JPH08504324A

JPH08504324A - キラルカルボン酸類の対掌体選択的製造

Info

Publication number: JPH08504324A
Application number: JP6511213A
Authority: JP
Inventors: フィリップロッシ，リチャード; リーヒーフナー，ドナルド; メルビンゼップ，チャールズ
Original assignee: セプラコア，インコーポレイテッド
Priority date: 1992-10-26
Filing date: 1993-10-25
Publication date: 1996-05-14
Also published as: EP0672166A1; CA2146556A1; WO1994010334A1; AU5586694A; AU677805B2; US5273895A

Abstract

(57)【要約】アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩アダクト又はグリシデートをキラルカルボン酸に対掌体選択的に転化する方法が開示される。この方法は微生物又は微生物に由来する酵素調製物を利用するもので、プロフェン群のＮＳＡＩＤ類を容易に入手することができる前駆体から製造するのに特に有用である。細菌、酵母菌又は真菌が前駆体をプロフェン類に転位させることができる典型的なものである。

Description

【発明の詳細な説明】キラルカルボン酸類の対掌体選択的製造発明の背景本発明はアルデヒドの酸化状態にあるラセミ前駆体からキラルカルボン酸を対掌体選択的に製造する方法に関する。この前駆体のキラルカルボン酸への転化は前駆体を微生物又は微生物に由来する酵素調製物に暴露することによって達成される。アルデヒド類のカルボン酸類への酸化は有機化学の１つの古典的な手法である。しかし、典型的な化学的オキシダント類は、出発原料がラセミ体である場合には、可能な対掌体生成物間に選択性をもたらさない。他の反応において、ある転化が酵素を用いて実施できる場合、その転化が対掌体選択性であることが、時に見いだされることがあることは知られている。かくして、例えばパターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）ら［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、４６、４６８２−４６８５（１９８１）］は、グリオキサラーゼＩとグリオキサラーゼＩＩを使用するα−ケトアルデヒド類の光学活性α−ヒドロキシ酸類への酵素転化について述べている。本発明者らは、ラセミ体アルデヒド類のキラルカルボン酸類への、微生物又は微生物に由来する酵素を使用する対掌体選択性転化の例を知らない。ラセミ体アルデヒド類のキラル酸類への対掌体選択性転化は、製剤工業、特に、ＮＳＡＩＤ群のキラル酸、例えばイブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン及びフルルピプロフェン（ｆｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ）の単一対掌体の合成工業において特に有用な方法であると思われる。ＮＳＡＩＤ類においては、ほとんどの薬剤におけるように、ラセミ体の一方の対掌体は医療状態の治療において他方の対掌体より活性であることが多い。例えばイブプロフェンについて言うと、そのＳ体は鎮痛剤としてＲ体の約１００倍も活性である。現在、世界中の製薬会社は、当局から、全ての薬剤を純粋な活性形で供給するよう管理しなければならないと言う圧力を受けている。その理由は、ある薬剤の一方の対掌体は所望とされる活性を有するのに、他方は所望とされる活性を生み出すことに関して不活性であるのみならず、無関係な性質や有害な薬理的性質さえ有すると言う危険が常に存在することにある。これは、最も悲劇的なケースとして、Ｓ体は有効な鎮痛剤であるが、Ｒ対掌体は催奇性物質である薬剤のサリドマイドの場合に証明された。イブプロフェンの純粋なＳ対掌体を得るようにイブプロフェンを合成し、或いは分割する方法は知られている。山本ら［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５６、３１２５−３１２９（１９９０）］は、アシネトバクター属細菌を使用する２−（４’−イソブチルフェニル）プロピオニトリル（ＩＩ）のラセミ体からＳ−イブプロフェン（Ｉａ）を９５％を越える対掌体過剰率（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｅｘｃｅｓｓ：ｅｅ）で合成することについて述べている：コッブスら（米国特許第５，１０８，９１６号明細書）は、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）に由来するリパーゼを使用してフェノプロフェン（ＩＩＩ）及びイブプロフェン（ＸＶ）のメチルエステルを対掌体選択的に加水分解して対応するＳ−酸を９５％ｅｅで生成させる方法を明らかにしている：ナプロキセン（ＩＶ）について同様の方法がグ（Ｇｕ）らによって述べられている［Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、２７、１７６３−１７６６（１９８６）］：バートラ（Ｂｅｒｔｏｌａ）ら（米国特許第５，１０８，９１７号明細書）は、ラセミ体イブプロフェンメチルエステルからアセトバクター属、バチルス属及びブドウ球菌属の細菌を使用してＲ−異性体に富むイブプロフェンを製造する方法を明らかにしている。バートラら（欧州特許出願第２７４，１４６号明細書）は、２−（６−メトキシ−２−ナフチル）ヘプタン（Ｖ）の微生物指令酸化反応によりＳ−ナプロキセンを７０％を越える収率で製造する方法を明らかにしている。この酸化に有用な微生物はエクソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）及びリノクラディエラ属（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）に見いだされた：マトソン（Ｍａｔｓｏｎ）ら（米国特許第５，０７７，２１７号明細書）及びワルド（Ｗａｌｄ）ら（米国特許第５，０５７，４２７号明細書）は、膜反応器でのラセミ体エステルの酵素分割法を明らかにしている。イブプロフェンとナプロキセンについては、典型的な水溶性エステルが説明されている。好ましい酵素はアルカリ性のプロテアーゼ類、エステラーゼ類及びリパーゼ類である。以上の方法はプロフェン類としても知られるフェニルプロピオン酸ＮＳＡＩＤ類の単一の異性体をニトリル類の加水分解によって、親酸のエステルの加水分解によって、またアルキルベンゼン類のα−酸化によっても得るのに有用であると思われる。ラセミ体イブプロフェンの商業的製造に現在使用されている方法は英国特許第１，１６０，７２５号明細書に記載されるもので、その反応は反応式Ａ：で示される。気付かれるであろうに、ニトリル類、親酸のエステル類及び酸化性のアルキルベンゼン類は中間体の中には生成していない。従って、プロフェンの単一の異性体を製造する現存する方法には、そのいずれを使用しても、ラセミ化合物の製造に用いられる工程に加えて更なる工程が伴われる。しかして、商業的製造の正規の過程で既に入手できるようになっている中間体から進めるイブプロフェンのキラル合成の必要が存在する。また、アルデヒド中間体を通して合成されるかもしれないその他のカルボン酸類のキラル合成の必要も存在する。発明の概要本発明の１つの目的はラセミ体アルデヒド（例えば、ＶＩＩＩ）又はグリシド酸エステル（例えば、ＶＩＩ）をキラルカルボン酸（例えば、Ｉａ）に対掌体選択的に転化する方法を提供することである。この目的及び他の目的、特徴及び利点は、キラルカルボン酸の単一の対掌体、又はキラルカルボン酸の単一の対掌体に富む対掌体混合物を製造する方法に関する本発明により与えられる。この方法は、アルデヒド類、アルデヒド類の重亜硫酸塩付加生成物及びグリシデート類から選ばれる前駆体を、微生物又は微生物に由来する酵素調製物に暴露することによってその前駆体をキラルカルボン酸の単一の対掌体、又はキラルカルボン酸の単一の対掌体に富む対掌体混合物に転化することから成る。カルボン酸はイブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン及びフルルビプロフェンより成る群から選ばれるα−置換プロピオン酸系薬剤（プロフェン）であるのが好ましい。この転位反応の遂行能は微生物、特に細菌の中にかなり広く認められる。前駆体がアルデヒド又は重亜硫酸塩付加生成物である場合、好ましい酵素調製物はＩＵＢ命名法でオキシドレダクターゼと称されるデヒドロゲナーゼを含有するものでる。１つの態様において、カルボン酸はイブプロフェンであり、単一の対掌体はＳ −イブプロフェンである。本発明のイブプロフェンの態様に関して好ましい微生物は細菌、特にグラム陰性の棹状菌である。シュードモナス属、アエロモナス属、エシェリキア属、アクロモバクター属及びアルカリゲネス属の代表的なものが好ましく、そしてシュードモナス・ポーシモビリス（ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）とアルカリゲネス・ファエカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）が最も好ましい。所望とされる生成物がイブプロフェンである場合、１つの前駆体はα−メチル−４− （２−メチルプロピル）ベンゼンアセトアルデヒド（ＶＩＩＩ）であり；もう１つの前駆体はα−ヒドロキシ−β−メチル−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンエタンスルホン酸塩（ＶＩＩ）であり；更にもう１つの前駆体は３−メチル− ３−［４−（２−メチルプロピル）フェニル］オキシラン−２−カルボン酸塩（ＸＩＩＩ）である。好ましい微生物はシュードモナス・ポーシモビリスとアルカリゲネス・ファエカリスである。もう１つの態様において、カルボン酸はナプロキセンであり、好ましい前駆体はα−ヒドロキシ−β−メチル−６−メトキシ−２−ナフタレンエタンスルホン酸塩であり、そして微生物はアセトバクター属、アシネトバクター属、アルトロバクター属、アスペルギルス属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、カンジダ属、シュードモナス属、ロドコッカス属及びセラチア属である。もう１つの態様において、カルボン酸はケトプロフェンであり、好ましい前駆体はα−ヒドロキシ−β−メチル−３−ベンゾイルベンゼンエタンスルホン酸塩であり、そして好ましい微生物はバチルス属及びサッカロミセス属である。もう１つの側面では、本発明は式ＩＸ：を有する前駆体の、式Ｘ：を有するカルボン酸への対掌体選択性転化法に関する：但し、上記の式においてＲ¹はアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ²は水素、アルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ³は水素、アルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｍ⁺はアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンであり；ここで、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は異なる基である。この方法は、前駆体をカルボン酸に対掌体選択的に転化する微生物又は微生物に由来する酵素調製物の作用にその前駆体を付すことから成る。微生物は細菌、酵母菌又は真菌であるのが好ましい。本発明で使用されるラセミ体化合物、アンビスケール性（ａｍｂｉｓｃａｌｅｍｉｃ）化合物及びスケール性（ｓｃａｌｅｍｉｃ）化合物又は対掌体的に純粋な化合物の化学式の表示方法はマエール（Ｍａｅｈｒ）のＪ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．、６２、１１４−１２０（１９８５）による。かくして、黒塗りと破線のくさび形（例えば、Ｉａ）はキラル要素の絶対配置を示すために用いられ；線で囲まれたくさび形と点線又は折れ線（例えば、Ｘ）は不確定絶対配置（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅａｂｓｏｌｕｔｅｃｏｎｆｉｇｒｕｒａｔｉｏｎ）の対掌体的に純粋な化合物を示す。１つの好ましい態様において、Ｒ¹は置換アリールであり、Ｒ²はメチルであり、そしてＲ³は水素である；ここで、Ｒ¹が３−ベンゾイルフェニル、４−（２− メチルプロピル）フェニル、３−フルオロ−４−フェニルフェニル又は６−メトキシ−２−ナフチルであるものが最も好ましい。もう１つの側面では、本発明は式ＸＩ：を有する前駆体の、式Ｘａ：を有するカルボン酸への対掌体選択性転化法に関する：但し、上記の式においてＲ¹はアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ^2aはアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｍ⁺はアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンであり；ここで、Ｒ¹及びＲ^2aは異なる基である。Ｒ¹が置換アリールであり、そしてＲ^2aがメチルであるのが好ましい。この方法は、前駆体を対応するカルボン酸に対掌体選択的に転化することができる細菌、真菌及び酵母菌より成る群から選ばれる微生物又はこれら微生物に由来する酵素調製物の作用にその前駆体を付すことから成る。シュードモナス属、アエロモナス属、エシェリキア属、アセトバクター属、アルトロバクター属、アシネトバクター属、セラチア属、フラボバクテリウム属、クルイベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、ミクロコッカス属、ロドコッカス属、アルカリゲネス属、バチルス属及びブレビバクテリウム属からの細菌、サッカロミセス属及びカンジダ属からの酵母菌、並びにケカビ属、アブシディア属、アクチノケカビ属、ユーペニシリウム属、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）及びアスペルギルス属からの真菌が前記の転位反応を行うことができるそのような微生物に入る。もう１つの側面において、本発明はラセミ体アルデヒド又はアルデヒド均等物の光学的に実質的に純粋なプロフェンへの対掌体特異性転化法にして、次の：（ａ）微生物の複数のコロニーを基質上の水性培地中で増殖させ；（ｂ）コロニーの上にやや溶けにくい上記のアルデヒド又はアルデヒド均等物を懸濁含有するか、又は可溶性のアルデヒド均等物（重亜硫酸塩付加物又はグリシデート）を溶解含有する不透明な水性培地を重ね、そしてその微生物の増殖を続け；（ｃ）その不透明な培地が透明になっているか、又はその逆になっているそのようなコロニーを初めに選択し；（ｄ）そのアルデヒド又はアルデヒド均等物を初めに選択されたコロニーの各培養物と共にインキュベートすることによってそのアルデヒド又はアルデヒド均等物をプロフェンに転化し；（ｅ）生成したままのプロフェン異性体の対掌体比を測定し；（ｆ）その対掌体比に基づいて培養物について２回目の選択を行い；そして（ｇ）そのアルデヒド又はアルデヒド均等物を２回目に選択された培養物の内の１つの培養物と共にインキュベートすることによってそのアルデヒド又はアルデヒド均等物を光学的に実質的に純粋なプロフェンに転化することから成る上記方法に関する。アルデヒド又はアルデヒド均等物は、例えば次の式ＶＩＩＩ、ＸＩＩ及びＸＩＩＩ：及びである。１つの好ましい態様において、培養物について２回目の選択を行う工程（ｆ）では、実質的に純粋なケトプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン又はイブプロフェンの各対掌体、特にＳ−イブプロフェンが最大収率で生成させるそのような培養物が選ばれる。詳細な説明本発明はアルデヒドの酸化状態にあるラセミ体前駆体をキラルカルボン酸に転化する方法を包含する。前駆体はそのキラルカルボン酸に対応するアルデヒドであるか、又はグリシド酸であって、それらの転化は前者の場合は形式的には酸化反応であり、後者の場合は脱カルボキシル基反応と形式的酸化反応の両反応である。ラセミ前駆体は、通常、形式的に酸化されている部位に対してキラル中心のα −位における対掌体の混合物である。しかし、これは必要条件ではない。即ち、キラル中心は、原則的には、前駆体分子の他の位置にあることもできると思われる。上記の転位反応を行うことができる微生物は、グラム陰性細菌（シュードモナス属、アエロモナス属、エシェリキア属、アセトバクター属、アシネトバクター属、セラチア属及びアルカリゲネス属）、グラム陽性細菌（バチルス属及びブレビバクテリウム属）、酵母菌（サッカロミセス属及びカンジダ属）及び糸状真菌（ケカビ属、アブシディア属、アクチノムコア属（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）、ユーペニシリウム属、アクレモニウム属及びアスペルギルス属）の中に見いだされた。その高い試験成功率に基づいて、その能力は微生物に一般的であると予想され、そして下記の選別法が与えられると、特定の微生物をどう同定するかはこの技術分野の通常の技能の範囲内である。水にやや溶けにくいアルデヒド（プロフェン前駆体のようなアルデヒド）を転位してかなりよく水に溶ける酸塩（プロフェン塩のような塩）にすることができる微生物の、特に速くかつ効率的な選択方法は転位反応でもたらされる溶解性の変化を利用する方法である。しかして、アルデヒドの水性培地中の、例えばアガロース中の懸濁液を微生物の１つ又は複数のコロニーに暴露し、そして初め不透明な培地についてそのコロニー周辺が半透明になるか又は透明になるかの徴候を観察する。次に、標準的な微生物学的方法を用いるもっと大規模なインキュベーションのために、そのやや溶けにくい前駆体を含有する水性培地に透明性をもたらすコロニーを選択する。別法として、前駆体が水溶性である場合（例えば、重亜硫酸塩付加物）は、その可溶性前駆体のアガロース中溶液をコロニーを覆うように入れてもよく、そしてその初め透明な培地について不透明状態と、それに続いて現れる透明状態の徴候を観察してもよい。初め可溶性のプロフェンアルデヒド重亜硫酸塩に関して観察される一般的な現象は、まず、重亜硫酸塩が不溶性の中間体に転化することに起因する不透明状態とそれに続いて起こるアガロースが持つｐＨにおいて可溶性であるプロフェンの形成に多分起因する澄明化の現象である。この現象は試験コロニーを取り囲む同心の透明な環と不透明な環として目に見えるように示される。ここで、本明細書で用いられている“やや溶けにくい”及び“水溶性”なる用語は化合物が約２ｇ／Ｌ、及び溶液が緩衝溶液となるｐＨにおいて透明な溶液をもたらすか否かを意味する。しかして、やや溶けにくい化合物は不透明な懸濁液か又は沈澱をもたらし、可溶性化合物は透明な溶液をもたらす。更に大きなスケールでは、そのインキュベーションの生成物は適切な周知の化学的方法で単離され、カルボン酸の所望とされる光学異性体の存在に関して測定が行われる。分析はこの技術分野で公知の標準的な方法のいずれによって行ってもよい。本発明者らはキラル基質に対してはＨＰＬＣが多数の試料の急速、半定量的な分析に関して特に有用であることを見いだした。プロフェンについては、ダイセル・ケミカル・インダストリーズ社（ＤａｉｃｅｌＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）（日本）から市販されるキラルセル（Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ）ＯＪ^TMがよく適合する。本発明の１つの態様において、前駆体をカルボン酸に対掌体選択的に転化することができる微生物は天然微生物源から選択したものであることができる。天然微生物源、特に土壌試料から単離される多数の微生物が上記の選別法に従って選択され、そしてそれらは、後記において説明される更なる試験に付されたとき、対掌体選択性転化能を示した。この転化反応を行うことができる微生物は、また、この同じ選択法をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）［メリーランド州（ＭＤ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）］から得られる試料に適用することによっても同定することができる。また、外来遺伝物質の導入により対掌体選択性転化能を獲得した微生物も上記の定義に包含される。これは対掌体選択性転化の要因となるポリペプチド、例えば酵素を暗号解読するクローン化された遺伝子を１つの適当な微生物からもう１つの微生物、特にエシェリキア・コリに転移させることによって達成することができる。形質転換微生物はシュードモナス属、マイコバクテリウム属、ストレプトミセス属、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、バチルス属、ノカルジア属、ロドコッカス属、エシェリキア属及びコリネバクテリウム属に属するものであることができる。これらの微生物は、例えば重合体ゲルに固定化するのが有利であろう。固定化は生細胞、死亡細胞及び／又は休止細胞を用いて、或いはそれら細胞に由来する適当な酵素を用いて行うことができる。ここで、酵素は、より高特異性の活性が必要とされる場合には、ある程度精製してもよい。従って、“微生物又は微生物に由来する物質”なる用語は死亡した、生きている又は休止している微生物、及び、所望によっては、濃縮され、精製され、そして固定化された酵素又は中間代謝物のような、それら微生物からの抽出物を意味する。例えば、酵素は、所望によっては、例えば人工又は天然の補助因子と組み合わせて使用することができる。生細胞又は死亡細胞に由来する酵素は、適当な条件下で所望とされる異性体を生成させることができる。微生物又はそれら微生物に由来する物質は数回使用することができる。微生物は、補基質（例えば、グルコース）がなくても、活性を維持することができる。所望とされる光学異性体の富化は適当な緩衝液中のみならず、生理的塩中でも起こり得る。微生物の選択法は次の順序で行われる：（ａ）微生物の複数のコロニーを基質上の水性培地中で増殖させる；好ましい培地はブレーンーハート・インフュージョン（Ｂｒａｉｎ−ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ）（ＢＨＩ）であり、また好ましい基質は平板上に塗被された寒天である；（ｂ）そのコロニーの上に水性培地、好ましくはアルデヒド又はアルデヒド均等物を懸濁又は溶解して含有する燐酸塩系緩衝剤でｐＨ７．０に調整されたアガロースを重ねる；微生物をアルデヒド層の下で増殖し続けるようにする；（ｃ）その不透明な培地が透明になっているか、又は透明な培地が不透明になっているそのようなコロニーを初めに選択する。この選択手順は一次の選択を構成する。二次の選択を次に：（ａ）そのアルデヒド又はアルデヒド均等物を初めに選択されたコロニーの各各の培養物と共にインキュベートし；そして（ｂ）生成したままのカルボン酸異性体の対掌体比を測定することによって行う。分析から明らかになる、所望とされる対掌体を最大量で生成させる第二の選択で得られたコロニーを次に予備的転化のために使用する。本発明の１つの好ましい態様によれば、プロフェンの前駆体をプロフェンに転化する能力を有する微生物は約０．５〜１０日間培養される。その細胞を次に液体栄養培地に懸濁させ、プロフェン前駆体を細胞の作用に付す。別法として、細胞を、例えば溶菌性培地に懸濁させることによって死なせてもよく、次いで前駆体を溶菌細胞から放出された物質の作用に付してもよい。上記の約０．５〜１０日間の培養後に、細胞を培養培地から単離してもよく、その後それら細胞を液体栄養培地又は溶菌性培地に懸濁させる。前駆体の選択的酸化に使用される微生物を増殖させるのに、同化性炭素源（例えば、グルコース、ラクトース、スクロース等）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）を有機栄養源（例えば、酵母抽出物、麦芽抽出物、ペプトン、獣肉抽出物等）及び無機栄養源（例えば、痕跡量の燐酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、その他の金属）と共に含有する普通の培養培地を用いることができる。所望によって１種又は２種以上の成分で富化されたジャップ（Ｊａｐ）培地も適当な培養培地として使用することができる。もう１つの培養培地は所望によって１種又は２種以上の成分で富化されたＴＳＢ−培地２Ｘである。トリプチカーゼダイズブイヨン［オキソイド（Ｏｘｏｉｄ：登録商標）］６０ｇ／Ｌより成る培地も使用することができる。もう１つの培地は所望によって１種又は２種以上の成分で富化された２ＸＴＹである。トリプトン［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ：登録商標）］３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物（ディフコ：登録商標）２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ・３ｇ／Ｌ、（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄・１ｇ／Ｌ及び（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄・１ｇ／Ｌより成る、ｐＨ６．８の培地も使用することができる。もう１つの培養培地は所望によって１種又は２種以上の成分で富化された脱脂乳培地である。１つの好ましい培地はＢＨＩを３７ｇ／Ｌ、寒天を１５ｇ／Ｌ含有するｐＨ７．０に調整されたＢＨＩ培地である。微生物の増殖中は温度を０〜４５℃、ｐＨを３．５〜９に保つのが好ましい。微生物は温度２０〜３７℃、ｐＨ５〜９で増殖させるのが更に好ましい。微生物の増殖中に必要とされる好気性条件は、既に十分に確立された方法のいずれによっても与えることができる。但し、酸素の供給は微生物の代謝要件を満足するに十分なものでなければならない。これは酸素を、適当には空気の形で供給し、そして、所望によっては、同時にその反応液を振盪又は撹拌することによって、達成するのが最も好適である。前駆体のカルボン酸への転化中に、微生物は上記の普通の培養培地を用いている増殖段階に存在していてもよいし、或いは酵素の分解を予防するなんらかの系（培地又は緩衝液）中に保存しておいてもよい。微生物又はそれら微生物に由来する物質により製造されるカルボン酸は、前記のように、そのような生成物について自体公知の方法のいずれによっても回収、精製することができる。微生物は傾斜寒天上に保持し、５０％グリセロール中で凍結する、即ち凍結乾燥することができる。これら微生物は、必要とされるならば、既に十分に確立された方法のいずれによっても予備培養することができる。例えば、これら微生物は回転シェーカー中、ブイヨン又はＢＨＩにおいて３０℃で２４時間インキュベートすることができる。キラル中心がカルボキシレートに対してα−位にある場合、アルデヒドと重亜硫酸塩との反応は式：を有する前駆体の、式を有するカルボン酸への転化反応として模式的に表すことができる：但し、上記の式においてＲ¹はアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ²は水素、アルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ³は水素、アルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｍ⁺はアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンであり；ここで、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は異なる基である。また別に、グリシデート類の反応は式：を有する前駆体の、式：を有するカルボン酸への転化反応として表すことができる：但し、上記の式においてＲ^2aはアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；ここでＲ¹ とＲ^2aは異なる基である。明細書全体を通じて、置換基はそれらが持ち出される時に定義され、その定義は続いて現れる所全てにおいて保持される。アルキルは１〜６個の炭素原子を持つ直鎖、分枝鎖又は環式の炭化水素残基を意味し；アリールはフェニル、ナフチル等の残基を意味し；アラルキルはアルキレン鎖に結合したアリール残基（例えば、ベンジル、フェネチル、α−メチルフェネチル等）を意味し；置換アリールは１個又は２個以上のアルキル、アルコキシ、フェニル、フェノキシ、ベンゾイル、ハロゲン及び同様の置換基で変換されたフェニル又はナフチルを意味する（例えば、４−イソブチルフェニル；６−メトキシ−２−ナフチル；３−フルオロ −４−フェニル；３−フェノキシフェニル；３−ベンゾイルフェニル３−クロロ−４−（２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）フェニル；４−（２ −チエニルカルボニル）フェニル；４−（１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ −イソインドール−２−イル）。生成物がプロフェンである好ましい態様において、Ｒ²又はＲ^2aはメチルである。キラル炭素が脱プロトン化反応のために活性化され、かつキラル炭素上の１個の置換基が水素である場合、微生物又は酵素混合物の活性を実質的に阻害しない条件下でキラル中心をラセミ化することが可能であろう。このような場合、本発明の方法はラセミ前駆体のカルボン酸の単一の対掌体への転化を本質的に完了させるように実施することができる。この目的のために、脱プロトン化反応の実験をイブプロフェン（ＸＩＩ）の重亜硫酸塩付加生成物に対して行い、その結果ｐＨ８．９以上でデュウテリウムがキラル炭素に組み込まれることが見いだされた。しかして、微生物の触媒作用によるこの転化法には現場ラセミ化工程が含まれることがあり、それによって前駆体ＸＩＩはイブプロフェンの単一の異性体に実質的完全に転化される。イブプロフェンの前駆体ＶＩＩＩ、ＸＩＩ及びＸＩＩＩ並びに２−フェニルプロピオン酸の重亜硫酸塩前駆体（ＸＩＶ）、ケトプロフェンの前駆体（ＸＶＩ）及びナプロキセンの前駆体（ＸＶＩＩ）を用いて実験を行った。土壌試料から得られた、及びＡＴＣＣから得られた多数の微生物を前記のように線状に接種し、平板培養した。微生物源Ａと表示される微生物はＡＴＣＣから得られたものであった。それらのＡＴＣＣ識別番号を括弧の中に示す。微生物源Ｂと表示される微生物は元々はＡＴＣＣのコロニーから得られたものであったが、それらは実験室で汚染物となってしまった；微生物源Ｃと表示される微生物はマサチューセッツ州（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、マールボロ（Ｍａｒｌｂｏｒｏ）の土壌試料から得られたものであった。ＢＨＩ／寒天上で４８〜７２時間増殖させた後、それら試験コロニーの上に、前駆体ＸＩＩ・２．０ｇ／Ｌの、燐酸塩緩衝剤２０ｍＭを含有するｐＨ７．０のアガロース中溶液を重ねた。これらのコロニーを更に１〜２週間増殖させ、不透明な区域について観察した。不透明な区域（続いて透明化する）を持つこのようなコロニーを以下に述べる第二のスクリーンで更に培養した。即ち、微生物を１２５ｍＬのシェーカーフラスコ中の滅菌されたＢＨＩブイヨン２５ｍＬに接種し、そのフラスコを２５℃、１５０ＲＰＭで振った。２４時間後に当該前駆体１０ｍｇを水性懸濁液として各フラスコに加えた。そのフラスコをシェーカーに戻し、更に４８〜７２時間振った。インキュベーション後、よく混合されたブイヨン３ｍＬを取り出し、ｐＨ２まで酸性化し、そしてジエチルエーテル２ｍＬで抽出した。そのジエチルエーテル溶液を移動相２ｍＬを有するＨＰＬＣのバイアルに入れ、そして１つの試料をキラルセルＯＪ^TMカラムの上に注加した。このカラムをヘキサン中酢酸０．５％より成る移動相を用いて溶離させた。結果を表Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに示す。表中、縦欄Ｒ及びＳの中の数字はＨＰＬＣから得られたピーク面積を表す。但し、それらは無次元の相対的な数字である。それらを共に用いてＲ対Ｓの比（第４縦欄及び第５縦欄に示される）を導き、かつ標準条件下での転化の程度を略定量化する。以上の実験で使用されたシュードモナス・ポーシモビリス（ＳＥＰ５４）はメリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクションに寄託番号ＡＴＣＣ５５３６９で寄託されたものである。２回目のスクリーン操作は、生成物の対掌体をクロマトグラフィーで分離する条件が一旦確かめられると、非常に容易に開始できるようになり、多くの微生物はこの２回目のスクリーン操作で直接スクリーンされることが見いだされた。同定されている微生物を使用しての、ナプロキセンの重亜硫酸塩前駆体（ＸＶＩＩ）の酸化結果は表Ｅに示され、またケトプロフェンの重亜硫酸塩前駆体（ＸＶＩ）の酸化結果は表Ｆに示される。ＸＶＩＩによる５９種の接種物から、第一パスの選択（ｆｉｒｓｔｐａｓｓｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）で、４４種の菌株（ある種の菌株は多重接種された）の内ナプロキセンの一方又は他方の対掌体を１００％ｅｅで生成させる１７種の菌株が得られた。条件は最適化されなかったので、４４種の内１７種（３３％）は原料第一パス収率である。前記の手順を用いると有用な微生物が容易に得られることを確認するために、マサチューセッツ州の土壌試料から単離された土壌微生物の更に９８種の培養物を調べた。これらの培養物はこの技術分野で周知の日常的な方法で単離され、これらを上記のミクロタイタ皿に接種した。これらの微生物は分類、同定されなかったので、ある種の培養物ではそれによって同一の菌株の多重発生を代表させることが可能であり、実際それは確からしい。９８種の培養物の内３１種（３１％）がＸＶＩＩをナプロキセンの単一の対掌体に転化させることができた。同様に、土壌微生物の培養物をＸＶＩのケトプロフェンへの転化のために試験した。土壌試料とＡＴＣＣの両寄託培養物から成る合計２５０種の接種物で選択性酸化をすることができる培養物が２６種得られた。これらの内３種が純Ｒ又は純Ｓのケトプロフェンを生成させた。以上、本発明を特に示し、その好ましい態様を参照して説明したが、当業者であれば、本発明の精神と範囲から逸脱することなしに本発明の形態と細部に他の変更を加え得ることは理解できるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１０月２７日【補正内容】請求の範囲１．式：を有する前駆体の、式：を有するカルボン酸への対掌体選択性転化法にして、該前駆体を該カルボン酸に対掌体選択的に転化することができる微生物又は該微生物に由来する酵素調製物の作用に該前駆体を付すことから成る上記転化法：但し、上記の式においてＲ¹はアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ²は水素、アルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ³は水素、アルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｍ⁺はアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンであり；ここで、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は異なる基である。２．式：を有する前駆体の、式：を有するカルボン酸への対掌体選択性転化法にして、細菌、真菌及び酵母より成る群から選ばれる、該前駆体を該カルボン酸に対掌体選択的に転化することができる微生物又は該微生物に由来する酵素調製物の作用に該前駆体を付すことから成る上記転化法：但し、上記の式においてＲ¹はアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ^2aはアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｍ⁺はアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンであり；ここで、Ｒ¹及びＲ^2aは異なる基である。３．微生物が細菌、酵母菌又は真菌である、請求の範囲第１項に記載の方法。４．酵素調製物がオキシドレダクターゼを含有するものであることを更に特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。５．キラルカルボン酸がα−置換プロピオン酸系薬剤である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。６．カルボン酸がイブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン及びフルルビプロフェンより成る群から選ばれる、請求の範囲第５項に記載の方法。７．カルボン酸がイブプロフェンである、請求の範囲第６項に記載の方法。８．微生物がシュードモナス属、アエロモナス属、エシェリキア属、アクロモバクター属及びアルカリゲネス属から選ばれる、請求の範囲第６項に記載の方法。９．イブプロフェンの単一の対掌体がＳ−イブプロフェンであり、前駆体がα −メチル−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンアセトアルデヒド、α−ヒドロキシ−β−メチル−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンエタンスルホン酸塩又は３−メチル−３−［４−（２−メチルプロピル）フェニル］オキシラン−２− カルボン酸塩であり、そして微生物がシュードモナス・ポーシモビリス又はアルカリゲネス・ファエカリスである、請求の範囲第８項に記載の方法。 10．カルボン酸がナプロキセンであり、前駆体がα−ヒドロキシ−β−メチル −６−メトキシ−２−ナフタレンエタンスルホン酸塩であり、そして微生物がアセトバクター属、アシネトバクター属、アルトロバクター属、アスペルギルス属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、カンジダ属、シュードモナス属、ロドコッカス属及びセラチア属から選ばれる、請求の範囲第６項に記載の方法。 11．カルボン酸がケトプロフェンであり、前駆体がα−ヒドロキシ−β−メチル−３−ベンゾイルベンゼンエタンスルホン酸塩であり、そして微生物がバチルス属及びサッカロミセス属から選ばれる、請求の範囲第６項に記載の方法。 12．Ｒ¹が置換アリールであり、Ｒ²がメチルであり、そしてＲ³が水素である、請求の範囲第１項に記載の方法。 13．Ｒ¹が置換アリールであり、そしてＲ^2aがメチルである、請求の範囲第２項に記載の方法。 14．やや溶けにくいラセミ体アルデヒド、アルデヒドのやや溶けにくい重亜硫酸塩付加生成物又はやや溶けにくいグリシデートの、光学的に実質的に純粋なα −置換プロピオン酸への対掌体特異性転化法にして、次の：（ａ）微生物の複数のコロニーを基質上の水性培地中で増殖させ；（ｂ）該コロニーの上に該アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩付加生成物、又はグリシデートを懸濁含有する不透明な水性培地を重ね、そして該微生物の増殖を続け；（ｃ）該コロニーの、該不透明な培地が透明になっているそのようなコロニーを初めに選択し；（ｄ）該アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩付加生成物、又はグリシデートを初めに選択された該コロニーの各々の培養物と共にインキュベートすることによって該アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩付加生成物、又はグリシデートを該α−置換プロピオン酸に転化し；（ｅ）生成したままの該α−置換プロピオン酸の異性体の対掌体比を測定し；（ｆ）その対掌体比に基づいて該培養物について２回目の選択を行い；そして（ｇ）該アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩付加生成物、又はグリシデートを２回目に選択された該培養物の内の１つの培養物と共にインキュベートすることによって光学的に実質的に純粋なα−プロピオン酸に転化することから成る上記方法。 15．培養物について２回目の選択を行う工程（ｆ）で、実質的に純粋なイブプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン又はナプロキセンの各対掌体を最大収率で生成させるそのような培養物が選ばれることを更に特徴とする、請求の範囲第１４項に記載の方法。 16．培養物について２回目の選択を行う工程（ｆ）で、実質的に純粋なＳ−イブプロフェンを最大収率で生成させるそのような培養物が選ばれることを更に特徴とする、請求の範囲第１４項に記載の方法。 17．可溶性のラセミ体アルデヒド、アルデヒドの可溶性重亜硫酸塩付加生成物又は可溶性のグリシデートの、光学的に実質的に純粋なα−置換プロピオン酸への対掌体特異性転化法にして、次の：（ａ）微生物の複数のコロニーを基質上の水性培地中で増殖させ；（ｂ）該コロニーの上に該アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩付加生成物、又はグリシデートを溶解含有する透明な水性培地を重ね、そして該微生物の増殖を続け；（ｃ）該コロニーの、該透明な培地が不透明になっているそのようなコロニーを初めに選択し；（ｄ）該アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩付加生成物、又はグリシデートを初めに選択された該コロニーの各々の培養物と共にインキュベートすることによって該アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩付加生成物、又はグリシデートを α−置換プロピオン酸に転化し；（ｅ）生成したままの該α−置換プロピオン酸の異性体の対掌体比を測定し；（ｆ）その対掌体比に基づいて該培養物について２回目の選択を行い；そして（ｇ）該アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩付加生成物、又はグリシデートを２回目に選択された該培養物の内の１つの培養物と共にインキュベートすることによって該アルデヒド、アルデヒドの重亜硫酸塩付加生成物、又はグリシデートを光学的に実質的に純粋なα−置換プロピオン酸に転化することから成る上記方法。 18．培養物について２回目の選択を行う工程（ｆ）で、実質的に純粋なイブプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン又はナプロキセンの各対掌体を最大収率で生成させるそのような培養物が選ばれることを更に特徴とする、請求の範囲第１７項に記載の方法。 19．培養物について２回目の選択を行う工程（ｆ）で、実質的に純粋なＳ− イブプロフェンを最大収率で生成させるそのような培養物が選ばれることを更に特徴とする、請求の範囲第１７項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:025） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:025） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:85） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ (72)発明者ゼップ，チャールズメルビンアメリカ合衆国 01503 マサチューセッツ州バーリン，ハイランドストリート 19

Claims

【特許請求の範囲】１．アルデヒド類、アルデヒド類の重亜硫酸塩付加生成物及びグリシデート類から選ばれる前駆体を微生物又は微生物に由来する酵素調製物に暴露することによって該前駆体をキラルカルボン酸の単一の対掌体、又はキラルカルボン酸の単一の対掌体に富む対掌体混合物に転化することから成る、キラルカルボン酸の単一の対掌体、又はキラルカルボン酸の単一の対掌体に富む対掌体混合物の製造法。２．微生物が細菌、酵母菌又は真菌である、請求の範囲第１項に記載の方法。３．酵素調製物がオキシドレダクターゼを含有するものであることを更に特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。４．キラルカルボン酸がα−置換プロピオン酸系薬剤である、請求の範囲第１項に記載の方法。５．カルボン酸がイブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン及びフルルビプロフェンより成る群から選ばれる、請求の範囲第４項に記載の方法。６．カルボン酸がイブプロフェンである、請求の範囲第５項に記載の方法。７．微生物がシュードモナス属、アエロモナス属、エシェリキア属、アクロモバクター属及びアルカリゲネス属から選ばれる、請求の範囲第６項に記載の方法。８．イブプロフェンの単一の対掌体がＳ−イブプロフェンであり、前駆体がα −メチル−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンアセトアルデヒド、α−ヒドロキシ−β−メチル−４−（２−メチルプロピル）ベンゼンエタンスルホン酸塩又は３−メチル−３−［４−（２−メチルプロピル）フェニル］オキシラン−２− カルボン酸塩であり、そして微生物がシュードモナス・ポーシモビリス又はアルカリゲネス・ファエカリスである、請求の範囲第７項に記載の方法。９．カルボン酸がナプロキセンであり、前駆体がα−ヒドロキシ−β−メチル −６−メトキシ−２−ナフタレンエタンスルホン酸塩であり、そして微生物がアセトバクター属、アシネトバクター属、アルトロバクター属、アスペルギルス属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、カンジダ属、シュードモナス属、ロドコッカス属及びセラチア属から選ばれる、請求の範囲第５項に記載の方法。 10．カルボン酸がケトプロフェンであり、前駆体がα−ヒドロキシ−β−メチル−３−ベンゾイルベンゼンエタンスルホン酸塩であり、そして微生物がバチルス属及びサッカロミセス属から選ばれる、請求の範囲第５項に記載の方法。 11．式：を有する前駆体の、式：を有するカルボン酸への対掌体選択性転化法にして、細菌、真菌及び酵母菌より成る群から選ばれる、該前駆体を該カルボン酸に対掌体選択的に転化することができる微生物又は該微生物に由来する酵素調製物の作用に該前駆体を付すことから成る上記転化法：但し、上記の式においてＲ¹はアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ²は水素、アルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ³は水素、アルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｍ⁺はアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンであり；ここで、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は異なる基である。 12．Ｒ¹が置換アリールであり、Ｒ²がメチルであり、そしてＲ³が水素である、請求の範囲第１１項に記載の方法。 13．式：を有する前駆体の、式：を有するカルボン酸への対掌体選択性転化法にして、該前駆体を該カルボン酸に対掌体選択的に転化することができる微生物又は該微生物に由来する酵素調製物の作用に該前駆体を付すことから成り、ここで該生物は細菌、真菌及び酵母より成る群から選ばれる、上記転化法：但し、上記の式においてＲ¹はアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｒ^2aはアルキル、アラルキル、アリール又は置換アリールであり；Ｍ⁺はアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンであり；ここで、Ｒ¹及びＲ^2aは異なる基である。 14．Ｒ¹が置換アリールであり、そしてＲ^2aがメチルである、請求の範囲第１２項に記載の方法。 15．やや溶けにくいラセミ体アルデヒド又はアルデヒドの均等物の、光学的に実質的に純粋なプロフェンへの対掌体特異性転化法にして、次の：（ａ）微生物の複数のコロニーを基質上の水性培地中で増殖させ；（ｂ）該コロニーの上に該アルデヒド又はアルデヒド均等物を懸濁含有する不透明な水性培地を重ね、そして該微生物の増殖を続け；（ｃ）該コロニーの、該不透明な培地が透明になっているそのようなコロニーを初めに選択し；（ｄ）該アルデヒド又はアルデヒド均等物を初めに選択された該コロニーの各各の培養物と共にインキュベートすることによって該アルデヒド又はアルデヒド均等物をプロフェンに転化し；（ｅ）生成したままの該プロフェンの異性体の対掌体比を測定し；（ｆ）その対掌体比に基づいて該培養物について２回目の選択を行い；そして（ｇ）該アルデヒド又はアルデヒド均等物を２回目に選択された該培養物の内の１つの培養物と共にインキュベートすることによって該アルデヒド又はアルデヒド均等物を光学的に実質的に純粋なプロフェンに転化することから成る上記方法。 16．培養物について２回目の選択を行う工程（ｆ）で、実質的に純粋なイブプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン又はナプロキセンの各対掌体を最大収率で生成させるそのような培養物が選ばれることを更に特徴とする、請求の範囲第１５項に記載の方法。 17．培養物について２回目の選択を行う工程（ｆ）で、実質的に純粋なＳ−イブプロフェンを最大収率で生成させるそのような培養物が選ばれることを更に特徴とする、請求の範囲第１５項に記載の方法。 18．可溶性のラセミ体アルデヒド均等物の光学的に実質的に純粋なプロフェンへの対掌体特異性転化法にして、次の：（ａ）微生物の複数のコロニーを基質上の水性培地中で増殖させ；（ｂ）該コロニーの上に該アルデヒド均等物を溶解含有する透明な水性培地を重ね、そして該微生物の増殖を続け；（ｃ）該コロニーの、該透明な培地が不透明になっているそのようなコロニーを初めに選択し；（ｄ）該アルデヒド均等物を初めに選択された該コロニーの各々の培養物と共にインキュベートすることによって該アルデヒド均等物をプロフェンに転化し；（ｅ）生成したままの該プロフェンの異性体の対掌体比を測定し；（ｆ）その対掌体比に基づいて該培養物について２回目の選択を行い；そして（ｇ）該アルデヒド又はアルデヒド均等物を２回目に選択された該培養物の内の１つの培養物と共にインキュベートすることによって該アルデヒド又はアルデヒド均等物を光学的に実質的に純粋なプロフェンに転化することから成る上記方法。 19．培養物について２回目の選択を行う工程（ｆ）で、実質的に純粋なイブプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン又はナプロキセンの各対掌体を最大収率で生成させるそのような培養物が選ばれることを更に特徴とする、請求の範囲第１８項に記載の方法。 20．培養物について２回目の選択を行う工程（ｆ）で、実質的に純粋なＳ−イブプロフェンを最大収率で生成させるそのような培養物が選ばれることを更に特徴とする、請求の範囲第１８項に記載の方法。