NL8403487A

NL8403487A - Werkwijze voor de enzymatische scheiding van dl-alfa-aminozuuramides.

Info

Publication number: NL8403487A
Application number: NL8403487A
Authority: NL
Original assignee: Stamicarbon
Priority date: 1984-11-15
Filing date: 1984-11-15
Publication date: 1986-06-02
Also published as: EP0181675A1; JPS61119199A; ES548864A0; CA1258244A; DK161337B; EP0181675B1; PT81475A; US4880737A; PT81475B; DK526385A; BR8505749A; DK161337C; DK526385D0; DE3572691D1; ES8701150A1; ATE45982T1; IL77054A0

Description

*? 4 * Λ * - ** JAS / JB/WCH/WP / mjh STAHICARBON B.V. (Licensing subsidiary of DSM)

Uitvinders: Pieter L. Kerkhoffs te Geleen

Wilhelmus H.J. Boesten te Sittard -1- PN 3595

- WERKWIJZE VOOR DE ENZYMATISCHE SCHEIDING VAN DL-a-AMINOZÏÏUKAMIDES

*

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van L-α-aminozuur en D-a-aminozuuramide uit DL-a-• -aminozuuramide door het DL-a-aminozuuramide in een waterige oplossing in kontakt te brengen met een α-aminoacylamidase bevattend preparaat 5 verkregen uit een kuituur van Pseudomonas putida in aanwezigheid van sporen tweewaardige metaalionen als aktivator. Een dergelijke werkwijze is bekend, uit het Amerikaaüse octrooischrift 4.080.259. In dit octrooischrift worden als aktivator voor de a-aminoacylamidase-akti-viteit (ook wel aminopeptidase-aktiviteit genoemd) van preparaten 10 verkregen uit microorganismen behorende tot het geslacht Pseudomonas magnesium-, mangaan- en zinkverbindingen genoemd. Op zichzelf was het al geruime tijd bekend dat bijvoorbeeld leucine-aminopeptidase (waarvan de werking in feite overeenkomt met die van het onderhavige a-aminoacylpeptldase) geaktiveerd wordt door tweewaardige 15 mangaanionen en magnesiumionen, vide Methods in Enzymology Vol II, p.

93 (1955), Academie Press Inc., New lork. Ook andere enzymen kunnen worden geaktiveerd door tweewaardige metaalionen, vide bijvoorbeeld SRI report No. 139 pp. 181-2 (1981).

Dergelijke metaalionen komen voor in sporenconcentraties, dat 20 wil zeggen in concentraties beneden 1 mmol/1. Het effekt van deze ionen op de aktiviteit van het enzym kan bijzonder groot zijn. Men zal dan ook waar mogelijk gebruik maken van dergelijke aktivatoren in enzymatische reakties. Als referentieoplossing voor de uitvinding dient dan ook een α-aminoacylamidase bevattende waterige oplossing van 25 zuiver DL-a-aminozuuramide, waarin sporen tweewaardige metaalionen als aktivator aanwezig zijn.

8403487 5 * < -2-

In de praktijk bevatten de droge enzympreparaten al dergelijke sporenelementen. Deze elementen worden namelijk doorgaans al in de fermentor, waar de kweek van het microorganisme plaatsvindt, toegevoegd. Na de kweek komen de sporenelementen dan vanzelf in een 5 eventueel gedroogd enzympreparaat terecht.

Het is aanvraagster gebleken dat in een bijzonder praktische . uitvoeringsvorm van de werkwijze als in de aanhef beschreven de akti-viteit van het enzympreparaat in de oplossing dikwijls lager is dan die van een gelijke hoeveelheid enzympreparaat bevattende referen-10 tieoplossing. In die praktische uitvoeringsvorm wordt de bovenbeschreven werkwijze toegepast in dezelfde waterige oplossing als die waarin het DL-a-aminozuuramide is gesynthetiseerd. Hierdoor wordt een dure, tussentijdse opwerking van dit DL-a-aminozuuramide overbodig.

Een gebruikelijke synthese voor DL-a-aminozuuramide verloopt 15 via de zogenaamde Streckersynthese, waarbij een aldehyd met een cyanide en een ammoniumzout wordt gekoppeld tot een DL-a-aminonitril. Vervolgens kan behandeling van het aldus verkregen DL-a-aminonitril plaatsvinden met een keton in sterk basisch milieu, waarbij het DL-a--aminozuuramide wordt gevormd. Deze arainonitrilomzetting is beschre-20 ven in het Engelse octrooischrift 1.548.032. Een andere mogelijkheid voor de omzetting van DL-a-aminonitril in het overeenkomstige DL-a--aminozuuramide is gelegen in de behandeling hiervan met geconcentreerd zwavelzuur, gevolgd door neutralisatie met een hydroxide.

Aanvraagster heeft nu gevonden dat de aktiviteit van het a-25 -aminoacylamidase preparaat verkregen uit een kuituur van Pseudomonas putida althans gedeeltelijk wordt geremd (ten opzichte van de referentieoplossing) door natriumionen. Deze natriumionen kunnen bijvoorbeeld afkomstig zijn van natriumcyanide, gebruikt in de Streckersynthese en/of van natriumhydroxide, gebruikt bij de omzetting van 30 DL-a-aminonitril- Er zijn nog andere oorzaken denkbaar waardoor natriumionen in de oplossing aanwezig kunnen zijn, maar in feite is het niet relevant hoe deze ionen in de oplossing terecht zijn gekomen. Tot dusver was niet bekend dat natriumionen een dergelijk inhibitie— effekt vertonen op α-aminoacylamidase preparaten van Pseudomonas 35 putida.

84 0 3 4 8 7 -3-

Aanvraagster heeft bovendien gevonden dat bij de praktische uitvoeringsvorm van de enzymatische scheiding niet alleen natrium een effekt heeft op de enzymaktiviteit, maar dat het tegenion, bijvoorbeeld het anion van het ammoniumzout in de Streckersynthese (men 5 dient hierbij te bedenken dat in principe veel verschillende ammoniumzout en in de Streckersynthese kuitnen worden toegepast) eveneens invloed heeft op die aktiviteit. Zo is het aanvraagster gebleken, dat bijvoorbeeld nitraat-, acetaat- en bisfosfaationen een remmende werking vertonen ten opzichte van de referentieoplossing.

10 Voor de anionen geldt eveneens dat het tot dusver niet bekend was, dat de aktiviteit van a-aminoacylamidase uit Pseudomonas putida hierdoor kan worden beïnvloed.

De uitvinding heeft tot doel een oplossing aan te geven voor de nadelige gevolgen van de remming, waarmee aanvraagster werd 15 gekonfronteerd bij de praktische uitvoering van de werkwijze als in de aanhef beschreven.

De uitvinding heeft bovendien als doel te voorzien in een werkwijze als ia de aanhef beschreven, waarbij de enzymaktiviteit zelfs ten opzichte van de referentieoplossing wordt verhoogd· 20 De werkwijze volgens de uitvinding voor het bereiden van L-a- -aminozuur en D-α-aminozuuramide uit DL-a-aminozuuramide door het DL-oc-aminozuuramide in een waterige oplossing in kontakt te brengen met een a-amidoacylamidase bevattend preparaat verkregen uit een kuituur van Pseudomonas putida in aanwezigheid van sporen tweewaardige 25 metaalionen als aktivator is hierdoor gekenmerkt, dat de waterige oplossing bovendien een kaliumzout gekozen uit de groep kaliumsulfaat en kaliumchloride bevat. Hierdoor wordt bereikt dat men met minder cc--aminoacylaaidase kan volstaan bij de enzymatische scheiding, hetgeen een duidelijk kostprijsvoordeel oplevert. Dit voordeel weegt 30 ruimschoots op tegen de, ten opzichte van natriumverbindingen, duurte van de kaliumverbindingen.

Waar natrium, in welke zoutvorm dan ook, een remmende werking vertoont op het enzym, komt het als een verrassing, dat kalium in de juist gekozen zoutvorm, dat wil zeggen als chloride of, bij voorkeur, 35 als sulfaat, een aktiverende werking op het enzym vertoont.

84 0 3 i ~ 7 5 - -4-

De werkwijze volgens de uitvinding is uiteraard niet beperkt tot de praktische uitvoeringsvorm als boven beschreven, maar omvat in het algemeen de enzymatische scheiding van DL-a-aminozuuramides in een waterige oplossing. Minder belangrijk is daarbij hoe die waterige 5 oplossing is gemaakt.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding kan per liter waterige oplossing 0,1-3 mol kalium als sulfaat of als chloride worden toegepast.

De werkwijze volgens de uitvinding heeft in principe 10 betrekking op a-aminoacylamidase bevattende preparaten afkomstig van de stam Pseudomonas putlda, alsmede van mutanten hiervan. Een bijzonder geschikte Pseudomonas putida stam is gedeponeerd bij de American Type Culture Collection te Washington D.C., Verenigde Staten van Amerika, onder nummer 12633.

15 Een preparaat met α-aminoacylamidaseaktiviteit kan worden verkregen door precipitatie van de cellen van Pseudomonas putida, eventueel onder toepassing van een uitvlokkingsmiddel· De cellen kunnen eveneens worden verknoopt of worden gehecht of geabsorbeerd aan •een drager. In sommige gevallen kan het gewenst zijn de celwanden te 20 modificeren, bijvoorbeeld door een thermische behandeling of door chemische behandeling (bijvoorbeeld met tolueen) om het enzym beter toegankelijk te maken. Een ruw preparaat kan eveneens worden verkregen door de wand van de cellen te vernietigen en het enzym te winnen door extraktie, filtratie en eventueel door sproeidrogen.

25 Een preparaat, dat uit het zuivere enzym bestaat, kan op gebruikelijke wijze worden verkregen uit het bovenbeschreven ruwe pro— dukt. Ruwe of zuivere enzympreparaten kunnen, net als hele cellen, eveneens op een drager worden geïmmobiliseerd.

Het preparaat met α-aminoacylamidaseaktiviteit wordt in 30 waterige milieu met het DL-α-aminozuuramide in contact gebracht bij een temperatuur tussen 0 en 60 eC en bij voorkeur bij een temperatuur tussen 20 en 40 °C en een pH tussen 6 en 10,5 en bij voorkeur tussen 7,5 en 9,5-

Buiten de genoemde trajekten is de aktiviteit en/of de stabi- $40348? -5- liteit van het enzym in het algemeen onvoldoende voor het gebruik in de praktijk.

De gewichtsverhouding van het (niet gezuiverde) enzympre-paraat tot het substraat kan binnen ruime grenzen variëren, bijvoor-5 beeld tussen 1 : 25 en 1 : 750. Indien een zuiver’enzym wordt gebruikt, kan een hogere verhouding worden toegepast.

Wanneer de hydrolyse van het L-a-aminozuuramide is voltooid, kan het vrije zuur van het resterende D-a-aminozuuramide worden afgescheiden en kan de laatstgenoemde verbinding vervolgens ook worden 10 gehydrolyseerd onder vorming van het D-α -aminozuur.

Wanneer het D-a-aminozuuramide oplosbaar is naast het L-α-aminozuur (zoals bijvoorbeeld het geval bij D-phenylglycineamide en D-valineamide) kan men het D-α-aminozuur als volgt verkrijgen. Men voegt aan bovengenoemd mengsel een aldehyd, bijvoorbeeld benzaldehyd, 15 in een hoeveelheid equimolair of hoger ten opzichte van het D-a- -aminozuuramide toe, waardoor een onoplosbare Schiffse base van het D-a-aminozuuramide ontstaat (D-N-benzylideenverbinding van D-a-aminozuuramide). Vervolgens kan men dan na afscheiden van de t

Schiffse base deze met een sterk zuur hydrolyseren tot het D-a-20 -aminozuur.

De werkwijze volgens de uitvinding is geschikt voor het isoleren van optisch actieve, natuurlijke of synthetische α-aminozuren en/of D-a-aminozuuramides, zoals bijvoorbeeld de D- en/of L-vorm van phenylalanine, 3,4-dihydroxyphenylalanine, homophenylalanine, tyro-25 sine, methionine, valine, leucine, alanine, phenylglycine, 4-hydroxyphenylglycine, 4-alkoxyphenylglycine en andere gesubstitueerde phenylglycines. Kernpunt van de werkwijze volgens de uitvinding is dat het enzym kan worden geaktiveerd, onafhankelijk van het substraat.

30 Een praktische voorkeursuitvoering voor de bereiding van een L-α-aminozuur en een D-a-aminozuuramide, uitgaande van een aldehyd, cyanide en ammoniumzout, die mede de werkwijze volgens de uitvinding omvat, is alsvolgt:

Een aldehyd RCHO, waarin R een al of niet gesubstitueerde alkyl- of 35 arylgroep voorstelt, wordt in een waterige ammoniakoplossing gebracht, 8403437 ΐ «.

’ -6- waarin tevens kaliumcyanide en ammoniumsulfaat zijn opgelost. De oplossing wordt nu gedurende 1-4 uur verwarmd tot 40 °C. Hierbij wordt DL-oc-aminonitril (R-CH-C3N) gevormd (plus kaliumsulfaat).

M2 ' 5 Vervolgens wordt een keton toegevoegd alsmede kaliumhydroxide en wordt DL-tx-aminozuuramide (R—CH—C0NH2) gevormd. Enzymatische scheiding met NH2 hoge aktiviteit kan nu plaats vinden door toevoegen van een a--aminoacylamidase preparaat afkomstig van Pseudomonas putida. Des-10 gewenst kan verdere opwerking van het D—oc-aminozuuramide tot het overeenkomstige D-a-aminozuur via Schiffse base vorming plaatsvinden.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.

Vergelijkend voorbeeld 15 In een 50 ml reaktievaatje, voorzien van een verwarmingsman- tel, werd 4,4 g DL-valineamide (37,9 mmol) onder roeren opgelost in 39,6 g water en werd de aldus verkregen oplossing verwarmd tot 40 °C. Vervolgens werd 300 mg van een ruw, α-aminoacylamidase bevattend, preparaat (dat sporen Mn2+ en Mg^+ bevatte) verkregen uit Pseudomonas 20 putida ATCC 12633 toegevoegd en werd het vaatje gesloten. Na 45 minuten werd een monster genomen en werd met behulp van een ammoniak-elektrode de gevormde hoeveelheid ¢1¾ (gevormd bij de hydrolyse van het L-α-aminozuuramide tot het overeenkomstige L-n-aminozuur) bepaald. Er bleek 25293 μ mol NE§ te zijn gevormd in deze referentieoplossing. 25 Omgerekend was de aktiviteit van het enzym 83 units/gram, waarbij 1 unit = 1 μ mol NH3 gevormd per minuut per gram enzympreparaat, bij een reaktietijd van 45 minuten en een temperatuur van 40 °C.

Voorbeeld I

In het vaatje beschreven in het vergelijkend voorbeeld werden 30 achtereenvolgens 4 ,4 g DL-valineamide (37,9 mmol) en 4,4 g kaliumsulfaat (25,3 mmol) opgelost in 35,2 g water en werd vervolgens verwarmd tot 40 eC. Vervolgens werd 275 mg van het enzympreparaat uit het vergelijkend voorbeeld toegevoegd. Na 45 minuten werd de hoeveelheid als bóven beschreven bepaald.

8403487 ¥ -7-

Er werd een aktiviteit van 128 units/g gevonden. Hieruit blijkt de aktiverende Invloed van kaliumsulfaat op het enzympreparaat.

In onderstaande tabel is de invloed van diverse ionen weergegeven.

5 Tabel

1 | Ration | Anion | Aktiviteit | Relative I

[ DL-α-amino zuur amide [ in | in 1 ln ! Aktiviteit |

I in water [mol/1000 g j mol/1000 g [ mol/1000 g | Ü/g enzym 1 ia % I

!_1_i_I_I_I_ !-1-1-1 f |

I DL-valine- I 0,86 1 - — | - - I 83 I 100 I

10 | amide II I I

I (10 gew. Z) I 0,86 I Nat 1,7 j Cl' 1,7 | 26 31,3 j I 0,86 I Na+ 1,4 | SO42" 0,7 j 67 80,7 l I 0,86 I Kt 1,34 j Cl~ 1,34 ] 87 I 104,8 f I 0,86 [Kt 1,16 I S042- 0,58 | 128 I 154,8 15 [ I 0,86 I Kt 1,0 I NO3" 1,0 I 67 I 80,7 I I 0,86 I Kt 1,14 j HPC42” 0,57 | 34 | 41,0 I I I I I__!-1 I-1 I-[ I 1 1 I DL-valine- I 1,72 I - - I - - I 48 j 100 j I amide I I l I (20 gew. Z) I 1,72 I Kt 2,68 | Cl' 2,68 | 45 93,8 L._1_!_I_I___ 1---[ 1-ίr i f 20 I DL-valine- I 1,72 |- - |- - | 1S1 J L0° j 1 amide I I I o-, -1 1 (20 gew. %) I V.72 I Kt 2,27 | CH3C00'2,27 ! 50 33,1 | Γ--f I ["“ Γ I Γ I DL-phenyl- I 0,33 I - - I - ' ^ ! ?;?0 !

[glycine- I 0,33 | Na+ 0,70 [ S042* 0,35 170 | 42,0 J

! (S^ew. Z) ï 0,33 ί Kt 0,58 ! S042” 0,29 [ 435 I 107,4 [ II11! I_J I__I_!__!-i 8403467 % -8-

Voorbeeld II

La een 1 liter reaktiekolf, voorzien van roerder, thermometer, koeler, druppeltrechter en verwarmingsmantel werd bij kamertemperatuur 66 g ammoniumsulfaat (0,5 mol) opgelost in 150 ml water 5 en werd onder roeren 250 ml ammonia (25 gew. %) toegevoegd.

Vervolgens werden 65 g kaliumcyanide (1,0 mol) en 110 ml water toegevoegd. Via de druppeltrechter werd vervolgens langzaam 95 ml iso-butyraldehyd (1,0 mol) toegedruppeld, waarbij de temperatuur niet boven 40 °C kwam.

10 Teneinde deze Strecker reaktie volledig te laten verlopen werd het reaktiemengsel bij de verkregen temperatuur gedurende 2,5 uur geroerd. De opbrengst aan DL-oc-valInenitril berekend ten opzichte van isobutyraldehyd, bedroeg volgens HPLC analyse 93 %.

Vervolgens werd aan dit reaktiemengsel een mengsel toegevoegd 15 van 75 ml aceton en 100 ml water en werd de pH ingesteld op 13,3 met 10 ml 8 molair kaliumhydroxideoplossing. De temperatuur liep hierbij in 0,5 uur op van 33 °C tot 41 °C.

Deze temperatuur werd gedurende 6 uur gehandhaafd,waarna 3,0 ' ml geconcentreerd zwavelzuur werd toegevoegd om de kaliumhydroxi- 20 deoplossing te neutraliseren. Vervolgens werd de kolf voor destillatie in orde gemaakt. In 1 uur tijd werd 110 ml van een water-ammoniak-aceton mengsel over de top gedestilleerd, terwijl de bodemtemperatuur tot 102 °C opliep.

Met behulp van HPLC analyse werd de opbrengst aan DL-a^ 25 -valineamide bepaald. Deze bedroeg 88,4 %, berekend op basis van butyraldehyd. De pH van de oplossing was 9,5. Na verwijdering van het kaliumsulfaat door middel van filtratie werd de oplossing op 40 °C gebracht en werd vervolgens hieraan 15 g van een a -aminoacylamidase bevattend preparaat, afkomstig uit een kuituur van Pseudomonas putida 30 ATCC 12633, toegevoegd. Daarna werd gedurende 20 uur bij 40 °C geroerd.

Aan de oplossing werd vervolgens langzaam 45 ml benzaldehyd toegedruppeld en werd nog gedurende 0,5 uur geroerd bij 40 °C.

Het neergeslagen D-N-benzylideenvalineamide werd afge-35 filtreerd, op het filter met 4 x 25 ml water gewassen en gedurende 16 uur bij 45 °C en bij 16 mbar gedroogd. (Uit het filtraat kan men desgewenst L-valine winnen).

S 4 0 3 4 3 7 -9-

De opbrengst aan droog en (met behulp van dunnelaagchromato-grafie bepaald) zuiver D-N-benzylideenvalineamide bedroeg 82,6 g. Het rendement berekend op basis van isobutyraldehyd bedroeg 40,5% en op basis van valineamide 91,6%.

5 Uit de specifieke rotatie (a]p20 = -12,7 (CH3OH; C = 2,0) kon een selektiviteit van 99,6 % worden berekend.

Aan een voor destillatie geschikte 1 liter reaktiekolf werd 82,0 g D-N-benzylideenvalineamide en een mengsel bestaande uit 350 ml water en 25 ml geconcentreerd zwavelzuur toegevoegd. In twee uur tijd 10 werd 170 ml water en 40 ml benzaldehyd afgedestilleerd. Na toevoegen van 75 ml geconcentreerd zwavelzuur werd nog gedurende drie uur verwarmd op 100 °C. Vervolgens werd afgekoeld tot 60 °C en werd ammonia (25 gew,%) langzaam toegedruppeld tot een pH van 2,0 werd bereikt.

Aan deze oplossing werd 2,5 g aktieve kool toegevoegd, waarna 15 gedurende 0,5 uur werd geroerd bij 60 °C. Vervolgens werd de aktieve kool afgefiltreerd en op het filter gewassen met 2 x 5 ml water. Het filtraat werd verder geneutraliseerd met 25 gew.Z ammoniaoplossing tot pH 5,0. Hierbij kristalliseerde D-valine uit. Na koelen tot 20 eC werd het D-valine afgefiltreerd en op het filter gewassen met 3 x 25 ml 20 water en 3 x 25 ml aceton en daarna gedurende 16 uur gedroogd bij 45 eC en 16 mbar. De opbrengst aan zuiver (dunnelaagchromatografisch bepaald) en sulfaatvrij D-valine bedroeg 35,4 g. Het overall rendement bedroeg 30,3 %, berekend ten opzichte van isobutyraldehyd. (Hen dient echter hierbij te .bedenken, dat uit 1 mol isobutyraldehyd in theorie 25 slechts 0,5 mol D-valine kan worden bereid).

Uit de specifieke rotatie (α]ΐ)20 = + 28,0 (6 N HC1; G * 8) kon een selektiviteit van 99,5 % worden berekend. De selektiviteit werd alsvolgt berekend: 50.[a]D20 30 % D -----Z + 50 %.

max. [α]ρ20 8 4 0 3 4 8 7

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van L-α-aminozuur en D-a--aminozuuramide uit DL-a-aminozuuramide door het DL-a— -aminozuuramide in een waterige oplossing in kontakt te brengen met een α-aminoacylamidase bevattend preparaat verkregen uit een 5 kuituur van Pseudomonas putida in aanwezigheid van sporen tweewaardige metaalionen als aktivator, met het kenmerk, dat de waterige oplossing bovendien een kaliumzout gekozen uit de groep kaliumsulfaat en kaliumchloride bevat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de waterige 10 oplossing per liter 0,1-3 mol kaliumionen bevat.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de kaliumionen in de vorm van kaliumsulfaat aanwezig zijn.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men een α-aminoacylamidase preparaat uit Pseudomonas putida ATCC 15 12633 toepast.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat men » als DL-a-aminozuuramide, DL-phenylglycineamide of DL-valineamide toepast.

6. Werkwijze voor de bereiding van L-a-aminozuur met als formule

20 R-CÏÏ-C00H, waarin R een eventueel gesubstitueerde alkyl- of NH2 arylgroep voorstelt en een.D-α-aminozuuramide met als formule R-CS - CO, waarin R dezelfde betekenis heeft als hierboven, I I NH2 NH2 25 met het kenmerk,, dat een aldehyd met als formule RCHO, waarin R dezelfde betekenis heeft als hierboven in een waterige ammoniakoplossing met kaliumcyanide en ammonium-sulfaat wordt omgezet in een DL-α-aminonitril, vervolgens een behandeling met een keton en kaliumhydroxide bevattende oplossing 30 plaatsvindt en tenslotte aan de aldus verkregen DL-a- -aminozuuramide bevattende oplossing een met sporen tweewaardige metaalionen geaktiveerd α-aminoacylamidase bevattend preparaat verkregen uit een kuituur van Pseudomonas putida wordt toegevoegd. ü 4 0 3 4 8 7 % - -11-

7. Werkwijze zoals in hoofdzaak is beschreven en/of in de voorbeelden nader is toegelicht.

8. L-ac-aminozuur en D-oc-aminozuuramide verkregen onder toepassing, van de werkwijze volgens een der voorgaande conclusies. 8403487