EP0826032A1 - Biotechnologisches verfahren zur herstellung von r-alpha-piperazincarbonsäure und s-alpha-piperazincarbonsäureamid - Google Patents

Biotechnologisches verfahren zur herstellung von r-alpha-piperazincarbonsäure und s-alpha-piperazincarbonsäureamid

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EP0826032A1
EP0826032A1 EP96915025A EP96915025A EP0826032A1 EP 0826032 A1 EP0826032 A1 EP 0826032A1 EP 96915025 A EP96915025 A EP 96915025A EP 96915025 A EP96915025 A EP 96915025A EP 0826032 A1 EP0826032 A1 EP 0826032A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
microorganisms
piperazine
piperazinecarboxamide
formula
optionally substituted
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96915025A
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Andreas Kiener
Jean-Paul Roduit
Klaus Heinzmann
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Lonza AG
Original Assignee
Lonza AG
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas

Definitions

  • the invention relates to new microorganisms which are capable, optionally substituted, of (RS) - ⁇ -piperazinecarboxamides of the formula
  • microorganisms are capable of utilizing optionally substituted ⁇ -piperazinecarboxamides of the formula I above, in the form of their racemate or their optically active isomers, in particular R- ⁇ -piperazinecarboxamides, as the only nitrogen source.
  • These microorganisms or their cell-free enzymes are optionally substituted for a new process for the preparation of R- ⁇ -piperazinecarboxylic acids (formula II) and / or for the preparation of S- ⁇ -piperazinecarboxamides, optionally substituted, of the formula
  • R- ⁇ -piperazinecarboxylic acid of the formula II is an important intermediate for the preparation of (R) -2-carboxy-4- (3-phosphonopropyl) piperazine, a selective antagonist of N-
  • the object of the present invention is to provide a simple and technically viable biotechnological process for the production of optically pure R- ⁇ -piperazinecarboxylic acids, the S- ⁇ -piperazinecarboxamide also being able to be isolated in good purity at the same time.
  • microorganisms according to the invention can be isolated from soil samples, sludge or waste water with the aid of customary microbiological techniques. According to the invention, these microorganisms are isolated in such a way that they are the only ones in a medium with an optionally substituted ⁇ -piperazinecarboxamide (formula I) in the form of its racemate or its optically active isomers
  • Nitrogen source preferably with an R- ⁇ -piperazinecarboxamide as the sole nitrogen source, and grown with a suitable carbon source in the usual way; b) then those selected from the culture obtained by cultivation are those which are stable and are capable, in (RS) - ⁇ -piperazinecarboxamides (formula I), of the R- ⁇ -piperazinecarboxamide into the corresponding R- ⁇ -piperazinecarboxylic acid (formula II ) to transfer.
  • the microorganisms can use, for example, sugar, sugar alcohols or carboxylic acids as a growth substrate as a carbon source.
  • Hexoses such as glucose or pentoses can be used as sugar.
  • Di- or tricarboxylic acids or salts thereof such as citric acid or succinate can be used as carboxylic acids.
  • glycerin can be used as the sugar alcohol.
  • a sugar alcohol such as glycerol is preferably used as the carbon source.
  • the selection and growth medium which can be used are those customary in the art, such as, for example, the mineral salt medium according to Kulla et al. (Arch. Microbiol., 135, 1-7, 1983) or that described in Table 1. Preferably, the one described in Table 1 is used.
  • Piperazine carboxamide can be used as an enzyme inducer.
  • the cultivation and selection is expediently carried out at a temperature of from 15 to 55 ° C., preferably from 20 to 45 ° C. and at a pH between pH 5 and pH 11, preferably between pH 6 and pH 10.
  • microorganisms with specific R-piperazinecarboxylic acid amidase activity are microorganisms of the genus Burkholde ⁇ a and their functionally equivalent variants and mutants.
  • Microorganisms of the genus Burkholderia as deposited on April 20, 1995 with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, in accordance with the Budapest Treaty, and their functionally equivalent variants and mutants are particularly preferred.
  • Taxonomic properties of the microorganisms of the genus Burkholderia (DSM 9925)
  • “Functionally equivalent variants and mutants” are understood to mean microorganisms which have essentially the same properties and functions as the original microorganisms. Such variants and mutants can happen to z. B. are formed by UV radiation.
  • the corresponding R- ⁇ -piperazinecarboxamide is converted and isolated from the microorganisms into the corresponding R- ⁇ -piperazinecarboxylic acid by means of the specific microorganisms already described or by means of cell-free enzymes
  • Piperazinecarboxamides of the formula I can be used as the piperazinecarboxamides of the formula I.
  • Representatives of substituted piperazine carboxamides can be -C-C4-alkyl-substituted such.
  • Piperazinecarboxamide or 4-methylpiperazinecarboxamide is preferably used.
  • the enzymes for the cell-free system can be obtained by disrupting the microorganisms in the usual manner. For example, the ultrasonic, French press or lysozyme method can be used for this. These cell-free enzymes can also be immobilized on a suitable carrier material.
  • DSM 9925 The previously described specific microorganisms of the genus Burkholderia (DSM 9925) and their functionally equivalent variants and mutants are particularly suitable for the method.
  • the biotransformation can also be dormant
  • the medium used for the method with resting cells can be the facl-usual ones, such as, for example, the mineral salt medium described above according to KuUa et al., 1983 (ibid), low-molecular phosphate buffer, HEPES buffer, or the medium described in Table 1.
  • a medium containing a carbon and nitrogen source such as, for example, commercially available media or the medium according to Table 1, is usually used for the process with growing cells. The method is preferably carried out in the medium according to Table 1.
  • the biotransformation is expediently carried out with a single or continuous addition of corresponding (RS) - ⁇ -piperazinecarboxamide in such a way that the concentration of (RS) - ⁇ -piperazinecarboxamide does not exceed 20% by weight, preferably 10% by weight.
  • the pH of the medium can be in a range from pH 5 to pH 11, preferably from pH 6 to pH 10.
  • the biotransformation is expediently carried out at a temperature of from 15 to 55 ° C., preferably from 20 to 50 ° C.
  • the R- ⁇ -piperazinecarboxamide of the formula I has been converted completely to the R- ⁇ -piperazinecarboxylic acid, with S- ⁇ -piperazinecarboxamide also being obtained.
  • the R- ⁇ -piperazinecarboxylic acid obtained in this way and / or the S- ⁇ -piperazinecarboxylic acid amide can be prepared by conventional workup methods such as, for. B. isolated by acidification, electrodialysis, chromatography or extraction. The isolated S- ⁇ -piperazinecarboxamide can then be hydrolyzed chemically to the S- ⁇ -piperazinecarboxylic acid.
  • the A-N medium was used for the isolation of microorganisms which are capable of utilizing racemic piperazinamide as the sole nitrogen source. 100 ml of this medium was placed in a 300 ml Erlenmeyer flask and mixed with various soil samples (2 g) from the LONZA AG plant in Visp, Switzerland. The flasks were incubated at 30 ° C for 5 days at rest. Then 1 ml of the A-N medium was used to make a fresh one
  • the cells were grown in 11 A-N medium at 30 ° C. and then harvested and washed. 5 g cells (wet weight) were in
  • the cells were grown in A-N medium (Table 1) and then washed once with physiological saline. After resuspending in 69 mM phosphate buffer, pH 8.0 and setting a cell density of 10 at OD650, 20 gH (RS) -piperazinecarboxamide were added at a temperature of 47 ° C. Then it was incubated for 18 h (total volume:
  • Detector Hewlett-Packard diode array detector Buffer: 10 mM disodium hydrogen phosphate, 10 mM boric acid,
  • Electrolyte 900 ml buffer plus 100 ml methanol
  • Capillary HP Gl 600-61211 Electrical field: 20 kV current: approx. 24 - 30 ⁇ A
  • Oven temperature 20 ° C detector setting: 210 nm (bandwidth 5 nm) migration time: approx.17.1 min (S-acid) approx. 17.7 min (R-acid)

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Abstract

Beschrieben werden neue Mikrooganismen, die befähigt sind α-Piperazincarbonsäureamide, in Form des Racemats oder seiner optisch aktiven Isomere, der allgemeinen Formel (I) als einzige Stickstoffquelle zu verwerten und (RS)-α-Piperazincarbonsäureamid der bereits definierten Formel (I) in eine R-α-Piperazincarbonsäure der Formel (II) zu überführen.

Description

Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von R-α-Piperazincarbonsäure und S-α- Piperazincarbonsäureamid
Die Erfindung betrifft neue Mikroorganismen, die befähigt sind, in (RS)-α-Piperazincarbonsäu- reamiden, gegebenenfalls substituiert, der Formel
das R-α-Piperazincarbonsäureamid, gegebenenfalls substituiert, in die entsprechende R-α- Piperazincarbonsäure, gegebenenfalls substituiert, der Formel
zu überführen. Die Mikroorganismen sind befähigt, gegebenenfalls substituierte α-Piperazincar- bonsäureamide der obigen Formel I, in Form ihres Racemats oder ihrer optisch aktiven Isomere, insbesondere R-α-Piperazincarbonsäureamide, als einzige Stickstoff quelle zu verwerten. Diese Mikroorganismen bzw. deren zellfreie Enzyme werden für ein neues Verfahren zur Herstellung von R-α-Piperazincarbonsäuren (Formel II), gegebenenfalls substituiert, und/oder zur Herstellung von S-α-Piperazincarbonsäureamiden, gegebenenfalls substituiert, der Formel
eingesetzt. R-α-Piperazincarbonsäure der Formel II ist ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von (R)-2-Carboxy-4-(3-phosphonopropyI)piperazin, einem selektiven Antagonisten von N-
Methyl-D-aspartat (Synlett, 1996, 143 - 144).
Ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von R-α-Piperazincarbonsäure ist bisher in der Literatur nicht beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein einfaches und technisch gangbares biotechno¬ logisches Verfahren zur Herstellung von optisch reinen R-α-Piperazincarbonsäuren zur Verfügung zu stellen, wobei gleichzeitig das S-α-Piperazincarbonsäureamid ebenfalls in guter Reinheit isoliert werden kann.
Diese Aufgabe wird mit den Mikroorganismen gemäss Patentanspruch 1 und mit dem Verfahren gemäss Patentanspruch 3 gelöst.
Die erfindungsgemässen Mikroorganismen können aus Bodenproben, Schlamm oder Abwasser unter Zuhilfenahme üblicher mikrobiologischer Techniken isoliert werden. Erfindungsgemäss erfolgt die Isolation dieser Mikroorganismen derart, dass man diese a) in einem Medium mit einem gegebenenfalls substituierten α-Piperazincarbonsäureamid (Formel I) in Form seines Racemats oder seiner optisch aktiven Isomere als einziger
Stickstoffquelle, vorzugsweise mit einem R-α-Piperazincarbonsäureamid als einziger Stickstoff quelle, und mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle auf übliche Weise züchtet; b) aus der durch Züchtung erhaltenen Kultur dann jene selektioniert, die stabil sind und befähigt sind, in (RS)-α-Piperazincarbonsäureamiden (Formel I) das R-α-Piperazincar- bonsäureamid in die entsprechende R-α-Piperazincarbonsäure (Formel II) zu überführen.
Demzufolge können alle Mikroorganismen angewendet werden, die spezifisch die R- Piperazincarbonsäure-Amidasen enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können die Mikroorganismen beispielsweise Zucker, Zuckeralkohole oder Carbonsäuren als Wachstumssubstrat nützen. Als Zucker können Hexosen wie beispielsweise Glucose oder Pentosen angewendet werden. Als Carbonsäuren können Di- oder Tricarbonsäuren bzw. deren Salze verwendet werden wie beispielsweise Citronensäure oder Succinat. Als Zuckeralkohol kann beispielsweise Glycerin verwendet werden. Vorzugsweise wird als Kohlenstoffquelle ein Zuckeralkohol wie Glycerin eingesetzt. Als Selektions- und Anzuchtmedium können die in der Fachwelt üblichen verwendet werden, wie beispielsweise das Mineralsalzmedium gemäss Kulla et al. (Arch. Microbiol., 135, 1 - 7, 1983) oder das in Tabelle 1 beschriebene. Vorzugsweise wird das in Tabelle 1 beschriebene angewendet.
Während der Anzucht und Selektion werden zweckmässig die wirksamen Enzyme der Mikroorganismen induziert. Als Enzym-Induktor kann Piperazincarboxamid angewendet werden.
Zweckmässig erfolgt die Anzucht und Selektion bei einer Temperatur von 15 bis 55 °C, vorzugsweise von 20 bis 45 °C und bei einem pH- Wert zwischen pH 5 und pH 11 , vorzugsweise zwischen pH 6 und pH 10.
Bevorzugte Mikroorganismen mit spezifischer R-Piperazincarbonsäure-Amidase- Aktivität sind Mikroorganismen der Gattung Burkholdeήa, sowie deren funktioneil äquivalente Varianten und Mutanten. Besonders bevorzugt sind Mikroorganismen der Gattung Burkholderia, wie sie am 20.04.1995 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, gemäß Budapester Vertrag hinterlegt wurden, und deren funktionell äquivalente Varianten und Mutanten.
Taxonomische Eigenschaften der Mikroorganismen der Gattung Burkholderia (DSM 9925)
Zellform Stäbchen
Breite μm 0,7 - 0,8
Länge μm 1,5 - 3,5
Gram-Reaktion -
Lyse durch 3% KOH +
Aminopeptidase (Cerny) +
Sporen -
Oxidase +
Catalase +
Pigmente gelb
Wachstum anaerob PNPG +
ADH
Urease
Hydrolyse von Gelatine
Substratverwertung
Adipat +
Citrat w
Malat +
Glucose -
Adonitol -
Mannitol -
Suberat +
Acetamid +
2,3-Butylenglycol + Abkürzungen: m-Hydroxybenzoat + α-Amylamin + PNPG: p-Nifc
Tryptamin - ADH: Alkoh
Unter "funktioneil aequivalente Varianten und Mutanten" werden Mikroorganismen verstanden, die im wesentlichen dieselben Eigenschaften und Funktionen wie die Ursprungs¬ mikroorganismen besitzen. Derartige Varianten und Mutanten können zufällig z. B. durch UV- Bestrahlung gebildet werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von R-α-Piperazincarbonsäure, gegebenenfalls substituiert, der Formel
und / oder von S-α-Piperazincarbonsäureamiden, gegebenenfalls substituiert, der Formel
erfolgt derart, dass man im (RS)-α-Piperazincarbonsäureamid, gegebenenfalls substituiert, der Formel
das entsprechende R-α-Piperazincarbonsäureamid mittels der spezifischen bereits beschriebenen Mikroorganismen oder mittels zellfreier Enzyme aus diesen Mikroorganismen zur entsprechenden R-α-Piperazincarbonsäure umsetzt und isoliert, wobei bei der
Biotransformation neben der R-α-Piperazincarbonsäure das S-α-Piperazincarbonsäureamid anfällt, welches gegebenenfalls isoliert wird.
Die Edukte, die (RS)-α-Piperazincarbonsäureamide der Formel
die gegebenenfalls substituiert sind, können aus den entsprechenden aromatischen Amiden durch fachmännisch übliche Hydrierung gewonnen werden.
Als Piperazincarbonsäureamide der Formel I können substituierte und unsubstituierte angewendet werden. Vertreter von substituierten Piperazincarbonsäureamiden können sein Cι-C4-Alkyl-substituierte wie z. B. 4-Methylpiperazincarbonsäureamid, H2N-CH2-substi- tuierte wie beispielsweise 4-Aminomethylpiperazincarbonsäureamid oder Acyl-substituierte wie 4-Acetylpiperazincarbonsäureamid. Vorzugsweise wird Piperazincarboxamid oder 4- Methylpiperazincarbonsäureamid verwendet. Die Enzyme für das zellfreie System können durch fachmännisch übliches Aufschliessen der Mikroorganismen gewonnen werden. Hierzu kann beispielsweise die Ultraschall-, French-Press oder Lysozym-Methode verwendet werden. Diese zellfreien Enzyme können auch auf einem geeigneten Trägermaterial immobilisiert werden.
Für das Verfahren besonders geeignet, sind die zuvor beschriebenen spezifischen Mikro¬ organismen der Gattung Burkholderia (DSM 9925), sowie deren funktionell aequivalente Varianten und Mutanten.
Die Biotransformation kann nach üblichem Anzüchten der Mikroorganismen mit ruhenden
Zellen (nicht wachsende Zellen, die keine Kohlenstoff- und Energiequelle mehr benötigen) oder mit wachsenden Zellen durchgeführt werden.
Als Medium für das Verfahren mit ruhenden Zellen können die facl männisch üblichen dienen, wie beispielsweise das zuvor beschriebene Mineralsalzmedium gemäss KuUa et al., 1983 (ibid), niedermolare Phosphatpuffer, HEPES-Puffer, oder das in Tabelle 1 beschriebene Medium. Für das Verfahren mit wachsenden Zellen wird üblicherweise ein Medium enthaltend eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle wie beispielsweise handelsübliche Medien oder das Medium gemäss Tabelle 1 angewendet. Vorzugsweise wird das Verfahren in dem Medium gemäss Tabelle 1 durchgeführt.
Zweckmässig wird die Biotransformation unter einmaliger oder kontinuierlicher Zugabe von entsprechendem (RS)-α-Piperazincarbonsäureamid so durchgeführt, dass die Konzentration an (RS)-α-Piperazincarbonsäureamid 20 Gew.%, vorzugsweise 10 Gew.%, nicht übersteigt.
Der pH- Wert des Mediums kann in einem Bereich von pH 5 bis pH 11, vorzugsweise von pH 6 bis pH 10, liegen.
Zweckmässig wird die Biotransformation bei einer Temperatur von 15 bis 55 °C, vorzugsweise von 20 bis 50 °C durchgeführt.
Nach einer üblichen Umsetzungszeit von 1 bis 100 h ist das R-α-Piperazincarbonsäureamid der Formel I vollständig zur R-α-Piperazincarbonsäure umgewandelt, wobei auch S-α- Piperazincarbonsäureamid anfallt. Die auf diese Weise gewonnene R-α-Piperazincarbonsäure und / oder das S-α-Piperazincarbon¬ säureamid können durch übliche Aufarbeitungsmethoden wie z. B. durch Ansäuern, Elektrodialyse, Chromatographie oder Extraktion isoliert werden. Das isolierte S-α- Piperazincarbonsäureamid kann dann chemisch zur S-α-Piperazincarbonsäure hydrolysiert werden.
Beispiele:
Beispiel 1
a) Isolation von Mikroorganismen, die befähigt sind racemisches Piperazincarboxamid als einzige Stickstoffquelle zu verwerten:
Für die Isolation von Mikroorganismen, die befähigt sind, racemisches Piperazinamid als einzige Stickstoffquelle zu verwerten, wurde das A-N-Medium, dessen Zusammensetzung in Tabelle 1 gegeben ist, verwendet. 100 ml dieses Mediums wurden in einen 300 ml Erlenmeyerkolben gegeben und mit verschiedenen Erdproben (2 g) aus dem Werksareal der LONZA AG in Visp, Schweiz versetzt. Die Kolben wurden ruhend bei 30 °C während 5 Tagen inkubiert. Dann wurde 1 ml des A-N-Mediums verwendet, um einen frischen
Kolben mit dem gleichen Medium zu beimpfen. Dieser Kolben wurde wiederum unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Insgesamt wurde dieser Anreicherungszyklus 5mal wiederholt. Danach wurden die Anreicherungen auf Agar-Medium (A-N-Medium mit zusätzlich 16 gH Agar) zu Einzelkolonien ausgestrichen. Die isolierten Mikroorganismen wurden im folgenden qualitativen Testsystem auf stereoselektive Amidasen hin untersucht. Einzelkolonien wurden verwendet, um 100 ml A- N-Medium in 300 ml Erlenmeyerkolben zu beimpfen. Diese Kolben wurden drei Tage auf einer Schüttelmaschine bei 30 °C inkubiert, wobei die Kulturen bereits nach einem Tag ausgewachsen waren. Danach wurden die zellfreien Kulturüberstände mittels Dünn- Schichtchromatographie (Kieselgel, Laufmittel: 11 Teile Ethanol, 6 Teile CHCI3, 6 Teile
NH4OH (25%), Nachweis mittels Ninhydrin) auf den Gehalt an Piperazincarbonsäure und Piperazincarboxamid hin untersucht. Mikroorganismen, die etwa die Hälfte der einge¬ setzten Menge (RS)-Piperazincarboxamid umgesetzt hatten, wurden für biochemische Untersuchungen verwendet, um festzustellen, welche Stämme R-spezifische Amidasen enthielten. b) Biochemische Untersuchungen zur Identifizierung von Mikroorganismen mit R- spezifischen Amidasen:
Zur Herstellung von Protein-Rohextrakt wurden die Zellen in 11 A-N-Medium bei 30 °C angezogen und anschliessend geerntet und gewaschen. 5 g Zellen (Nassgewicht) wurden in
10 ml 69 mmol Phosphatpuffer, pH 7,0, resuspendiert und mittels einer FRENCH®-Presse aufgeschlossen. Der Rohextrakt wurde nach einer Zentrifugation von 2 h bei 40O00 x g in Portionen bei -20 °C eingefroren. Zur Bestimmung der Stereoselektivität wurden die Hydrolyseraten von R-Prolinamid und S-Prolinamid verglichen. Dazu wurde folgender Enzymtest verwendet: Assayvolumen 1 ml, enthaltend 69 mmol Phosphatpuffer, pH 7,0,
100 - 800 μg Protein-Rohextrakt, 2 mg S- resp. R-Prolinamid-HCl, Inkubationszeit 1 -24 h, Inkubationstemperatur 30 °C, Detektion mit Ninhydrin nach Dünnschichtchromatographie (siehe oben). Die Amidase des Stammes mit der Bezeichnung DSM 9925 zeigte eine schnelle Hydrolyse von R-Prolinamid. Dieser Stamm wurde für die Herstellung optisch aktiver Piperazincarbonsäurederivate verwendet.
Durch Veränderung der Inkubationstemperatur und des pH- Wertes der Assay-Lösung wurde festgestellt, dass die spezifische Aktivität der Amidasen zwischen einer Temperatur von 30 - 60 °C und einem pH-Wert von 7 - 10 am grössten war.
Tabelle 1
A-N-Medium
Zusammensetzung Konzentπ
(RS)-Piperazinamid 2000
Glycerin 10000
Hefeextrakt 500
Na2S04 100
Na2HPθ4 2000
KH2PO4 1000
NaCl 3000
MgCl2x6H2O 400
CaCl2x2H2O 14,5
FeCl3x6H2O 0,8 ZnSθ4χ7H2θ lOOxlO"3
H3BO3 300x10-3
CoCl2x6H2O 200x10-3
CuCl2x2H2O 10x10-3
NiCl2x6H2O 20x10-3
NaMoO x2H O 30x10-3
Beispiel 2
Herstellung von R-Piperazincarbonsäure:
Für die Herstellung von R-Piperazincarbonsäure mit den Stämmen mit der Bezeichnung DSM 9925 wurden folgende Bedingungen gewählt.
Die Zellen wurden im A-N-Medium (Tabelle 1) angezogen und dann lmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Nach Resuspendieren in 69 mM Phosphatpuffer, pH 8,0 und Einstellen einer Zelldichte von 10 bei OD650 wurde bei einer Temperatur von 47 °C 20 gH (RS)-Piperazincarboxamid hinzugegeben. Dann wurde 18 h lang inkubiert (Totalvolumen:
200 ml, 31 mmol (RS)-Piperazincarboxamid (4 g)). Nach dem Entfernen der Zellen wurde die zellfreie Lösung unter reduziertem Druck auf 20 ml konzentriert und dann mit HC1 auf ca. pH 0 angesäuert, wobei das Produkt ausfiel. Die isolierte Säure wurde in 0,1 M HC1 umkristallisiert und getrocknet. Es wurden 1,38 g (6,8 mmol) R-Piperazincarbonsäure als Dihydrochlorid isoliert, entsprechend einer Ausbeute von 44% bezogen auf die eingesetzte Menge R-Amid im (RS)-Piperazincarboxamid. Der ee-Wert, d.h. die Enantiomerenreinheit, war größer als 99% nach Derivatisierung mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-ß-D-glucopyranosylisothiocyanat, gemessen mittels Kapillar-Elektrophorese.
Tabelle 2
Kapillar-Elekrophorese Bedingungen
CE Apparatur: Hewlett-Packard HP DCE
Detektor: Hewlett-Packard Diode-Array-Detektor Puffer: 10 mM Di-Natriumhydrogenphosphat, 10 mM Borsäure,
150 mM Natriumdodecylsulfat, pH 9,0 Elektrolyt: 900 ml Puffer plus 100 ml Methanol Kapillare: HP Gl 600-61211 Elektrisches Feld: 20 kV Strom: ca. 24 - 30 μA
Ofentemperatur: 20 °C Detektoreinstellung : 210 nm (Bandbreite 5 nm) Migrationszeit: ca. 17,1 min (S-Säure) ca. 17,7 min (R-Säure)

Claims

Patentansprüche:
Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß sie befähigt sind, in (RS)-α-Piperazincar- bonsäureamiden, gegebenenfalls substituiert, der Formel
das R-α-Piperazincarbonsäureamid, gegebenenfalls substituiert, in die entsprechende R- α-Piperazincarbonsäure, gegebenenfalls substituiert, der Formel
zu überführen.
2. Mikroorganismen nach Anspruch 1 der Gattung Burkholderia, insbesondere wie hinterlegt unter der Nr. DSM 9925, sowie deren funktionell äquivalente Varianten und Mutanten.
3. Verfahren zur Herstellung von R-α-Piperazincarbonsäuren, gegebenenfalls substituiert, der Formel
und/oder von S-α-Piperazincarbonsäureamiden, gegebenenfalls substituiert, der Formel
dadurch gekennzeichnet, daß man in einem (RS)-α-Piperazincarbonsäureamid, gegebenenfalls substituiert, der Formel
das R-α-Piperazincarbonsäureamid mittels der Mikroorganismen gemäß Anspruch 1 oder mittels zellfreier Enzyme aus diesen Mikroorganismen zur entsprechenden R-α-Piperazin¬ carbonsäure umsetzt und dieses und/oder das bei dieser Biotransformation neben der R- α-Piperazincarbonsäure anfallende S-α-Piperazincarbonsäureamid isoliert.
4. Verfahren nach Patentanspruch 3 , dadurch gekennzeichnet, daß man die Biotransformation mittels Mikroorganismen der Gattung Burkholderia, insbesondere wie hinterlegt unter der Nr. DSM 9925, oder mit deren funktionell äquivalenten Varianten und Mutanten oder mit zellfreien Enzymen aus diesen Mikroorganismen durchführt.
5. Verfahren nach mindestens einem der Patentansprüche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Biotransformation unter einmaliger oder kontinuierlicher Zugabe des (RS)- α-Piperazincarbonsäureamids durchführt, so daß die Konzentration an (RS)-α-Piperazincar- bonsäureamid im Kulturmedium 20 Gew.-% nicht übersteigt.
6. Verfahren nach mindestens einem der Patentansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Biotransformation bei einem pH- Wert von 6 bis 10 und bei einer Temperatur von 15 bis 55° C durchführt.
EP96915025A 1995-05-08 1996-05-07 Biotechnologisches verfahren zur herstellung von r-alpha-piperazincarbonsäure und s-alpha-piperazincarbonsäureamid Withdrawn EP0826032A1 (de)

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