JPH03224496A - 光学活性なα―置換有機酸を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、光学活性なα−置換有機酸の製造方法に関す
る。

本発明の方法で得られる光学活性なα−置換有機酸は、
解熱消炎鎮痛剤等の医薬品、抗生物質およびβ−ブロッ
カ−等の医薬原料、除草剤および殺虫剤等の農薬および
その原料、超誘電特性を有する化合物の原料、さらには
光学分割剤として有用な化合物である。

（従来の技術） ラセミ体のα−置換ニトリルまたはα−置換アミドから
光学活性なα−置換有機酸を、微生物またはその調製物
の生化学的作用によって製造する方法およびそれに用い
る微生物は、アミノニトリルまたはアミノ酸アミドから
の光学活性なアミノ酸の製造においてはかなり知られて
いる（特表昭６３−５００００４、特開昭６０−１８８
３５５等）。

また、アミノ酸以外の光学活性なα−置換有機酸を対応
するラセミ体のニトリルまたはアミドから生化学的な作
用によって製造する方法としては、特開昭６１−８８８
９４、特公昭５４−１４６６８および特願平１−１６０
６５３において報告されている。

上記従来技術のうち、光学活性アミノ酸製造に関しては
、そのほとんどが水や緩衝液等の水性媒体中で反応を行
うものである。また、反応を水溶性の有機溶媒を含んだ
水性媒体中で行ってもよいとの記載が特表昭６３−５０
０００４号になされているが、これは単に基質の濃度を
高める効果のみをもたらした。

一方、アミノ酸以外の光学活性なα−置換有機酸の製造
技術においては、全て水性媒体、または水性媒体と有機
溶媒から成る二相系媒体で行われており、反応率をさら
に高めようとすれば、光学純度が低下してしまうといっ
た問題点があった。

（発明が解決しようとする課題） 上述の状況を鑑みて、本発明の課題は、医薬、農薬およ
び各種の工業用原料として有用な各種の光学活性なα−
置換有機酸を、対応するラセミ体のα−置換ニトリルま
たはα−置換アミドから、微生物またはその調製物の作
用により、高収率で高光学純度を維持する製造法を提供
することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の課題を解決するため、微生物を用
いた光学活性なα−置換有機酸の製造法について鋭意検
討した結果、式（１）で示されるラセミ体のα−置換ニ
トリルまたはラセミ体のα−置換アミドを式（Ｕ）で示
される光学活性α−置換有機酸に変換する能力を持つ微
生物を見出した。そこで、反応条件を検討したところ、
水やリン酸緩衝液等の水性媒体中で行う場合と比較して
、均−混合媒体系で行うと反応速度が高まり、かつ、光
学純度も著しく上昇することをも見出し、本発明を完成
するに至った。

すなわち、本発明は、下記一般式（１）で示されるラセ
ミ体のα−置換ニトリルまたはα−置換アミドに、アル
カリゲネス属、シュウドモナス属、ロドシュウドモナス
属、コリネバクテリウム属、アシネトバクタ−属、バチ
ルス属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属、ノカ
ルディア属またはキャンディダ属に属する微生物または
その調製物を作用させる時に、水やリン酸緩衝液等の水
性媒体と水溶性有機溶媒との混合物から成る均−系混合
媒体中で行い、−ａ式（Ｉ［）で示される光学活性なα
−置換有機酸を取得することを特徴とする光学活性なα
−置換有機酸の製造方法を提供するものである。

Ｒ，−Ｃ−Ｘ　　　　　　　（１） ｚ Ｒ，−”Ｃ−Ｃ０ＯＨ・　　　（ＩＩ）２ 上記（１）式において、Ｘはニトリル基またはアミド基
である。また、上記（１）および（Ｉｔ）式において、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ任意に、ハロゲン、ヒドロ
キシ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基
、アリール基、アリールオキシ基、複素環基を表す。た
だし、Ｒ３とＲ２が同一の基であることはない。

さらに詳しく説明すると、（１）式、（Ｉｆ）式中のＲ
３とＲ２で表すハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩
素、コウ素、臭素が挙げられる。アルキル基、アルコキ
シ基としては、炭素数１〜８のものが好ましく、炭素数
１〜３のものが特に好ましい。シクロアルキル基として
は、炭素数３〜８のものが好ましく、炭素数３〜６のも
のが特に望ましい。アリール基、アリールオキシ基とし
ては、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェニルオキ
シ基、ナフチルオキシ基等が挙げられる。複素環基とし
ては、異種原子として、窒素、酸素、硫黄の少なくとも
１種を１個以上含み、３〜１５の炭素から構成される複
素環からなるものが好ましい。

１個から４個の異種原子を持つものがより好ましい。こ
のような複素環としては、例えば、チオフェン、インド
ール、 等が挙げられる。

上述のアルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基、
アリール基、アリールオキシ基、複素環基の炭素および
窒素に結合している水素は、各種の置換基によって置換
されていてもよい。かがる置換基としては、例えば、フ
ッ素、塩素、コウ素、臭素等のハロゲン、ヒドロキシ基
、チオール基、ニトロ基、アミノ基、フェニル基やナフ
チル基のようなアリール基、フェニルオキシ基やナフチ
ルオキシ基のようなアリールオキシ基、異種原子として
窒素、酸素、硫黄の少なくとも１種を１個以上含み、３
〜１５の炭素から構成される複素環基および炭素数が１
〜８のアルキル基、炭素数が１〜８のアルコキシ基、炭
素数１〜１０のアシル基等が挙げられる。これらの置換
基中の炭素および窒素に結合した水素が、さらに上述の
置換基で置換されていてもよい。

Ｒ１，Ｒ１のどちらか一方が立体障害の大きな基、例え
ば、ハロゲン、アリール基、アリールオキシ基、複素環
基であるか、これらの基を置換基として含有する基の場
合、光学純度の極めて高い生成物を取得できるので好ま
しい。

本発明の製造法により得ることのできる式（■）の化合
物の代表例を表１に示す。

表 本発明における原料化合物である式（１）で示される化
合物は、公知の方法で製造することができる。〔例えば
、特開昭５１−７０７４４、特開昭５１−１２２０３６
、米国特許４１８６２７０゜５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、、ｆ
Ｌ、　６４５　（１９８６）　）本発明に用いられる微
生物としては、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ）属
、ロドシエウドモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ　
ｔｅｒ　ｉｕ麟）属、アシネトバクタ−（＾ｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属
、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属−ノカ
ルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、キャンディダ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ）属に属する微生物の中から選ばれた微生物
である。

具体的には、以下の微生物を使用することができる。

アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ８７５０、シュウドモナス
フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ）ＮＲＲＬ　　Ｂ−９８１（ＩＦＯ３９
２５Ｌ　シュウドモナス　フルオレッセンス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　Ｉ　Ｆ　
Ｏ３０８１、（ＩＦＯとはｌＮ５ＴＩＴＵＴＥ　ＦＯＲ
ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ、　０ＳＡＫＡを示す。）ロ
ドシュウドモナス　スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）　ＡＴＣ
Ｃ１１１６７、コリネバクテリウム　ニトリロフィラス
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｗ　ｎ１ｔｒｉｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ２１４１９、コリネバクテリウ
ム　エスピー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｉｓｐ
、）ＫＯ−２−４（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３５３）、ア
シネトバクタ−エスピー（＾ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
　Ｓｐ。

）ＡＫ　　　２２６（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２４５１）、
バチルス　サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉＳ）　ＣＮ５　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３５４）
、マイコバクテリウム　エスピー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｓｐ、）　Ａ　Ｃ７７７（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−２３５２）、ロドコッカス　エスピー（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｓｐ、）　Ａ　Ｋ　３２　（Ｆ　ＥＲＭ　
　ＢＰ−１０４６）、シュウドモナス　ベシキュラリス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）
　Ａ　Ｔ　ＣＣ１１４２６、キャンディダ　トロピカリ
ス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）　ＡＴＣ
Ｃ２０３１１、ノカルディア　グロベルラ（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ　ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）　ＡＴＣＣ２１５０５゜ ロドコッカス　エスピー　ＡＫ　　３２は、上記の番号
で微生物工業技術研究所（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）に国際寄託さ
れており、菌学的性質はヨーロッパ特許　２０４５５５
　（１９８６）に記載されている。

コリネバクテリウム　エスピー　ＫＯ−２−４、バチル
ス　サブティリス　ＣＮ　　５、マイコバクテリウム　
エスピー　ＡＣ７７７は、新たに土壌中よりニトリル資
化菌として分離したもので、いずれも上記の番号で微生
物工業技術研究所に国際寄託されている。

アシネトバクタ−エスピー　ＡＫ　　２２６は、アクリ
ル酸またはメタクリル酸のような不飽和有機酸を対応す
るニトリル化合物より生成するためにすでに分離された
ものである（特公昭６３−２５９６号公報）。本菌株は
、上記の番号で微生物工業技術研究所に国際寄託されて
いる。

コリネバクテリウム　エスピー　ＫＯ−２−４、バチル
ス　サブティリス　ＣＮ　５、マイコバクテリウム　エ
スピー　ＡＣ７７７、アシネトバクタ−エスピー　ＡＫ
　　２２６の菌学的性質は、表２に示すとおりである。

以上の菌学的性質をバージ−の細菌分類書（Ｂｅｒｇｙ
’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｓｉｎａｔｉｖ
ｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

ｇｙ　　第８版（１９７４）　）　、および「マニュア
ル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｍａｎ
ｕａｌｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　）第４版（１９８５年）〕に基づいて分類した。

ＫＯ−２−４株は、好気性、グラム陽性、カタラーゼ陽
性の胞子を生じない桿菌であり、鞭毛を着生せず、運動
性はない。さらに、発育の初期は桿状でスナツピングを
伴った発育をし、後に短稈状に断裂するといった多形性
を有するので、コリネ型に属することは明らかである。

また、セルロース分解能を持たないこと、抗酸性でない
こと、絶対好気性でないこと、ＯＦテストが−であるこ
とから、コリネバクテリウム属に属する細菌と同定した
。

ＣＮ　　５株は、主にグラム陽性の桿菌であり、胞子を
形成する。また、鞭毛を着生し、運動性を有することか
ら、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科に属することは明らかで
ある。さらに、ＣＮ　　５株は好気性であリ、カタラー
ゼ陽性であることより、バチルス属である。さらに、グ
ルコースよりガスを生成しないこと、デンプンを加水分
解すること、ＶＰテストで陽性であること、硝酸塩還元
能があること、５０°Ｃで生育すること、７％ＮａＣ４
２含有肉汁で生育すること、コーザークエン酸培地でク
エン酸を利用できることより、重囲はＢａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｂｔｉｌｉｓと同定した。

ＡＣ７７７株は、好気性のグラム陽性桿菌であり、さら
に、断裂して短棒状になる。また、胞子を形成しないの
で、コリネ型細菌に属する。さらに、ＯＦテストがＯで
あること、グルコースより酸を生成すること、オキシダ
ーゼ陰性であることから、マイコバクテリウム属と同定
した。

本発明における反応方法は、微生物またはその調製物と
前記式（１）で示されるラセミ体のニトリルやアミドを
接触することにより行われる。微生物またはその調製物
とは、具体的には、前記微生物を培養した培養物、そこ
から集めた菌体または菌体処理物（例えば、菌体の破砕
物または菌体より分離抽出した酵素）、さらには、菌体
または菌体処理物を適当な方法により担体に固定化した
ものを示す。

本発明で使用される微生物の培養は、公知の方法に準じ
て行うことができる。使用する培地は、一般微生物の栄
養源として公知のものが利用でき１、グルコース、グリ
セリン、エタノール、シュークロース、デキストリン、
酢酸、オレイン酸エチル等の炭素源、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、アンモニア等の窒素源、酵母エキ
ス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス等の有機栄養源、
リン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、マンガン、ラン
タン等の無機栄養源を適宜組み合わせて使用できる。ま
た、微生物の本発明における反応活性を促進する物質と
して、イソブチロニトリル等のシアノ化合物、カプロラ
クタム等のアミド化合物を添加してもよい。培地のｐＨ
は５〜１０の範囲で選べばよく、培養温度は１８〜５０
°Ｃ１好ましくは２５〜４０℃である。培養日数は１〜
１０日の範囲で活性が最大になるまで培養すればよい。

本発明における反応条件を次に説明する。反応媒体は水
、緩衝液または培養液等の水性媒体と水溶性有機溶媒か
ら成る均一系混合媒体を用いる。

水溶性有機溶媒としては、水性媒体と均一系を形成する
ものならば特に制限はないが、メタノール、エタノール
、イソプロピルアルコール、ＮｌＮ−ジメチルホルムア
ミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ア
セトン、アセトニトリル、ジオキサンが好ましく、特に
メタノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシドが望ましい。また、これらの有機溶媒の濃
度は、使用する微生物酵素の耐有機溶媒性や基質により
異なるが、通常０．　１　（ｖ／ｖχ）から９９゜９（
ｖ／νχ）であり、好ましくは２　（ｖ／ｖχ）から４
０　（ｖ／ｖχ）である。また、水性媒体のうち、緩衝
液としては通常、リン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液が
使用される。

反応媒体中へは、式（Ｉ）で示されるラセミ体を粉末ま
たは液状のままで、あるいは上記の有機溶媒に溶かして
添加する。式（Ｉ）で示されるラセミ体の添加濃度は０
．０１〜７０重量％程度、好ましくはＯ８１〜４０重量
％であり、反応溶媒中に完全溶解しなくてもよい。反応
に菌体を使用する場合の菌体の濃度は、通常０．０５〜
２０重量％の範囲でよい。反応温度は５〜８０℃、好ま
しくは１５〜６０°Ｃ１反応ｐＨは４〜１１、好ましく
は６〜１０である。反応は通常１〜１００時間の範囲で
ある。消費される式（１）で示されるラセミ体は、連続
的にまたは間歇的に補充して、反応液中の濃度が上記の
範囲内に維持されるように添加してもよい。反応は、生
成される光学活性α−置換有機酸の含有率が低下しない
範囲で止めればよい。

本発明における目的生成物の回収は、次のようにして行
われる。反応終了液より菌体等の不溶物を除去した後、
ｐＨを弱アルカリ、好ましくは８゜５付近に調製した後
、ｎ−ブタノール、ベンゼン、ジエチルエーテル、クロ
ロホルム等の溶媒により、未反応の式（１）で示される
化合物を抽出除去し、次に、ＰＨを酸性（２付近）とし
、ｎ−ブタノール、ベンゼン、ジエチルエーテル、クロ
ロホルム等の溶媒で抽出することにより、目的生成物を
回収する。さらに、目的物の精製は、シリカゲルを用い
たカラムクロマトグラフィーにて適当な溶媒、例えば、
ヘキサン、ジエチルエーテル、クロロホルム、メタノー
ルの混合液にて溶出させることにより行われる。

本発明における反応機構は、ニトリルまたはアミドをカ
ルボン酸に変換する酵素であるアミダーゼ、ニトリルヒ
ドラターゼもしくはニトリラーゼが、ラセミ体のニトリ
ルまたはアミドの一方の異性体にのみ選択的に作用する
こと、すなわち、該酵素による反応速度が光学異性体に
よって非常に大きく異なることに基づくと考えられる。

また、反応系に水溶性有機溶媒を加えることによって、
さらに選択性を高めることができる。したがって、本発
明によって光学活性な有機酸を作ると、その結果として
、未反応物質または反応中間物質として光学活性なニト
リルもしくはアミドが残存または生成される。

これらのニトリルもしくはアミドは、酸を用いた加水分
解反応により容易に光学活性な有機酸とすることができ
る。すなわち、本発明は、Ｒ体と３体もしくは（＋）体
と（−）体の有機酸のどちらをも製造することができる
ものである。また、どちらか一方の光学活性な有機酸の
みを製造することを目的とするならば、未反応物質また
は反応中間体である光学活性なニトリルまたはアミドは
、例えば、アンモニアのようなアルカリを用いた反応に
より容易にラセミ化でき、ラセミ体のニトリルまたはア
ミドとして、本発明の原料として用いることができる。

したがって、工業的な実施においては、高収率で目的の
光学活性有機酸の製造を行うことができる。

（実施例） 次に、実施例により本発明をより詳細に説明する。ただ
し、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではな
い。

実施例１ グルコース１％、酵母エキス０．５％、ペプトン０．５
％、リン酸１カリウム０．１２％、リン酸２カリウム０
．０８％、硫酸マグネシウム０゜０２％、硫酸第１鉄０
．００３％、塩化ナトリウム０．１％、イソブチロニト
リル０．１％を含み、ｐＨを７．２とした殺菌培地２０
００ｄに、あらかじめ同培地で培養したマイコバクテリ
ウム　エスピー　ＡＣ７７７を２％植菌し、３２°Ｃで
２日間振盪培養した。培養後、遠心分離にて菌体を集め
、これを０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７゜０）１
６０ｄを含む三角フラスコ中に懸濁させた後、ジメチル
スルホキシド４０ｄ！に溶解した２−（６゛−メトキシ
−２゛−ナフチル）プロピオニトリル２ｇを加え、３２
℃で振盪しながら反応させた。

２０時間後に反応を終了し、遠心分離により菌体を除去
した後、その上清液のｐＨを８．５に調整し、クロロホ
ルム２０（ｌｄを添加して未反応の２−（６゛−メトキ
シ−２゛−ナフチル）プロピオニトリルを抽出除去した
。水層のｐＨを１．５に塩酸にて調整した後、クロロホ
ルム２００ｄを添加して目的物を抽出した。これを減圧
濃縮した後、シリカゲルカラムで精製した。目的の溶出
液を減圧濃縮したところ、８２５■のＳ−（＋）　−２
−（６’−メトキシ２”−ナフチル）プロピオン酸（Ｓ
−（＋）−ナプロキセン〕を得た。

〔α〕２°＝＋６８．４゜ （Ｃ＝１．クロロホルム） 融点＝１５３〜１５４°Ｃ 比旋光度より、光学純度は９９．０％ｅ、ｅ、であった
。なお、本物質はＴＬＣクロマトグラフィーおよび高速
液体クロマトグラフィーにて単一であり、単離物のＩＲ
スペクトル、ＮＭＲも構造を指示した。

さらに、以下の条件の高速液体クロマトグラフィーによ
って求めた光学純度も上記と一致した。

カラム；ＳＵＭＩＰＡＸ　０Ａ−２５０Ｏ３，５ｕｍ、
　４ａ＋＋ｗｉｄＸ２５Ｃ１１（住友化学工業株式会社
製）溶媒；０．０２Ｍ酢酸アンモニウム−メタノール溶
液 流速；　１．　　Ｏｄ／ｓｉｎ 検出；ＵＶ２５４ｎａ＋ なお、上記の条件では、Ｓ−（＋）体が先に溶出し、Ｒ
−（−）体がその後に溶出される。

実施例２ 実施例１と同様に、殺菌培地１００ｍにあらかじめ同培
地で培養した微生物を２％植菌し、３２°Ｃで２日間振
盪培養した。培養後、遠心分離にて菌体を集め、これを
０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）９ｄを含む
三角フラスコに懸濁させた後、各種水溶性有機溶媒ｌｌ
ｌ１１に溶解した１０■の２−（６’−メトキシ−２゛
−ナフチル）プロピオニトリルを加え、３２°Ｃで振盪
しながら反応させた。

５時間反応後に生成したＳ〜（＋）　−２−（６’−メ
トキシ２゛−ナフチル）プロピオン酸の生成率および光
学純度を高速液体クロマトグラフィーにより分析し算出
した。また、対照として、有機溶媒無添加系を用いた。

結果を表３に示す。

実施例３ 実施例１と同様に、殺菌培地１００ＩＩ１１にあらかじ
め同培地で培養した微生物を２％植菌し、３２°Ｃで３
０時間培養した。培養後、遠心分離にて菌体を集め、こ
れを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８，０）５．４ｄ
を含む三角フラスコに懸濁させた後、メタノール０．６
ｄに溶解した１２■の２−（６’−メトキシ−２゛−ナ
フチル）プロピオニトリルを加え、３２°Ｃで振盪しな
がら１８時間反応させた。遠心分離により菌体を除去し
た後、その上清液を高速液体クロマトグラフィーにより
分析した。

Ｓ−（＋）−２−（６’−メトキシ−２°−ナフチル）
プロピオン酸の生成量とその光学純度を表４に示す。ま
た、反応系にメタノールを添加しない場合の結果も比較
のために記載する。

実施例４ 実施例１と同様に、殺菌培地１０ｄにあらかじめ同培地
で培養したコリネバクテリウム　エスピー　ＫＯ−２−
４を１％植菌し、３２°Ｃで４８時間培養した。培養後
、遠心分離にて菌体を集め、これを０．０１Ｍリン酸緩
衝液２．７ｄを含むネジ栓付試験管に懸濁させた後、各
種水溶性溶媒０゜３１ｄに溶解した３■の２−（６’−
メトキシ−２゛−ナフチル）プロピオンアミドを加え、
３０°Ｃで振盪しながら反応させた。３時間後に反応を
終了し、遠心分離により菌体を除去した後、その上清液
を高速液体クロマトグラフィーにより分析を行った。結
果を表５に示す。

表 実施例５ 実施例１と同様に、殺菌培地５００１ｄにあらかしめ同
培地で培養したマイコバクテリウム　エスピー　ＡＣ７
’７７を２％植菌し、３２℃で２日間培養した。培養後
、遠心分離にて菌体を集め、これを０．０１Ｍリン酸緩
衝液に懸濁させ、６１０ｎｍでのＯＤ（吸光度）が２０
の画体懸濁液を調製した。この懸濁液を用いて有機溶媒
の添加濃度の酵素活性、光学活性に及ぼす影響を調べた
。すなわち、菌体量をＯＤ６１　＝　１０、２−４６’
−メトキシ−２゛−ナフチル）プロピオニトリルの最終
濃度が０．１％に統一し、有機溶媒の濃度のみを可変に
して反応液を調製した０反応は３２゛Ｃで５時間行い、
２−（６°−メトキシ−２“−ナフチル）プロピオン酸
の生成率および光学純度を、高速液体クロマトグラフィ
ーにより求めた。結果を表６に示す。

表６ 実施例６ 実施例１と同様に、殺菌培地５００ｄにあらかじめ同培
地で培養したコリネバクテリウム　エスピー　ＫＯ−２
−４を５％植菌し、３２°Ｃで３５時間培養した。培養
後、遠心分離にて菌体を集め、これを０．１Ｍリン酸バ
ッファー（ｐＨ８，０）２７ｙｄを含む三角フラスコに
懸濁させた後、３Ｆａ１のジメチルホルムアミドに溶解
した３００■の２−　（５Ｈ−（１）ベンゾピラノ（２
，３−ｂ）ピリジン−７−イル）　プロピオニトリルを
加え、３２℃で激しく振盪しながら反応させた。４８時
間後に反応を終了し、遠心分離により菌体を除去した後
、その上清液のｐＨを８．５に調整し、クロロホルム６
０１ｄを添加して、未反応および中間体のニトリル化合
物と対応するアミド体を抽出除去した。次に水層のｐＨ
を１．０〜２．０に塩酸にて調整した後、クロロホルム
６０ｄを添加して目的物を抽出した。これを減圧濃縮し
た後、ＨＰ−２０カラムを用いてアセトンにて溶出させ
ることにより精製した。目的の溶出液を減圧濃縮したと
ころ、１４５■の（＋）−２−（５Ｈ−［１］ベンゾピ
ラノ（２，３−ｂ）ピリジン−７−イル）　プロピオン
酸（（＋）プラノプロフェン）を得た。

〔α）”＝＋４４．１゜ （Ｃ＝１．０．メタノール） 融点：１８４〜１８５°Ｃ ＩＲ，ＮＭＲスペクトル分析は、構造を指示した。また
、実施例１で説明した高速液体クロマトグラフィーより
、光学純度は９９．１％ｅ、ｅ、と決定した。

実施例７ 実施例１と同様に、殺菌培地１００ｄにあらかじめ同培
地で培養したコリネバクテリウム　エスピー　ＫＯ−２
−４を１％植菌し、３２°ｃで４８時間培養した。培養
後、遠心分離にて菌体を集め、これを０．０１Ｍリン酸
バッファー（ｐ　Ｈ８゜５）９ｄを含む三角フラスコに
懸濁させた後、各種水溶性有機溶媒１−に溶解したｌＯ
■の２−（５Ｈ−［１）ベンゾピラノ　（２，３−ｂ）
ピリジン−７−イル）　プロピオニトリルを加え、３２
℃で振盪しながら反応させた。１５時間反応後に生成し
た（＋）−２−（５Ｈ−（１）ベンゾピラノ（２，３−
ｂ）ピリジン−７−イル）　プロピオン酸の生成率およ
び光学純度を高速液体クロマトグラフィーより分析した
。また、対照として有機溶媒無添加系を用いた。結果を
表７に示す。

表７ 実施例８ 実施例１と同様に、殺菌培地１００ｍに、あらかじめ同
培地で培養したマイコバクテリウム　エスピー　ＡＣ７
７７を２％植菌し、３２℃で４８時間培養した。培養後
、遠心分離にて菌体を集め、これを０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）に再懸濁させて、菌体懸濁液を調製
した。この懸濁液を用いて同量の菌体を含む次の２種類
の酵素反応系を作成した。

■菌体懸濁液０．８ｄに０，２ｉｄのジメチルスルホキ
シドに溶解した１ｍｇの２−（６°−メトキシ−２゛−
ナフチル）プロピオニトリルを加えた均一反応系。

■菌体懸濁液０．５ｍに０．５１１のｎ−ヘキサンに溶
解した１■の２−　（６’−メトキシ−２′−ナフチル
）プロピオニトリルを加えた二相反応系。

■、■各々３２°Ｃで５時間反応を行い、２−（６″−
メトキシ−２゛−ナフチル）プロピオン酸の生成率およ
び３体の光学純度を高速液体クロマトグラフィーにより
分析した。その結果を表８に示す。

表 実施例９ 実施例１と同様に、殺菌培地４０（ｌｄにあらかじめ同
培地で培養したマイコバクテリウム　エスピー　ＡＣ７
７７を２％植菌し、３２℃で２日間振盪培養した。培養
後、遠心分離にて国体を集め、これを０．０１Ｍリン酸
バッファー（ｐＨ７゜０）１６（ｌｄを含む三角フラス
コに懸濁させた後、ジメチルスルホキシド４ｏ−に溶解
した２−（２’（Ｐ−フルオロフェニル）−５゛−ベン
ゾキサゾリル］−プロピオニトリル２ｇを加え、３２°
Ｃで激しく振盪しながら反応させた。２４時間後に反応
を終了し、遠心分離により菌体を除去した後、その上清
液のｐＨを１０．０に調整し、クロロホルム２００ｄを
添加して未反応の２−（２’−（Ｐ−フルオロフェニル
）−５’〜ベンゾキサゾリル］フロピオニトリルを抽出
除去した。水層のｐＨを１．５に塩酸にて調整した後、
クロロホルム２００ｄを添加して目的物を抽出した。こ
れを減圧濃縮した後、シリカゲルカラムで精製した。目
的の溶出液を減圧濃縮したところ、８０４■のＳ−（＋
）−２〔２°−（Ｐ−フルオロフェニル）　−５’−ベ
ンゾキサゾリル〕プロピオン酸Ｃ５−（＋）−フルノキ
サブロフェン〕を得た。

〔α〕”＝＋７２．５” （Ｃ＝２．０．ＤＭＦ） 融点：１７６〜１７７°Ｃ 比旋光度より、光学純度は９８．４％ｅ、ｅ、であった
。なお、本物質はＴＬＣクロマトグラフィー高速液体ク
ロマトグラフィーにて単一であり、単離物のＩＲスペク
トル、ＮＭＲも構造を指示した。

実施例１０ 実施例１と同様に、殺菌培地１００ＩＩ１１にあらかじ
め同培地で培養した微生物を２％植菌し、３２°Ｃで３
０時間培養した。培養後、遠心分離にて菌体を集め、こ
れをＯ，１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８，０）５．４ａ
ｉ！を含む三角フラスコに懸濁させた後、ジメチルスル
ホキシド００６１１１に溶解した１２■の２−　　（２
’−（Ｐ−フルオロフェニル）５゛−ベンゾキサゾリル
〕−プロピオニトリルを加え、３２°Ｃで１８時間反応
させた。遠心分離により菌体を除去した後、その上清液
を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。

Ｓ−（＋）−フルノキサプロフエンの生成率（ｍｏｌχ
）とその光学純度を表９に示す。また、反応系にジメチ
ルスルホキシドを添加しない場合の結果も比較のために
記載する。

表 実施例１１ 酢酸アンモニウム１．０％、酵母エキス０．　５％、ポ
リペプトン０．　５％、リン酸ｌカリウム０゜２％、硫
酸マグネシウム０．０２％、塩化ナトリウム０．１％、
塩化ランタン０．０５％を含み、ｐＨを７．５とした殺
菌培地８００ｄに、あらがしめ同培地で培養したアシネ
トバクタ−エスピー　ＡＫ２２６を１％植菌し、３２”
Ｃ７’２４時間培養した。培養終了後、遠心分離により
集菌し、これを水道水７５Ｒ１の入った三角フラスコ中
に懸濁させた後、２５１ｄのジメチルスルホキシドに溶
解したｌＯｇの２−（４’−イソブチルフェニル）プロ
ピオニトリルを加え、３２゛Ｃで激しく攪拌しながら２
００時間反応せた。遠心分離により菌体を除去した後、
その上清液のｐＨを８．５に調整し、クロロホルム３０
０１ｄを添加して未反応の２−（４’イソブチルフエニ
ル）プロピオニトリルを抽出除去した。水層のｐＨを１
．０に塩酸で調整した後、クロロホルム３００−を添加
して目的物を抽出した。これを減圧濃縮した後、シリカ
ゲルカラムにより精製したところ、４．１ｇのＳ−（＋
）−２−（４’−イソブチルフェニル）プロピオンＨ（
Ｓ−（＋）−イブプロフェン〕を得た。

〔α）”＝＋５７．１゜ （Ｃ＝１．０．エタノール） 融点：４８〜４９°Ｃ 比旋光度より、光学純度は９９％ｅ、ｅ、であった。

なお、本物質は高速液体クロマトグラフィーにて単一で
あった。

実施例１２ 実施例１１と同様な培地で培養して得たアシネトバクタ
−エスピーＡＫ２２６株の菌体を用いて、Ｓ−（＋）−
イブプロフェン生成に与える有機溶媒添加効果を検討し
た。

菌体を０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７゜０）　９
ａｉ！を含む三角フラスコに懸濁させた後、各種水溶性
有機溶媒ＩＩｄに溶解した１０■の２−（４”イソブチ
ルフェニル）プロピオニトリルを加え、３２°Ｃで振盪
しながら反応させた。５時間後に生成したＳ−（＋）−
イブプロフェンの生成率および光学純度を高速液体クロ
マトグラフィーにより分析し算出した。また、対照とし
て有機溶媒無添加系を用いた。結果を表１０に示す。

表 （発明の効果） 本発明を利用することにより、各種の光学活性なα−置
換有機酸を、光学不活性な物質を原料として、微生物を
用いて常温常圧の反応条件下で製造することができる。

本発明の利用は、経済上非常に有利である。

さらに、本発明によれば、光学純度が８０％ｅ。

８０以上、有機酸の種類によっては９５％ｅ、ｅ、以上
という極めて高純度の光学活性α−置換有機酸を、収率
よ（得ることができる。

本発明は、詳細に、かつ、特にその具体化においては実
施例をもって述べてきたが、本発明の精神と範囲からは
ずれることがないならば、本発明の中で各種の変化や変
更ができることは、この技術分野の者には明らかであろ
う。

（ほか１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記一般式（ I ）で示されるラセミ体のα−置換ニト
   リルまたはα−置換アミドに、アルカリゲネス属、シュ
   ウドモナス属、ロドシュウドモナス属、コリネバクテリ
   ウム属、アシネトバクター属、バチルス属、マイコバク
   テリウム属、ロドコッカス属、ノカルディア属またはキ
   ャンディダ属に属する微生物またはその調製物を作用さ
   せ、下記一般式（II）で示される光学活性なα−置換有
   機酸を取得する際に、反応溶媒として水性媒体と水溶性
   有機溶媒から成る均一混合媒体中で作用させることを特
   徴とする光学活性なα−置換有機酸の製造方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＿１およびＲ＿２はハロゲン原子、ヒドロキ
   シ基、置換または無置換のアルキル基、置換または無置
   換のシクロアルキル基、置換または無置換のアルコキシ
   基、置換または無置換のアリール基、置換または無置換
   のアリールオキシ基、置換または無置換の複素環基を表
   す。ただし、Ｒ＿１とＲ＿２は同一になることはない。 そして、Ｘはニトリル基またはアミド基を表す。） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｒ＿１およびＲ＿２は上記と同一である。）