JPH05507625A - ２―アリール―アルカン酸のエナンチオマーの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２−アリール−アルカン酸のエナンチオマーの製法技術分野 本発明は、エナンチオ選択性アミダーゼの存在下に相当するＲおよびＳアミドの 混合物をエナンチオ選択性加水分解することにより酸のエナンチオマーを調製す る方法に関する。

これはまた前記方法に使用するためのアミダーゼを産生ずる微生物および固定化 アミダーゼに関する。

背景技術 以下に記載の式！で表わされる多くの農園芸用中間体および薬剤製品は最近では ラセミ混合物またはジアステレオマー混合物として市販されそして使用されてい る。多くの場合、生理学的効果は１つのエナンチオマー／ジアステレオマーのみ から特異的に由来し、一方、他のエナンチオマー／ジアステレオマーは不活性で あるかまたは有害でさえある。エナンチオ分別化のための化学的または酵素的技 術は光学的に高純度の薬品の製造のために次第に重要な手段になってきている。

微生物または酸素の存在下に相当するラセミアミドをエナンチオ選択性加水分解 することにより光学的活性酸たとえば２−アリールアルカン酸を酵素的に生産す ることがヨーロッパ特許出願公開筒３２６、４８２号から知られている。使用さ れる微生物はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびブ レビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ）属に属する。方法は有機 溶媒を用いることなくバッチ式で実施され、そして酵素活性物質は一度使用され た後廃棄された。このヨーロッパ特許出願公開筒３２６．４８２号の実施例にお けるデータによればＳアミドの酸への転化は約４０〜６５％の範囲であり、すな わちＳアミドの３５〜６０％が未転化のままである。生産された酸におけるＳ形 のエナンチオマー過剰分は９２〜９７％であった。微生物はＮ−メチルアセトア ミドを含む発酵基質中で培養された。

ヨーロッパ特許出願公開筒３５６，９１２号には、ラセミ脂肪族２−置換二トリ ルを光学的に活性な脂肪族２−置換カルボン酸へ転化しうるプソイドモナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フサリウム（Ｆｕｉａｒｉｕｍ）　＋　ロードコツカ ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｉｕ＋ｗ）、ミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏ　Ｃｏｃｃｕｓ）　、、バクテリウム （Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）およびバチルス（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ）の属からの 微生物が開示されている。

微生物はまた芳香族２−置換二トリルにおいても活性であると記載されているが 、裏付けのデータは示されていない０反応の完了後に相当するニトリルから得ら れるＳ酸のエナンチオマー過剰分は最大８４％であった。ニトリルの酸への転化 のためにロードコツカスを用いる場合、エナンチオマー過剰分は３５％であった ０発酵基質はニトリルを含んでいた。

ヨーロッパ特許出願公開筒３４８．９０１号は、ラセミ性α−置換二トリルまた はアミドをアルカリゲネス（＾ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、プソイドモナス（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロードプソイドモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏ口ｏｎ ａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ　ｔａｒ　ｔｕｓ）、アシネ トバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、 ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｗ）、ロードコツカス（Ｒｈｏｄ ｏｃｏｃｃｕｓ）およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の間から選択される微生 物で処理することにより光学的に活性なα−置換有機酸を製造する方法に関する 。この第３４８．９０１号公開物は本発明方法に使用するいずれの微生物も開示 していない。

本発明の目的はアミドたとえば２−アリールアルカン酸アミドの向上したエナン チオ選択転化を有する方法を提供するものである。

相当するニトリルおよびアミドからＳ酸を製造するために３３０の異なった土壌 サンプルから単離される８０９個の菌株の検査を記載する作業はＡｐｐｌ、　Ｅ ｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５６　（１９９０）、　３１２５に明ら かであり、これは本特許出願の先行データの後に公開された。

本発明の目的はまたエナンチオマーであるＲおよびＳアミドの混合物を２つのア ミドエナンチオマーの１つに相当する酸へ高純度および高収率で転化する方法を 提供するものである。

本発明の目的はまた誘導物質としてニトリルまたはアミドを必要とすることなく エナンチオ選択性アミダーゼを生産する方法を提供するものである。

本発明の記載 本発明は、エナンチオ選択性アミダーゼ活性を有する酵素的に活性な生物学的物 質の存在下に相当するＳおよびＲアミドの混合物をエナンチオ選択性加水分解す ることにより酸のエナンチオマーを製造する方法を提供するものである。この方 法により、二種類の収率が重要である。Ｎ単に言えば、二種類の収率とは一つは 転化度でありもう一つは得られた酸の純度である。転化度とは２つのエナンチオ マーアミドの１つが酸へ転化される程度である。得られた酸の純度はここではエ ナンチオマー過剰分と称し、そして以下のように定義される。以下に記載のよう に、本発明はこれら二種類の収率の少なくとも１つに関する限り優れている。

我々は驚くべきことに本発明方法により非常に高い転化度を得ることができるこ とを見出した。一定の反応条件下で、はぼ１００％の転化度を得ることさえ可能 である。

さらに驚くべきことに、本発明方法を用いて非常に高いエナンチオマー過剰分を 得ることができる。一定の反応条件下で、はぼ１００％のエナンチオマー過剰分 を得ることさえ可能である。

それゆえ本発明方法を完了しアミド除去後、得られたＲまたはＳ酸は非常に高純 度であり、はとんど１００％の純度の場合もある。したがってエナンチオマーで あるＲおよびＳアミドの出発混合物、場合によりＲおよびＳアミドのラセミ混合 物から、本発明方法により、Ｒ酸およびＳアミドがほとんど欠失したＳ酸および 未転化Ｒアミドの混合物を直接製造するかまたはＳ酸およびＲアミドがほとんど 欠失したＲ酸および未転化Ｓアミドの混合物を直接製造することができる。これ は簡潔な分離とより高収率を許す。

本発明方法により調製されうる適当な酸の例は、一般式ＩＸ−ＣＲ’Ｒ”　−Ｃ ｏｏｎ　（１） （式中、Ｘは場合によりハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基またはベンゾ イル基で置換されてもよいフェニルまたはナフチル基を表わし、Ｒ’　はヒドロ キシ基、アミノ基またはアルキル基を表わし、Ｒ２は水素原子またはアルキル基 を表わす）で表わされる化合物である。

本発明方法において出発物質として使用されうるアミドの例は、一般式■ Ｘ−ＣＲ’Ｒ”　−ＣＯＮｌｂ　（ＩＩ　）（式中、Ｒ＋、Ｒ２およびＸは各々 前記定義のものである）で表わされる化合物である。

明らかに、上述したフェニルおよびナフチル基は両方とも置換されていてよい、 ナフチル基はαまたはβナフチル基である。ハロゲン原子は、好ましくは塩素原 子およびフッ素原子である。アルキルおよびアルコキシ基は好ましくは低級アル キルおよび低級アルコキシ基である。以後、用語低級とは当該基が１０を越えな い、好ましくは４を越えない炭素原子を含むことを示す。

本発明方法で使用するアミドは場合によりその場で製造してもよい。

本発明方法で使用される酵素的に活性な生物学的物質はコナンチオ選択性アミダ ーゼ活性を有するので、この物質はここでアミダーゼと称される。

本発明の一つの見地において、本発明は前記生物学的物質を固定化することを特 徴とするものである。第二の見地において、この方法は加水分解を有機溶媒の存 在下に行なうことを特徴とするものである。

本発明方法で使用されるアミダーゼのエナンチオ選択性は、ラセミアミド、たと えば式■の酸、たとえばラセミ２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチル アミドの加水分解により測定されうる。

本発明方法により得られうる転化度は好ましくは約６５％以上、さらに好ましく は約９０％以上、よりさらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％ 以上である。好ましい高転化率はさらに以下の実施例で説明する特に好ましい反 応条件を用いて得られうる。

得られたエナンチオマー酸のエナンチオマー過剰分は好ましくは約８５％以上、 より好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上である。さら に以下の実施例で説明する特に好ましい反応条件を用いると、得られるエナンチ オマー酸のエナンチオマー過剰分は約９９％以上、より好ましくは約９９．５％ 以上、最も好ましくは約９９．９％以上である。エナンチオマー過剰分は以下の 式を用いてＲおよびＳ形の濃度から計算される： （（Ｓ）−（Ｒ））／　（（Ｓ）＋　（Ｒ））Ｘ１００％（式中、［Ｒ）および （Ｓ）はそれぞれＲおよびＳ形の濃度である）本発明はまたエナンチオ選択性ア ミダーゼ活性を有する酵素的に活性な微生物の生物学的に純粋な培養物を提供す るものである。実際、本発明は本質的にアミダーゼ活性を生ずる。すなわちたと えばアミドのような誘導物質を用いることなくアミダーゼ活性を生ずるロードコ ツカス菌株を記載する。

さらに、本発明は上記方法に使用するためのエナンチオ選択性アミダーゼ活性を 有する固定化された酵素的に活性な生物学的物質を提供するものである。さらに 、本発明はまた、ロードコツカス菌株から由来することを特徴とするエナンチオ 選択性アミダーゼ活性を有する生物学的物質およびニトリルまたはアミド（非置 換またはＮ−置換）を含まない培地中でアミダーゼ産生性ロードコツカス菌株の 培養を含むことを特徴とするエナンチオ選択性アミダーゼ活性を有する生物学的 物質を調製する方法を提供するものである。

これに加えて、本発明はまたエナンチオ選択性アミダーゼ活性を有する酵素的に 活性な微生物の生物学的に純粋な培養物およびこのような生物学的物質を調製す る方法を提供するものである。このような微生物はセラノティア、モラキセーラ またはプソイドモナスの菌株から得られうる。

発明の詳細な記載 本発明は、エナンチオマーであるＲおよびＳアミドの混合物に適切な反応培地中 で問題の生物学的物質の作用を受けさせることによりそれ自体公知の方法で実施 される。熟練者は本発明方法を実施するための都合の良い条件を決定することが でき、当然払われるべき注意は以下の実施例を含む本明細書に託される。

本発明の方法で使用される生物学的物質はそれ自体公知の方法で調製される。

アミダーゼ活性を存する生物学的物質は、ロードコツカスの本質的アミダーゼ産 生菌株、特にロードコンカスエリスロポリスＤＰ−１０からそれ自体公知の方法 で好ましく得られうる。この微生物菌株は、ブダペスト条約の条項下に、ＤＳＭ 　（ドイツチュ　ザームルングフオンミクロオルガニスメン　ラント　ゼルタル トレン　ゲーエムベーノｈ−、ブラウンシュバイヒ、ドイツ国（Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅ　Ｓａ＋＊ｍｌｕｎｇ　ｖｏｎＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ＋ｗｅｎ　ｕｎｄ　 Ｚｅｌｌｋｕｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、　Ｇｅｒｍａ ｎｙ）に、受入れ番号ＤＳＭ５９１０にて１９９０年３月２３日付で寄託された 。上記のように１９９１年２月２１日付で寄託された他のロードコツカス　エリ スロポリス菌株は０５Ｍ６３７４．　ＤＳＭ６３７５および［］５５Ｍ６３７８ （それぞれロードコツカス　エリスロポリスＮｏ、ＤＰ−１１，ＤＰ−２６およ びＤｐ−２５）を含む。

菌株ＤＳＭ５９１０は広い範囲の脂肪族および芳香族アミドをこれらの相当する 酸へ加水分解することができる。しかしながら、菌株はアミノ酸アミドたとえば フェニルグリシンアミドおよび多数の脂肪族アミノ酸アミドのＤおよびＬ型の両 方ともを加水分解する。この菌株（および他のロードコツカス属に属する菌株） が本発明にしたがってラセミアミドをエナンチオ選択性加水分解する能力を有す ることは非常に驚くべきことである。菌株ＤＳＭ５９１０はアミダーゼの産生に 対し本質的である。すなわちアミダーゼ活性の最大発現に対し誘導物質が必要で ないという点で有利である。

ロードコツカスアミダーゼは好ましくはエナンチオ選択性８５％以上、より好ま しくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、そして最も好ましくは９ ９％以上を有する。

アミダーゼ活性を有する生物学的物質はまたそれ自体公知の方法で、セラッティ ア、モラキセーラおよびプソイドモナスのアミダーゼ産生菌株から得られうる。

これらの菌株はブダペスト条約の条項下にＮＲＲＬ　（ノーザン　レジオナル　 リサーチ　ラボラトリイーズ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国、イリノイ州、ペオリア）にて以 下の受入れ番号で寄託された。プソイドモナスプチダＮＲＲＬ−Ｂ−１８６６９ およびモラキセーラ種ＮＲＲＬ−８−１８６７１は１９９０年７月８日に寄託さ れそしてプソイドモナスプチダＮＲＲＬ−８−１８８２０、プソイドモナス種Ｎ ＲＲＬ−Ｂ−１８８１９およびセラッテイアリクウエファシエンスＮ［ＩＲＬ− Ｂ−１８８２１は１９９１年５月９日に寄託された。

本発明によれば、この方法は、一般に均質または不均質の水性または水性・油性 培地中で微生物からの固定化細胞、全細胞または細胞抽出物およびアミドと得ら れる酸の混合物の関数として決められた温度およびｐＨ値条件にて実施される。

酵素反応はバッチ式または連続式条件下に固定化細胞を用いて実施される。

本発明方法のための出発物質は予め調製されたアミドでよい；これはたとえば相 当するニトリルの化学的または酵素的加水分解により作られうる。これに代わっ て、アミドをたとえば相当するニトリルの酵素加水分解によりその場で作っても よい。

反応完了後、エナンチオマー酸を反応混合物から回収しそして常法により精製す ることができる。ＲおよびＳアミドの混合物（たとえばラセミ混合物）を出発物 質として使用した場合、この方法の結果Ｓ酸およびＲアミドの混合物またはＲ酸 およびＳアミドの混合物が得られる。酸からアミドを分離後、アミドを公知の方 法でラセミ化してラセミアミドとしこれをすでに記載のように再生利用して加水 分解することができる。ラセミ化は、第四アンモニウム官能基を含む陰イオン交 換樹脂たとえばトルエンまたは他の非水性溶媒中ＯＨ形のアンバーライトＩＲＡ −４００でアミドを還流することにより実施さ全細胞、細胞ペースト、均質化細 胞または粗製もしくは精製した酵素溶液である。固定化は、公知方法たとえば架 橋によりたとえば米国特許第４８９２．８２５号明細書にしたがってグルタルア ルデヒドまたはポリアゼチジンを用いて実施されうる。固定化物質は、固定床カ ラムまたは撹拌されたタンク反応器中のいずれかにて連続法で使用されるのが好 ましい、有機溶媒を使用する場合、撹拌したタンク反応器を使用するのが特に好 ましく、ここでは固定化物質および有機溶媒相は親水膜により保持される（たと えば、例８、図１）０本発明方法で使用されるべき有機溶媒は水混和性（たとえ ば、ジメチルスルホキシド）または水不混和性（たとえば、トルエンまたはオク タン）である。溶媒の量は一般に反応系の２〜２０重量％である。

本発明方法は一般式Ｉで表わされる２−アリールアルカン酸を作るために使用さ れうる。

本発明方法は、特に式中アリール基Ｘがフェニル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−イ ソブチルフェニル、３−ベンゾイルフェニル、β−ナフチルまたは６−メドキシ ー２−ナフチル基でありそしてＲと称する基はヒドロキシ、メチル、エチルまた はイソプロピル基である酸の製造に特に適する。

本発明により製造されうる酸の特定例のいくつかは、２−（４−クロロフェニル ）−３−メチル酪酸（以後ＣＰＩＡとする）、（６−メドキシー２−ナフチル） ヒドロキシプロピオン酸、２−（６−メドキシー２−ナフチル）−プロピオン酸 、２−（４−イソブチルフェニル）プロピオン酸、２−フェニル−２−ヒドロキ シプロピオン酸および２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸である。

略語 ＣＰＩＡｍは２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチルアミドであり、Ｃ ＰＩＡは２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチル酸であり、ＩＢＡｍは ２−（４−イソブチルフェニル）プロピオンアミドであり、ＩＢＡＣは２−（４ −イソブチルフェニル）プロピオン酸（イブプロフェン）であり、ＮＰＡ■は２ −（６−メドキシー２−ナフチル）プロピオンアミドであり、ＮＰＡＣは２−（ ６−メドキシー２−ナフチル）プロピオン酸（ナプロキセン）であり、ＡＴＡＩ は２−フェニル−２−ヒドロキシプロピオンアミドであり、ＡＴＡＣは２−フェ ニル−２−ヒドロキシプロピオン酸でありそして［ＩＰＬＣは高性能液体クロマ ドグ続〈実施例において、上記したアミドおよび酸生成物は逆相高性能クロマト グラフィにより測定された。メタノール７０〜７５％および０．１％Ｈ：１ＰＯ ４で酸性化されたｕｔｏ　２５〜３０％またはアセトニトリル６７％および０． １％ＨｉＰＯｎで酸性化されたａｔｏ　３３％の可動相を使用するゾルパックス （Ｚｏｒｂａｘ）　Ｃ１８カラムを使用した。酸生成物のクロマトグラフィによ る同定および定量は信鱈すべき標準物と比較することにより測定した。

ＣＰＩＡｍ／ＣＰＩＡ、　ＮＰＡ＊／ＮＰＡＣおよびＩＢＡｍ／ＩＢＡＣの分離 に対するキラル）ＩＰＬＣは、クロムテッヒ　（Ｃｈｒｏｍｔｅｃｈ）　（スウ ェーデン）製のα、−ＡＧＰカラムを用いて実施された。様々なエナンチオマー の分離に対する可動相を以下にまとめる。

アミドおよび酸エナンチオマーのキラルＨＰＬＣ分離エナンチオマー　可　動　 相 ＣＰＩＡ＋ｗ、　ＣＰＩＡ　９５％０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，０）　 ：　５％エタノール ＮＰＡｍ、　ＮＰＡＣ９５％０．０４Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ５，６）　７５％ エタノール ＩＢＡｍ、　ＩＢＡＣ９６％０．０２Ｍリン酸塩緩衝液＜ｐＨ５，２）　：　４ ％エタノール ＡＴＡ鋼およびＡＴＡＣエナンチオマーの分離に対するキラルＨＰＬＣをレゾル ボシル（Ｒｅｓｏｌｖｏｓｉｌ）　ＢＳＡ−７カラム（アルチッチ（ＡＩｌｔｅ ｃｈ）社）を用いて実施した。ＡＴＡｍ／ＡＴＡＣエナンチオマー組成に用いる 可動相は０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，０）であった、上記アミドおよび 酸のエナンチオマー組成、純度およびクロマトグラフィによる同定は、信鯨すべ き標準エナンチオマーまたはラセミ混合物と比較することにより測定された。

製造例 Ｒ，５−ＣＰＩＮのＲ，５−ＣＰＩＡ−への化学的加水分解ラセミ２−（４−ク ロロフェニル）−３−メチルブチロニトリル９．６９ｇ　（５０ミリモル）、ジ オキサン７５＋ｄ、水７５Ｍ１およびアンバーライトＩＲＡ−４００（ＯＨ）樹 脂２５．２ｇを含む懸濁液を撹拌し、６４時間還流加熱した。樹脂を濾過後、濾 液を蒸発乾固しそして５０〜５５°Ｃにて減圧濾中で乾燥すると粗製ラセミＣＰ ＩＡｄ、８　ｇが得られた。回収した物質の組成を）ＩＰＬｃで決定した。

回収した物質はラセミ２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチロニトリル ３．６ミリモルおよびラセミＣＰＩＡｍ　４６．４ミリモルを含んでいた。

例１ エナンチオ選択性アミダーゼ活性を存する生物学的物質の調製使用した微生物は 、ロードコツカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐ ｏｌｉｓ）　０５Ｍ５９１０（ＤＰ−１０）　、ロードコツカス　エリスロポリ スＤＳ門６３７４（ＯＰ−１１）　、ロードコツカス　エリスロポリスＤＳＭ６ ３７８（ＤＰ−２５）　、ロードコツカス　エリスロポリスＤＳＭ６３７５　（ ＤＰ　−２６）、プソイドモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｐｕｔｊ ｄａ）　ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６６９（１３−５５−ＡＣＮ−２８）、モラキセー ラ種（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｓｐ、）　ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６７１（３Ｌ−Ａ− １−５−１ａ−１）　、プソイドモナス　プチダＮＲＩ？Ｌ−８−１８８２０（ ２Ｄ−１１−５−１ｂ）、プソイドモナス種ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８１９（２Ｄ− １１−５−１ｃ）およびセラッテイアリクウエファシエンス　（Ｓｅｒｒａｔｉ ａ　Ｉｉｇｕｅｆａｃｆｅｎｓ）ＮＲＲＬ−８−１８８２１（ＭＯＢ１？Ｉ／Ｎ ３）である。

プソイドモナス、セラッティアおよびモラキセーラ菌株の培養に使用する増殖培 地は以下の成分からなる。

工Ｚ上 ＫＨｉＰＯ４８，８５ クエン酸ナトリウム　２．２５ Ｍｇ５Ｏａ、７Ｈｔ０　０．５ ＦｅＳＯａ、７Ｈｚ８　０．０５ グルコースａ　１０．０ 微量元素溶液ｃ　１．Ｏｍ ビタミン溶液ｄ　１．Ｏｄ ニトリル　２．７ｇ オートクレーブ後の添加 微量元素溶液：２５％Ｈｃｌ　１０ａｆ、Ｆｅｃｌｇ・４ＨｚＯ１，５ｇ、　Ｃ ｏｃｌｆ・６ＨｚＯＯ，０１９ｇ、　Ｍｎｃｌｇ　・４Ｈｔ００．１ｇ、　Ｚｎ ｃｌｇ　０．０７ｇ、　Ｈ３ＢＯ３０，０６２ｇ。

ＮａＭｏＯ４・２）１ｚＯ０，０３６ｇ　：　Ｎｉｃｌｇ　・６Ｈｚｏ　０．０ ２４ｇ、およびＣｕｃｌｚ　・２ＨｚＯＯ，０１７ｇ　、　Ｆｅｃｌｇ　・４Ｈ ｚＯをＨｃｌに溶かし蒸溜水を加えて１２にする。

ビタミン溶液：ビオチン０．０１ｇ、葉酸０．０１ｇ、ピリドキシンＩ’１ｃｌ Ｏ，０５ｇ　、リボフラビン０．０２５　ｇ　、チアミンＨｃｌ　Ｏ，０２５ｇ 　、ニコチン酸０．０２５　ｇ　、パントテン酸０．０２５　ｇ　、ビタミン［ １＋ｇ　０．００６５ｇ、　Ｐ　−アミノ安息香酸０．０２５　ｇおよび千オ酢 酸０．０２５ｇ、　１．４−ジシアノブタン（プソイドモナスプチダ１３−５Ｓ −ＡＣＮ−２ａ）　、２−メチルゲルタロニトリル（プソイドモナス種　２Ｄ− １１−５−１ｃ、プソイドモナスブチダ２Ｄ−１１−５−１ｂ、　七うンｆイ？ ’Ｊり’ｙｓ７ｙ’ｔ７ｘスＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３、モラキセーラ種　３Ｌ−Ａ− １−５−１ａ−１）。

上記培地（ＰＲ／グルコース）　１０ａｆ容量に凍結貯蔵培養物０．１ｊｄを接 種した。　２５０ＲＰＭにて振とう基中室温（２２〜２５℃）で−晩増殖後、接 種材料１０−を２１！フラスコ中の新しい培地９９０ｍへ加えた。培地中に泡を 発生させるのに十分な高速で電磁撹拌しながら細胞を１８〜２４時間増殖した。

遠心分離により細胞を採取し、０．８５％食塩水で一回洗い、そして濃縮したペ ーストを貯蔵のために一７０°Ｃの凍結器に直ちに入れた。

例２ エナンチオ選択性アミダーゼ活性を存する生物学的物質の調製ロードコツカスエ リスロポリスＤＰ　、１０の培養のために使用される増殖培地は以下の成分によ り作られた。

工Ｚ上 ＫＨｔＰＯａ　９．０Ｏ ＮａｘｌｌＰＯｍ　−２Ｈｚｏ　２１．０ＯＮａｃｌ　Ｏ，５０ ＣａＣ１ｚ　’２Ｈ２００，０２ ＭｇＳＯ４・７ｎｚｏ　Ｏ，３０ （ＮＨ，）　、ＳＯ，３，５０ 酵母抽出物（ディフコ）　Ｏ，ＳＯ グルコース”　３．７５ 微量元素溶液”　１０．００ｄ ｐＨ値　７．５ ０オートクレーブ後に添加 ９０微量元素溶液５Ｌ−７（たとえばＯ３？ｌ、菌株カタログ、１９８３．　ｐ ２９６）これらの成分を水９００ｄに溶かし、リン酸／水酸化ナトリウムを加え ることによりＰＨ値を７．５に調節し、そして水を添加することにより溶液を１ ２とした。

上記増殖培地１００Ｍ！１を５００　Ｉ１１エルレンマイヤーフラスコへ加えオ ートクレーブした。グルコースを滅菌貯蔵溶液からの冷却培地へ添加した（２０ ％、重量／容量）、ロードコツカスエリスロポリスＤＳＭ５９１０を接種したエ ルレンマイヤーフラスコを２８時間振とう５中で３０℃にて培養した。

遠心分離（ツルバール５ｏｒｖａ　１１登録商標　遠心分離器中１５分間２０、 ０ＯＯｒｐ■）により細胞を採取し、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸塩緩衝液で２回洗 浄した。洗浄した細胞ペレット（＝細胞ペースト）を４°Ｃで貯蔵するかまたは 凍結した（−２５°Ｃ）。

例３ エナンチオ選択性アミダーゼ活性を有する生物学的物質の固定化例２で記載した ように得られた新しい細胞ペーストを前記のように固定化した（米国特許第４． ８９２．８２５号明細書、例１１）。

例４ ０−ドコツ力スエリスロボリスＤＰ−１０による５−ＣＰＩＡｍの５−ＣＰＩＡ への加水分解 乾燥した固定化ロードコツカスエリスロポリス０Ｐ−１０のサンプル７５ｍｇを リン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．０）　３　ｄへ加え、４°Ｃに て１時間インキュベートした。固定化細胞懸濁液を室温まで温めそしてジメチル スルホキシド（以後、ＤＭＳＯと称する）１２０ｄ中の５−ＣＰｒＡｌ１．３ｍ ｇ　（２９，８μモル）を加えた。５０℃にて４８時間撹拌しながらインキュベ ーション後、反応物を３Ｍ＋（，５０４で酸性化してＰＲ値３．０にした。塩化 メチレン４容量に加えそして懸濁液を１５〜３０分間撹拌した。塩化メチレン層 を除去し、窒素ガス気流下に蒸発乾固し、残渣をメタノール３ｒｄ中に懸濁した 。

メタノール溶液の組成をＩ（ＰＬＣにより測定した。

抽出した上澄液は０．５μモルＣＰＩＡｍおよび２８．３μモルＣＰＩＡを含有 した。

キラルＨＰＬＣによるエナンチオマー組成の測定により５−ＣＰＩＡのエナンチ オマー過剰分は９９％であった。

比較例 ロードコツカスエリスロポリス０Ｐ−１０によるＲ−ＣＰＩＡｅｌの加水分解乾 燥した固定化ロードコツカスエリスロポリス０Ｐ−１０のサンプル７５−ｇをリ ン酸塩緩衝液（１００■Ｌ　ｐｔ＋値：　７．０）　３　ｄへ加え４℃にて１時 間インキュベートした。固定化細胞懸濁液を室温まで温めそして０Ｍ３０１２０ ｕｌ中のＲ−ＣＰＩＡｍ６．３ｍｇ　（２９，８ｕモル）を加えた。５０℃で４ ８時間撹拌しながらインキュベーション後、反応物を３ＭＨ！Ｓｏ、で酸性化し てｐＨを３．０にした。塩化メチレン４容量を加えそして懸濁液を１５〜３０分 間撹拌した。塩化メチレン相を除去しそして窒素ガス気流下に蒸発乾固したゆメ タノール溶液の組成はＩＩＰＬＣにより測定した。

抽出した上澄液はＣＰｒＡｌ１２２．７ａモルおよびＣＰＩＡ　０．５μモル未 満を含有した。

酸の量は出発物質における不純物として存在する量に相当する。

Ｒ−ＣＰＩＡｗの不完全な回収はほとんどが実験上の誤りおよび／または基質の 細胞および／または支持材料への吸着によるものであった。

例５ ０−ドコンカスエリスロボリスＤＰ−１０によるＲ、５−ＣＰｒＡｌ１の５−Ｃ ＰＩＡへの加水分解 乾燥した固定化ロードコツカスエリスロポリスＤＰ−１０のサンプル７５−ｇを リン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．０）　３　ａｆへ加え、４℃に て１時間インキュベートした。固定化細胞懸濁液を室温まで温め、ＤＮＳ０１２ ０ｐｌ中のｊｌ、５−ＣＰＩＡｍ６．３ｍｇ　（２９，８μモル）を加えた。５ ０°Ｃで４８時間撹拌しながらインキュベージラン後反応物を３ＭＨ，ＳＯ，で 酸性化してｐＨ値３．０とした。塩化メチレン４容量を加えそして懸濁液を１５ 〜３０分間撹拌した。塩化メチレン相を除去しそして窒素ガス気流下に蒸発乾固 した。メタノール溶液の組成をＨＰＬＣにより測定した。

抽出した上澄液はＣＰＩＡｍ　１２．５ａモルおよびＣＰｒＡｌ１．８μモルを 含有した。

キラル［ＩＰＬＣによるエナンチオマー組成の測定によりＲ−ＣＰＩＡ−のエナ ンチオマー過剰分は１００％であり５−ＣＰＩＡのエナンチオマー過剰分は１０ ０％であった。

例６ ０−ドコツカスエリスロポリスＤＰ−１０によるＲ、５−ＣＰｒＡｌ１の５−Ｃ ＰＩＡへの加水分解 Ｒ，５−ＣＰＩＡｓ　５９．８μモルと７２時間インキュベーシッンを用いて例 ５の手法を繰り返した。メタノール溶液の組成はＨＰＬＣにより測定された。

抽出した上澄液はＣＰＩＡｍ　３１．９ａモルおよびＣＰｒＡｌ１．８μモルを 含有した。

キラルＩ（ＰＬＣによる抽出した上澄液のエナンチオマー組成の測定により、５ −ｃｐｒ軸　４．８μモル、Ｒ−ＣＰＩＡｍ　２７．１μモルおよび５−ＣＰｒ Ａｌ１．８μモルが示された。　５−ＣＰＩＡのエナンチオマー過剰分は１００ ％であっ颯 例７ ０−ドコツカスエリスロポリスＤＰ−１０によるトルエン中のＳ−ＣＰＩＡｍの ＣＰＩＡへの加水分解 乾燥した固定化ロードコツカスエリスロポリスｆｌＰ−１０のサンプル３００ｍ ｇをリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値ニア、０）１２ｍへ加え、混合物を １時間４℃にてインキュベートした。固定化細胞懸濁液を室温まで温め、リン酸 塩緩衝液をデカンテーションにより除去した。１１００１ＩＩリン酸塩緩衝液（ ｐＨ値：　７．０）で飽和したトルエン１２ｄを加えた。トルエン飽和緩衝液は 、トルエンと１００ｓ＋Ｍ　１７ン酸塩緩衝液（ｐＨ値ニア、０）の等容量を混 合し、振とうし、相を分離し、そして水相を除去することにより調製した。　５ −ＣＰＩＡ脂（１９，７ｇモル／：）ｄ）１１８ｇモルを添加後、トルエン懸濁 液を３０℃にて撹拌しながらインキュベーションした。サンプル２ｄを４８時間 および１２０時間で除去し、そして各サンプルを窒素ガス気流下に蒸発乾固した 。各サンプルをメタノール２ｄ中に再懸濁しメタノール溶液の組成をＩＩＰＬｃ により測定した。

４８時間後、トルエンの上澄サンプルはＣＰＩＡｓ＋　１１．４μモルおよびＣ ＰＩＡ　５．７μモルを含み、１２０時間後これはＣＰＩＡｍｌ、９ｇモルおよ びＣＰＩＡ　９．４μモルを含有した。

例８ ０−ドコツカスエリスロポリスＤＰ−１０による緩衝液／オクタンにおける５− ＣＰＩＡへのＳ−ＣＰＩＡｍの加水分解乾燥した固定化ロードコツカスエリスロ ポリスＤＰ−１０のサンプル５００ｍｇを、リン酸塩緩衝液（１００ｗＭ、　ｐ Ｈ値：　７．０）１６１ｄおよびｎ−オクタン４ｄからなる二相溶液へ添加した 。固定化細胞懸濁液を３時間５０℃にてインキュベートした。Ｓ−ＣＰＩＡｍｌ Ｏｓｇ（４７，４μモル）を添加しそして５０°Ｃおよび６００ｒｐ−にて６時 間インキュベージジン後に、各相のアリコート０．５ｊｄを除去した。各アリコ ートをｌ０Ｎ）ＩｃｌでｐＨ２，０まで調整した。塩化メチレン４容量を各アリ コートへ加え、懸濁液を１５分間撹拌した。塩化メチレン層を除去し、空気流下 に蒸発乾固しそして各残渣をメタノール０．５１ｄ中で再懸濁した。メタノール 溶液の組成は［’ＬＣにより測定した。

抽出した上澄液には次のものが含まれていた：化合物　緩衝液相　オクタン相 ＣＰＩＡａ＋　０．５μモル　０ ＣＰＩＡ　１９．８ｇモル　１．９μモル例９ ０−ドコツカスエリスロポリス０Ｐ−１０による緩衝剤／オクタンにおける５− ＣＰＩＡへの連続５−ＣＰＩＡ―加水分解乾燥した固定化ロードコツカスエリス ロポリスＤＰ−１０のサンプル３．７４ｇを、底部に取り付けられた親水性膜（ ＰＴＧＣ０４３１０）を有するミリボア超遠心分離セルからなる反応器へ加えた 。固定化細胞をリン酸塩緩衝液（１００ｇ＊Ｍ、　ｐＨ値：　７．０）５０ｄと ｎ−オクタン２０Ｗｉ中で５０°Ｃにて２時間インキュベートした。　５−ＣＰ ＩＡｓ＋６４ｍｇ　（３０３，３μモル）を添加後、反応器を閉じそしてあらか じめＳ−ＣＰＩＡｍで飽和したリン酸塩緩衝液（１００＋Ｍ、　ｐＨ値：　７． ０）を送る螺動性ポンプの作動を開始した。

液体供給速度は２０ａｆ／ｈに調整され反応系に対する３、５時間の水圧保持時 間にした。浸透膜が緩衝層を選択的に通過しそしてｎ−オクタンおよび固定化ロ ードコツカスエリスロポリスＤＰ−１０を保持した。

反応器の配置を図１に模式的に示す。

反応器流出液を一定の間隔を置いた時間ごとに集め、例７に記載のように抽出し 、そしてＣＰＩＡ＋＊およびＣＰＩＡに対すＨＰＬＣにより分析した。

サンプル分析を出口における以下の速度に直した：経過時間　ＣＰＩＡｍ　ＣＰ ＩＡ 分　μモル／時　μモル／時 ４０　１２．５　１４．５ １１５　９．１　２４．１ １８０　４．４　３２．７ 例１１ ０５−ＣＰＩＡの樹脂ラセミ化 ５−ＣＰＩＡｓｌ、Ｏｇ　（４，７ミリモル）、アンバーライトＩＲＡ−４００ （ＯＨ）樹脂１．０ｇおよびトルエン２５ｍを含む懸濁液を撹拌し、４０時間還 流加熱した。樹脂を濾去後、濾液を蒸発すると結晶性固体０．９４　ｇが得られ た０回収された物質のエナンチオマー組成をキラルＨＰＬＣにより測定し、５４ ％Ｓ−ＣＰＩＡｍおよび４６％Ｆｌ−ＣＰＩ篩を示した。

例１１ ０−ドコツカスエリスロポリスＤＰ−１０によるＳ−ＣＰＩＡｍ、Ｒ−ＣＰＩＡ ＋ｗおよびＲ，Ｓ−ＣＰＩＡｍの加水分解 ロードコツカスエリスロポリス０Ｐ−１０の凍結した細胞ペーストのサンプル５ ０■ｇを室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．０）　１　ｄ へ加えた０次いでジメチルスルホキシド４０μｉ中の５−ｃｐｒ＾■またはＲ， Ｓ−ＣＰＩＡｍ９．４μモルを加えた。４８時間５０℃にてインキュベーション 後、反応物を３　Ｍｌｌ！ＳＯ４で酸性化してｐＨ値３とした。塩化メチレン４ 容量を加え、懸濁液を１５〜３０分間撹拌した。塩化メチレン相に除きそして窒 素ガス気流下に蒸発乾燥し残渣をメタノール１ｄに懸濁した。メタノール溶液の 組成は逆相１（ＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣにより測定されそして表１に示され る。

表１ ０−ドコツカスエリスロポリスロＰ−１０によるＳ−ＣＰＩＡｍ、　Ｒ−ＣＰＩ ＡｍおよびＲ，５−ＣＰＩＡ麟加水分解 Ｓ−ＣＰＩＡｍ　（９，４）　ＮＤ”　９．１　ＮＯ”　ＮＯ”　９．１　ＮＤ ”Ｒ−ＣＰＩＡｍ　（９，４）　８．２　ＮＤ慕・ｂＮＴ　ＮＴ　ＮＴ　ＮＴＲ ，５−ＣＰＩＡ＋ｍ（９，４）　４．７　４．６　ＴＲ’　４．７　４．６　Ｎ Ｄ”’ＮＯ＝検知せず。

’　Ｒ−ＣＰＩＡｗ出発物質におけるＲ−ＣＰＩＡ不純物に対する正しいデータ 。

ｃＮＴ＝試験せず。

’ＴＲ＝検知されたこん踏量。

回収された５−ＣＰＩＡのエナンチオマー過剰分は１００％であった。

例１２ ０−ドコツカスエリスロボリスＤＰ−１０によるＲ、Ｓ−＾ＴＡ＋ｗのＲ−ＡＴ ＡＣへの加水分解 ロードコツカスエリスロポリスＤＳＭ　５９１０（ＤＰ−１０）の凍結した細胞 ペーストノサンフル５０＃ｇをＩ７７酸塩緩衝液（１０（ｌｓＭ、　ｐＨ（ｉ　 ：　７．０）　１ｄへ室温にて加えた０次いでジメチルスルホキシド４０μｉ中 のＲ，５−ＡＴＡｓ１２．１Ｎモルを加えた。４８時間撹拌しながら２８゛Ｃに てインキュベーション後、反応混合液を遠心分離して細胞破片を除きそして上澄 液を０．２μ膜フイルターに通過させた。清澄化した上澄液の組成を逆相ＨＰＬ ＣおよびキラルｔｌＰＬｃにより測定しそして表２に示す。

１Ｌ２ ０−ドコツ力スエリスロポリスＤＰ−１０によるＲ、Ｓ−＾ＴＡ−加水分解ＨＰ ＬＣれた　モル 基質　−！　−一土立土一−−−−−−−−゛　れた　モル）　ＡＴＡｓ　ＡＴ ＡＣＳ−＾ＴＡ偏Ｒ−ＡＴＡｍ　５−ＡＴＡＣＲ−ＡＴＡＣＲ，５−ＡＴＡｓ（ １２，１）　３．３　４．２　３．３　ＴＲ”　０．３　３．９”ＴＲ＝検知さ れたこん踏量。

Ｒ，Ｓ−ＡＴＡｍの不完全な回収はほとんどが実験上の誤差および／または細胞 への基質の吸着のためであった６回収されたＲ−ＡＴＡＣのエナンチオマー過剰 分は８６％であった。

例１３ ０−ドコツカスエリスロポリスＤＰ−１１による５−ＣＰＩＡ＋ｓ、Ｒ−ＣＰＩ ＡｍおよびＲ，Ｓ−ＣＰＩＡｍの加水分解 ロードコツカスエリスロポリスＤＰ−１１の凍結した細胞ペーストのサンプル５ ０ｍｇを室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値ニア、０）ＩＨｌへ加 えた０例１１と同じ方法にて、Ｓ−ＣＰＩＡｍもしくはＲ−ＣＰＩＡｍまたはＲ ，５−ＣＰＩＡｍ９．４μモルを加えた。Ｎｉｌのように同じインキュベーショ ンおよび抽出記録の後で、抽出された上澄液の組成を逆相およびキラルＨＰＬＣ により測定した。結果を表３に示す。

表３ ０−Ｆコｙカス！！ＪスＯボ’ＪスＤＰ　ＩＩにょるＳ−ＣＰＩＡｍ、　Ｒ−Ｃ ＰＩＡｍおよびＲ，５−ＣＰｒＡｍ加水分解 １（ＰＬＣれた　モル 基質　−１柾−一一土ｉ土−−−−−−−−−”、　ｈｔ、＝　モル）ＣＰＩＡ ｍ　ＣＰＩＡ　Ｓ−ＣＰＩＡｍ　Ｒ−ＣＰＴＡｗ　５−ＣＰＩＡ　Ｒ−ＣＰＴＡ Ｓ−ＣＰＩＡｍ　（９，４）　４．７　４．７　ＴＲ”　ＮＯ’　４．７　Ｎ０ ｈＲ−ＣＰＩＡｓ　（９，４）　８．３　ＮＤ”ＮＴ’　ＮＴ’　ＮＴ’　ＮＴ ’Ｒ，Ｓ−ＣＰＩＡｍ（９，４）　６．３　２．８　１．８　４．５　２．８　 ＮＤ＋亀ＴＲ＝検知されたこん踏量。

’ＮＯ＝検知せず。

ＣＲ−ＣＰＩＡｓ出発物質におけるＲ−ＣＰＩＡ不純物に対し修正したデータ。

’１ｌｌＴ＝試験せず 回収された５−ＣＰＩＡのエナンチオマー過剰分は１００％であった。

例１４ ０−ドコツカスエリスロポリス０Ｐ−１１にょるＲ、Ｓ−ＡＴＡｍのＰ−ＡＴＡ Ｃへの加水分解 ロートコ７カスエリスロポリスＤＰ−１１の凍結細胞ペーストのサンプル５０ｖ ａｇを室温ニテ１７７酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．０）　Ｉ　ｄ へ加えた。例１２．Ｉ［（７）方法テ、Ｒ，Ｓ−ＡＴＡｍ１２．１μモルヲ加え た。Ｎ１２におけるのと同じインキュベーション、遠心分離および濾過経過に続 いて、抽出した上澄液の組成を逆相ＨＰＬＣおよびキラルＩ’１ＰＬＣにより測 定した。結果を表４に示す。

表４ ０−ドコツカスエリスロポリス０Ｐ−１１によるＲ、Ｓ−ＡＴＡｍ加水分解ＨＰ ＬＣれた　モル 基質　−１租−−一土立土一一−−−−−−−（’、、　ｈタモル）　ＡＴＡｓ 　ＡＴＡＣ５−ＡＴＡｓ　Ｒ−ＡＴＩｌ＋＋　５−ＡＴＡＣＲ−ＡＴＡＣＲ，Ｓ −ＡＴＡｍ（１２，１）　４．８　１．２　３．４　１．４　ＮｒＪ”　１．２ 亀ＮＤ＝検知されたこん踏量。

Ｒ，５−ＡＴＡ＋＊の不完全な回収率はほとんどが実験誤差および／または細胞 への基質の吸着によるものであった０回収されたＲ−ＡＴＡＣのエナンチオマー 過剰分は１００％であった。

例１５ ０−ドコｙカス：Ｌ！ＪスＯボ’）スＤＰ　２５によルＳ−ＣＰＩ１１ｗ、　Ｒ −ＣＰＴＡｗおよびＲ，Ｓ−ＣＰＩＡｗの加水分解 ロードコツカスエリスロポリスＤＰ　−２５の凍結した細胞ペーストのサンプル ５０Ｉ１ｇを室温ニＴ　＋Ｊ　７酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．０ ）　１　ｍへ加えた。例１１と同じ方法で、Ｓ−ＣＰＩＡｍもしくはＲ−ＣＩ” ｒＡｎ＋またはｌ？、５−ＣＰＩＡＩＩ９．４μモルを加えた。例１１と同じイ ンキュページせンおよび抽出経過に続いて、抽出した上澄液の組成を逆相および キラル１（ＰＬＣにより測定した。結果を表５に示す。

表５ ｏ−Ｆ：２−ｔカスエ’）スＯホ’）スＤＰ−２５ニョルＳ−ＣＰＩＡｍ、Ｒ− ＣＰＩＡｍおよびＲ，５−ＣＰｒＡｍ加水分解 （゛しな　−１：／ｌ／）　ＣＰＩＡＩＩ　ＣＰＩＡ　５−ＣＰＩＡＩＩ　Ｒ− ＣＰＩＡＩＩ　５−ＣＰＩＡ　Ｒ−ＣＰＩＡＳ−ＣＰＩＡｒｓ　（９，４）　６ ．０　３．２　１．７　４．３　３．２　ＮＤ”Ｒ−ＣＰＩＡｍ　（９，４）　 ８．４　ＮＤ”’　ＮＴｃＮＴｃＮＴｃＮＴ’Ｒ，Ｓ−ＣＰＩＡｍ（９，４）　 ６．２　３．１　１．８　４．４　３．１　ＮＤ””ＮＤ＝検知せず。

ｂＲ−ＣＰＩＡ−出発物質におけるＲ−ＣＰＩＡ不純物に対する修正ｃＮＴ＝試 験せず 回収された５−ＣＰＩＡのエナンチオマー過剰分は１００％であった。

例１６ ０−ドコツ力スエリスロポリスＤＰ　−２５にょるＲ、５−ＡＴＡ−のＲ−ＡＴ ＡＣへの加水分解 ２４個のロードコツカスエリスロポリスの凍結した細胞ペーストのサンプル５抛 ８を室温ニテリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＦＩ値：　７．０）　１　ｄへ 添加した。例５と同じ方法で、Ｒ，Ｓ−ＡＴＡｍ１２．１μモルを添加した０例 １２と同じインキュベーション、遠心分離および濾過経過に続いて、抽出した上 澄液の組成を逆相ＢＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣにより測定した。

結果を表６に示す。

表６ ０−ドコツカスエリスロボリスＤＰ−２５による！１．５−ＡＴＡ−加水分解Ｈ ＰＬＣれた　モル 基質　−１祖−一一土立及−−−−−−−−−（′　れた　モル）ＡＴＡｍ　Ａ ＴＡＣ５−ＡＴＡ＋ｗ　Ｒ−ＡＴＡｓ　５−ＡＴＡＣＲ−ＡＴＡＣＲ，５−ＡＴ Ａｓ（１２，１）　９．７　１．８　６．２　３．５　ＮＪ）”　１．８１ＮＯ ＝検知せず。

回収されたＲ−ＡＴＡＣのエナンチオマー過剰分は１００％であった。

例１７ ０−ドコツカスエリスロボリスＤＰ　−２６によるＳ−ＣＰＩＡｍ、Ｒ−ＣＰＩ Ａ＋＋およびＲ，５−ＣＰＩＡ曽の加水分解 ロードコツカスエリスロポリスＤＰ　−２６の凍結した細胞ペーストのサンプル ５０Ｉ１ｇを室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．０）　１ 　ｄへ加えた０例１１と同じ方法で、５−ＣＰＩＡｍもしくはＲ−ＣＰＩＡｍま たはＲ，５−ＣＰＩＡｄ、４μモルを添加した０例１１と同じインキュベーシヨ ンおよび抽出経過に続いて、抽出した上澄液の組成を逆相およびキラルＨＰＬＣ により測定した。これらの結果を表７に示す。

表７ ０−ドコツカスエリスロボリスＤＰ　−２６による５−ＣＰＩＡｓ、Ｒ−ＣＰＩ Ａ−およびＲ，５−ＣＰＩＡｍの加水分解 ＨＰＬＣれた　モル 基質　−ｍ　−一土立止−−−−−−−−−（゛　れた　モルシンＣＰＩＡａ　 ＣＰＩＡ　５−ＣＰＩＡｍ　Ｒ−ＣＰＴＡｍ　５−ＣＰＩＡ　Ｒ−ＣＰＩＡＳ− ＣＰＩＡｍ　（９，４）　４．６　４．７　ＴＲ”　４．６　４．７　ＮＤゝＲ −ＣＰＩＡｍ　（９，４）　８．４　ＮＯ”　ＮＴ’　ＮＴ’　ＮＴ’　ＮＴ’ Ｒ，５−ＣＰＩＡｍ（９，４）　５．７　３．２　１．５　４．２　３．２　Ｎ Ｏ’”ＴＲ＝検知したこん踏量 ’ＮＯ＝検知せず ’　＝Ｒ−ＣＰＩＡ−出発物質におけるＲ−ＣＰＩＡ不純物に対する修正したデ ータ 回収された５−ＣＰＩＡのエナンチオマー過剰分は１００％であった。

例１日 ロードコツカスエリスロポリス０Ｐ−２６によるＲ、５−ＡＴＡ−〇Ｒ−ＡＴＡ Ｃへの加水分解 ロードコツカスエリスロポリスＤＰ−２６の凍結した細胞ペーストのサンプル５ ０腸ｇを室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．０）　１　ｄ へ添加した０例１２と同じ方法で、Ｒ，５−ＡＴＡｓ１２．１Ｍモルを加えた０ 例１２と同じインキユベーシヨン、遠心分離および濾過記録に続いて、抽出した 上澄液の組成を逆相およびキラルＨＰＬＣにより測定した。結果を表８に示す。

表８ ０−ドコツカスエリスロボリスＤＰ　−２６によるＲ、Ｓ−ＡＴＡｍ加水分解Ｈ ＰＬＣ”　口　れた　モル 基質　−Ｕ　−一土立土−−−−−−−−−（゛、　れた　モル　ＡＴＡ＋ｓ　 ＡＴＡＣＳ−ＡＴＡｍ　Ｒ−ＡＴＡｍ　５−ＡＴＡＣＲ−ＡＴＡＣＲ，５−ＡＴ Ａａ＋（１２，１）　８．５　３．０　６．２　２．３　ＮＤ”　３．０”ＮＤ ＝検知せず 回収されたＲ−ＡＴＡＣのエナンチオマー過剰分は１００％であった。

例１９ プソイドモナス　プチダ１３−５３−ＡＣＮ−２ａによるＲ、５−ＮＰＡｓ＋の ５−ＮＰＡＣへの加水分解 プソイドモナス　プチダ１３−５５−ＡＣＮ−２ａの凍結した細胞ペーストのサ ンプル２５−ｇを室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｓＭ、　ｐＨ値：　７．２） 　１　ｄへ添加した。次いでジメチルスルホキシド４０μｉ中のＲ，Ｓ−ＮＰＡ ｍ　ｌμモルを添加した。４８時間撹拌しながら２８°Ｃでインキュベージラン 後、反応物を３Ｍ　Ｈ−ｔｓＯ４でｐＨ値３まで酸性化した。塩化メチレン４容 量を加え、懸濁液を３０分間撹拌した。塩化メチレン相を除去し、窒素気流下に 蒸発乾固した。残渣をメタノールＩＷ１に再度溶かした。抽出した上澄液の組成 を逆相）ＩＰＬＣおよびキラルＩＩＰＬｃにより測定し表９に示す。

表９ プソイドモナスプチダ１３−５Ｓ−ＡＣＮ−２ａによるＲ、Ｓ−ＮＰＡｍ加水分 解＋１ＰＬＣれた　モル 基質　−正枇一　−一土立土−−−−−−−−−′　れた　モル）　ＮＰＡｍ　 ＮＰＡＣ５−ＮＰＡｓ＋　Ｒ−ＮＰＡｍ５−ＮＰＡＣＲ−ＮＰＡＣＲ，５−ＮＰ ｈｓ（１，０）　０．４２０．４４　ＮＤ’　０．４２　０．４４　ＮＤ””Ｎ Ｏ＝検知せず 回収された５−ＮＰＡＣのエナンチオマー過剰分は１００％であった。

例２０ プソイドモナスプチダ１３−５５−ＡＣＮ−２ａによるＲ、５−ＩＢＡａの５４ ＢＡＣへの加水分解 プソイドモナスプチダ１３−５Ｓ−ＡＣＮ−２ａの凍結した細胞ペーストのサン プル５０ａ＋ｇを室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．０） 　１　ｄへ加えた０次いでジメチルスルホキシド４０μｌ中のＲ，５−ＩＢＡｓ 　９．８ａモルを添加した。４８時間撹拌しながら２８℃にてインキュ永−シッ ン後、反応物を３１’ｌ　ＨｇＳＯ４で酸性化してｐＨ値３にした。塩化メチレ ン４容量を加えそして懸濁液を１５〜３０分間撹拌した。塩化メチレン層を除き 、窒素ガス流下に蒸発乾固し、残渣をアセトニトリル１ｍに懸濁させた。アセト ニトリル溶液の組成を逆相ＨＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣにより測定し、そして 表１０に示す。

表１０ プソイドモナスプチダ１３−５５−ＡＣＮ−２ａによるＲ、Ｓ−ＩＢＡｍの加水 分解＋１ＰＬｃ　れた　モル 基質　−Ｕ−キール （゛　れた　モル）　ＩＢＡ履ＩＢＡＣ５４ＢＡｓ＋　Ｒ４ＢＡｍ　５−ＩＢＡ ＣＲ４ＢＡＣＲ，５４ＢＡ−（９，８）　４．８　１．３　１．４　３．４　１ ．３　ＮＯ−”ＮＤ＝検知せず Ｒ，Ｓ−ＩＢＡｍの回収が不完全なのは主に実験誤差および／または基質の細胞 への吸着によるものであろう。回収された５−ＩＢＡＣのエナンチオマー過剰分 は１００％であった。

例２１ プソイドモナスプチダ２Ｄ−１１−５−１ｂによるＲ、Ｓ−ＮＰＡｍの５−ＮＰ ＡＣへの加水分解 プソイドモナスプチダ２Ｄ−１１−５−１ｂの凍結した細胞ペーストのサンプル ２０５ｇを室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．２）　１　 ｉｄへ添加した０例１９と同じ方法にてジメチルスルホキシド４０μ！中のＲ， ５−ＮＰＡ鋼１鋼上８モル加した。２４時間のインキュベーションと例１９と同 じ抽出記録に続いて、抽出された上澄液の組成を逆相１１ＰＬｃおよびキラルＨ ＰＬＣにより測定しそして表１１に示す。

表１１ プソイドモナスプチダ２Ｄ〜１ｌ−５−１ｂによるＲ、　５−ＮＰＡｍの加水分 解ＨＰＬＣれた　モル 基質　−７Ｊｌ　−一土立土−−−−−−−−−′　れた　モル）　ＮＰＡｍ　 ＮＰＡＣ５−ＮＰＡｓ　Ｒ−ＮＰＡ＋ｍ　５−ＮＰＡＣＲ−ＮＰＡＣＲ，５−Ｎ Ｐ篩（１，０）　０．６００．４０　０．０５　０．５５　０．３９　０．０１ １回収れた５−ＮＰＡＣのエナンチオマー過剰分は９５％であった。

例２２ プソイドモナスプチダ２Ｄ−１１−５−１ｂによるＲ、Ｓ−ＩＢＡｍ（７）Ｓ− ＩＢＡＣへの加水分解 プソイドモナスプチダ２Ｄ−１１−５−１ｂの凍結した細胞ペーストのサンプル ５０ｍｇを室温にてリン酸塩緩衝液（１０ｈＭ、　ｐＨ値：　７．０）　１　ｍ へ添加した０例２０と同じ方法で、ジメチルスルホキシド４０μ！中のＲ，Ｓ− ＩＢＡｍ　９．８μモルを添加した。例２０と同じインキュベージジンおよび抽 出記録に続いて、抽出した上澄液の組成を逆相ＨＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣに より測定し、表１２に示す。

表１２ プソイドモナスプチダ２Ｄ−１１−５−１ｂによるＲ、Ｓ−ＮＰＡｍ加水分解Ｈ ＰＬＣれた　モル Ｒ，Ｓ−ＩＢＡｍ（９，８）　３．８　２．１　０．６　３．２　２．０　０． ＩＲ，５４ＢＡ＋ｗの不完全な回収はほとんどが実験誤差および／または基質の 細胞への吸着によるものであった０回収された５−ＩＢＡＣのエナンチオマー過 剰分は９０％であった。

例２３ プソイドモナス種２Ｄ−１１−５−１ｃによるＲ、５−ＮＰＡａの５−ＮＰＡＣ への加水分解プソイドモナス種菌株２Ｄ−１１−５−１ｃの凍結した細胞ペース トのサンプル２０＋＊ｇを、室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値： 　７．２）　１　ｍへ加えた０例１９と同じ方法で、ジメチルスルホキシド４０ μ！中のＲ，５−ＮＰＡ＋＊　１μモルを添加した０例１９と同じインキュベー ションおよび抽出記録に続いて、抽出した上澄液の組成を逆相ＨＰＬＣおよびキ ラル）ＩＰＬＣにより測定し、表１３に示す。

表１３ プソイドモナス種２Ｄ−１１−５−１ｃによるＲ、５−ＮＰＡ＋ｗ加水分解ＨＰ ＬＣ口　れた　モル） 基質　−Ｕ−キール （′、れた　モル）　ＮＰＡ＋ｗ　ＮＰＡＣＳ−ＮＰＡｍ　Ｒ−ＮＰｈ＋　５− ＮＰＡＣＲ−ＮＰＡＣＲ，Ｓ−ＮＰＡｍ（１，０）　０．５４０．４８　ＮＤ’ 　０．５４　０．４７　０．０１”　ＮＤ＝検知せず 回収された５−ＮＰＡＣのエナンチオマー過剰分は９６％であった。

例２４ セラッティアリクウエファシエンスＭＯＢ　Ｉ？Ｉ／Ｎ３によるＲ、Ｓ−ＮＰＡ ｍのＮＰＡＣへの加水分解 セラッティアリクウエファシエンスＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３の凍結した細胞ペースト のサンプル２０＋ｗｇを室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値ニア、 ２）　１　ｄへ加えた。例１９と同じ方法で、ジメチルスルホキシド４０μ！中 のＲ，Ｓ−ＮＰＡｍ　Ｉ　１１モルを添加した０例１９と同じインキュベーショ ンおよび抽出経過に続いて、抽出した上澄液の組成を逆相ＨＰＬＣおよびキラル ＨＰＬＣにより測定しそして表１４に示す。

表１４ セラッティアリクウエファシエンスＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３によるＲ、Ｓ−ＮＰＡｍ の加水分解 Ｒ，Ｓ−ＮＰＡｍ（１，０）　０．６４０．２６　０．２０　０．４４　０．２ ５　０．０１゛回収された５−ＮＰＡＣのエナンチオマー過剰分は９２％であっ た。

例２５ セラッティアリクウエファシエンスＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３によるＲ、５−ＩＢＡ− の５−ＩＢＡＣへの加水分解 セラッティアリクウエファシエンスＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３の凍結した細胞ペースト のサンプル５０■を室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値ニア、０） 　１　ｄへ添加した０例２０と同じ方法で、ジメチルスルホキシド４０μ！中の Ｒ，Ｓ−ＩＢＡｍ　９．８μモルを添加した０例２０と同じインキュベーション および抽出記録に続いて、抽出した上澄液の組成を逆相ＨＰＬＣおよびキラルＩ ＩＰＬｃにより測定しそして表１５に示す。

表１５ セラッティアリクウェファシエンス、ＭＯＢ　ｒＭ／Ｎ３によるＲ、５−ＩＢＡ −の加水分解 １’１ＰＬＣれた　モル 基質　−１批−−一土立土一一−−−−−−−゛　れた　モル　ＩＢＡｓ＋　ｒ ＢＡｃ　５−ＩＢＡＩＩ　Ｒ４ＢＡ＠　５４ＢＡＣＲ−ＩＢＡＣＲ，５−ＩＢＡ ＋＋＋（９，８）　４．９　０．７　２．０　２．９　０．７　ＮＤ慕”ＮＤ＝ 検知せず Ｒ，Ｓ−ＩＢＡｍの不完全な回収はほとんど実験誤差および／または基質の細胞 への吸着によるものであった０回収された５−ＩＢＡＣのエナンチオマー過剰分 は１００％であった。

例２６ モラキセーラ種３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ−１によるＲ、Ｓ−ＡＴＡｍのＲ−ＡＴ ＡＣへの加水分解 モラキセーラ種３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ−１の凍結した細胞ペーストのサンプル ５０■を室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｄ、　ｐＨ値：　７．０）　１　ｍへ 添加した０次いでジメチルスルホキシド４０μｌ中のＲ，５−ＡＴＡｓ１２．１ μモルを添加した。４８時間撹拌しながら２８℃にてインキュベーション後、反 ゛応懸濁液を遠心分離して細胞破片を除きそして上澄液を０．２μ膜フイルター に通した。上澄液の組成を逆相ＨＰＬＣおよびキラルＩＩＰＬｃにより測定し、 そして表１６に示す。

表１６ モラキセーラ種３Ｌ−Ａ−１−５−１ａ−１によるＲ、Ｓ−ＡＴＡｍの加水分解 １（ＰＬＣれた　モル 基質　−１祖−−一土立及一一一一一一一一一、れた　モル　ＡＴＡ■ＡＴＡＣ Ｓ−ＡＴＡｍ　Ｒ−ＡＴＡ■５−ＡＴＡＣ［１−ＡＴＡＣＲ，５−ＡＴ＾■（１ ２，１）　７．６　１．５　４．９　２．７　１１１１１”　１．５”ＮＤ＝検 知せず Ｒ，Ｓ−ＡＴＡｍの不完全な回収はほとんどが実験誤差および／または細胞への 基質の吸着のためであった０回収された５−ＡＴＡＣのエナンチオマー過剰分は １００％であった。

例２７ ０−ドコツカスエリスロポリスＤＰ−１０およびブレビバクテリウム種Ｒ３１２ によるＣＰＩＡ−生物転化の比較ロードコツカスエリスロポリスＤＰ−１０およ びブレビバクテリウム種Ｒ３１２の凍結した細胞ペーストのサンプル５０ｍｇを 室温にてリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ値：　７．０）　１　ｄ容量へ添 加した０次いでジメチルスルホキシド４０μｉ中の５−ＣＰＩＡｍ９．４μモル または１７．５−ＣＩ”ｒ＾■を添加した。５０°Ｃにて２．５，８．１６およ び２４時間後、反応物を３ＭＦＩｔＳＯ４で酸性化してｐＨ値を３．０にした。

塩化メチレン４容量を加えそして残渣をメタノールｌａｄに懸濁させた。メタノ ール溶液の組成を逆相１（ＰＬＣにより測定した。比活性として表わされる結果 を表１７に示す。

表１７ ０−ドコツ力スエリスロボリスロＰ−１０およびブレビバクテリウム種１？３１ ２によるＳ−ＣＰＩＡｍおよびＲｏＳ−ＣＰＡｍの加水分解生物転化時間　比活 性　（μモル Ｂ　５．２　４．４ １６　４．１　２．１ ２４　２．９　１．６ プレビバクテリウム　２　２．４　３．３Ｒ３１２５３，０３，６ ８３，８３，１ １６２，８２，２ ２４２，８１，７ 暑乾燥細胞重量 ロードコツカスエリスロポリスＤＰ−１０を用いた５−ＣＰＩＡｓおよびＲ，Ｓ −ＣＰＩＡｍ両方の加水分解に対しより高い比活性が得られた。

ＦＩＧ、１ 要約書 酸のエナンチオマーの１つが、相当するＲおよびＳアミドの混合物のエナンチオ 選択性加水分解をエナンチオ選択性アミダーゼ活性を有する酵素的に活性な生物 学的物質の存在下に実施し、前記生物学的物質がロードコツカス（Ｒｈｏｄｏ　 ｃｏｃｃｕｓ）　、セラッティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）　、モラキセーラ（Ｍｏ ｒａｘｅｌ　ｌａ）またはプソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌株か ら由来する方法により調製される。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年１２月２千日

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的物質がロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、セラッティア （Ｓｅｒｒａｔｉａ）、モラキセーラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）またはプソイドモ ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌株から由来するものであり、ただし生物学 的物質はロードコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）ＡＫ３２（ＦＥ ＲＭ　ＢＰ−１０４６）またはプソイドモナス　フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＮＲＲＬ　Ｂ　９８１　またはＩＦ０　 ３０８１から由来するものではないことを特徴とするエナンチオ選択性アミダー ゼ活性を有する酵素的に活性な生物学的物質の存在下に相当するＲおよびＳアミ ドの混合物のエナンチオ選択性加水分解により酸のエナンチオマーを調製する方 法。
2. ２．前記酸が一般式Ｉ： Ｘ−ＣＲ１Ｒ２−ＣＯＯＨ（Ｉ） （式中、Ｘはフェニル基またはナフチル基であってこれらの基は場合によりハロ ゲン原子、アルキル、アルコキシまたはベンゾイル基で置換されてもよい基を表 わし、Ｒ１はヒドロキシル、アミノまたはアルキル基を表わしそしてＲ２は水素 原子またはアルキル基を表わす）を有することからなる請求の範囲第１項に記載 の方法。
3. ３．Ｒ１がヒドロキシまたはアルキル基である請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．Ｒ２が水素原子である請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。
5. ５．前記アルキル基およびアルコキシ基は１０個以下の炭素原子、好ましくは４ 個以下の炭素原子を含む請求の範囲第２項〜第４項のいずれか１に記載の方法。
6. ６．前記生物学的物質がロードコッカスの菌株から由来する請求の範囲第１項〜 第５項のいずれか１に記載の方法。
7. ７．前記菌株がロードコッカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒ ｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）に属し、好ましくは菌株ＤＳＭ　５９１０，６３７４， ６３７５もしくは６３７８またはこれらの変異細胞もしくは突然変異体である請 求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．前記生物学的物質がセラッティアの菌株から由来する請求の範囲第１項〜第 ５項のいずれか１に記載の方法。
9. ９．前記菌株がセラッティア　リクウエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑ ｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に属しそして好ましくは菌株ＭＯＢ　ＩＭ／Ｎ３またはそ の変異細胞もしくは突然変異体である請求の範囲第８項に記載の方法。
10. １０．前記生物学的物質がモラキセーラの菌株から由来する請求の範囲第１項〜 第５項のいずれか１に記載の方法。
11. １１．前記菌株がモラキセーラ種（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｓｐ．）３Ｌ−Ａ−１ −５−１ａ−１またはその変異細胞もしくは突然変異体である請求の範囲第１０ 項に記載の方法。
12. １２．前記生物学的物質がプソイドモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐ ｕｔｉｄａ）の菌株、好ましくは１３−５Ｓ−ＡＣＮ−２ａまたは２Ｄ−１１− ５−５−１ｂから、またはプソイドモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ． ）２Ｄ−１１−５−１ｃまたはその変異細胞もしくは突然変異体から由来する前 出の請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１に記載の方法。
13. １３．前記の得られたエナンチオマ−酸がＳ形である請求の範囲第１項〜第１２ 項のいずれか１に記載の方法。
14. １４．前記の得られたエナンチオマ−酸がＲ形である請求の範囲第１項〜第１２ 項のいずれか１に記載の方法。
15. １５．前記出発アミドは２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブチルアミド （ＣＰＩＡｍ）でありそして生物学的物質がロードコッカスの菌株から由来する 請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１に記載の方法。
16. １６．前記の得られたエナンチオマ−酸がＳ形である請求の範囲第１５項に記載 の方法。
17. １７．前記出発アミドが２−フェニル−２−ヒドロキシプロピオンアミド（ＡＴ Ａｍ）でありそして生物学的物質がロードコッカスまたはモラキセーラの菌株か ら由来する請求の範囲第１項〜第７項、第１０項および第１１項のいずれか１に 記載の方法。
18. １８．前記の得られたエナンチオマ−酸がＲ形である請求の範囲第１７項に記載 の方法。
19. １９．前記出発アミドが２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオンアミド （ＮＰＡｍ）であり生物学的物質がセラッティアまたはプソイドモナスの菌株か ら由来する請求の範囲第１項〜第５項、第８項、第９項および第１２項のいずれ か１に記載の方法。
20. ２０．前記の得られたエナソチオマ−酸がＳ形である請求の範囲第１９項に記載 の方法。
21. ２１．前記出発アミドが２−（４−イソブチルフェニル）プロピオンアミド（Ｉ ＢＡｍ）であり生物学的物質がセラッティアまたはプソイドモナスの菌株から由 来する請求の範囲第１項〜第５項、第８項、第９項および第１２項のいずれか１ に記載の方法。
22. ２２．前記の得られたエナンチオマ−酸がＳ形である請求の範囲第２１項に記載 の方法。
23. ２３．エナンチオマ−過剰分が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％ 、より好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９ ％、最も好ましくは少なくとも９９．５％である請求の範囲第１項〜第２２項の いずれか１に記載の方法。
24. ２４．転化度が約６５％以上、より好ましくは約９０％以上、さらにより好まし くは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以上である請求の範囲第１項〜第２ ３項のいずれか１に記載の方法。
25. ２５．前記生物学的物質が固定化されている請求の範囲第１項〜第２４項のいず れか１に記載の方法。
26. ２６．前記物質がグルタルアルデヒドで架橋することにより固定化される請求の 範囲第２５項に記載の方法。
27. ２７．反応アミド混合物を含む溶液または懸濁液を、固定化生物学的物質が保持 されている反応器に通す請求の範囲第１項〜第２６項のいずれか１に記載の連続 方法。
28. ２８．加水分解を有機溶媒の存在下に行なう請求の範囲第１項〜第２７項のいず れか１に記載の方法。
29. ２９．有機溶媒の量を全反応系の２〜２０重量％にする請求の範囲第２８項に記 載の方法。
30. ３０．前記溶媒が水混和性有機溶媒、好ましくはジメチルスルホキシドである請 求の範囲第２８項または第２９項に記載の方法。
31. ３１．前記溶媒が水不混和性有機溶媒好ましくは炭素原子数６〜９の芳香族また は脂肪族炭化水素、最も好ましくはトルエンまたはオクタンである請求の範囲第 ２８項または第２９項に記載の方法。
32. ３２．前記生物学的物質が固定化されている請求の範囲第２８項〜第３１項のい ずれか１に記載の方法。
33. ３３．反応系が水相および溶媒相を含み、そして溶媒相および固定化物質が親水 性膜に保持される請求の範囲第３２項に記載の方法。
34. ３４．Ｘがフェニル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−イソブチルフェニル、３−ベン ゾイルフェニル、β−ナフチルまたは６−メトキシ−２−ナフチル基である請求 の範囲第２項〜第３３項のいずれか１に記載の方法。
35. ３５．Ｒ１はヒドロキシ、メチル、エチルまたはイソプロピル基である請求の範 囲第２項〜第３４項のいずれか１に記載の方法。
36. ３６．式Ｉで表わされる酸が２−（４−クロロフェニル）酪酸、２−（４−クロ ロフェニル）−３−メチル酪酸、（６−メトキシ−２−ナフチル）ヒドロキシプ ロピオン酸、２−（４−イソブチルフェニル）プロピオン酸、２−フェニル−２ −ヒドロキシプロピオン酸または２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸 である請求の範囲第３５項に記載の方法。
37. ３７．ラセミアミドのエナンチオ選択性加水分解を含む請求の範囲第１項〜第３ ６項のいずれか１に記載の方法。
38. ３８．未転化アミドをラセミ化しラセミ化アミドを再循環させた後で前記加水分 解を行なう請求の範囲第３７項に記載の方法。
39. ３９．前記生物学的物質が完全なまたは分裂した形で酵素的に活性な微生物細胞 を含む請求の範囲第１項〜第３８項のいずれか１に記載の方法。
40. ４０．ほとんど水の不存在下に強塩基性イオン変換樹脂とアミドとを接触させる ことからなるＲまたはＳアミドをラセミ化する方法。
41. ４１．前記樹脂が強塩基性ゲル型樹脂である請求の範囲第４０項に記載の方法。
42. ４２．前記樹脂が第四アンモニウム官能基を含む請求の範囲第４１項に記載の方 法。
43. ４３．ロードコッカス、セラッティア、モラキセーラまたはプソイドモナスの菌 株から由来するものであってただしロードコッカス種ＡＫ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ −１０４６）またはプソイドモナス　フルオレセンスＮＲＲＬ　Ｂ９８１または ＩＦ０　３０８１からは由来しない物質の生物学的に純粋な培養物。
44. ４４．エナンチオ選択性アミダーゼの構成性産生が特徴的な請求の範囲第４３項 に記載のロードコッカス菌株の生物学的に純粋な培養物。
45. ４５．ロードコッカス　エリスロポリスの菌株、好ましくは菌株ＤＳＭ５９１０ ，６３７４，６３７５もしくは６３７８またはその変異細胞もしくは突然変異体 の請求の範囲第４４項に記載の培養物。
46. ４６．前出の方法の請求の範囲各項のいずれか１に記載の方法に使用するための エナンチオ選択性アミダーゼ活性を有する固定化した酵素的に活性な生物学的物 質。
47. ４７．グルタルアルデヒドで架橋することにより固定化された請求の範囲第４６ 項に記載の薬剤。
48. ４８．エナンチオ選択性アミダーゼ活性を有することが特徴的な、ロードコッカ ス、セラッティア、モラキセーラまたはプソイドモナスの菌株から由来する生物 学的物質であってただしロードコッカス種ＡＫ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０４６ ）またはプソイドモナス　フルオレセンスＮＲＲＬ　Ｂ９８１またはＩＦ０　３ ０８１からは由来しない生物学的物質。
49. ４９．ロードコッカス　エリスロポリス、最も好ましくは菌株ＤＳＭ５９１０， ６３７４，６３７５もしくは６３７８またはその変異細胞もしくは突然変異体か ら由来する請求の範囲第４８項に記載の生物学的物質。
50. ５０．ニトリルまたはアミドを含まない培地中でロードコッカスのアミダーゼ産 生菌株を培養することを含むエナンチオ選択性アミダーゼ活性を有する生物学的 物質の調製方法。
51. ５１．ここで記載した新規特徴または特徴の組合せ。