JP2651703B2 - 微生物処理による光学活性なジハロゲノプロパノールの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はラセミ体のシハロゲノプロパノールを微生物
処理して光学活性なジハロゲノプロパノールを分取する
方法に関する。

（従来技術） ジハロゲノプロパノール、特に2,3−ジクロロ−１−
プロパノール（以下β−DCHと略称する）又は2,3−ジブ
ロモ−１−プロパノール（以下β−DBHと略称する）
は、下記構造式で表わされるようにC2位に不斉炭素をも
つ化合物であり、このものを光学分割して得られる光学
異性体から製造された光学活性なエピクロロヒドリン又
はエピブロモヒドリンは医薬、農薬、強誘電性液晶、光
学活性ポリマーなどの中間原料として重要である。

（但し、上式においてＸは塩素原子又は臭素原子であ
る） 従来ジハロゲノプロパノールの光学分割は極めて困難
であることが知られている。このジハロゲノプロパノー
ルを光学分割する方法については本出願人は先に微生物
を利用する光学分割方法を提案した（特開昭61−132196
号公報、特開昭62−40298号公報）。この方法は、土壌
中より分離採取して得られたシュードモナス属に属する
細菌、即ちシュードモナス（Pseudomonas）OS−Ｋ−29
（微工研菌寄第7846号,FERMP−7846）と命名される細菌
を用いてラセミ体のβ−DCH又はβ−DBHからＲ体のみを
分解せしめて、光学純度99％以上のＳ体を分取する方法
である。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、上記方法ではラセミ体β−DCH又はラ
セミ体β−DBHから培養によってＲ体を分解するに要す
る時間が甚だ長く、従って上記培養に際して温度管理、
撹拌動力、空気供給等に要する動力費用が大きいという
問題があった。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記先願の微生物処理による方法と同
等な高光学純度を与えることができ、しかも一方の光学
異性体をより速く資化することのできる微生物のスクリ
ーニングを行った。

その結果、約数千株の中からより強力なＲ体資化能を
持つシュードモナス属に属する後記３新菌株が上記欠点
を改善する微生物として見出された。

すなわち、本発明は、Ｒ−（＋）−2,3−ジクロロ−
１−プロパノール又はＲ−（＋）−2,3−ジブロモ−１
−プロパノール資化能を有し、それぞれシュードモナス
属に属する新菌株OS−Ｋ−９菌株,OS−Ｋ−74菌株及びO
S−Ｋ−76菌株から選ばれた細菌又はその培養菌体を適
当な培地中でラセミ体2,3−ジクロロ−１−プロパノー
ル又はラセミ体2,3−ジブロモ−１−プロパノールを作
用させてＳ−（−）−2,3−ジクロロ−１−プロパノー
ル又はＳ−（−）−2,3−ジブロモ−１−プロパノール
を分取することを特徴とする微生物処理による光学活性
なジハロゲノプロパノールの製法である。

本発明において用いられる土壌中から採取された上記
３種の新菌株、OS−Ｋ−９菌株,OS−Ｋ−74菌株及びOS
−Ｋ−76菌株の菌学的性質は下記に示すとおりである。

各培地における生育状態 3.肉汁液体培養（30℃,3日間） イ）生育状態 僅かに濁る 僅かに濁る 僅かに濁る ロ）ガス発生 無 無 無 ハ）培地の着色 無 無 無 4.肉汁ゼラチン穿刺培養 液化せず 液化せず 液化せず 5.リトマスミルク 凝固せず 凝固せず 凝固せず 青色 青色 無変化 上記の結果をもとにバージェイズ・マニュアル・オブ
・システマティック・バクテリオロジー（Bergey′s Ma
nual of Systematic Bacteriology）第１巻の記載に基
づき、それらの帰属同定を行うと、 OS−Ｋ−９菌株はシュードモナス シュードアルカリジ
ェネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）の新菌株 OS−Ｋ−74菌株はシュードモナス プチダ（Pseudomona
s putida）の新菌株 OS−Ｋ−76菌株はシュードモナス フルオレッセンス
（Pseudomonas fluorescence）の新菌株 と判明した。

本発明者らは、上記３種の新菌株をそれぞれシュード
モナス シュードアルカリジェネス（Pseudomonas pseu
doalcaligenes）OS−Ｋ−９（微工研菌寄第9769号,FERM
Ｐ−9769）、シュードモナス プチダ（Pseudomonas
putida）OS−Ｋ−74（微工研菌寄第9771号,FERMP−9771
号）、シュードモナス フルオレッセンス（Pseudomona
s fluorescence）OS−Ｋ−76（微工研菌寄第9770号,FER
M Ｐ−9770号）と命名した。

尚、本発明者らの実験によると、同属同種の標準菌株
であるシュードモナス シュードアルカリジェネスIFO1
4157株、シュードモナス プチダIFO14164株及びシュー
ドモナス フルオレッセンスIFO14160株については本発
明で用いる上記３新菌株と同様な効果、即ち、ジハロゲ
ノプロパノール資化性がないことが明らかとなった。

また、上記３新菌株は、前述した本出願人に係る先願
の菌株（OS−Ｋ−29（FERM Ｐ−7846）と比較して、 （ｉ）シュードモナス アルカリジェネスOS−Ｋ−９
（FERM Ｐ−9769）は、Ｄ−グルコース,D−ガラクトー
ス，シヨ糖及びトレハロースよりいずれも酸を生成しな
い （ii）シュードモナス プチダOS−Ｋ−74（FERM Ｐ−
9771）及びシュードモナス フルオレッセンスOS−Ｋ−
76（FERM Ｐ−9770）は、いずれもPseudomonasF寒天培
地，キングＢ寒天培地において蛍光性色素を生成する という生理学的諸性質において明らかに異なるものであ
る。

本発明ではラセミ体β−DCH又はラセミ体β−DBHに、
上記微生物を接触させてＳ−（−）−β−DCH又はＳ−
（−）−β−DBHを分取するが、具体的にはラセミ体β
−DCH又はラセミ体β−DBHを炭素源とし、無機態窒素
（各種のアンモニア塩，硝酸塩）を窒素源としその他無
機塩類を含む合成培地中で上記細菌を培養するか、又は
上記細菌をブイヨン培地、あるいは加糖ブイヨン培地
等、炭素源，窒素源，有機栄養源，無機栄養源を含む通
常よく用いられる栄養培地中で培養せしめ、よく生育さ
せておき、これから得られる菌体をラセミ体β−DCH又
はラセミ体β−DBHを含有する培地中で作用させた後、
残存するＳ−（−）−β−DCH又はＳ−（−）−β−DBH
を分取すればよい。

炭素源としてはグルコース，シュクロース，グリセリ
ン等の炭水化物、あるいはクエン酸，マレイン酸，リン
グ酸等の有機酸及びその塩類を、窒素源としては硫酸ア
ンモニウム，塩化アンモニウム，硝酸アンモニウム，リ
ン酸アンモニウム等の無機態窒素、及び尿素，ペプト
ン，カゼイン，酵母エキス，肉エキス等の有機能窒素を
用いることができる。その他の無機塩類としてはリン酸
塩，マグネシウム塩，カリ塩，マンガン塩、鉄塩，亜鉛
塩，銅塩等が用いられる。

本菌の培養は、慣用の方法で行うことができる。通
常、温度約20〜40℃、好ましくは25〜37℃、pH約６〜
９、好ましくはpH6.5〜7.5で振盪あるいは通気撹拌等の
手段により好気的に行われる。

本発明で用いる微生物とラセミ体β−DCH又はラセミ
体β−DBHを接触させるときのこれらの濃度は培地中約
0.2容量％程度であればよく、その接触時間は通常３日
以内、好ましくは２日〜３日以内である。

培養終了後、培養液をとり出し遠心分離して微生物菌
体と上清液とに分離し、上清液中の光学活性なβ−DCH
又はβ−DBHを活性炭カラム処理、エーテル抽出，減圧
蒸留等の操作によって分取する。

以下実施例により説明する。実施例中％は特に記さな
い限り重量％を表わす。

実施例１ ラセミ体β−DCHを唯一の炭素源とした培地、すなわ
ち ラセミ体β−DCH 0.2 容量％ 硫安 0.05％ 硝安 0.05％ りん酸水素第２カリウム 0.1 ％ りん酸第２ナトリウム 0.1 ％ りん酸第１ナトリウム 0.2 ％ 硫酸マグネシウム 0.05 ％ 硫酸鉄，硫酸銅，硫酸マンガン 微量 pH 6.5 を含む培地100mlを有する10個の坂口フラスコ（500ml
容）に本菌OS−Ｋ−９株の傾斜寒天培地から１白金耳ず
つ植菌を行い、30℃で振盪培養を３日間実施する。次に
上記組成の培地20を入れた25容培養器（ジャーファ
メンター）に上記前培養分を加え、以下の条件下で２日
間通気撹拌培養した。

温度30℃ pH 初発6.5 通気量 20/min 回転数 300rpm 培養終了後、培養液を取り出し、遠心分離機を用いて
微生物菌体とその上清液とに分離し、この中に残存する
β−DCHを活性炭カラム処理，エーテル抽出，減圧蒸留
によって油状物質として6.2g採取した。本物質の同定は
次の方法で行った。

１）ガスクロマトグラフィーによる同定。

カラム担体PEG−20MP、５％、60〜80メッシュを用い
て市販β−DCHと比較した結果、その保持時間は全く同
じであった。純度98.6％以上。

２）IR（赤外線吸収スペクトル）による同定。

第１図に示したチャートのように、その吸収パターン
は市販β−DCHと全く同一であった。

以上から本物質は明らかに光学活性β−DCHである事
が判明した。又本物質がＳ−（−）−β−CDHである事
の確認は以下の方法によった。

１）比旋光度の測定。

市販β−DCH及び本物質の比旋光度は次の如くであ
る。

市販β−DCH▲〔α〕²⁰ _D▼＝0.0 Ｃ＝1,ジクロロメタ
ン 本物質▲〔α〕²⁰ _D▼＝−9.5゜ Ｃ＝1,ジクロロメタン ２）Ｒ−（＋）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチ
ルフェニルアセテートエステルの調製ならびに高速液体
クロマトグラフィーによる分析。Ｒ−（＋）−α−メト
キシ−α−トリフルオロメチルフェニルアセテートクロ
ライドを市販β−DCHならびに本物質に反応せしめ、そ
のエステル誘導体を調製した後、液体クロマトグラフィ
ーでの分析結果は次のようであった。

分析条件 カラム担体 ZORBAXODS4.6mm×25cm（Du Pont社製） 溶 出 液 メタノール：水＝63:35（V/V） 溶 出 量 1ml/min 検 出 法 260nmにおける吸光度 分析結果 市販β−DCH 保持時間50.5分及び52.0分に同一面積を
もつ２つのピークを与えた。

本物質 保持時間50.5分にのみピークを与え52.0分には
ピークを与えなかった。

３）ジクロロプロピル−Ｎ−フェニルカルバメートの調
製及びその比旋光度。

市販β−DCH、及び本物質1gとフェニルイソシアネー
ト0.9gを乾燥アセトン30ml,トリエチルアミン0.3mlに加
え、約３時間加熱還流し、そのジクロロプロピル−Ｎ−
フェニルカルバメートを調製した後、その比旋光度を測
定した。

市販β−DCH▲〔α〕²⁵ _D▼＝0.0 Ｃ＝1,メタノール 本物質▲〔α〕²⁵ _D▼＝−16.4゜ Ｃ＝1,メタノール 以上の結果から本物質は、Ｓ−（−）−β−DCHであ
り、その光学純度は99％以上であることが判った。

実施例２ 肉エキス0.5％，ポリペプトン0.5％，グルコース1.0
％,pH7なる培地100mlを有する５個の坂口フラスコ（500
ml容）を常法どおり、加熱蒸気滅菌後、菌株OS−Ｋ−９
株の傾斜寒天培地から菌株を１白金耳ずつ接種する。各
々のフラスコは30℃以下で48時間往復振盪培養（200rp
m）を行う。

次に上記組成の培地20を30容ジャーファメンター
に入れ、常法どおり加圧蒸気滅菌後、各々のフラスコで
育成せしめた微生物菌体を無菌的に接種せしめ、次の条
件下で20時間培養する。

温度30℃ pH 初発pH7.0 通気量 20/min 回転数 300rpm 培養の終了した培養液は遠心分離機にて微生物菌体と
上清液とに分離し、上清液は廃棄する。残った微生物菌
体は50mMりん酸緩衝液pH6.5にて３回〜４回洗浄し洗浄
菌体を得る。次にこの洗浄菌体を実施例１で示したラセ
ミ体β−DCHを含有する培地20に懸濁させ、次の条件
下に保持する。

温度30℃ 通気量 20/min 回転数 300rpm pH 5.5（炭酸カルシウムを20g加えて保持する） 洗浄菌体を培地に加えてから48時間、上記の様に通気
撹拌培養し、再び遠心分離機にて微生物菌体と上清液と
に分離した。上清液からの光学活性β−DCHの分離は実
施例１と同様にし、光学活性β−DCH7.2gを得た。この
β−DCHは、実施例１に示したように各種の分析を行っ
た結果、光学純度99％以上のＳ−（−）−β−DCHであ
った。

実施例３ 使用した菌株としてOS−Ｋ−９株の代りにOS−Ｋ−74
株又はOS−Ｋ−76株とした以外は実施例１と同様にして
それぞれ下表に示すような分析結果の光学活性Ｓ−β−
DCHを得た。

実施例４ 炭素源として、ラセミ体β−DCHの代りにラセミ体β
−DBHを用い、菌株としてOS−Ｋ−９株,OS−Ｋ−74株又
はOS−Ｋ−76株を用いた以外は実施例１と同様にしてそ
れぞれ下表に示すような分析結果の光学活性Ｓ−β−DB
Hを得た。

（発明の効果） 本発明法によれば、光学活性なジハロゲノプロパノー
ルが先願発明に比べて短時間で製造することができ、し
かも得られた光学活性体は光学純度が非常に高いもので
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１によって得られたＳ−β−DCHと市販
品ラセミ体β−DCHの赤外線吸収スペクトルであり、第
２図は実施例４のNo.3によって得られたＳ−β−DBHと
市販品ラセミ体β−DBHの赤外線吸収スペクトルであ
る。 第１図 実線：実施例１のＳ−（−）−β−DCH 一点鎖線：市販品 第２図 実線：実施例4No.3のＳ−（−）−β−DBH 一点鎖線：市販品

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:40）

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｒ−（＋）−2,3−ジクロロ−１−プロパ
   ノール又はＲ−（＋）−2,3−ジブロモ−１−プロパノ
   ール資化能を有し、それぞれシュードモナス属に属する
   新菌株OS−Ｋ−９菌株,OS−Ｋ−74菌株及びOS−Ｋ−76
   菌株から選ばれた細菌又はその培養菌体を培地中でラセ
   ミ体2,3−ジクロロ−１−プロパノール又はラセミ体2,3
   −ジブロモ−１−プロパノールを作用させてＳ−（−）
   −2,3−ジクロロ−１−プロパノール又はＳ−（−）−
   2,3−ジブロモ−１−プロパノールを分取することを特
   徴とする微生物処理による光学活性なジハロゲノプロパ
   ノールの製法。