JPH04341185A - 新規ニトリラーゼ - Google Patents

新規ニトリラーゼ

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JPH04341185A
JPH04341185A JP3307360A JP30736091A JPH04341185A JP H04341185 A JPH04341185 A JP H04341185A JP 3307360 A JP3307360 A JP 3307360A JP 30736091 A JP30736091 A JP 30736091A JP H04341185 A JPH04341185 A JP H04341185A
Authority
JP
Japan
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nitrilase
ala
molecular weight
nitrile
aliphatic nitriles
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Pending
Application number
JP3307360A
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English (en)
Inventor
Keizo Yamamoto
敬三 山本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Asahi Chemical Industry Co Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Chemical Industry Co Ltd filed Critical Asahi Chemical Industry Co Ltd
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ニトリル基をカルボン
酸基に加水分解させる触媒として有用な新規ニトリラー
ゼに関するものである。特に、医薬品の原料、農薬の原
料、超誘電特性を有する化合物の原料、さらには光学分
割剤として有用な化合物である光学活性な２−ヒドロキ
シカルボン酸を製造する際の触媒として有用なものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を
製造する方法としては、ラセミ体の分別結晶による光学
分割法、クロマトグラフィーによる光学分割法、有機化
学的な不斉合成法等が知られているが、これらの方法は
、操作が煩雑、低収率、生成物の光学純度が低い等の欠
点を有している。
【０００３】さらに、微生物を用いる方法については、
還元酵素を用いる方法（特開昭６３−３２４９２号）が
知られているが、高価な補酵素を必要とする欠点を有し
ている。さらに、ニトリルまたはアミドの加水分解作用
を用いる方法（特開昭６１−８８８９４号、特公昭５４
−１４６６８号および特開平２−８４１９８号）が知ら
れている。これらは、ラセミ体のニトリルの一方の異性
体に特異的に作用する鏡像選択的ニトリラーゼを利用す
る方法であるが、反応率を５０％以内で止めてしまって
いた。最近、我々は特願平２−２８８４４２号（発明の
名称；光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸の製造法；
平成２年１０月２９日出願）において鏡像選択的ニトリ
ラーゼを用いて反応率を５０％以上で行う方法を提示し
た。
【０００４】一方、これらの方法で示される、ラセミ体
のニトリルを鏡像選択的に加水分解するニトリラーゼ自
体については、特開平２−８４１９８号に記載されるア
シネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の鏡
像選択的ニトリラーゼ以外は知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、工業
用原料として有用な光学活性な２−ヒドロキシカルボン
酸を生成する触媒としての、鏡像選択的ニトリラーゼを
見い出すことである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するため、鏡像選択的ニトリラーゼを微生物中
の酵素タンパクに求め、各種の精製技術を利用すること
により単離精製した。その結果、サブユニット分子量が
３２，０００±２，０００で構成されるタンパクで、ニ
トリル基をカルボン酸基に加水分解する能力を持ち、か
つ、式（Ｉ）で示されるラセミ体の２−ヒドロキシニト
リルを式（ＩＩ）で示される光学活性な２−ヒドロキシ
カルボン酸に鏡像選択的加水分解を行うことのできる新
規なニトリラーゼを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
【化１】
【０００８】
【化２】
【０００９】上記（Ｉ）および（ＩＩ）式において、Ｒ
は置換または無置換のアリール基、置換または無置換の
複素環基を示す。さらに詳しく説明すると、アリール基
として、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。複素
環基としては、異種原子として、窒素、酸素、硫黄の少
なくとも１種を１ケ以上含むものが好ましく、また、炭
素数としては、３〜１３が好ましく、３〜６が更に好ま
しい。また、置換基としては、炭素数１〜６、好ましく
は１〜３の低級アルキル基、フェニル基やナフチル基の
ようなアリール基、炭素数１〜６の低級アルコキシ基、
ヒドロキシ基、チオール基、ニトロ基、アミノ基、また
フッ素、塩素、ヨウ素、臭素等のハロゲン原子が好まし
い。
【００１０】次に、本発明を詳細に説明する。 （１）　　酵素を含有する微生物及びこの培養方法目的
の新規なニトリラーゼは、アルカリゲネス　　フェカリ
ス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓ）Ａ
ＴＣＣ　　８７５０に含まれる。この微生物の培養は、
公知の培養方法に準じて行うことができる。使用する培
地は、一般微生物の栄養源として公知のものが利用でき
、グリセリン、クエン酸、酢酸、グルタミン酸等の炭素
源、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム等の窒
素源、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン等
の有機栄養源、リン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、
コバルト等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせ
て使用できる。また、微生物中の目的のニトリラーゼ酵
素の量を増大させる物質として、ｎ−ブチロニトリル等
のニトリル化合物あるいはε−カプロラクタム等のアミ
ド化合物を添加するのが好ましい。培地のｐＨは５〜１
０の範囲で選べばよく、培養温度は１０〜３８℃、好ま
しくは２５〜３２℃である。培養日数は１〜５日の範囲
で目的のニトリラーゼ酵素の含量が最大になるまで培養
すればよい。 （２）　　酵素の精製 酵素の精製は、通常の酵素精製法を用いることができる
。培養終了液より遠心分離等によって菌体を集め、超音
波処理、ダイノミル等の機械的方法によって菌体を破砕
する。細胞片等の固形物を遠心分離によって除き、粗酵
素を得る。次に、超遠心分離分画、塩析、有機溶媒沈澱
、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ハイドロフォービッククロマトグラフィー、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、結晶化等を行うことにより精
製される。これについては、実施例にて、一例を記載す
る。 （３）　　酵素活性の測定法 マンデロニトリル１０μｍｏｌ、リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）０．１ｍｍｏｌ、牛血清アルブミン１ｍ
ｇ、ジチオスレイトール１μｍｏｌおよび適当量の酵素
液を加え、１．０ｍｌになるように混合して、３０℃に
て３０分反応させた後、８０％酢酸０．２ｍｌを添加し
て反応を停止させた。生成したマンデル酸は高速液体ク
ロマトグラフィーにより測定した。
【００１１】その条件としては、ユニシルパックＣｌ８
（ガスクロ工業（株））のカラムで、０．１Ｍリン酸１
アンモニウム（ｐＨ４．８）とメタノールを８０：２０
に混合した触媒を１分間に１ｍｌずつ溶出させ、２５４
ｎｍの吸光度にて検出した。基質特異性等の検討におい
ては反応により生成したアンモニアをＪ．Ｃｌｉｎ．Ｐ
ａｔｈ．１３，１５６（１９６０）の方法にて測定した
。この場合の反応は、ニトリル化合物１０μｍｏｌ、リ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．１ｍｍｏｌ、牛
血清アルブミン１ｍｇ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
１μｍｏｌ、および適当量の酵素液を加え、１．０ｍｌ
になるように混合し、３０℃、３０分反応を行わせた。
【００１２】１分間に１μｍｏｌのマンデル酸またはア
ンモニアを生成する酵素量を１単位とした。 （４）　　酵素の均一性 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をトリス−グ
リシン緩衝液を用い４〜１２％ゲルにて、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２４４，４４０６（１９６９）の方法に
て行った。均一な１本のタンパクバンドが見られ、公知
の標準タンパクとの比較よりこのタンパクの分子量は３
２，０００±２，０００となった。 （５）　　酵素の性質 本発明のニトリラーゼは、均一に精製された後、次の性
質を有していることが解った。 （１）　　酵素作用 ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基をカ
ルボン酸基とアンモニアに加水分解する反応の触媒とし
ての機能を示す。式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシニ
トリルに対しては鏡像選択的加水分解を行ない、式（Ｉ
Ｉ）で示される光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を
生成する反応の触媒としての機能を示す。さらに式（Ｉ
）で示される２−ヒドロキシニトリルは、反応媒体中で
は下記式（ＩＩＩ）の平衡状態にある。
【００１３】
【化３】
【００１４】よって、式（Ｉ）で示されるヒドロキシニ
トリルの代わりに（ＩＩＩ）に示されるアルデヒドと青
酸（青酸ナトリウムまたは青酸カリウム等の塩でもよい
。）から、式（ＩＩ）で示される光学活性な２−ヒドロ
キシカルボン酸を生成する反応の触媒としての機能をも
示す。これらの代表例については、実施例をもって示す
。 （２）　　基質特異性 ｎ−バレロニトリル等の飽和脂肪族ニトリル、アクリロ
ニトリル等の不飽和脂肪族ニトリル、クロロアセトニト
リル、２−クロロプロピオニトリル等のハロゲンで置換
された脂肪族ニトリル、ベンジルシアナイド等の芳香族
で置換された脂肪族ニトリル、３−チオフェンアセトニ
トリル、３−ピリジンアセトニトリル等の複素環で置換
された脂肪族ニトリル、サクシノニトリル等のジニトリ
ル化合物に作用する。特に、クロロアセトニトリル、ベ
ンジルシアナイド、ｐ−アミノベンジルシアナイド、３
−チオフェンアセトニトリルの水和速度が大きい。
【００１５】さらに、ベンゾニトリルに対する作用は低
く（マンデロニトリルに対する活性の１．１％）、芳香
族ニトリルへの作用は低い。公知のニトリラーゼはベン
ゾニトリル等の芳香族ニトリルに対する作用が最も強い
ことが知られている。参考文献−Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
，１６５，３０９（１９７７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
，１６７，６８５（１９７７）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１７，６７７（１９８５）、Ａｐｐｌ．Ｅｎ
ｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１，３０２（１９８６）
、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．，１８２，３４９（１９８９
）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．，１１，５８１（１９８９）。よって、本発明のニト
リラーゼは、公知のニトリラーゼとは全くタイプの異な
るものである。これについては、実施例に記載する。 （３）　　分子量 公知の方法にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行い、標
準タンパク質と比較することにより、ニトリラーゼのサ
ブユニットの分子量は３２，０００±２，０００である
。
【００１６】また、活性発現時の会合した状態の分子量
をみるために、ＡｓａｈｉｐａｋＧＳ−６２０のカラム
を用い、０．３Ｍ　　ＮａＣｌ、１ｍＭ　　ＤＴＴ、０
．１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍ　　リン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）を溶媒とするＨＰＬＣ法によりニト
リラーゼを溶出させた。標準タンパク質との比較よりそ
の分子量は４６０，０００±３０，０００である。これ
は、ニトリラーゼの活性型、つまり本来の分子量が約４
６万であることを示している。 （４）　　Ｎ末アミノ酸配列 ニトリラーゼを脱塩濃縮乾固した後、トリフルオロ酢酸
を加えて溶解し、Ｅｄｍａｎ分解反応を応用したＡｐｐ
ｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の気相プロテイン
・シーケンサーに適用した。ＰＴＨ（フェニルチオヒダ
ントイン）アミノ酸の同定にはＨＰＬＣを用い、各サイ
クルで得られたＰＴＨ−アミノ酸のピーク位置、ピーク
高さを標準ＰＴＨ−アミノ酸のそれと比較して、定性、
定量を行った。得られたＮ末端アミノ酸配列は次のよう
である。
【００１７】Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−（５）　　至適
ｐＨ及び至適温度 各ｐＨにおける活性を測定したところ、至適ｐＨは７．
５である。これについては、実施例に記載する。また、
至適温度は４０〜４５℃である。 （６）　　温度安定性 ｐＨ７．０の緩衝液にニトリラーゼを入れ１０〜７０℃
、１０分間放置した後、加水分解活性をみたところ、４
５℃まで９５％以上の活性が残存している。 （７）　　ｐＨ安定性 ０．１Ｍの各ｐＨ緩衝液にニトリラーゼを入れ４０℃、
３０分間放置した後、加水分解活性をみたところ、ｐＨ
６．５〜８．０が安定領域である。これについては実施
例に記載する。 （８）　　阻害剤 各種金属イオン及び各種阻害剤を反応時に共存させて活
性をみたところ、ニトリラーゼは、Ｈｇ＋　、Ｃｏ２＋
、Ｚｎ２＋、Ｐｂ２＋、Ｃｕ２＋、ｐ−クロロマーキュ
リーベンゾエイト等で阻害される。これについては、実
施例に記載する。 （９）　　安定化剤 ｐＨ７．５の緩衝液にニトリラーゼと、各種酵素安定化
剤を入れ、５０℃、１５分間放置した後、加水分解活性
をみたところ、１ｍＭ　　ＤＴＴ（ジチオスレイトール
）にニトリラーゼ安定化効果がみられる。 （１０）吸収スペクトル ニトリラーゼの吸収スペクトルを２５０〜８５０ｎｍに
おいてみたところ、２７９ｎｍ付近の吸収以外は見られ
ない。
【００１８】以上の様に、本酵素は、飽和及び不飽和脂
肪族ニトリル、ハロゲン、複素環及び芳香族で置換され
た脂肪族ニトリル、ジニトリル化合物に作用する新しい
ニトリラーゼであり、さらに、２−ヒドロキシニトリル
を光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸に鏡像選択的加
水分解するというすぐれた効果を有する酵素である。
【００１９】
【実施例】次に、実施例により本発明をより詳細に説明
する。ただし、これら実施例は本発明の範囲を限定する
ものではない。なお、特に説明がない限りは、実施例中
の％は重量％を示す。
【００２０】
【実施例１】ニトリラーゼ含有菌体の培養酢酸アンモニ
ウム１％、酵母エキス０．５％、ペプトン０．５％、リ
ン酸１カリウム０．１２％、リン酸２カリウム０．０８
％、硫酸マグネシウム０．０２％、硫酸第１鉄０．００
３％、塩化ナトリウム０．１％，ｎ−ブチロニトリル０
．３％を含み、ｐＨを７．２とした殺菌培地２０００ｍ
ｌに、酢酸アンモニウムの代りにＬ−グルタミン酸ナト
リウムを同量添加した上記培地で培養したアルカリゲネ
ス　　フェカリス　　ＡＴＣＣ　　８７５０を２％植菌
し、３２℃で２０時間振盪培養した。遠心分離にて、湿
菌体２８．３ｇを得た。取得した菌体の酵素活性は、マ
ンデロニトリルをマンデル酸に変換する活性でみると、
０．０６０μｍｏｌｅ／乾菌体ｍｇ／ｍｉｎであった。
【００２１】
【実施例２】ニトリラーゼの精製 実施例１で取得した菌体を、１ｍＭ　　ＤＴＴ，０．１
ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）〔以後、バッファーと略す。〕で洗浄
後、バッファー１５０ｍｌに懸濁し、９ＫＨｚにおける
超音波処理を約３０分行い、菌体を破砕した。破砕菌体
は、１５，０００×ｇ、２０分間の遠心分離で除去し、
無細胞抽出液を得た。これに硫酸アンモニウムが１０％
になる様に添加した後、遠心分離により上清液を取得し
た。これに硫酸アンモニウムをさらに３５％になる様に
添加し、遠心分離により活性画分を沈澱として取得した
。この沈澱は、２０ｍｌバッファーに溶解後、バッファ
ーに十分透析し、硫安１０〜３５％画分とした。次に、
１００，０００×ｇ，２時間の超遠心分離を行い、上清
液をＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ−４Ｂ
のカラムを通過させ、３０％エチレングリコールを含む
バッファーと、７０％エチレングリコールを含むバッフ
ァーの直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分
を熱め、濃縮しバッファーで透析した後、ＤＥＡＥ−ｃ
ｅｌｌｕｌｏｓｅのカラムを通過させ、バッファーと０
．５Ｍ　　ＮａＣｌを含むバッファーの直線的な濃度勾
配で酵素を溶出させた。活性画分は、限外ろ過により濃
縮し、バッファーに透析した。このようにして、ニトリ
ラーゼを均一に精製した。この精製過程を表１に示す。
【００２２】
【実施例３】マンデロニトリルからのＲ−（−）−マン
デル酸の生成 実施例２で均一に精製されたニトリラーゼを用いて、以
下の条件にて反応経過をみた。リン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７．５）１ｍｍｏｌ、マンデロニトリル０．４ｍｍ
ｏｌ、牛血清アルブミン１０ｍｇ、ＤＴＴ０．０１ｍｍ
ｏｌ、ニトリラーゼ０．３単位を含む反応液１０ｍｌを
３０℃にて攪拌しながら反応させた。マンデロニトリル
、マンデルアミド、ベンズアルデヒド、Ｒ−（−）−マ
ンデル酸、およびアンモニアを定量した。結果は図１に
示すとおりであり、基質の減少にともない、Ｒ−（−）
−マンデル酸とアンモニアが等モル生成され、マンデル
アミドは検出されないことにより、明らかにニトリラー
ゼであることを示していた。また、生成されたＲ−（−
）−マンデル酸の光学純度は、Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ
　　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２１６，４０６（
１９８１）の方法により高速液体クロマトグラフィー分
析を行ったところ、反応１，２，４，６時間とも１００
％ｅ．ｅ．となった。反応終了液のｐＨを８．５に調整
した後、ジエチルエ−テル１０ｍｌを加えて有機層を抽
出除去した。水層のｐＨを１．５に調整した後、ジエチ
ルエーテル１０ｍｌを加えて、目的物の抽出を２回行っ
た抽出液を減圧乾燥させた後、７０℃ベンゼン約３ｍｌ
に溶かして室温放置したところ４９ｍｇ（０．３２２ｍ
ｍｏｌ）のＲ−（−）−マンデル酸を得た。
【００２３】
【化４】
【００２４】融点：１３２℃ 比旋光度より光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。
【００２５】
【実施例４】ベンズアルデヒドとＫＣＮからのＲ−（−
）−マンデル酸の生成 実施例２で均一に精製されたニトリラーゼを用いて以下
の条件にて反応経過をみた。リン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）１ｍｍｏｌ、ベンズアルデヒド０．４ｍｍｏ
ｌ、ＫＣＮ０．４５ｍｍｏｌ（あらかじめｐＨ８．０に
調整して添加する。）、牛血清アルブミン１０ｍｇ、Ｄ
ＴＴ０．０１ｍｍｏｌ、ニトリラーゼ０．３単位を含む
反応液１０ｍｌを３０℃にて攪拌しながら反応させた。 マンデロニトリル、マンデルアミド、ベンズアルデヒド
、青酸、Ｒ−（−）−マンデル酸、およびアンモニアを
定量した（青酸の定量は、Ｊ．Ａｓｓｏｃ．Ｏｆｆ．Ａ
ｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６７，６４１（１９８４）の方法
による発色法にて行った。）。その結果、基質の減少に
ともない、Ｒ−（−）−マンデル酸とアンモニアが等モ
ル生成されており、マンデルアミドは検出されなかった
。生成されるＲ−（−）−マンデル酸の濃度は、反応１
，２，４，６時間でそれぞれ１６，３０，３３，３５ｍ
Ｍであった。さらに、生成されるＲ−（−）−マンデル
酸の光学純度は、高速液体クロマトグラフィー分析によ
り、反応１，２，４，６時間とも１００％ｅ．ｅ．とな
った。反応終了液より、実施例３と同様にして、Ｒ−（
−）−マンデル酸４７．５ｍｇ（０．３１３ｍｍｏｌ）
を得た。
【００２６】
【化５】
【００２７】融点：１３２℃ 比旋光度より光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。
【００２８】
【実施例５】基質特異性の検討 実施例２で均一に精製されたニトリラーゼを用いて、基
質特異性を検討した。ニトリル化合物１０μｍｏｌ、リ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．１ｍｍｏｌ、牛
血清アルブミン１ｍｇ、ＤＴＴ１μｍｏｌ、およびニト
リラーゼ０．０００５〜０．０１単位を加え、１．０ｍ
ｌになるように混合し、３０℃、３０分間反応を行わせ
、生成するアンモニアを定量することにより活性を求め
た。各種ニトリル化合物に対する基質特異性は、マンデ
ロニトリルに対する活性（３．１０単位／ｍｇ）を１０
０％とした場合の結果を表２に示す。本ニトリラーゼは
、ｎ−バレロニトリル等の飽和脂肪族ニトリル、アクリ
ロニトリル等の不飽和脂肪族ニトリル、クロロアセトニ
トリル、２−クロロプロピオニトリル、２−ブロモプロ
ピオニトリル等のハロゲンで置換された脂肪族ニトリル
、ベンジルシアナイド、フェニルグリシノニトリル等の
芳香族で置換された脂肪族ニトリル、３−チオフェンア
セトニトリル、３−ピリジンアセトニトリル等の複素環
で置換された脂肪族ニトリル、サクシノニトリル等のジ
ニトリル化合物に作用する。特に、クロロアセトニトリ
ル、ベンジルシアナイド、ｐ−アミノベンジルシアナイ
ド、３−チオフェンアセトニトリルに強く作用する。 さらに、ベンゾニトリル等の芳香族ニトリルへの作用は
低かった。
【００２９】
【実施例６】至適ｐＨの検討 実施例２で均一に精製されたニトリラーゼを用いて、至
適ｐＨを検討した。マンデロニトリル１０μｍｏｌ、各
種緩衝液０．１ｍｍｏｌ、牛血清アルブミン１ｍｇ、Ｄ
ＴＴ１μｍｏｌ、およびニトリラーゼ０．０１単位を加
え、１．０ｍｌになるように混合し、３０℃、３０分間
反応を行わせ、生成するＲ−（−）−マンデル酸を定量
することにより活性を求めた。緩衝液は、ｐＨ５．５〜
８．０のリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０の
トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１１．０のホウ酸−
ＮａＯＨ緩衝液を用いた。結果は図２に示すとおりであ
り、至適ｐＨは７．５であった。
【００３０】
【実施例７】ｐＨ安定性の検討 実施例２で均一に精製されたニトリラーゼを用いて、ｐ
Ｈ安定性について検討した。ニトリラーゼ０．１単位を
０．１Ｍの各種緩衝液に入れ、４０℃、３０分間放置し
た後、ニトリラーゼ０．０１単位を用いて、マンデロニ
トリルを基質とする標準活性測定法にて活性を測定した
。熱処理をしないニトリラーゼ活性を相対活性１００％
とした結果は、ｐＨ６．５〜８．０で約１００％となり
、ｐＨ５．５、６．０、８．５、９．０ではそれぞれ４
２、８１、７２、３１％となった。
【００３１】
【実施例８】阻害剤の検討 実施例２で均一に精製されたニトリラーゼを用いて、各
種阻害剤の影響をみた。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
．５）０．１ｍｍｏｌ、牛血清アルブミン１ｍｇ、ニト
リラーゼ０．０１単位、および各種阻害剤０．１μｍｏ
ｌを加え、３０℃、１０分間放置後、マンデロニトリル
１０μｍｏｌを加え、１．０ｍｌにして、３０℃、３０
分間反応を行わせて、生成するＲ−（−）−マンデル酸
を定量することにより活性をもとめた。阻害剤を添加し
ない活性を相対活性１００％とした結果は、表３に示す
とおりである。Ｈｇ＋　、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋、Ｐｂ２
＋、Ｃｕ２＋、Ｐ−クロロマーキュリーベンゾエイトで
阻害され、ＳＨ阻害剤のほとんどのもので阻害をうけた
。この阻害は、ＤＴＴの添加により弱くなった。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
【発明の効果】ニトリル基をカルボン酸基に加水分解す
る上で、極めて微量の触媒量で、しかも常温常圧におい
て加水分解を促進させることができ、さらに反応系に不
純物や副生物を生じさせることのない、新規なニトリラ
ーゼを見い出すに至った。このニトリラーゼにより、各
種有用なカルボン酸を安価に作ることができる。特に、
光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を製造する際に、
対応するニトリル化合物の鏡像選択的加水分解を行う触
媒として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のニトリラーゼを用いた、マンデロニト
リルからのＲ−（−）−マンデル酸の生成例である。
【図２】本発明のニトリラーゼを用いた、至適ｐＨの検
討結果である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
    ｅｓ）属細菌から調製され、下記の理化学的性質を有す
    るニトリラーゼ。 （１）　　酵素作用 ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基をカ
    ルボン酸基とアンモニアに加水分解する反応の触媒とし
    ての機能を示す。２−ヒドロキシニトリルに対しては、
    鏡像選択的加水分解を行ない、光学活性な２−ヒドロキ
    シカルボン酸を生成する反応の触媒としての機能を示す
    。 （２）　　基質特異性 ｎ−バレロニトリル等の飽和脂肪族ニトリル、アクリロ
    ニトリル等の不飽和脂肪族ニトリル、クロロアセトニト
    リル、２−クロロプロピオニトリル等のハロゲンで置換
    された脂肪族ニトリル、ベンジルシアナイド等の芳香族
    で置換された脂肪族ニトリル、３−チオフェンアセトニ
    トリル、３−ピリジンアセトニトリル等の複素環で置換
    された脂肪族ニトリル、サクシノニトリル等のジニトリ
    ル化合物に作用する。特に、クロロアセトニトリル、ベ
    ンジルシアナイド、ｐ−アミノベンジルシアナイド、３
    −チオフェンアセトニトリルの水和速度が大きい。 （３）　　分子量 分子量は４６０，０００±３０，０００である。サブユ
    ニットの分子量は３２，０００±２，０００（ＳＤＳ−
    ＰＡＧＥ）である。 （４）　　Ｎ末アミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｖ
    ａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌ
    ｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ
    −Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
    Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ− （５）　　至適ｐＨ及び至適温度 ｐＨ７．５、４０〜４５℃でニトリル基の加水分解作用
    は至適である。 （６）　　温度安定性 ｐＨ７．０で１０〜４５℃、１０分間放置しても、ニト
    リル基の加水分解活性は９５％以上残存している。 （７）　　ｐＨ安定性 ｐＨ６．５〜８．０が安定領域である。 （８）　　阻害剤 Ｈｇ＋　、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋、Ｐｂ２＋、Ｃｕ２＋、
    ｐ−クロロマーキュリーベンゾエイト等で阻害される。 （９）　　安定化剤 ジチオスレイトールにて安定化される。 （１０）吸収スペクトル ２７９ｎｍ以外の吸収はない。
JP3307360A 1990-12-11 1991-11-22 新規ニトリラーゼ Pending JPH04341185A (ja)

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