerol Stärke Ethanol Methanol Cellulose
Auf der Basis der obigen mykologischen Eigenschaften wurden die taxonomischen Positionen dieser Bakterien gemäß Bergy's Manual of Determinative Bacteriogy, 8. Auflage (1974) und dem Manual of Clinical Microbiology, 4. Auflage (1985) bestimmt.
Der KO-2-4 Stamm ist ein Bacillus, das keine Sporen bildet, aerob, gram-positiv und katalaseaktiv ist, kein Flagellant ist und keine Motilität hat. Es ist klar, daß es ein Stamm ist, der zur Gruppe der Coryneform-Bakterien gehört, weil es einen derartigen Polymorphimus hat, daß es in dem frühen Stadium des Wachstums ein Stab ist und mit Gelenk (snapping) wächst und dann Plastmotomie in die Stabform durchläuft. Des weiteren ist der Stamm nicht in der Lage Cellulose zu zersetzen, ist nicht säurefest und ist nicht absolut aerob und ist negativ beim OF- Test. Daher kann bestimmt werden, daß der KO-2-4 Stamm ein Bakterium ist, das zur Gattung Corynebacterium gehört.
Der CN5 Stamm ist hauptsächlich ein grampositives Bacillus und bildet Sporen. Des weiteren ist es ein Flagellat und mobil. Daher ist klar, daß der Stamm zu der Familie Bacillaceae gehört. Der CN5 Stamm ist aerob und katalasepositiv. Daher gehört der Stamm zur Gattung Bacillus. Des weiteren bildet der Stamm kein Gas aus Glukose, ist in der Lage Stärke zu hydrolysiern, ist positiv im VP-Test, ist in der Lage Nitrat zu reduzieren, wächst bei 50 ºC und enthält in der Bouillonbrühe (Bouillon broth) 7% NaCl und erlaubt es Zitronensäure auf Koser's Citratmedium zu verwenden. Demgemäß kann identifiziert werden, daß der Stamm Bacillus subtilis ist.
Der AC777 Stamm ist ein aerobes gram-positives Bacillus, das Plastomotomie in die Stabform durchläuft und keine Sporen bildet. Daher gehört es zur Gruppe der Cornyneform-Bakterien. Des weiteren zeigt sich der Stamm oxidativ im OF-Test, kann eine Säure aus Glukose bilden und ist oxidasenegativ. Demgemäß kann identifiziert werden, daß der Stamm zur Gattung Mycobacterium gehört.
Die Reaktion der vorliegende Erfindung wird durchgeführt, indem ein racemisches Nitril oder Amid der Formel (I) in Kontakt mit dem Mikroorganismus oder seiner Zubereitung gebracht wird. Der Ausdruck "Mikroorganismus oder seine Zubereitung", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein kultiviertes Medium, das erhalten wird, indem ein Mikroorganismus kultiviert wird; Zellen davon gesammelt werden oder behandelte Zellen (zurn Beispiel zersetzte Zellen oder Enzyme, die aus diesen Zellen extrahiert werden); oder Zellen oder behandelte Zellen auf einem Träger mittels eines geeigneten Verfahrens immobilisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen können mittels üblicher Verfahren kultiviert werden. Kulturmedien, die als Nährstoffquellen bekannt sind, können verwendet werden. Kohlenstoffquellen, schließen Glukose, Glyzerin, Ethanol, Sucrose, Dextrin, Essigsäure; Stickstoffquellen, einschließlich Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniak; organische Nährstoffquellen, einschließlich Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton, Fleischextrakt; und anorganische Nährstoffquellen, einschließlich Phosphorsäure, Magnesium; Kalium, Eisen, Mangan ein, die in geeigneter Kombination verwendet werden können. Falls erwünscht, können Cyanoverbindungen, wie Isobutyronitril hinzugefügt werden, um die Reaktionsaktivität der erfindungsgemäßen Mikroorganismen zu beschleunigen. Der pH des Mediums ist in dem allgemeinen Bereich von 5 bis 10. Die Kulturtemperatur beträgt 18 bis 50 ºC, bevorzugt 25 bis 40 ºC. Die Kultur wird fortfahren gelassen bis die Aktivität ein Maximum erreicht, im allgemeinen für 1 bis 10 Tage.
Die Reaktionsbedingungen der vorliegende Erfindung sind derart, daß eine wäßrige Lösung, wie Wasser, eine Pufferlösung oder ein Kulturmedium oder ein zwei Phasen-System, das aus einem organischen Lösungsmittel und einer wäßrigen Lösung besteht, als Reaktionslösung verwendet werden können. Die racemische Verbindung, die durch die Formel (I) wiedergegeben wird, wird in der Form eines Pulvers oder einer Flüssigkeit zu der Reaktionslösung hinzugefügt. Alternativ wird die racemische Verbindung in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und hinzugefügt. Die Menge der racemischen Verbindung, die hinzugefügt wird, liegt in dem Bereich von 0,01 bis 70 Gew.%, bevorzugt 0,1 bis 40 Gew.% und es ist nicht notwendig die racemische Verbindung vollständig in der Reaktionslösung zu lösen. Die Konzentration des Bakteriums, das für die Reaktion verwendet wird, liegt in dem allgemeinen Bereich von 0,05 bis 20 Gew.%. Die Reaktionstemperatur liegt in dem allgemeinen Bereich von 5 bis 80 ºC, bevorzugt 15 bis 60 ºC und der pH liegt in dem allgemeinen Bereich von 4 bis 11, bevorzugt 6 bis 10. Die Reaktionszeit beträgt im allgemeinen 1 bis 100 Stunden. Die racemische Verbindung, die durch Formel (I) wiedergegeben wird, kann kontinuierlich oder intermittierend zu der Reaktionslösung hinzugefügt werden, um die racemische Verbindung zu ergänzen, 50 daß die Konzentration der racemischen Verbindung in dem oben beschrieben Bereich gehalten werden kann. Die Reaktion kann beendet werden bevor der Gehalt der gebildeten optisch aktiven α-substituierten organischen Säure, die durch die Formel (II) wiedergegeben wird, nicht erniedrigt wird. Die Reaktion wird im allgemeinen durchgeführt bis die Reaktivität 8 bis 60% erreicht.
Das gewünschte erfindungsgemäße Produkt kann in der folgenden Weise wiedergewonnen werden.
Nach dem ein unlöslicher Stoff, wie Bakterien aus der Kulturlösung entfernt werden, wird der pH der resultierenden Lösung auf 8,5 eingestellt. Die unreagierte Verbindung der Formel (I) wird mit einem Lösungsmittel, wie n-Butanol, Benzol, Diethylether oder Chloroform extrahiert, um sie zu entfernen. Der pH der resultierenden Lösung wird dann auf 2 eingestellt und die Extraktion wird mit einem Lösungsmittel, wie n-Butanol, Benzol, Diethylether oder Chloroform durchgeführt, wobei das gewünschte Produkt wiedergewonnen werden kann. Das Produkt kann mittels einer Kieselsäuregel- Säulenchromatographie gereinigt werden, gefolgt von einer Elution mit einem Lösungsmittel, wie einer Mischung aus, zum Beispiel Hexan, Diethylether, Chloroform und Methanol.
Es wird angenommen, daß der Reaktionsmechanismus der vorliegende Erfindung derart ist, daß das Enzym, das Nitril oder Amid in eine Carbonsäure umwandelt, das heißt eine Amidase, eine Nitrilhydratase oder Nitrilase selektiv mit nur einem Isomer des racemischen Nitrils oder Amids reagiert. Es wird nämlich angenommen, daß die Rate der Enzymreaktion sehr mit dem optischen Isomer variiert. Demgemäß, falls eine optisch aktive organische Säure mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wird, wird ein optisch aktives Nitril oder Amid folglich gelassen oder als unreagiertes Material oder als Zwischenprodukt gebildet. Das Nitril oder Amid kann leicht in eine optisch aktive organische Säure umgewandelt werden, indem es in der Gegenwart von einer Säure hydrolysiert wird. Nämlich jedes R Isomer und S Isomer oder (+) Isomer und (-) Isomer der organischen Säure kann erfindungsgemäß hergestellt werden. Falls irgendein Isomer der optisch aktiven organischen Säure hergestellt werden soll, wird ein optisch aktives Nitril oder Amid, das unreagiertes Material ist oder ein Zwischenprodukt racemisiert, zum Beispiel mittels einer Reaktion, die ein Alkali, wie Ammoniak verwendet und das resultierende racemische Nitril oder Amid kann als erfindungsgemäßes Ausgangsmaterial verwendet werden. Demgemäß können die gewünschten optisch aktiven organischen Säuren mit hohen Ausbeuten in einem industriellen Maßstab hergestellt werden.
Amidase, Nitrilhydratase oder Nitrilase, die aus den erfindungsgemäßen Mikroorganismen isoliert werden, haben eine derartige Spezifität, daß es eine Möglichkeit gibt, daß die Reaktionsrate sehr mit dem optischen Isomer variiert, falls es mit dem racemischen Nitril oder Amid reagiert wird. Die von den Erfinder isolierte Nitrilase oder Amidase, haben eine derartige Spezifität der oben beschriebenen Mikroorganismen. Nitrilase, die aus dem Acinetobacter sp. Ak 226 Stamm isoliert wurde, wird unten mittels Beispiels dargestellt.

(1) Herstellung des Enzyms:

Um erfindungsgemäße Nitrilase herzustellen, wird der Acinetobacter sp. Ak 226 Stamm in dem oben beschriebenen Medium kultiviert. Das Material zur Beschleunigung der Reaktionsaktivität wird hinzugefügt und der Stamm wird für 1 bis 3 Tage unter den oben beschriebenen Kulturbedingungen kultiviert.
Nitrilase wird aus dem resultierenden Kulturmedium wiedergewonnen und kann mittels üblicher Enzymreinigungsverfahren gereinigt werden. Bakterien werden mittels Zentrifugierens gesammelt und mittels Ultraschallbehandlung oder einem mechanischen Mittel wie einer Dainomühle getrennt. Feststoffe, wie Zell-Memblens (cell memblems) werden mittels Zentrifugierens entfernt. Das resultierende rohe Enzym wird einem fraktionierten Ultra- Zentrifugieren, einer Aussalzbehandlung, einer Präzipitierungsbehandlung mit organischen Lösungsmitteln und einer weiteren Reinigung mittels der Adsorptionschromatographie, der Ionenaustauschchromatographie und/oder Gelpermeationschromatographie unterworfen. Dies wird detaillierter in dem Beispiel beschrieben.

(2) Assay (Messung des Titers):

0,5 µmol der Kaliumphosphatpufferlösung (pH 8,0) und 1,34 µmol an 2-(4'-Isobutylphenyl)propionitril werden in einer geeigneten Menge einer Enzymlösung hinzugefügt, um ein Volumen von 0,5 ml zu ergeben. Danach wird die Mischung bei 30 ºC für 30 Minuten reagieren gelassen, 0,1 ml an 80 % Essigsäure werden dazu hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Die Menge an 2-(4'-Isobutylphenyl)propionsäure und Ammoniak werden gemessen. Die Menge an 2-(4'-Isobutylphenyl)propionsäure wird mittels einer hoch leistungsfähigen Flüssigchromatographie gemessen, wobei eine µ Bondapack C18 Säule verwendet wird und ein Lösungsmittel wird verwendet, das erhalten wird, indem 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 3) mit 50 % (V/V) an Acetonitril gemischt werden. Der Assay wird bei einer Absorbanz von 254 nm durchgeführt. Die Menge an gebildetem Ammoniak wird gemäß J. Clin. Path., 13, 156 (1960) gemessen.
Die Menge an Enzym, die notwendig ist, um 1 µmol an 2-(4'- Isobutylphenyl)propionsäure oder Ammoniak pro eine Minute zu bilden, wird als eine Einheit bezug genommen.

(3) Eigenschaften des Enzyms:

Erfindungsgemäße Nitrilase wird in reiner Form isoliert und hat die folgenden Eigenschaften.
(i) Funktion: Ein Molekül einer Nitrilverbindung wird hydrolysiert, um ein Molekül einer organischen Säure oder ein Ammonikmolekül zu bilden.
Die Reaktionsrate mit dem S-Isomer des racemischen 2-(4'- Isobutylphenyl)propionitril ist viel höher als mit seinem R- Isomer. Demgemäß wird optisch aktive S-(+)-2-(4'- Isobutylphenyl)propionsäure gebildet. Dies wird in dem Beispiel beschrieben.
(ii) Substratspezifität:
Das Enzym reagiert mit vielen Nitrilverbindungen, wie aliphatischen Nitrilen und aromatischen Nitrilen, die in der folgenden Tabelle 2 dargestellt werden. Jedoch reagiert es nicht mit Verbindungen, die eine Aminogruppe in α-Position haben. Tabelle 2 Substrat Relative Aktivität (x10² %) Acetonitril n-Butyronitril n-Capronitril iso-Capronitril Acrylonitril Methacrylonitril Hydroxyacetonitril Chloracetonitril 2,3 Dibromopropionitril Benzylcyanid α-Phenylpropionitril 2-(4'-Isobutylphenyl)propionitril 2-Phenylglycinonitril Thiophenacetonitril Nicotinonitril Benzonitril o-Tolunitril m-Tolunitril p-Tolunitril m-Nitrobenzonitril o-Fluorobenzonitril m-Fluorobenzonitril p-Fluorobenzonitril m-Chlorobenzonitril Glutaronitril m-Phthalonitril
(iii) Optimaler pH: Ungefähr pH 8,
(iv) pH-Stabilität: Stabil bei einem pH 5,8 bis 6,7, falls er mit einer Pufferlösung behandelt wird, die verschiedene pH bei 60 ºC für 60 Minuten haben.
(v) Optimale Temperatur: Die maximale Wirkung wird bei einer Temperatur von ungefähr 45 bis 60 ºC erhalten.
(vi) Absorptionsspektrum: Maximales Absorptionsspektrum bei ungefähr 223 nm und 280 nm.
(vii) Molekulargewicht: Ungefähr 580 000, die mittels einer Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit mit Asahipak GS-620 gemessen wird (ein Produkt der Asahi Chemical Industrie Co., Ltd.).
(viii) Molekulargewicht der Untereinheit: 42000 bis 47000, berechnet mittels Elektrophorese des SDS-Polyacrylamidgels.
Wie oben ausgeführt, ist das obige Enzym eine neue Nitrilase, die mit einem weiten Bereich an aliphatischen Nitrilen und aromatischen Nitrilen reagiert. Des weiteren hat das obige Enzym eine derartig ausgezeichnete Wirkung, daß 2-(4'- Isobutylphenyl)propionitril mit einer optischen Spezifität hydrolysiert wird, wenn das Nitril als Substrat verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter unter bezug auf die folgenden Beispiele dargestellt, die jedoch nicht als Beschränkung der vorliegende Erfindung in irgend einer Weise verstanden werden dürfen. In den folgenden Beispielen bedeutet % Gewicht, wenn nicht etwas anderes angeben wird.

BEISPIEL 1

Herstellung der 5-(+)-α-Phenylpropionsäure:

Zu 2000 ml eines sterilisierten Kulturmediums, das 1 % Glukose, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton, 0,12 % Monokaliumphosphat, 0,08 Dikaliumphosphat, 0,02 % Magnesiumsulfat, 0,003 % Eisensulfat, 0,1 % Natriumchlorid und 0,1 Isobutyronitril enthält und einen pH von 7,2, wurden 2 % an Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419 Stamm geimpft, der vorher auf demselben Medium kultiviert wurde. Das Medium wurde bei 32 ºC für zwei Tage mittels einer Schüttel-Kultur kultiviert. Nach der Kultivierung wurden Bakterien (5,2 g Trockengewicht) mittels Zentrifugierens gesammelt, in 160 ml eines 0,01 M Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert und in einen Erlenmeyerkolben getan. 1,6 g an α-Phenylpropionitril wurde dazu hinzugefügt und die Reaktion der Mischung trat ein, während sie bei 32 ºC geschüttelt wurde. Nach 20 Stunden wurde die Reaktion beendet und die Bakterien wurden mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurde auf 8,5 eingestellt. 200 ml an Chloroform wurde dazu hinzugefügt, um das nicht reagierte α- Phenylpropionitril zu extrahieren und zu entfernen. Der pH der Wasserschicht wurde auf 1,0 bis 2,0 mit Salzsäure eingestellt.
200 ml Chloroform wurden dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mittels einer Kieselsäuregel-Säule (500 mg, die mit Hexan eingestellt wurde) gereinigt, mit Hexan- Diethylether (95 : 5 an Volumen) eluiert. Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 475 mg an S- (+)-α-Phenylpropionsäure zu erhalten.
Spezifische Drehung: [α]²&sup5;D = +75º (C = 1,65 Chloroform)
Die optische Reinheit betrug 98 % der spezifischen Drehung. TLC-Chromatographie und Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit zeigt, daß das Produkt allein vorlag.

BEISPIEL 2

Herstellung der S-(+)-α-Phenylpropionsäure:

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, wurden zu 500 ml des sterilisierten Kulturmediums 2 % des Mikroorganismus, der zuvor in demselben Medium kultiviert wurde, geimpft. Die Medien wurden bei 32 ºC für 2 Tage mittels einer Schüttel- Kultur kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Bakterien mittels Zentrifugierens gesammelt, in 30 ml eines 0,01 M Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert und in einen Erlenmeyerkolben getan. 300 mg an α-Phenylpropionitril wurde dazu hinzugefügt und die Mischung wurde bei 32 ºC unter Schütteln reagieren gelassen.
Nach der Entfernung der Bakterien aus der Reaktionslösung mittels zentrifugaler Trennung, wurde die Extraktion mit Chloroform in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, um α-Phenylpropionsäure zu erhalten. Die optische Spezifität davon wurde mittels Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit überprüft. Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Mikroorganismus Reaktionszeit (Std) Produktmenge (mg) Verhältnis von S-(+)-α-Phenyl-propionsäure/R-(-)-a-Phenylpropionsäure Pseudomonas fluorescens NRRL B 981 Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 11167 Rhodococcus sp. AK 32 Bacillus subtilis CN 5 Mykobacterium sp. AC 777 Corynebacterium sp. KO-2-4 nur das S-Isomer
Die optische Spezifität wurde unter Verwendung eines Flüssigchromatographen von hoher Leistungsfähigkeit, gemäß des Verfahrens zur Analysierung von S-(-)-1-(Naphthyl)ethylamid [Journal of Chromatographie, 378, Seite 409 418 (1986)], bestimmt.

BEISPIEL 3

Herstellung von S-(+)-α-Phenylpropionsäure:

Bakterien wurden klutiviert, gesammlt mittels zentrifugaler Trennung, in 30 ml an 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 8) suspendiert und in einen Erlenmeyerkolben, wie in Beispiel 2 getan. 300 mg an α-Phenylpropionamid wurde dazu hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 32 ºC unter Schütteln durchgeführt.
Nachdem die Bakterien aus der Reaktionslösung mittels zentrifugaler Trennung entfernt wurden, wurde α- Phenylpropionsäure in derselben Weise wie in Beispiel 2 erhalten. Die optische Spezifität wurde mittels Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit überprüft. Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Mikroorganismus Reaktionszeit (Std) Produktionsmenge (mg) Verhältnis von S-(+)-α-Phenylpropionsäure/R-(-)-α-Phenylpropionsäure Pseudomonas fluorescens IFO 3081 Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 11167 Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419 Rhodococcus sp. AK 32 Bacillus subtilis CH 5 Mycobacterium sp. AC 777 Pseudomonas fluorescens NRRL B 981 nur DAS S-Isomer

BEISPIEL 4

Herstellung von S-(+)-Ibuprofen:

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, wurden zu 500 ml des sterilisierten Kulturmediums 2 % an Acinetobacter sp. AK 226 Stamm, der zuvor in demselben Medium kultiviert wurde, geimpft. Die Medien wurden bei 32 ºC für 35 Stunden kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Bakterien mittels zentrifugaler Trennung gesammelt, in 30 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 8,0) suspendiert und in einen Erlenmeyerkolben getan. 90 mg an 2-(4'- Isobutylphenyl)propionitril wurde dazu hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 32 ºC unter Schütteln durchgeführt. Nach 16 Stunden wurde die Reaktion beendet und die Bakterien wurden mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurde auf 8,5 eingestellt. 30 ml an Chloroform wurde dazu hinzugefügt, um das nicht reagierte 2-(4'-Isobutylphenyl)propionitril zu extrahieren und zu entfernen. Nachdem der pH der Wasserschicht auf 1,0 bis 2,0 mit Salzsäure eingestellt wurde, wurden 30 ml Chloroform dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mittels einer Kieselsäuregel- Säulenchromatographie gereinigt, mit Hexan-Diethylether eluiert (3 : 1 an Volumen). Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 52 mg an S-(+)-2-(4'- Isobutylphenyl) propionsäure zu erhalten.
[α]²&sup0;D = +52,7º (C = 1, Ethanol)
Schmelzpunkt: 49 ºC
Die optische Reinheit betrug 95% der spezifischen Drehung. TLC-Chromatographie und Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit zeigt, daß das Produkt allein vorlag.

BEISPIEL 5

Herstellung von S-(+)-Naproxen:

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, wurden zu 500 ml des sterilisierten Kulturmediums 2 % an Rhodococcus sp. AK 32 Stamm, der zuvor in demselben Medium kultiviert wurde, geimpft. Die Medien wurden bei 32 ºC für 30 Stunden kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Bakterien mittels zentrifugaler Trennung gesammelt, in 30 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 8,0) suspendiert und in einen Erlenmeyerkolben getan. 90 mg an 2-(6'-Methoxy-2'- naphthyl)propionitril wurde dazu hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 32 ºC unter Schütteln durchgeführt. Nach 30 Stunden wurde die Reaktion beendet und die Bakterien wurden mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurde auf 8,5 eingestellt. 30 ml an Chloroform wurde dazu hinzugefügt, um das nicht reagierte Material und die Nebenprodukte zu extrahieren und zu entfernen. Der pH der Wasserschicht wurde auf 1,0 bis 2,0 mit Salzsäure eingestellt, 30 ml Chloroform wurden dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mittels einer Kieselsäuregel-Säulenchromatographie gereinigt, mit Hexan-Diethylether eluiert (7 : 3 an Volumen). Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 37 mg an S-(+)-2-(6'-Methoxy-2'-naphthyl)propionsäure zu erhalten.
[a]²&sup0;D = +62,8º (C = 1, Chloroform)
Schmelzpunkt: 153 ºC
Die optische Reinheit betrug 95 % der spezifischen Drehung. TLC-Chromatographie und Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit zeigt, daß das Produkt allein vorlag.

BEISPIEL 6

Herstellung von (+)-Pranoprofen:

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, wurden zu 500 ml des sterilisierten Kulturmediums 2 % an Corynebacterium sp. KO-2- 4, das zuvor in demselben Medium kultiviert wurde, geimpft. Die Kultivierung wurden bei 32 ºC für 35 Stunden durchgeführt. Nach der Kultivierung wurden die Bakterien mittels zentrifugaler Trennung gesammelt, in 30 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 8,0) suspendiert und in einen Erlenmeyerkolben getan. 90 mg an 2-(5H-[1]Benzopyrano[2,3- b]pyridin-7-yl)propionitril wurde dazu hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 32 ºC unter heftigem Schütteln der Mischung durchgeführt. Nach 24 Stunden wurde die Reaktion beendet und die Bakterien wurden mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurde auf 8,5 eingestellt. 30 ml an Chloroform wurde dazu hinzugefügt, um die rohe Nitrilverbindung und die korrespondierende Amidverbindung zu extrahieren und zu entfernen. Der pH der Wasserschicht wurde auf 1,0 bis 2,0 mit Salzsäure eingestellt, 30 ml Chloroform wurden dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mittels einer Kieselsäuregel- Säulenchromatographie gereinigt, mit Hexan-Diethylether eluiert (3 : 1 an Volumen). Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 42 mg an (+)-2-(5H- [1]Benzopyrano[2,3-b]pyridin-7-yl)propionsäure [(+)Pranoprofen] zu erhalten.
[a]²&sup0;D = +43,3º (C = 1,0; Methanol)
Schmelzpunkt: 184 - 185 ºC
Die optische Reinheit betrug 96% der spezifischen Drehung. TLC-Chromatographie und Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit zeigt, daß das Produkt allein vorlag.

Beispiel 7

Reinigung der Nitrilase der Acinetobacter sp. AK 226:

Das Kultivierungsverfahren aus Beispiel 4 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 2 l des Kulturmediums, das 1 % Ammoniumacetat an Stelle der Glukose enthält, verwendet wurde. 40 g der Bakterien wurden mittels zentrifugaler Trennung gesammelt, mit 0,01 M Kaliumphosphatpufferlösung (6,5) gewaschen und dann in 160 ml an 0,03 Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,5) suspendiert. Die Suspension wurde einer Ultraschallbehandlung (9 KHz) für 30 Minuten unterworfen, um die Zellen zu zerreißen. Die zerrissenen Zellen wurden mittels zentrifugaler Trennung entfernt (15000 x g für 20 Minuten), um einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Der Extrakt wurde gegen eine 0,03 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,5) dialysiert und einer zentrifugalen Trennung (100 000 x g für 2 Stunden) unterworfen. Die überstehenden Flüssigkeit wurde durch eine DEAE-Cellulosesäule durchgeleitet, um ein Enzym mit einem linearen Gradienten von 0,05 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,5) zu eluieren, die 0 bis 0,5 M Natriumchlorid enthält. Aktive Fraktionen wurden gesammelt, gegen 0,01 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,5) dialysiert und durch eine Hydroxyapatitsäule geleitet, um ein Enzym mit einem linearen Gradienten von 0,01 bis 0,2 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,5) zu eluieren. Aktive Fraktionen wurden gesammelt, gegen 0,03 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,5) dialysiert und mittels der DEAE-Cellulosesäule und dem Hydroxyapatit in einer ähnlichen Weise zu der, die, oben beschrieben ist, gereinigt. Aktive Fraktionen wurden mittels Ultrafiltration konzentriert und einer Gelpermeationschromatographie, unter Verwendung von Sephacryl S-400 [(equilibriert, unter Verwendung einer 0,05 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,5)], unterworfen. In dieser Weise wurde Nitrilase einheitlich gereinigt. Der Fortschritt der Reinigung wird in Tabelle 5 unten gezeigt. Tabelle 5 Stadium Gesamtaktivität (Einheit) Gesamtprotein (mg) Spezifische Aktivität (Einheit/mg) 1. Zelifreier Extrakt 2. Ultrazentrifugale Trennung 3. Erste DEAE-Cellulose 4. Erster Hydroxyapatit 5. Zweite DEAE-Cellulose 6. Zweiter Hydroxyapatit 7. Sephacryl S-400

Beispiel 8

Der Verlauf der Bildung an S-(+)-Ibuprofen:

Nitrilase, die einheitlich in Beispiel 7 gereinigt wurde, wurde verwendet und der Verlauf der Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen geprüft.
Ein ml der Reaktionslösung, die 100 µmol an Kaliumphosphatpufferlösung (pH 8,0), 4,77 µmol an 2-(4'- Isobutylphenyl)propionitril und 0,02 Einheiten an Nitrilase enthält, wurde gründlich bei 32 ºC geschüttelt, um die Reaktion durchzuführen. Die Mengen an 2-(4'- Isobutylphenyl)propionitril, 2-(4'-Isobutylphenyl)propionsäure und Ammoniak wurden für jede Reaktionszeit bestimmt. Die Ergebnisse werden in der Figur gezeigt. Die optische Reinheit der gebildeten S-(+)-2-(4'-Isobutylphenyl)propionsäure betrug 98 % für 6 Stunden, 96 % für 24 Stunden und 95 % für 40 Stunden.

Beispiel 9

Herstellung von R-(-)-Ibuprofen:

Das unreagierte 2-(4'-Isobutylphenyl)propionitril, das mit Chloroform in Beispiel 4 extrahiert wurde, wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Zu dieser Probe wurden 5 ml an deionisiertem Wasser und 5 ml an konzentrierter Schwefelsäure hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 105 ºC unter Rühren für 7 Stunden reagiert. Nach der Vollendung der Reaktion wurden 20 ml an Chloroform hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mittels der Siliciumdioxid- Säulenchromatographie gereinigt, mit Hexan-Diethylether (3 : 1 an Volumen) eluiert. Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 44 mg an R-(-)-2-(4'- Isobutylphenyl)propionsäure zu erhalten.
[α]²&sup0;D = -50,0º (C = 1, Ethanol)
Schmelzpunkt: 48 - 49 ºC
Das Produkt hatte einen R-Isomerengehalt von 95 % der spezifischen Drehung.
Dünnschichtchromatographie zeigte, daß das Produkt einen einzelnen Punkt zeigt.

Beispiel 10

Herstellung von S-(+)-Ibuprofen:

Acinetobacter sp. AK 226 Stamm wurde in derselben Weise wie in Beispiel 4 kultiviert. Die Bakterien (950 mg Trockengewicht) wurden mittels zentrifugaler Trennung gesammelt, in 30 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 8,0) suspendiert und in einen Erlenmeyerkolben getan. 5 ml Hexan, das 1,5 g an 2-(4'- Isobutylphenyl)propionitril enthält, wurde zu der Suspension hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 32 ºC unter Schütteln durchgeführt. Nach 16 Stunden wurde die Reaktion beendet und die Bakterien wurden mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der Wasserschicht wurde auf 8,5 eingestellt, indem 270 ml an Wasser und Natriumhydroxid hinzugefügt wurden. Die Hexanschicht wurde entfernt. Des weiteren wurden 300 ml an Chloroform hinzugefügt, um das unreagierte 2-(4'- Isobutylphenyl)propionitril vollständig zu entfernen. Der pH der Wasserschicht wurde auf 1,0 mit Salzsäure eingestellt. 300 ml Chloroform wurden dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mittels einer Kieselsäuregel- Säulenchromatographie gereinigt, mit Hexan-Diethylether eluiert (3 : 1 an Volumen). Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 670 mg an S-(+)-2-(4'- Isobutylphenyl) propionsäure zu erhalten.
[α]²&sup0;D = +56,0º (C = 1, Ethanol)
Schmelzpunkt: 49 - 50 ºC
Das Produkt hatte ein S-Isomerengehalt von 98,5 % der spezifischen Drehung.
Dünnschichtchromatographie zeigte, daß das Produkt einen einzelnen Punkt zeigt.

BEISPIEL 11

Herstellung der R-(-) Mandelsäure:

Zu 100 ml eines sterilisierten Kulturmediums, das 1 % Glukose, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton, 0,2 % Dikaliumphosphat, 0,1 % Natriumchlorid und 0,003 % Eisensulfat enthält und einen pH von 7,0 hat, wurden 4 % an Alcaligenes faecalis ATCC 8750 Stamm geimpft, der vorher auf demselben Medium kultiviert wurde. Das Medium wurde bei 32 ºC für zwei Tage mittels einer Schüttel-Kultur kultiviert. Nach der Kultivierung wurden Bakterien (60 mg g Trockengewicht) mittels zentrifugaler Trennung gesammelt, in 150 ml eines 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert. 250 mg an Mandelsäurenitril wurde zu 50 ml der Suspension hinzugefügt und die Mischung wurde bei 32 ºC unter Schütteln für 4 Stunden reagieren gelassen. Die Bakterien wurden aus der Reaktionslösung mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurde auf 8,5 eingestellt. 50 ml an Chloroform wurde dazu hinzugefügt, um das nicht reagierte Mandelsäurenitril zu extrahieren. Der pH der Wasserschicht wurde auf 1,0 mit Salzsäure eingestellt. 40 ml Diethylether wurden dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mittels einer Säulenchromatographie auf Kieselsäuregel (500 mg, das mit Hexan eingestellt wurde) gereinigt, mit Hexan-Ethylacetat (50 : 50 an Volumen) eluiert. Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 76 mg an R-(-)-Mandelsäure zu erhalten.
[α]²&sup5;D = 141º (C = 1, H&sub2;O)
Schmelzpunkt: 130-132ºC
Der R-Isomerengehalt betrug 92,2 % der spezifischen Drehung.
Eine Analyse wurde mittels einer Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit, gemäß dem Journal of Chromatography, 216, 406 (1981) gemacht. Es wurde gefunden, daß die Probe einen R-Isomerengehalt von 91 % hatte.

Beispiel 12

Herstellung der R-(-) -Mandelsäure:

Ein Liter des Kulturmediums, das dieselbe Zusammensetzung hat, wie die in Beispiel 11, wurde verwendet. Zu dem Medium wurde jeweils Pseudomonas vesicularis ATCC 11426 Stamm und Candidia tropicalis ATCC 20311 geimpft. Die Kultivierung wurde durchgeführt. Die gesammelten Zellen (1,76 g und 7,14 g Trockengewicht) wurden jeweils in 100 ml und 500 ml an 1,0 M Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert. 2,0 g des Mandelsäureamids wurde zu 100 ml jeder Suspension hinzugefügt. Die Mischungen wurden bei 32 ºC für 40 Stunden, unter Schütteln, reagieren gelassen. Unlösliche Stoffe, wie Zellen, wurden von jeder Reaktionslösung mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der überstehenden Flüssigkeiten wurde auf 1,0 mit Salzsäure eingestellt. 50 ml Diethylether wurde dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Die Extrakte wurden in derselben Weise wie in Beispiel 11 gereinigt.
Es wurden 795 mg an R-(-)-Mandelsäure aus der Reaktionslösung von Pseudomonas vesicularis ATCC 11426 erhalten.
[α]²&sup5;D + -153º (C = 1, H&sub2;O)
Schmelzpunkt: 134 - 135ºC
Es wurden 940 mg an R-(-) Mandelsäure aus der Reaktionsmischung aus Candida tropicalis ATCC 20311 erhalten.
[α]²&sup5;D = -147º (C = 0,5, H&sub2;O)
Schmelzpunkt: 133 - 134ºC
Der R-Isomerengehalt der gereinigten Proben, der aus der spezifischen Drehung berechnet wurde, betrug jeweils 100 % und 98 %.

Beispiel 13

Herstellung der S-(-)-2-Chlorpropionsäure:

In derselben Weise wie in Beispiel 11 wurde Mycobacterium sp. AC777 kultiviert. Die Bakterien (710 mg; Trockengewicht) wurden in 80 ml an 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8) suspendiert.
200 mg an 2-Chlorpropionitril wurde zu 20 ml der Suspension hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 32 ºC für zwei Stunden, unter Schütteln, reagieren gelassen. Unlöslicher Stoff wurde aus der Reaktionslösung mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der überstehenden Flüssigkeiten wurde mit Natriumhydroxid auf 9 eingestellt. 20 ml an Chloroform wurden zu der überstehenden Flüssigkeit hinzugefügt, um das unreagierte 2-Chloropropionitril zu entfernen. Der pH der wäßrigen Schicht wurde auf 1 mit Salzsäure eingestellt. 20 ml an n-Butanol wurde zu der wäßrigen Schicht hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Die n-Butanolschicht wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mittels der Säulenchromatographie auf Kieselsäuregel (500 mg, eingestellt mit Chloroform) gereinigt, indem mit Chloroform-Methanol (10:1 an Volumen) eluiert wurde. Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 59 mg an S-(-)-2- Chlorpropionsäure zu erhalten.
[α]25D = -8,4º (C = 1, H&sub2;O)
Der S-Isomerengehalt, der aus der spezifischen Drehung berechnet wurde, betrug 80 %.
Flüsigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit und TLC- Chromatographie zeigten, das das Produkt das einzige war.

Beispiel 14

Herstellung der S-(-)-2-Brompropionsäure:

In derselben Weise wie in Beispiel 12 wurde Mycobacterium sp. AC777 Stamm kultiviert. Die Bakterien (710 mg, Trockengewicht) wurden in 20 ml an 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8) suspendiert. 200 mg an 2-Brompropionitril wurde zu der Suspension hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 32 ºC für 30 Stunden, unter Schütteln, reagieren gelassen. Unlöslicher Stoff wurde aus der Reaktionslösung mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde mit Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt. 20 ml an Chloroform wurden dazu hinzugefügt, um das unreagierte 2-Brompropionitril zu extrahieren. Der pH der wäßrigen Schicht wurde auf 1,5 mit Schwefelsäure eingestellt. 40 ml an n-Butanol wurde dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Die n- Butanolschicht wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mittels der Säulenchromatographie auf Kieselsäuregel (500 mg, eingestellt mit Chloroform) gereinigt, indem mit Chloroform- Methanol (10:1 an Volumen) eluiert wurde. Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 45 mg an S-(-)- 2-Brompropionsäure zu erhalten.
[α]²&sup5;D = -19,9º (C = 1, Methanol)
Der S-Isomerengehalt, der aus der spezifischen Drehung berechnet wurde, betrug 86 %.
Flüsigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit und TLC- Chromatographie zeigten, das das Produkt das einzige war.

Beispiel 15

Herstellung der (+)-2-Phenoxypropionsäure:

In derselben Weise wie in Beispiel 11 wurde Mycobacterium sp. AC777 Stamm kultiviert. Die Bakterien (710 mg, Trockengewicht) wurden in 100 ml an 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert. 100 mg an 2-Phenoxypropionitril wurde zu 10 ml der Suspension hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 32 ºC für 3 Stunden, unter Schütteln, reagieren gelassen. Unlöslicher Stoff wurde aus der Reaktionslösung mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde mit Natriumhydroxid auf 9 eingestellt. 10 ml an Chloroform wurden dazu hinzugefügt, um das unreagierte 2-Phenoxypropionitril und 2-Phenoxypropionamid zu entfernen. Der pH der wäßrigen Schicht wurde auf 1 mit Salzsäure eingestellt. 10 ml Chloroform wurde zu der Wasserschicht hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Die Chloroformschicht wurde unter reduziertem Druck konzentriert und in derselben Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, um 34 mg an 2-Phenoxypropionsäure zu erhalten. In derselben Weise wie in Beispiel 2 wurde die optische Spezifität mittels Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit überprüft. Es wurde nur das (+) Isomer gebildet.

Beispiel 16

Herstellung der (+)-2-Phenoxypropionsäure:

In derselben Weise wie in Beispiel 11 wurde Rhodococcus sp. AK 32 Stamm kultiviert. Die Bakterien (210 mg, Trockengewicht) wurden in 100 ml an 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert. 100 mg an 2-Phenoxypropionamid wurde zu 10 ml der Suspension hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 32 ºC für 3 Stunden, unter Schütteln, reagieren gelassen. Unlöslicher Stoff wurde aus der Reaktionslösung mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde mit Natriumhydroxid auf 9 eingestellt. 10 ml an Chloroform wurden dazu hinzugefügt, um das unreagierte Amid zu entfernen.
Der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde auf 1 mit Salzsäure eingestellt. 10 ml Chloroform wurde dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Die Chloroformschicht wurde unter reduziertem Druck konzentriert und in derselben Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, um 42 mg an 2-Phenoxypropionsäure zu erhalten. In derselben Weise wie in Beispiel 2 wurde die optische Spezifität mittels Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit überprüft. Es wurde gefunden, daß nur das (+) Isomer gebildet wurde.

Beispiel 17

Herstellung der S-(+)-2-Phenyl-n-buttersäure:

150 mg an 2-Phenyl-n-butyronitril wurde zu 10 ml einer Suspension aus Bakterien vom Rhodococcus sp. AK 32 Stamm hinzugefügt, der in derselben Weise wie in Beispiel 5 kultiviert wurde. Die Mischung wurde bei 32 ºC für 18 Stunden, unter Schütteln, reagieren gelassen. Unlöslicher Stoff wurde aus der Reaktionslösung mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde mit Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt. 30 ml an Chloroform wurden dazu hinzugefügt, um das unreagierte Nitril und das korrespondierende Amid zu entfernen. Der pH der wäßrigen Schicht wurde auf 2,0 mit Salzsäure eingestellt. 30 ml Chloroform wurde dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert und in derselben Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, um 64 mg an S-(+)-2-Phenyl-n-buttersäure zu erhalten.
[α]¹&sup9;D = +80,0º (C = 0,9, Toluol)
Die optische Reinheit betrug 93 % der spezifischen Drehung.
TLC- Chromatographie und Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit zeigten, das das Produkt das einzige war.

Beispiel 18

Herstellung der S-(-)-3-Chlor-2-methylpropionsäure:

In derselben Weise wie in Beispiel 11 wurde Mycobacterium sp. AC777 kultiviert. 710 mg (Trockengewicht) der Bakterien wurden in 100 ml an 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert und in einen Erlenmeyerkolben getan. 500 mg an 3-Chlor-2- methylpropionitril wurde zu 50 ml der Suspension hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 32 ºC für 4 Stunden, unter Schütteln, reagieren gelassen. Bakterien wurden aus der Reaktionsmischung mittels zentrifugaler Trennung entfernt. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde mit Salzsäure auf 1,0 eingestellt. 30 ml an n-Butanol wurde dazu hinzugefügt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Die Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentrtert und mittels der Säulenchromatographie auf Kieselsäuregel (1 g, eingestellt mit Chloroform) gereinigt, indem mit Chloroform-Methanol (10:1 an Volumen) eluiert wurde. Das gewünschte Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 243 mg an S-(-)-3-Chlor-2- methylpropionsäure zu erhalten.
[α]²&sup5;D = 14,0º (C = 1, MeOH)
Die Probe wurde mit (1R, 2R)-(-)-1-(4-nitrophenyl)-2-amino-1,3-propandiol reagiert, um sie zu amidieren. Das Amid wurde mittels Flüssigchromatographie von hoher Leistungsfähigkeit [Chromatograhia 24, 477 (1987)] analysiert. Ein einziger Peak wurde gefunden und nur das S-Isomer wurde gebildet.
Falls die vorliegende Erfindung verwendet wird, können verschiedene optisch aktive α-substituierte organische Säuren aus optisch inaktiven Ausgangsmaterialien unter den Bedingungen einer normalen Atmosphäre und Raumtemperaturreaktion, unter Verwendung der vorliegenden Mikroorganismen, hergestellt werden. Demgemäß ist die vorliegende Erfindung ökonomisch sehr vorteilhaft.
Des weiteren können optisch aktive α-substituierte organische Säuren, die eine optische Reinheit von 50 hoch wie zumindest 80 % oder so extrem hoch wie zumindest 90 %, gemäß der Arten der organischen Säuren haben, erfindungsgemäß in hohen Ausbeuten erhalten werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven α-substituierten organischen Säure der Formel (II) mit den Stufen:

(a) Behandeln eines racemischen α-substituierten Nitrils oder Amids der Formel (I) mit einem Mikroorganismus aus der durch Mikroorganismen der Gattungen Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium sp. Stamm KO-2-4 (FERM BP-2 353), Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus und Candida oder ihren Zubereitungen gebildeten Gruppe; und

(b) Gewinnen der resultierenden optisch aktiven α-substituierten organischen Säuren der Formel (II)

worin R&sub1; und R&sub2; jeweils ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Alkoxygruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Aryloxygruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte heterozyklische Gruppe mit der Maßnahme darstellen, daß R&sub1; und R&sub2; voneinander verschieden sind; und X -CN oder -CONH&sub2; bedeutet, worin R&sub1; und R&sub2; die vorstehenden Bedeutungen besitzen.

2 Corynebacterium sp. Stamm KO-2-4 (FERM BP-2353).

3. Bacillus subtilis Stamm CN5 (FERM BP-2354).

4. Mycobacterium sp. Stamm AC777 (FERM BP-2352)

5. Nitrilase, die nicht mit Verbindungen mit einer Aminogruppe in α-Stellung reagiert, und von Acinetobacter sp. Stamm AK226 (FERM BP-2451), der ein racemisches α-substituiertes Nitril in eine optisch aktive α-substituierte organische Säure im Verfahren gemäß Anspruch 1 überführen kann.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Alkylgruppe 1 bis 8 Kohlenstoffatome, die Alkoxygruppe 1 bis 8 Kohlenstoffatome und die Cycloalkylgruppe 3 bis 8 Kohlenstoffatome besitzt, die Arylgruppe Phenyl oder Naphthyl ist, die Aryloxygruppe Phenyloxy oder Naphthyloxy ist und die heterozyklische Gruppe ein oder mehrere Heteroatome aus der durch Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel gebildeten Gruppe enthält und 3 bis 15 Kohlenstoffatome besitzt.