JPH0473998B2

JPH0473998B2 -

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Publication number: JPH0473998B2
Application number: JP1330367A
Authority: JP
Priority date: 1989-12-19
Filing date: 1989-12-19
Publication date: 1992-11-25
Also published as: EP0434393A3; EP0434393B1; DE69026585T2; DE69026585D1; EP0434393A2; JPH03191794A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は微生物を用いて、ラセミ体３−ハロゲ
ノ−１，２−プロパンジオールより光学活性なＲ
−（−）−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオー
ルを分取する方法に関するものである。Ｒ−（−）−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジ
オールは光学活性な医薬品や生理活性物質の合成
原料として有用な物質である。例えばＲ−（−）−
３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールは光学
活性なベーターブロツカー（降圧剤）やＬ−カル
ニチン等の合成に利用することができる。またＲ
−（−）−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオー
ルからは光学活性な医薬、農薬あるいは生理活性
物質、強誘電性液晶に有用な合成中間体Ｒ−（＋）
−グリシドールに導くことができる。〔従来の技術〕Ｒ−（−）−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジ
オールの製法に関しては次のようなものが知られ
ている。これらのうちHayan F.Jonesによるメチル−
５−クロロ−５−デオキシ−α−Ｌ−アラビノフ
ラノシドより得る方法（Chemistry and
Industry，15，P533，1978）やH.Jacksonらによ
る１，２，５，６−ジアセトニル−Ｄ−マンニト
ールより得る方法（Chem.−Biol.Interaction，
13，P193，1976）は化学合成法であり、いずれ
も原料の入手が困難であり高度な合成手法を必要
とし、工程が繁雑であるため工業的には不適当で
ある。また、本発明と同じくシユードモナス属に
属する微生物を利用する方法としては高橋氏らの
製法（特開昭62−122597号公報、特開昭62−
158494号公報、特開昭63−36798号公報、特開昭
63−251098号公報が既に知られているが、これら
の方法はＳ−（＋）−３−ハロゲノ−１，２−プロ
パンジオールが酸化的に分解、代謝される反応を
利用した方法であり、以下のような問題点を有す
る。すなわち用いる微生物群、例えば例示されて
いるシユードモナス・フラジIFO 3458，シユー
ドモナス・クルシビエIFO 12047，シユードモナ
ス・クロロラフイスIFO 3904はＳ−（＋）−３−
ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを代謝し得
るが、ラセミ体３−ハロゲノ−１，２−プロパン
ジオールを単一炭素源とし、硫安あるいは硝安の
ような無機能窒素を窒素源とする完全合成培地中
では生育増殖できない。よつてその反応に際して
はそれらの実施例にみられるように、多量の菌体
を栄養培地中で別に増殖させてその洗浄菌体をラ
セミ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール
に作用させねばならない。又は他の栄養源を含み
生育できる培地中にラセミ体３−ハロゲノ−１，
２−プロパンジオールを加えなければならない等
の問題点があり、これらの事はその反応あるいは
精製という観点からみると好ましくないと考えら
れる。〔発明が解決しようとする課題〕本発明は上記の従来法より経済的に安価でかつ
技術的に簡便な方法によりＲ−（−）−３−ハロゲ
ノ−１，２−プロパンジオールを製造することを
目的とする。〔課題を解決するための手段〕本発明者らはラセミ体３−ハロゲノ−１，２−
プロパンジオールからＳ−（＋）−３−ハロゲノ−
１，２−プロパンジオールを優先的に分解・資化
し、さらに単一炭素源として生育増殖しうる微生
物を求めるべく検討を行い鋭意研究した結果、土
壌より目的とする微生物の分離に成功し、Ｒ−
（−）−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール
の製法を確立した。すなわち本発明は、Ｓ−（＋）−３−ハロゲノ−
１，２−プロパンジオール資化能を有し、Ｓ−
（＋）−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール
を単一炭素源として生育増殖しうるシユードモナ
ス属に属する細菌又はその培養菌体を、ラセミ体
３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを単一
炭素源とする培地中で培養せしめ、培養物より、
残存するＲ−（−）−３−ハロゲノ−１，２−プロ
パンジオールを分取することを特徴とする微生物
処理によるＲ−（−）−３−ハロゲノ−１，２−プ
ロパンジオールの製法である。本発明によれば、Ｒ−（−）−３−ハロゲノ−
１，２−プロパンジオールの大量生産を行う場合
にも多量の菌体を別途に培養し集菌しなくても種
菌としての分量だけを培養し、それを接種すれば
よい。なお本発明で用いることのできる微生物はいず
れもＳ−（＋）−３−ハロゲノ−１，２−プロパン
ジオールを資化するにあたりＳ−（＋）−３−ハロ
ゲノ−１，２−プロパンジオールの脱ハロゲン化
水素反応を行い、ハロゲン化水素酸を生ずる。ま
た本発明に用いられる３−ハロゲノ−１，２−プ
ロパンジオールとしては３−クロロ−１，２−プ
ロパンジオールもしくは３−ブロモ−１，２−プ
ロパンジオールが適当である。本発明者らが土壌より分離採取し、本発明に用
いた微生物の形態学的・生理学的諸性質は表１に
示すとおりである。【表】７. 抗酸性無
同左同左
【表】【表】【表】【表】以下の結果をもとにバージエイズ・マニユア
ル・オブ・システマチツク・バクテリオロジー第
９版に従い分類すると、上記菌体は、グラム陰
性、好気性かん菌、極鞭毛を有し、オキシダーゼ
陽性、カタラーゼ陽性からシユードモナス属に属
することが判明した。近縁菌株としてはシユード
モナス・アシドボランス（Pseudomonas
acidoborans），シユードモナス・テストステロ
ニ（Pseudomonas testosteroni），シユードモナ
ス・デラフイールデイ（Pseudomon−as
delafieldii），シユードモナス・フアシリス
（Pseudomonas facilis），シユードモナス・サツ
カロフイラ（Pseudomonas saccharophila），シ
ユードモナス・シユードフラバ（Pseudomonas
pseudoflava），シユードモナス・パレロニ（Ｐ
−seudomonas palleronii）が考えられるが、上
記菌株は炭素源としてＤ−グルコースを利用でき
るのに対してシユードモナス・アシドボランス及
びシユードモナス・テストステロニは炭素源とし
てＤ−グルコーズを利用できない点、また上記菌
株は炭素源としてパラハイドロキシベンゾエイト
（Ｐ−Hydroxybenzoate）を利用できるのに対し
てシユードモナス・デラフイールデイ，シユード
モナス・フアリシス，シユードモナス・サツカロ
フイラ，シユードモナス・フラバは炭素源として
パラハイドロキシベンゾエイトを利用できない
点、また上記菌株はカロチノイド色素を生成しな
いのに対し、シユードモナス・シユードフラバ，
シユードモナス・パレロニはカロチノイド色素を
生成する点が異なり、上記菌株は公知の菌株の特
徴と一致するものがなく新菌株と考えられ
Pseudomonas sp.DS−Ｋ−2DI，Ｐ−
seudomonas sp.DS−Ｋ−9D1，Pseudomonas
sp.DS−Ｋ−14A4と命名した。また上記菌株はそ
れぞれシユードモナス属に属する類似菌株である
が、Pseudomonas sp.DS−Ｋ−2D1と
Pseudomonas sp.DS−Ｋ−14A4はリトマスミル
クを白色に還元するのに対してPseudomonas
sp.DS−Ｋ−9D1はリトマスミルクを白色に還元
しない点、またMGPB寒天培地での生育常態に
おいてPseudomonas sp.DS−Ｋ−2D1はコロニ
ーの隆起状態が中心凸状であるのに対して
Pseudomonas sp.DS−Ｋ−14A4はコロニーの隆
起状態が凸状である点が異なり上記菌株はそれぞ
れ３種の異なる菌株ことが判明した。なおこれら
の菌株は工業技術院微生物工業技術研究所におい
て微工研菌寄第11108号（FERM Ｐ−11108），
微工研菌寄第11109号（FERM Ｐ−11109），微
工研菌寄第11110号（FERM P11110）として寄
託されている。なお本発明における使用菌としては、上記菌株
ばかりでなく、Ｓ−（＋）−３−ハロゲノ−１，２
−プロパンジオール資化能を有し、Ｓ−（＋）−３
−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを単一炭
素源として生育増殖しうるシユードモナス属に属
する細菌であれば、すべて用いることができる。本発明は具体的にはラセミ体３−ハロゲノ−
１，２−プロパンジオールを単一炭素源とし、無
機態窒素（各種アンモニウム塩又は硝酸塩）を窒
素源として、その他無機塩類を加えた合成培地中
で上記細菌を培養するか、又は上記いずれか１種
類の細菌をブイヨン培地あるいはペプトン培地等
炭素源、窒素源、有機栄養源、無機栄養源を含む
通常よく用いられる培地中で培養し、これらから
得られる培養物あるいは培養菌体をラセミ体３−
ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを単一炭素
源として含有する培地中に接種し、さらに培養あ
るいは作用させ、培養物より、残存するＲ−（−）
−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを分
取すればよい。炭素源としてはラセミ体３−ハロ
ゲノ−１，２−プロパンジオール、グリセリン等
のアルコール類、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクト
ース、Ｄ−ガラクトース等の糖類、クエン酸、マ
レイン酸、リンゴ酸、フマール酸等の有機酸及び
その塩類を、窒素源としては硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機
態窒素、及び尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エ
キス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機
態窒素源を用いることができる。その他無機塩類
としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリ塩、マ
ンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩等が用いられる。上記菌の培養は慣用の方法で行うことができ
る。通常、培養温度は約20〜40℃、好ましくは25
〜37℃、PHは約５〜10、好ましくは5.5〜9.5で振
盪培養あるいは通気攪拌培養等の手段により好気
的に行われる。反応液中の基質濃度は0.1〜10％
（ｖ／ｖ）程度が好ましく、その反応時間は基質
濃度、その他の反応条件によつて異なるが48〜80
時間で終了するのが好ましい。反応の停止は残存
する基質をガスクロマトグラフイー等で分析し、
残存基質が50％、すなわちＳ−（＋）−３−ハロゲ
ノ−１，２−プロパンジオールがすべて資化され
た時点で止めるのが好ましい。残存するＲ−（−）
−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールの採
取、精製は次のように行う。すなわち培養終了
後、培養液をとり出し遠心分離操作あるいは凝集
剤等により微生物菌体とその上清液とに分離し、
上清液中に残存するＲ−（−）−３−ハロゲノ−
１，２−プロパンジオールを活性炭に吸着させ、
アセトンで溶出し減圧蒸留するか、酢酸エチル等
の溶媒抽出を行い減圧蒸留するかのいずれかの方
法で精製分取すればよい。〔実施例〕以下実施例により本発明を具体的に説明する。
なお例中％は特に記載のない限り重量％で示す。実施例１硫安 0.5％リン酸第２ナトリウム 0.1％リン酸第２カリウム 0.1％リン酸第１ナトリウム 0.2％硫酸マグネシウム 0.05％硫酸鉄、硫酸銅、硫酸マンガン微量炭酸カルシウム 0.45％ PH 6.8 からなる組成の培地100mlを入れた坂口フラスコ
（500ml容）を121℃、15分間滅菌後、ラセミ体３
−クロロ−１，２−プロパンジオールを1.0％
（ｖ／ｖ）になるように上記培地に添加し、ラセ
ミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単
一炭素源とする培地を作成した。次に表１に示し
た微生物Pseudomonas sp.DS−Ｋ−2D1を傾斜
寒天培地から１白金耳、上記培地に接種し、30
℃、130rpmの条件で４日間振盪培養した。培養終了後、培養液を取り出し遠心分離操作に
より菌体を除去し、上清液を得た。この上清液を
約20mlにまで濃縮し、酢酸エチルにより抽出、そ
して硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下で油
状物質として３−クロロ−１，２−プロパンジオ
ールを0.4gを分取した。本物質の同定はガスクロマトグラフイーによつ
て行つた。カラム担体PEG−20MP、60〜80メツ
シユを用いて市販のラセミ体３−クロロ−１，２
−プロパンジオール（東京化成社製品）と比較し
たところ保持時間は全く同じであつた。本物質の比旋光度及び（Ｒ）−３−クロロ−１，
２−プロパンジオールの比旋光度（文献値）は次
の如くである。本物質〔α〕²² _D＝−7.75° （Ｃ＝１，H₂Ｏ）文献値〔α〕²² _D＝−6.9° （Ｃ＝２，H₂Ｏ）また、本物質を常法によりトシル化した後、光
学異性体分離カラム〔CHIRALCEL OCカラム
（25cm×0.46cmI.D）〕（ダイセル化学工業(株)製）に
よりヘキサン−イソプロパノール（95：５）の溶
媒を用いて室温，流速1.0ml／min、波長235nmの
条件でHPLC分析を行つた。この分析法では保持
時間はＳ体79分、Ｒ体89.8分となり、本物質はＲ
体に相当する保持時間を示し、光学純度98％e.e.
以上であつた。実施例２，３菌株を表１に示したPseudomonas sp.DS−Ｋ
−9D1及びPseudomonas sp.DS−Ｋ−14A4に変
更した以外は実施例１と同様の方法で行つた。ま
た、得られた物質を実施例１に示した様に種々分
析を行つた結果、それぞれ光学純度98％e.e.以上
のＲ−（−）−３−クロロ−１，２−プロパンジオ
ールであつた。実施例２，３の結果を以下にまと
めて示す。実施例菌株〔α〕²² _D （Ｃ＝１，H₂Ｏ）２ DS−Ｋ−9D1 −7.70° ３ DS−Ｋ−14A4 −7.71° 実施例収量（ｇ）２ 0.38 ３ 0.45 実施例４硫安 0.5％リン酸第２ナトリウム 0.02％リン酸第２カリウム 0.02％リン酸第１ナトリウム 0.04％硫酸マグネシウム 0.05％硫酸鉄，硫酸銅，硫酸マンガン微量 PH 6.8 からなる組成の培地2.5を入れた５容培養器
（ジヤーフアーメンター）を121℃、15分間滅菌
後、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオ
ールを1.0％（ｖ／ｖ）になるように上記培地に
添加し、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパン
ジオールを単一炭素源とする培地を作製した。次
に表１に示した微生物Pseudomonas sp.DS−Ｋ
−2D1を予めペプトン1.0％、酵母エキス1.0％、
グリセロール1.0％、PH7.2からなる栄養培地で30
℃、24時間振盪培養し、これを上記ラセミ体３−
クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源
とする培地に２％（ｖ／ｖ）量無菌的に接種し
た。そして以下の条件で４日間通気攪拌培養を行
つた。温度 30℃ 通気量 0.5／min 回転数 500rpm なお、PHの測定及び制御は連動させたPHメータ
ーで行い、3N−NaOHによりPH6.8に制御した。培養終了後、培養液を取り出し遠心分離操作に
より菌体を除去し、上清液を得た。上清液からの
３−クロロ−１，２−プロパンジオールの調製は
実施例１と同様にして行い14.9gを分取した。この得られた物質を実施例１に示した様に種々
分析を行つた結果、光学純度98％e.e.以上のＲ−
（−）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールで
あつた。本物質の比旋光度は〔α〕²² _D＝−7.75°（Ｃ
＝１，H₂Ｏ）であつた。実施例５，６菌株を表１に示したPseudomonas sp.DS−Ｋ
−9D1及びPseudomonas sp.DS−Ｋ−14A4に変
更した以外は実施例４と同様の手法で行つた。ま
た得られた物質を実施例１に示した様に種々分析
を行つた結果、それぞれ光学純度98％e.e.以上の
Ｒ−（−）−３−クロロ−１，２−プロパンジオー
ルであつた。実施例５，６の結果をまとめて示
す。実施例菌株〔α〕²² _D （Ｃ＝１，H₂Ｏ）５ DS−Ｋ−9D1 −7.74° ６ DS−Ｋ−14A4 −7.70° 実施例収量（ｇ）５ 15.0 ６ 13.5 実施例７ペプトン1.0％、酵母エキス1.0％、グリセロー
ル1.0％、PH7.2からなる組成の栄養培地100mlを
入れた坂口フラスコ（500ml容）を121℃、15分間
滅菌後、表１に示したPseudomonas sp.DS−Ｋ
−2D1を傾斜寒天培地から１白金耳接種した。30
℃、24時間振盪培養した後、遠心分離操作により
菌体と上清液を分離し、上清液は廃棄した。そし
て得られた菌体を50mMリン酸緩衝液、PH7.0に
て２〜３回洗浄し、洗浄菌体とした。次にこの菌
体を実施例１に示したラセミ体３−クロロ−１，
２−プロパンジオールを単一炭素源とする培地
100mlに懸濁し、30℃、130rpmで３日間反応させ
た。反応終了後、遠心分離操作により菌体を除去
し、上清液を得た。上清液からの３−クロロ−
１，２−プロパンジオールの調製は実施例１と同
様にして行い0.4gを分取した。得られた物質を実
施例１に示したように種々分析を行つた結果、光
学純度98％e.e.以上のＲ−（−）−３−クロロ−
１，２−プロパンジオールであつた。本物質の比
旋光度は〔α〕²² _D＝−7.75°（Ｃ＝１，H₂Ｏ）であ
つた。実施例８，９菌株を表１に示したPseudomonas sp.DS−Ｋ
−9D1及びPseudomonas sp.DS−Ｋ−14A4に変
更した以外は実施例７と同様の方法で行つた。ま
た、得られた物質を実施例１に示したように種々
分析を行つた結果、それぞれ光学純度98％e.e.以
上のＲ−（−）−３−クロロ−１，２−プロパンジ
オールであつた。実施例８，９の結果を以下にま
とめて示す。実施例菌株〔α〕²² _D （Ｃ＝１，H₂Ｏ）８ DS−Ｋ−9D1 −7.74° ９ DS−Ｋ−14A4 −7.70° 実施例収量（ｇ）８ 0.51 ９ 0.45 実施例 10〜12 実施例１〜３に従いラセミ体３−クロロ−１，
２−プロパンジオールをラセミ体３−ブロモ−
１，２−プロパンジオールに替えて実験を行つ
た。実験方法及びその他の操作は実施例１に従つ
て行つた。以下に実施例10〜12の結果をまとめて
示す。実施例菌株〔α〕²² _D （Ｃ＝１，CHCL₃） 10 DS−Ｋ−2D1 −3.80° 11 DS−Ｋ−9DI −3.75° 12 DS−Ｋ−14A4 −3.77° 実施例収量（ｇ） 10 0.61 11 0.65 12 0.55 なお（Ｒ）−３−ブロモ−１，２−プロパンジ
オールの比旋光度の文献値は次の如くである。〔α〕²² _D＝−3.94° （Ｃ＝5.07，CHC₃）また、実施例10〜12で得られたＲ−（−）−３−
ブロモ−１，２−プロパンジオールを常法により
トシル化した後、光学異性体分離カラム
〔CHIRALCEL OCカラム（25cm×0.46cmI.D）〕
（ダイセル化学工業(株)製）によりヘキサン−イソ
プロパノール（95：５）の溶媒を用いて室温、流
速1.0m／min、波長235nmの条件でHPLC分析
を行つた。この分析では保持時間はＳ体98.9分、
Ｒ体115.4分となり、上記物質はＲ体に相当する
保持時間を示し、それぞれ光学純度96％e.e.以上
であつた。実施例 13〜15 実施例４〜６に従いラセミ体３−クロロ−１，
２−プロパンジオールをラセミ体３−ブロモ−
１，２−プロパンジオールに替えて実験を行つ
た。実験方法及びその他の操作は実施例４に従つ
て行つた。得られた物質を実施例10に示した様に
種々分析を行つた結果、それぞれ光学純度96％e.
e.以上のＲ−（−）−３−ブロモ−１，２−プロパ
ンジオールであつた。以下に実施例13〜15の結果
をまとめて示す。実施例菌株〔α〕²² _D （Ｃ＝１，CHCL₃） 13 DS−Ｋ−2D1 −3.77° 14 DS−Ｋ−9DI −3.74° 15 DS−Ｋ−14A4 −3.78° 実施例収量（ｇ） 13 17.1 14 15.5 15 16.8 実施例 16〜18 実施例７〜９に従いラセミ体３−クロロ−１，
２−プロパンジオールをラセミ体３−ブロモ−
１，２−プロパンジオールに替えて実験を行つ
た。実験方法及びその他の操作は実施例７に従つ
て行つた。得られた物質を実施例10に示した様に
種々分析を行つた結果、それぞれ光学純度96％e.
e.以上のＲ−（−）−３−ブロモ−１，２−プロパ
ンジオールであつた。以下に実施例16〜18の結果
をまとめて示す。実施例菌株〔α〕_D ²⁵ （Ｃ＝１，CHCL₃） 16 DS−Ｋ−2D1 −3.77° 17 DS−Ｋ−9D1 −3.78° 18 DS−Ｋ−14A4 −3.74° 実施例収量（ｇ） 16 0.62 17 0.59 18 0.66 〔発明の効果〕シユードモナス属の細菌を利用してラセミ体３
−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールからＳ−
（＋）−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール
を優先的に資化させることにより、原料的に安価
でかつ工業的に簡便な方法によつてＲ−（−）−３
−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを製造す
ることができる。

Claims

【特許請求の範囲】１Ｓ−（＋）−３−ハロゲノ−１，２−プロパン
ジオール資化能を有し、Ｓ−（＋）−３−ハロゲノ
−１，２−プロパンジオールを単一炭素源として
生育増殖しうるシユードモナス属に属する細菌又
はその培養菌体を、ラセミ体３−ハロゲノ−１，
２−プロパンジオールを単一炭素源とする培地中
で培養せしめ、培養物より、残存するＲ−（−）−
３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを分取
することを特徴とする微生物処理によるＲ−（−）
−３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールの製
法。２３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールが
３−クロロ−１，２−プロパンジオールである請
求項１に記載の製法。３３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールが
３−ブロモ−１，２−プロパンジオールである請
求項１に記載の製法。