CH638241A5 - Enzympraeparat mit l-alpha-aminoacylamidase-aktivitaet. - Google Patents

Enzympraeparat mit l-alpha-aminoacylamidase-aktivitaet. Download PDF

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CH638241A5
CH638241A5 CH13077A CH13077A CH638241A5 CH 638241 A5 CH638241 A5 CH 638241A5 CH 13077 A CH13077 A CH 13077A CH 13077 A CH13077 A CH 13077A CH 638241 A5 CH638241 A5 CH 638241A5
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Lucia Redempta M Meyer-Hoffman
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Novo Industri As
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates, welches L-a-Amino- 30 acylamidase-Aktivität aufweist, durch Züchten eines Mikroorganismus in Gegenwart eines Nährmediums, welches assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor enthält.
Es ist bekannt, dass gewisse Mikroorganismen, wie z.B. 35 Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Mycobacterium phlei, Aeromonas proteolytica, Bacillus subtilis und Bacillus stearothermophilus Enzyme produzieren können, welche fähig sind, a-Aminosäureamide zu hydrolysieren, wobei a-Amino-säuren in einem wässerigen Medium gebildet werden. 40
Diese bekannten Enzyme, welche im folgenden als a-Ami-noacylamidasen bezeichnet werden, weisen eine hochgradig stereospezifische Aktivität auf und hydrolysieren nur L-a-Ami-noacylamide. So bleiben D-a-Aminoacylamide im wesentlichen von diesen Enzymen unangetastet. 45
Diese a-Aminoacylamidasen sind daher geeignet zur Durchführung einer optischen Auflösung von DL-a-Amino-säuren. In einem derartigen Verfahren wird die a-Aminoacyl-amidase mit dem DL-a-Aminosäureamid in Berührung gebracht, um eine Hydrolyse des L-a-Aminosäureamides zu 50 bewirken, wobei die entsprechende Aminosäure gebildet wird, und die gebildete Aminosäure und/oder das verbleibende D-a-Aminosäureamid wird isoliert (Greenstein & Winitz : «Chemistry of the amino-acids», Band 3, Seiten 1778 bis 1781 (New York 1961)). 55
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Beschaffung eines Präparates mit verbesserter L-a-Aminoacylamidase-Aktivität im Vergleich zu den Präparaten, welche nach der oben genannten bekannten Methode erhalten wurden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des 60 gewünschten Enzympräparates ist dadurch gekennzeichnet,
dass ein Mikroorganismus aus der Gruppe Pseudomonas putida, Pseudomonas reptilivora und Pseudomonas arvilla verwendet wird.
Durch Züchtung dieser Mikroorganismen in einer an sich 65 bekannten Weise lassen sich Präparate erhalten, welche eine aussergewöhnlich hohe Amidaseaktivität ohne unerwünschte enzymatische Nebenwirkungen aufweisen..
Die im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Mikroorganismen sind in «Manual of determinative bacterio-logy» von Bergey (Baltimore 1975) beschrieben.
Die bevorzugten Stämme sind Pseudomonas putida ATCC 12633, ATCC 25571, ATCC 17390, ATCC 17426 und ATCC 17484, Pseudomonas reptilivora ATCC 14039 und Pseudomonas arvilla ATCC 23974.
Diese Stämme sind bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C., USA, erhältlich.
Pseudomonas putida und insbesondere der Stamm ATCC 12633 ist ein besonders bevorzugter Mikroorganismus.
Von Pseudomonas putida ist aus der Literatur bekannt, dass er fähig ist, Mandelsäureracemase zu erzeugen.
Es ist daher erstaunlich, dass Pseudomonas putida ein Enzym erzeugt, welches eine stereospezifische Amidase-Aktivi-tät aufweist und keine Racemiziserung von z.B. Phenylglycin bewirkt, welches der Mandelsäure nahe verwandt ist.
Die im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Mikroorganismen können in üblichen Nährmedien gezüchtet werden, wie sie z.B. von Hegeman in Journal of Bacteriology, 91, Seite 1140 (1966) beschrieben sind.
Die Mikroorganismen werden vorzugsweise bei einer Tem-pertur im Bereich von 30 bis 35 °C unter aeroben Bedingungen gezüchtet.
In den meisten Fällen ist der Zusatz von Wachstumsfaktoren oder Induktoren nicht notwendig. Der Zusatz von Hefeextrakt scheint einen günstigen Einfluss auf die Erzeugung des Enzyms auszuüben. Nach einer Inkubationszeit von zwischen etwa 2 und etwa 30 Stunden können die Zellen gewonnen werden, vorzugsweise während der Periode des exponentiellen Wachstums.
Ein Präparat mit a-Aminoacylamidase-Aktivität kann erhalten werden durch Ausfällen der Zellen, gegebenenfalls ' unter Verwendung eines Flockulierungsmittels. Die Zellen können auch mit einem Träger vernetzt oder an einen solchen gebunden oder absorbiert werden. In gewissen Fällen kann es wünschenswert sein, die Zellwände zu modifizieren, z.B. durch eine Wärmebehandlung, um das Enzym besser zugänglich zu machen. Ein rohes Präparat kann auch erhalten werden durch Zerstören der Zellen und Gewinnung des Enzyms durch Extraktion, Filtration und gegebenenfalls Sprühtrocknen.
Ein Präparat, welches aus reinem Enzym besteht, kann auf übliche Weise aus dem oben beschriebenen rohen Produkt gewonnen werden. Reines Enzym oder Enzympräparate können auch aus dem Kulturmedium nach bekannten Verfahren erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung des neuen Enzympräparates zur Herstellung von L-a-Aminosäure und D-a-Aminosäureamid aus DL-a-Amino-säureamid durch In-Berührungs-Bringen dieses DL-a-Amino-säureamides mit dem Präparat.
Das Präparat mit L-a-Aminoacylamidase-Aktivität wird vorzugsweise mit dem DL-a-Aminosäureamid in einem wässerigen Medium bei einer Temperatur zwischen 0 und 60 °C und vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 20 und 40 °C und bei einem pH zwischen 6 und 10,5, vorzugsweise zwischen 7,5 und 9,5 in Berührung gebracht.
Ausserhalb dieser Bereiche ist die Aktivität und/oder die Stabilität des Enzyms im allgemeinen für den praktischen Gebrauch ungenügend. Das Enzym kann auf bekannte Weise aktiviert werden, z.B. durch Zusatz einer Metallverbindung, wie einer Magnesium-, Mangan- oder Zinkverbindung.
Das Gewichtsverhältnis des (ungereinigten) Enzyms zum Substrat kann innerhalb weiter Grenzen variieren, zum Beispiel zwischen 1:25 und 1:750. Wenn ein reines Enzym verwendet wird, kann ein höheres Verhältnis verwendet werden.
Wenn die Hydrolyse des L-a-Aminosäureamides vollendet ist, kann die freie Säure vom verbleibenden D-a-Aminosäure-
3
638 241
amid abgetrennt werden und die letztgenannte Verbindung dann auskristallisierte, wurde mit einem Glasfilter abfiltriert kann dann hydrolysiert werden, um D-a-Aminosäure zu erge- und auf dem Filter mit zwei Portionen von 10 ml Wasser und ben. anschliessend mit zwei Portionen von 10 ml Aceton gewaschen.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich für die Isolie- Nach dem Trocknen wurden 1,6 g L-Phenylglycin erhalten rung optisch aktiver natürlicher oder synthetischer a-Amino- 5 (Ausbeute : 80%).
säuren, wie z.B. der D- und/oder L-Form von Phenylalanin, Die spezifische Drehung des L-Phenylglycins betrug: [aß0 =
3,4-Dihydroxyphenylalanin, Tyrosin, Methionin, Leucin, Ala- 157,7° (C = 1,6; 2,6 Gewichtsprozent HCl).
nin, Phenylglycin, 4-Hydroxyphenylglycin, 4-Alkoxyphenylgly- Aus der Literatur (siehe Beilstein, 14. III, Seite 1188) ist ein und anderen substituierten Phenylglycinen. bekannt, dass [aß0 = 157,5° (C = 1,6; 2,6 Gewichtsprozent
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgen- io HCl).
den Beispiele näher beschrieben.
Beispiel 5
Beispiel 1 In einem, mit einem Rührer ausgestatteten Kolben wurden
Pseudomonas putida ATCC 12633 wurde bei 28 bis 30 °C in 4,0 g (26,6 mg Mol) DL-Phenylglycinamid, 3 ml 0,125 molares einem Kolben inkubiert, welcher auf einer rotierenden Schüt- is MgCh, 1 ml 0,025 molares MnCh und 1 ml roher Zellextrakt telvorrichtung angebracht war. Das Wachstum wurde mit (Trockengewicht 70 mg), welche wie in Beispiel 3 hergestellt einem Spektrophotometer bei X = 680 nm gemessen. Ein Nähr- worden war, zu 97 ml Wasser zugesetzt. Dieses Gemisch wurde medium vom pH 6,85 wurde zubereitet durch Vermischen von : anschliessend während 20 Stunden bei 25 °C gerührt.
1 Liter destilliertes Wasser, 8,95 g sekundäres Natriumphos- Nach dieser Reaktionszeit wurde das gebildete L-Phenylgly-
phat-dodeeahydrat, 3,4 g primäres Kaliumphosphat, 1,0 g 20 ein durch Filtration entfernt und das Filtrat über 75 ml «Dowex Ammoniumsulfat, 200 mg Nitrilotriessigsäure, 580 mg Magne- 21 K»-Austauscherharz in der OH~-Form hindurchgeführt, siumsulfat-heptahydrat, 67 mg Kalziumchloriddihydrat, 2,0 mg Das Austauscherharz wurde sodann mit 150 ml Wasser gewa-Ferrosulfat-heptahydrat, 0,2 mg Ammoniumparamolybdat und sehen und die vereinten Eluate durch Verdampften konzen-1 ml «Hunter's metals 44» (eine verdünnte Lösung von Zink, triert (40 °C; 12 mm Hg). 1,8 g D-Phenylglycinamid (Ausbeute: Eisen, Mangan und Kupfersulfat, Kobaltnitrat, Natriumperbo- 25 90%) wurden erhalten. Dieses Produkt war gemäss Dünnrat und E.D.T.A., beschrieben in J. Cellular & Compar. Phy- Schichtchromatographie rein.
siol., 49, Seiten 25 bis 68 (1957)). Das Gemisch wurde sodann Um die optische Reinheit zu bestimmen und mit der Litera-
sterilisiert und anschliessend abgekühlt und schliesslich mit 2 g tur zu vergleichen wurde das Amid in das entsprechende Salz-Asparagin und 2 g DL-Mandelsäure versetzt. säuresalz umgewandelt. Zu diesem Zweck wurde 1,0 g D-Phe-
Die Zellen wurden während der exponentiellen Wachs- 30 nylglycinamid in 201 Methanol gelöst, filtriert, und das Filtrat tumsphase durch Zentrifugieren gewonnen (30 Minuten bei mit 1,5 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. 20 ml Aceton wur-10 000 Touren pro Minute unter Kühlung). Der derart erhal- den sodann zugesetzt, das gebildete D-Phenylglycinamid. HCl tene Feststoff wurde mit 0,1 molarem Phosphatpuffer bei auf einem Glasfilter filtriert und auf dem Filter mit zwei Por-
einem pH von 6,8 gewaschen und nochmals zentrifugiert (20 tionen von 20 ml Aceton gewaschen. Es wurden 0,9 g D-Phenyl-Minuten bei 10 000 Touren pro Minute). Der Feststoff wurde in 35 glycinamid- HCl erhalten.
Phosphatpuffer suspendiert (40 g nasse Zellen in 100 ml Puf- Die spezifische Drehung betrug: [aß0 = 101,2° (C = 0,8 ;
fer), worauf die Zellwände mit einem Ultraschall-Zelldesinte- Wasser).
grator zerstört wurden (20 kc/s während 20 Minuten bei 0 °C). Aus der Literatur ist ersichtlich (Beilstein, 14, III, Seite
Ein roher Extrakt wurde durch Entfernen der festen Partikel 1189), dass [aß0 = -100,8° (C = 0,8 ; Wasser) beträgt.
mittels Zentrifugieren (30 Minuten bei 10 000 Touren pro 40 Minute bei 4 °C) erhalten. Die Ausbeute an Zellextrakt, berech- Beispiel 6
net als trockene Substanz betrug 0,8 g pro Liter Kulturflüssig- In diesem Beispiel wurde das Mass der Hydrolyse von keit. L-Phenylglycinamid und L-Leucinamid nach 36 und 60 Minu ten bei Verwendung eines aus Pseudomonas putida erhaltenen Beispiel 2 45 Enzympräparates vergleichen.
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch ein Zu einer Lösung von 150,0 mg (1,0 mg Mol) L-Phenylglycin-
Medium verwendet, welches 10 g Hefeextrakt (zugesetzt vor amid in 15 ml Wasser wurden 0,5 mg MnCh und 2 mg MgCh der Sterilisierung) anstelle von Asparagin enthielt. Die Aus- und anschliessend 0,10 ml roher Zellextrakt (7 mg Trockenge-beute an Zellextrakt betrug etwa 1,2 g trockene Substanz pro wicht), welcher wie in Beispiel 3 hergestellt worden war, zuge-Liter Kulturflüssigkeit. 50 setzt. Nach dem Ergänzen mit A Wasser auf 25,0 ml wurden
Proben nach 36 und 60 Minuten entnommen und die Anzahl Beispiel 3 Milligramm-Mol L-Phenylglycin, welche in jeder Probe enthal-
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch ein ten waren, durch Aminosäureanalyse bestimmt.
Kulturmedium verwendet, welches 10 g Hefeextrakt anstelle Auf dieselbe Weise und mit einer ähnlichen Menge an Zell-
von Asparagin und Mandelsäure enthielt. Die Ausbeute an Zell-55 extrakt wurden 130,0 mg (1 mg Mol) Leucinamid umgewandelt, extrakt betrug 1,25 g trockene Substanz pro Liter Kulturflüssig- Auch hier wurden Proben nach 36 und 60 Minuten entnom-keit. men.
Beispiel 4 Resultate
In einem, mit einem Rührer ausgestatteten Kolben wurden 60 36 Minuten 60 Minuten
1,5 ml 0,125molares MgCh, 0,5 ml 0,025molares MnCh und 0,1
ml roher Zellextrakt (Trockengewicht 7 mg), welcher wie in L-Phenylglycinamid 0,63 mg Mol/25 ml 0,88 mg Mol/25 ml Beispiel 3 hergestellt worden war, zu einer Losung von 2,0 g L-Leucinamid 0,16 mg Mol/25 ml 0,28 mg Mol/25 ml
( 13,3 mg Mole) L-Phenylglycmamid in 48 ml Wasser unter
Rühren bei 25 °C zugesetzt. Während der Reaktion stieg der pH 65
des Reaktionsgemisches von 9,6 auf 9,7. Beispiel 7
Nach 20 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit 4N Salz- 1,0 mg Mol von jedem der folgenden a-Aminosäureamide säure auf ein pH von 6,5 angesäuert. L-Phenylglycin, welches wurde bei 20 °C mit 0,1 ml rohem Zellextrakt (Trockengewicht
638 241
4
7 mg), welcher wie in Beispiel 3 hergestellt worden war, in 5 ml Wasser, in welchem 0,5 mg MnCh und 2,0 mg MgCh aufgelöst worden waren, umgewandelt. Nach 3 und 18 Stunden wurde eine Aminosäureanalyse durchgeführt.
Resultate
Gewichtsprozent Aminosäure nach 3 Stunden nach 18 Stunden
L-Phenylglycinamid
98%
99%
L-Methioninamid
97%
99%
L-p-Hydroxyphenyl-
92%
98%
glycinamid
L-Leucinamid
57%
98%
DL-a-Amino-
42%
51%
8-cyanovaleramid
L-Phenylalaninamid
34%
96%
L-Tyrosinamid
29%
96%
Glycinamid
1%
3%
DL-a-Aminocapro-
0%
0%
lactam
Beispiel 8
Es wurden Substratlösungen hergestellt, welche die folgende Zusammensetzung aufwiesen: 5 ml Wasser, 100 mg L-Phenylglycinamid, 0,5 mg MnCh und 2 mg MgCh.
Substrate mit dieser Zusammensetzung wurden mit 0,1 ml rohem Zellextrakt (Trockengewicht 2 mg) von jedem der untenstehenden Mikroorganismen behandelt. Nach 0,5 und 1,5 Stunden wurde eine Aminosäurenalyse durchgeführt.
Gewichtsprozent Aminosäure nach 'A Stunde nach 1 Vz Stunde
Aspergillus oryzae
0%
1%
Aspergillus
0%
1%
parasiticus
Bacillus subtilis
1%
2%
Pseudomonas putida
34%
72%
Bacillus
2%
3%
stearothermophilus
Aeromonas
21%
48%
proteolitica
Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, weist das durch Züchtung von Pseudomonas putida erhaltene Enzympräparat eine wesentlich höhere Aktivität als die durch Züchtung der übrigen Mikroorganismen erhaltenen Enzympräparate auf.
Beispiel 9
Es wurden Enzympräparate wie in Beispiel 3 hergestellt unter Verwendung der Mikroorganismen Pseudomonas reptilivora ATCC 14039 und Pseudomonas arvilla ATCC 23974. Die Ausbeute an rohem Zellextrakt, ausgedrückt als Gramm pro Liter der Kulturflüssigkeit, betrugen 1,24 g/Liter bzw. 0,82 g/Liter.
Die a-Aminoacylamidase-Aktivität unter Verwendung von L-Phenylglycinamid als Substrat wurde untersucht unter Verwendung von 0,1 ml Zellextrakt (Trockengewicht 4 mg) und einer Lösung bestehend aus 0,2 g L-Phenylglycinamid, 0,3 ml 0,25molares MnCh, 1,2 ml 0,125molares MgCh und 23,5 ml Wasser.
Nach 1 Stunde zeigte die Aminosäureanalyse, dass die Umwandlung in L-Phenylglycin 46,8% für das Präparat aus Pseudomonas reptilivora und 35,7% für dasjenige aus Pseudomonas arvilla betrug.
Das Beispiel wurde wiederholt, jedoch die Enzympräparate unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens und Pseudomonas stutzeri hergestellt. Nach 1 Stunde betrug die Umwandlung in L-Phenylglycin 21,4% bzw. 9,6% und 4,2%.
Beispiel 10
Die selektive Hydrolyse zu L-4-Hydroxyphenylglycin wurde bestimmt durch Auflösen von 0,071 g (0,43 Millimol) DL-4-Hydroxyphenylglycinamid in 24 ml Wasser und Zusatz von 25,1 mg eines Enzympräparates, welches durch Sprühtrocknen der Kulturflüssigkeit aus einer Kultur von Pseudomonas putida erhalten worden war, zu dieser Lösung. Der pH des Gemisches betrug 8,2. Das Gemisch wurde während 3 Stunden unter Rühren bei 30 °C gehalten. Alle 30 Minuten wurde eine 2-ml-Probe entnommen. Die Probe wurde mit 2 ml 0,333 N Schwefelsäure verdünnt und der Gehalt an L-4-Hydroxyphenylglycin durch Aminosäure-Analyse bestimmt. Aus diesen Daten wurde die Menge an L-Aminosäureamid, welche hydrolysiert worden war, berechnet. Die Resultate sind unten zusammengestellt. Es trat keine Hydrolyse des D-Aminosäureamides auf.
Zeit (Stunden)
Mol-Prozent hydrolysiertes L-4-Hydroxyphenylglycinamid
0,5
65
1
88
1,5
93
2
99
2,5
99
3
99
Beispiel 11
Die Hydrolyse von DL-4-Methoxyphenylglycyinamid wurde wie in Beispiel 10 bestimmt, unter Verwendung von 1,36 g DL-4-Methoxyphenylglycinamid, 43 ml Wasser und 49,3 mg des Enzympräparates, welches durch Sprühtrocknen einer Pseudomonas-putida-Kulturflüssigkeit erhalten worden war.
Die Probenentnahme und die Bestimmung der L-Amino-säure wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Es trat keine Hydrolyse des D-Aminosäureamides ein.
Zeit (Stunden)
Mol-Prozent hydrolysiertes L-4-Methoxyphenylglycinamid
0,5
18
1,0
41
1,5
61
2,0
77
2,5
91
3
99
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Claims (6)

638 241
1. Verfahren zur Herstellung von Enzympräparaten mit L-a-Aminoacylamidase-Aktivität durch Züchten eines Mikroorganismus in Gegenwart eines Nährmediums, welches assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Phos- 5 phor enthält, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus aus der Gruppe Pseudomonas putida, Pseudomonas repti-livora und Pseudomonas arvilla verwendet wird.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus verwendet wird, welcher zur Artio Pseudomonas putida gehört.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633 verwendet wird.
4. Verwendung eines nach dem Verfahren gemäss Patentan-15 spruch 1 erhaltenen Enzympräparates zur Herstellung von L-a-Aminosäure und D-a-Aminosäureamid aus DL-a-Amino-säureamid, dadurch gekennzeichnet, dass man das DL-a-Ami-nosäureamid mit dem Enzympräparat in Berührung bringt.
5. Verwendung nach Patentanspruch 4 eines nach dem Ver- 20 fahren gemäss Patentanspruch 2 oder 3 erhaltenen Enzympräparates.
6. Verwendung nach Patentanspruch 4 für die Herstellung von L-Phenylglycin und D-Phenylglycinamid aus DL-Phenyl-glycinamid. 25
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