DE2700456A1 - Verfahren zur herstellung eines enzympraeparats mit l-alpha-aminoacylamidase-aktivitaet - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines enzympraeparats mit l-alpha-aminoacylamidase-aktivitaet

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Description

LEINWEBER & ZIMMERMANN
7 O O A 5 G PATENTANWÄLTE
Dipl.-Ing. H. Leinweber ραο-η» Dipl.-Ing. Heinz Zimmermann Dipl.-Ing. A. Gf. v. Wengersky
Rosental 7, 8000 München 2
2. Aufgang (Kustermann-Passage) Telefon (089) 2603989 Telex 52 8191 lepatd Telegr.-Adr. Leinpat München
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z/x
NOVO INDUSTRI A/S
DK-2880 Bagsvaerd
Dänemark
Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparats mit L-oC-Aminoacyl amidase- Aktivität
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparats mit L-cC-Aminoacylamidase-Aktivität durch Kultivieren eines Mikroorganismus in Gegenwart, eines assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen enthaltenden Nährmediums.
Bekanntlich können einige Mikroorganismen, wie z.B. Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Mycobacterium
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phlei, Aeromonas proteolytica, Bacillus subtilis und Bacillus stearothermophilus, Enzyme erzeugen, die oC-Aminosäureamide in einem wässrigen Medium zu c<-Aminosäure zu hydrolysieren vermögen.
Diese bekannten Enzyme, die nachfolgend als o^-Aminoacylamidasen bezeichnet werden, zeigen eine stark stereospezifische Wirksamkeit und hydrolysieren nur L-oC-Aminoacylamidasen. So werden D-bf-Aminoacylamidasen von diesen Enzymen praktisch nicht angegriffen.
Deshalb sind diese oC-Aminoacylamidasen zur Durchführung einer optischen Spaltung von DL-c<-Aminosäuren geeignet. Bei einem solchen Verfahren wird oi-Aminoacylamidase mit DL-oC-Aminosäureamid zwecks Hydrolyse des L-oC-Aminosäureamids zur entsprechenden Aminosäure zusammengebracht, und die gebildete Aminosäure und/oder das verbleibende D-oC-Aminosäureamid wird isoliert (Greenstein & Winitz: "Chemistry of the aminoacids", Band 3, Seiten 1778 - 1781 (New York 1961)).
Die Erfindung soll ein Präparat mit verbesserter L-of-Aminoacylamidase-Aktivität, verglichen mit den nach den oben genannten bekannten Methoden hergestellten Präparaten, liefern; sie soll zu einem Präparat mit hoher L-<<-Aminoacylamidase-Aktivität und ohne erwünschte enzymatische Nebenwirkungen führen und ein Verfahren zur Herstellung von L-o£-Aminosäure und/oder D-o(-Aminosäureamid aus DL-oC-Aminosäureamid angeben.
Diese und weitere Aufgaben und Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und dem erfindungsgemäßen Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gruppe Pseudomonas putida, Pseudomonas reptilivora und Pseudomonas arvilla eingesetzt wird.
Durch Kultivieren dieser Mikroorganismen in an sich bekannter Weise werden Präparate erhalten, die eine ungewöhnlich
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hohe Amidase-Aktivität aufweisen.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Mikroorganismen sind in Bergey's Manual of determinative bacteriology (Baltimore 1975) beschrieben.
Bevorzugte Stämme sind Pseudomonas putida ATCC 12633, ATCC 25571, ATCC 17390, ATCC 17426 und ATCC 17484, Pseudomonas reptilivora ATCC 14039 und Pseudomonas arvilla ATCC 23974.
Diese Stämme sind von der American Type Culture Collection, Washington DC, V.St.A. erhältlich.
Pseudomonas putida und insbesondere der Stamm ATCC 12633 ist ein besonders bevorzugter Mikroorganismus.
Von Pseudomonas putida wird in der Literatur berichtet, daß er Mandelsäure-Racemase zu erzeugen vermag.
Es ist daher überraschend, daß Pseudomonas putida ein Enzym erzeugt, das eine stereo-spezifische Amidase-Aktivität aufweist und keine Racemisierung von z.B. Phenylglycin verursacht, das mit Mandelsäure eng verwandt ist.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Mikroorganismen können in einem gewöhnlichen Nährmedium kultiviert werden, wie es z.B. beschrieben ist von Hegeman im Journal of Bacteriology, 93, Seite 1140 (1966).
Die Mikroorganismen werden bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 30 bis 35 0C unter aeroben Bedingungen kultiviert.
In den meisten Fällen ist die Zugabe von Wachstumsfaktoren oder -beschleunigern unnötig. Der Zusatz von Hefeextrakt · scheint einen günstigen Einfluß auf die Enzymproduktion zu haben.
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Nach einer Inkubationszeit von zwischen etwa 2 und etwa 30 h können die Zellen geerntet werden, bevorzugt in der Zeit exponentiellen Wachstums.
Ein Präparat mit o^-Aminoacylamidase-Aktivität kann durch Fällen der Zellen, gegebenenfalls unter Verwendung eines Flockungsmittels, erhalten werden. Die Zellen können auch auf einem Träger vernetzt oder gebunden oder adsorbiert werden. Gelegentlich kann es wünschenswert sein, die Zellwandungen zu modifizieren, z.B. durch Wärmebehandlung, um das Enzym zugänglicher zu machen. Ein Rohpräparat kann auch durch Zerstören der Zellen und Gewinnen des Enzyms durch Extraktion, Filtrieren und gegebenenfalls Sprühtrocknen gewonnen werden.
Ein aus reinem Enzym bestehendes Präparat kann in herkömmlicher Weise aus dem oben beschriebenen Rohprodukt gewonnen werden. Reines Enzym oder Enzympräparate können auch aus dem Kulturmedium nach wohlbekannten Techniken erhalten werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung von L-«T-Aminosäure und D-o^-Aminosäureamid aus OL-oC-Aminosäureamid, in dem das DL-o^-Aminosäureamid mit einem Präparat mit L-of-Aminoacylamidase-Aktivität zusammengebracht wird.
Dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß ein Präparat verwendet wird, das durch Züchten eines Mikroorganismus aus der Gruppe Pseudomonas putida, Pseudomonas reptilivora und Pseudomonas arvilla in Gegenwart eines assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen enthaltenden Nährmediums erhalten wurde.
Das Präparat mit L-oi-Aminoacylamidase-Aktivität wird mit dem DL-ot-Aminosäureamid bevorzugt in einem wässrigen Medium bei einer Temperatur zwischen 0 und 60 C, insbesondere bevorzugt
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bei einer Temperatur zwischen 20 und 40 C, und bei einem pH-Wert zwischen 6 und 10,5 und insbesondere bevorzugt zwischen 7,5 und 9,5 in Berührung gebracht.
Außerhalb dieser Bereiche ist die Aktivität und/oder die Stabilität des Enzyms im allgemeinen für die praktische Verwendung unzureichend. Das Enzym kann in wohlbekannter Weise aktiviert werden, z.B. durch Zugabe einer Metallverbindung, wie z.B. einer Magnesium-, Mangan- oder Zinkverbindung.
Das Gewichtsverhältnis des (ungereinigten) Enzyms zum Substrat kann innerhalb weiter Bereiche variieren, z.B. zwischen 1:25 und 1:750. Bei Verwendung eines reinen Enzyms kann ein höheres Verhältnis zur Anwendung gelangen.
Ist die Hydrolyse des L-o^-Aminosäureamids abgeschlossen, kann die freie Säure von dem verbleibenden D-oi-Aminosäureamid abgetrennt werden, und die letztere Verbindung kann dann zu D-o^-Aminosäure hydrolysiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Isolierung optisch aktiver natürlicher oder synthetischer o^-Aminosäuren, wie z.B. der D- und/oder L-Form des Phenylalanins, 3,4-Dihydroxyphenylalanins, Tyrosins, Methionins, Leucins, Alanins, Phenylglycins, 4-Hydroxyphenylglycins, 4-Alkoxyphenylglycins und anderer substituierter Phenylglycine.
Weitere Vorteile, Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden näheren Beschreibung unter Bezugnahme auf die Beispiele.
Beispiel I
Pseudomonas putida ATCC 12633 wurde bei 28 - 30 0C in einem in eine rotierende Schüttelvorrichtung gebrachten Kolben in-
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kubiert. Das Wachstum wurde mit einem Spektrophotometer bei λ= 680 nm gemessen. Ein Nährmedium mit einem pH-Wert von 6,85 wurde durch Mischen folgender Bestandteile hergestellt: 1 1 destilliertes Wasser, 8,95 g sec.-Natriumphosphat-Dodecahydrat, 3,4 g prim.-Kaliumphosphat, 1,0g Ammoniumsulfat, 200 mg Nitrilotriessigsäure, 580 mg Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 67 mg Calciumchlorid-Dihydrat, 2,0 mg Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat, 0,2 mg Ammoniumparamolybdat und 1 ml "Hutner's Metalle 44" (eine verdünnte Lösung von Zink-, Eisen-, Mangan- und Kupfersulfat, Kobaltnitrat, Natriumperborat und A-DTA - beschrieben in J. Cellular & Compar. Physiol, 49, Seiten 25 bis 68 (1957)). Das Gemisch wurde dann sterilisiert und darauf gekühlt, und schließlich wurden 2 g Asparagin und 2 g DL-Mandelsäure zugesetzt.
Die Zellen wurden während der exponentiellen Wachstumsphase durch Zentrifugieren gewonnen (30 min bei 10 000 UpM unter Kühlen). Der so erhaltene Feststoff wurde mit 0,1 m Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,8 gewaschen und noch einmal zentrifugiert (20 min bei 10000 UpM). Der Feststoff wurde im Phosphatpuffer (40 g Naßzellen in 100 ml Puffer) suspendiert, worauf die Zellwandungen mit einem Ultraschallgerät (20 kHz 20 min bei 0 °C) zerstört wurden. Ein Rohextrakt wurde durch Entfernen der festen Teilchen mittels Zentrifugieren (30 min bei 10 000 UpM und 4 0C) erhalten. Die Ausbeute an Zellextrakt, berechnet als Trockensubstanz, belief sich auf 0,8 g/l Kulturflüssigkeit.
Beispiel II
Die Arbeitsweise des Beispiels I wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß ein Medium verwendet wurde, das 10 g Hefeextrakt (vor dem Sterilisieren zugesetzt) an Stelle von Asparagin enthielt. Die Ausbeute an Zellextrakt belief sich auf etwa 1,2 g Trockensubstanz/1 Kulturflüssigkeit.
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Beispiel III
Die Arbeitsweise des Beispiels I wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß ein Kulturmedium, das 10 g Hefeextrakt enthielt, anstelle von Asparagin und Mandelsäure verwendet wurde. Die Ausbeute an Zellextrakt belief sich auf 1,25 g Trokkensubstanz/1 Kulturflüssigkeit.
Beispiel IV
In einem mit einem Rührer versehenen Kolben wurden 1,5 ml 0,125 m MgCl2, 0,5 ml 0,025 m MnCl2 und 0,1 ml roher Zellextrakt (Trockengewicht 7 mg), hergestellt wie in Beispiel III beschrieben, zu einer Lösung von 2,0 g (13,3 mMol) L-Phenylglycinamid in 48 ml Wasser unter Rühren bei 25 C gegeben. Während der Reaktion stieg der pH-Wert des Reaktionsgemische von 9,6 auf 9,7.
Nach 20 h wurde das Reaktionsgemisch mit 4 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,5 angesäuert. L-Phenylglycin, das dann auskristallisierte, wurde auf einer Glasnutsche abfiltriert und auf dieser mit zwei 10 ml-Portionen Wasser und dann mit zwei 10 ml-Portionen Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen wurden 1,6 g L-Phenylglycin (Ausbeute 80 %) erhalten.
Die spezifische Drehung des L-Phenylglycins betrug
^0 = 157,7 ° (C = 1,6; 2,6 Gewichtsprozent HCl).
Aus der Literatur (vgl. Beilstein J_4_ III, S. 1188) ist bekannt, daß /k/p° = 157,5 (C = 1,6; 2,6 Gewichtsprozent HCl).
Beispiel V
In einem mit einem Rührer ausgestatteten Kolben wurden 4,0 g (26,6 mMol) DL-Phenylglycinamid, 3 ml 0,125 m MgCl2, 1 ml
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0,025 m MnCl.2 und 1 ml eines rohen Zellextrakts (Trockengewicht 70 mg), hergestellt, wie in Beispiel III beschrieben, zu 97 ml Wasser gegeben. Dieses Gemisch wurde dann 20 h bei 25°C gerührt.
Nach dieser Reaktionszeit wurde das gebildete L-Phenylglycin abfiltriert, und das Filtrat durch eine 75 ml-Dowex 21 K-Austauschersäule in der OH -Form geführt. Dann wurde der Austauscher mit 150 ml Wasser gewaschen, und die vereinigten Eluate wurden durch Verdampfen (40 °C/12 mm Hg) eingeengt. 1,8 g D-Phenylglycinamid (Ausbeute 90 %) wurden erhalten. Dieses Produkt war nach der Dünnschicht-Chromatographie rein.
Zur Bestimmung der optischen Reinheit und zum Vergleich mit der Literatur wurde das Amid in das entsprechende Hydrochlorid überführt. Hierzu wurde 1,0g D-Phenylglycinamid in 20 ml Methanol gelöst, worauf filtriert und 1,5 ml konzentrierte Salzsäure dem Filtrat zugesetzt wurden. Dann wurden 20 ml Aceton zugesetzt, das gebildete D-Phenylglycinamid · HCl dann auf einem Glasfilter filtriert und darauf mit zwei 20 ml-Portionen Aceton gewaschen. 0,9 g D-Phenylglycinamid · HCl wurden erhalten.
Die spezifische Drehung war /<</D = -101,2 ° (C = 0,8; Wasser).
Aus der Literatur (Beilstein J_4 III, Seite 1189) ergibt sich, daß /"<*/£° = -100,8 ° (C = 0,8; Wasser).
Beispiel VI
In diesem Beispiel werden die Hydrolysegeschwindigkeiten von L-Phenylglycinamid und L-Leucinamid nach 36 und 60 min unter Verwendung eines Enzympräparats, erhalten von Pseudomonas putida, verglichen.
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Zu einer Lösung von 150,0 mg (1,0 mMol) L-Phenylglycinamid in 15 ml Wasser wurden 0,5 mg MnCl- und 2 mg MgCl2 und dann 0,10 ml roher Zellextrakt (7 mg Trockengewicht), hergestellt, wie in Beispiel III beschrieben, zugesetzt. Nach dem Auffüllen auf 25,0 ml mit Wasser wurden Proben nach 36 und 60 min genommen, und die Zahl der mMole in jeder Probe enthaltenen L-Phenlyglycins wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt.
Ebenso und mit einer gleichen Menge Zellextrakt wurden 130,0 mg (1 mMol) Leucinamid umgewandelt. Auch hier wurden Proben nach 36 und 60 min entnommen.
Ergebnisse;
36 min 60 min
L-Phenylglycinamid 0,63 mMol/25 ml 0,88 mMol/25 ml L-Leucinamid 0,16 mMol/25 ml 0,28 mMol/25 ml
Beispiel VII
Je 1,0 mMol der folgenden ot-Aminosäureamide wurde bei 20 C mit 0,1 ml rohem Zellextrakt (Trockengewicht 7mg), hergestellt, wie in Beispiel III beschrieben, in 5 ml Wasser umgewandelt, in denen 0,5 mg MnCl2 und 2,0 mg MgCl2 gelöst worden waren. Nach 3 und 18h wurde eine Aminosäureanalyse vorgenommen.
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Ergebnisse;
Gewichtsprozent Aminosäure nach 18 h
nach 3 h 99
L-Phenylglycinamid 98 99
L-Methioninamid 97 98
L-p-Hydroxyphenyl-
glycinamid		 92 98
L-Leucinamid 57 51
OIj-oC- Amino- <i"-cyanova-
leramid		 42 96
L-Phenylalaninamid 34 96
L-Tyrosinamid 1 29 3
Glycinamid 1 O
Dh-ffC- Am i noc a pr ο 1 a c t am O
Beispiel VIII
Substratlösungen mit jeweils der folgenden Zusammensetzung wurden hergestellt: 5 ml Wasser, 100 mg L-Phenylglycinamid, 0,5 mg MnCl2 und 2 mg MgCl2-
Substrate dieser Zusammensetzung wurden mit 0,1 ml rohem Zellextrakt (Trockengewicht 2 mg) eines jeden der Mikroorganismen der folgenden Tabelle behandelt. Nach 0,5 und 1,5 h wurde eine Aminosäureanalyse durchgeführt.
Gewichtsprozent Aminosäure nach 0,5 h
nach 1,5h
Aspergillus oryzae Aspergillus parasiticus
0
0
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(Fortsetzung) Gewichtsprozent Aminosäure
nach 0,5 h nach 1,5 h
Bacillus subtilis Pseudomonas putida Bacillus stearothermophilus Aeromonas proteolytica
1 2
34 72
2 3
21 48
Wie sich aus der vorstehenden Tabelle ergibt, weist das durch Kultivieren von Pseudomonas putida erhaltene Präparat eine beträchtlich höhere Aktivität als die durch Kultivieren der übrigen Mikroorganismen erhaltenen Enzym-präparate auf.
Beispiel IX
Enzympräparate wurden wie in Beispiel III beschrieben unter Verwendung der Mikroorganismen Pseudomonas reptilivora ATCC 14039 und Pseudomonas arvilla ATCC 23974 hergestellt. Die Ausbeuten an rohem Zellextrakt waren, ausgedrückt als g/l Kulturflüssigkeit, 1,24 g/l bzw. 0,82 g/l.
Die o^-Aminoacylamidase-Aktivität unter Verwendung von L-Phenylglycinamid als Substrat wurde unter Einsatz von 0,1 ml Zellextrakt (Trockengewicht 4 mg) und einer aus 0,2 g L-Phenylglycinamid, 0,3 ml 0,25 m MnCl-, 1,2 ml 0,125 m MgCl2 und 23,5 ml Wasser bestehenden Lösung getestet.
Nach einer Stunde zeigte eine Aminosäureanalyse, daß die Umwandlung von L-Phenylglycin 46,8 % für das Präparat aus Pseudomonas reptilivora und 35,7 % für das aus Pseudomonas arvilla betrug.
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Das Beispiel wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Enzympräparate unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens bzw. Pseudomonas stutzeri erhalten wurden. Nach einer Stunde betrug die Umwandlung zu L-Phenylglycin 21,4 %, 9,6 % bzw. 4,2 %.
Beispiel X
Die selektive Hydrolyse zu L-4-Hydroxyphenylglycin wurde durch Auflösen von 0,071 g (0,43 itiMol) DL-4-Hydroxyphenylglycinamid in 24 ml Wasser und Zusatz von 25,1 mg eines Enzympräparats, erhalten durch Sprühtrocknen der Kulturflüssigkeit einer Kultur von Pseudomonas putida, zu dieser Lösung bestimmt. Der pH-Wert des Gemischs war 8,2. Das Gemisch wurde unter Rühren 3 h bei 30 0C gehalten. Alle 30 min wurde eine 2 ml-Probe genommen. Die Probe wurde mit 2 ml 0,333 η Schwefelsäure verdünnt, und der Gehalt an L-4-Hydroxyphenylglycin wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt. Aus diesen Daten konnte die Menge hydrolysierten L-Aminosäureamids berechnet werden. Die Ergebnisse sind nachfolgend zusammengefaßt. Eine Hydrolyse des D-Aminosäureamide trat nicht ein.
Zeit (h) Mol-% hydrolysierten L-4-Hydroxyphenylglycinamids
0,5 65
1 88
1,5 93
2 99
2,5 99
3 99
Beispiel XI
Die Hydrolyse von DL-4-Methoxyphenylglycinamid wurde wie in Beispiel X bestimmt, wobei 1,36 g DL-4-Methoxyphenylglycin-
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amid, 43 ml Wasser und 49,3 mg des Enzympräparats, erhalten durch Sprühtrocknen einer Pseudomonas putida Kulturflüssigkeit, eingesetzt wurden.
Die Probennahme und Bestimmung der L-Aminosäure wurden wie
oben beschrieben durchgeführt.
Eine Hydrolyse des D-Aminosäureamids trat nicht ein.
Zeit (h) Mol-% hydrolysierten L-4-Methoxyphenylglycinamids
0,5 18
1,0 41
1,5 61
2,0 77
2,5 91
3 99
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Claims (5)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von Enzympräparaten mit L-eC-Aminoacylamidase-Aktivität durch Kultivieren eines Mikroorganismus in Gegenwart eines assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphor-Quellen enthaltenden Nährmediums, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gruppe Pseudomonas putida, Pseudomonas reptilivora und Pseudomonas arvilla eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Spezies Pseudomonas putida eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633 oder dessen Mutante eingesetzt wird.
4. Verfahren zur Herstellung von L-o^-Aminosäure und D-</-Aminosäureamid aus DL-</-Aminosäureamid durch Zusammenbringen des DL-oC-Aminosäureamids mit einem Präparat mit oi-Aminoacylamidase-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß ein Präparat, das durch Kultivieren eines Mikroorganismus der Gruppe Pseudomonas putida, Pseudomonas reptilivora und Pseudomonas arvilla in Gegenwart eines assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphor-Quellen enthaltenden Nährmediums erhalten wurde, eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus einer Kultur von Pseudomonas putida erhaltenes Präparat eingesetzt wird.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2807286A1 (de) * 1978-02-21 1979-08-23 Bayer Ag Stereoselektive spaltung von phenylglycinderivaten und 4-hydroxyphenylglycinderivaten mit enzymharzen
FR2447359A1 (fr) * 1979-01-24 1980-08-22 Anvar Procede de preparation d'acides a-amines optiquement actifs par hydrolyse biologique de nitriles ou d'amides a-amines
JPS5713000A (en) * 1980-06-24 1982-01-22 Ube Ind Ltd Preparation of optical active tryptophane
US4366250A (en) * 1980-09-24 1982-12-28 Anvar Preparation process of optically active α-aminated acids by biological hydrolysis of nitriles
JPS59146595A (ja) * 1983-02-10 1984-08-22 Nippon Zeon Co Ltd Ｓ−アデノシル−ｌ−ホモシステインの製造法
NL8400312A (nl) * 1984-02-02 1985-09-02 Stamicarbon Optisch aktief gesubstitueerd boterzuuramide alsmede werkwijze voor de optische scheiding van gesubstitueerd boterzuuramide.
JPS60180599A (ja) * 1984-02-27 1985-09-14 Nippon Zeon Co Ltd Ｓ−アデノシル−ｌ−ホモシステインの製造法
NL8403093A (nl) * 1984-10-11 1986-05-01 Stamicarbon Werkwijze voor de enzymatische hydrolyse van d-alfa-aminozuuramiden.
NL8403487A (nl) * 1984-11-15 1986-06-02 Stamicarbon Werkwijze voor de enzymatische scheiding van dl-alfa-aminozuuramides.
JPS61293394A (ja) * 1985-06-21 1986-12-24 Mitsubishi Gas Chem Co Inc Ｌ−α−アミノ酸の製法
US5215897A (en) * 1985-09-04 1993-06-01 Nitto Chemical Industries Co., Ltd. Process for producing L-amino acids
JPS6255097A (ja) * 1985-09-04 1987-03-10 Nitto Chem Ind Co Ltd Ｌ−アミノ酸の製造法
GB8630029D0 (en) * 1986-12-16 1987-01-28 Ici Plc Decomposition of acrylamide
NL8800224A (nl) * 1988-01-29 1989-08-16 Stamicarbon Werkwijze ter bereiding van zwavelhoudende l-alpha-aminozuren.
DE3816063A1 (de) * 1988-05-06 1989-11-23 Schering Ag Verfahren zur herstellung von l-aminosaeuren und aminosaeure-amiden
US5283193A (en) * 1988-06-27 1994-02-01 Asahi Kasei Kogyo K.K. Process for producing optically active α-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor
US5238828A (en) * 1988-08-29 1993-08-24 Idemitsu Kosan Company Limited Method for the preparation of an optically active 2-substituted carboxylic acid
FR2655660B1 (fr) * 1989-12-11 1992-03-20 Rhone Poulenc Sante Nouveaux polypeptides, sequences d'adn permettant leur expression, procede de preparation et leur utilisation.
CA2150526C (en) * 1994-06-09 2005-11-15 Andreas Kiener Biotechnological process for the preparation of cyclic s-.alpha.-amino carboxylic acids and r-.alpha.-amino carboxamides
AU5693996A (en) * 1995-05-08 1996-11-29 Lonza A.G. Biotechnical production process of piperazine r-alpha-carbox ylic acids and piperazine s-alpha-carboxylic acid amide
US20050166498A1 (en) * 1999-12-17 2005-08-04 Oakey David D. Carpet tile with cutout section, method and apparatus for production and method of installation
AU2002318056A1 (en) * 2001-07-23 2003-02-17 Dsm Ip Assets B.V. Nucleic acid sequences encoding enantioselective amidases
AU2003257434A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-23 Degussa Ag L-amidase from rhizobium huautlense
DE602005018898D1 (de) 2004-01-19 2010-03-04 Dsm Ip Assets Bv Biochemische synthese von 6-aminocapronsäure
GB0413322D0 (en) * 2004-06-15 2004-07-14 Avecia Ltd Process

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5231031B2 (de) * 1973-06-30 1977-08-12
FR2245585B1 (de) * 1973-09-19 1976-05-14 Anvar
FR2294999A1 (fr) * 1974-12-18 1976-07-16 Anvar Procede de preparation d'amides par hydrolyse biologique

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS ERMITTELT *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2337761B1 (de) 1983-08-26
JPS6043958B2 (ja) 1985-10-01
FR2337761A1 (fr) 1977-08-05
GB1552542A (en) 1979-09-12
DE2700456C2 (de) 1988-11-24
LU74142A1 (de) 1977-07-22
DK143287B (da) 1981-08-03
US4080259A (en) 1978-03-21
BE850177A (fr) 1977-05-02
SE435731B (sv) 1984-10-15
CH638241A5 (de) 1983-09-15
SE7700066L (sv) 1977-07-09
DK6477A (da) 1977-07-09
DK143287C (da) 1982-01-11
NL7700092A (nl) 1977-07-12
JPS5294486A (en) 1977-08-09

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