JPH11508761A - Ｒ−α−ピペラジンカルボン酸およびＳ−α−ピペラジンカルボキサミドを製造する生物工学的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規な微生物が、単一の窒素源として、一般式（Ｉ）のピペラジン−α−カルボン酸アミドの、ラセミ体または光学活性な異性体の形態のものを資化することができ、かつ、上記一般式（Ｉ）のピペラジン（ＲＳ）−α−カルボン酸アミドを、一般式（II）のピペラジンＲ−α−カルボン酸に転換する能力を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｒ−α−ピペラジンカルボン酸およびＳ−α−ピペラジンカルボキサミド を製造する生物工学的方法 本発明は、場合によっては置換されている、一般式 の（ＲＳ）−α−ピペラジンカルボキサミド中において、Ｒ−α−ピペラジンカ ルボキサミドを、対応する、場合によっては置換されている、一般式 のＲ−α−ピペラジンカルボン酸に転化する能力を有する、新規な微生物に関す る。 この微生物は、上記の一般式Ｉの、場合によっては置換されているα−ピ ペラジンカルボキサミドの、ラセミ体の形態の、または場合によっては光学活性 な形態の異性体とくにＲ−α−ピペラジンカルボキサミドを、唯一の窒素源とし て資化する能力を有する。 この微生物またはその細胞を含まない酵素は、場合 によっては置換されているＲ−α−ピペラジンカルボン酸（式II）の製造、およ び（または）場合によっては置換されている、式 のＳ−α−ピペラジンカルボキサミドの製造のための、新規な方法に利用するこ とができる。 式IIのＲ−α−ピペラジンカルボン酸は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテートの 選択的拮抗剤である（Ｒ）−２−カルボキシ−４−（３−フォスフォノプロピル ）ピペラジン製造の重要な中間体である。［Ｓｙｎｌｅｔｔ，1996，143-144］ Ｒ−α−ピペラジンカルボン酸を製造する微生物学的方法は、今日まで文献に 記載されたことがない。 本発明の目的は、光学的に純粋なＲ−α−ピペラジンカルボン酸を製造する方 法であって、同時にＳ−α−ピペラジンカルボキサミドを高い純度で単離するこ とを可能にする、簡単で、かつ技術的に容易に実施できる方法を提供することに ある。 この目的は、請求の範囲第１項に記載の微生物によって、また請求の範 囲第３項に記載の方法によって、達成することができる。 本発明で使用する微生物は、土壌、スラッジまたは排水のサンプルから、常用 の微生物学的手法によって分離することができる。 本発明に従えば、それらの 微生物は下記のような方法で単離することができる： ａ）場合によっては置換されているα−ピペラジンカルボキサミド（式Ｉ）のラ セミ体または光学活性な異性体を唯一の窒素源として、好ましくはＲ−α−ピペ ラジンカルボキサミドを唯一の窒素源として、適当な炭素源とともに、培地中で 常法に従って成育させること、および ｂ）（ＲＳ）−α−ピペラジンカルボキサミド（式Ｉ）中で安定であり、かつ、 Ｒ−α−ピペラジンカルボキサミドを対応するＲ−α−ピペラジンカルボン酸（ 式II）に変換することができるものを、成育によって得た培養物から選択するこ と。 したがって、Ｒ−ピペラジンカルボキサミダーゼを特定的に含有する、すべて の微生物を使用することができるであろう。 成育の基質として微生物が資化することのできる炭素源の例は、糖、糖アルコ ールまたはカルボン酸である。 使用できる糖の例は、グルコースのようなヘキ ソースであるか、またはペントースである。 使用できるカルボン酸は、ジ−ま たはトリ−カルボン酸、たとえばクエン酸もしくはコハク酸、またはそれらの塩 である。 使用できる糖アルコールは、たとえばグリセロールである。 グリセ ロールのような糖アルコールが、炭素源として好ましく使用できる。 使用できる選択および成育の培地は、当業者の間で通常使用されているもの、 たとえばクラほかによる鉱物塩培地［Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，135,1- 7,1983］または表１に記載のものである。 表１に記載の培地を使用することが 好ましい。 微生物の成育段階および選択段階において、有効な酵素を誘導することが有利 である。 酵素インダクターとしては、ピペラジンカルボキサミドが使用できる 。 成育段階および選択段階は、温度約１５〜５５℃、好ましくは２０〜４５℃に おいて、またｐＨはｐＨ５〜ｐＨ１１の間で、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ１０の間 で実施することが有利である。 とくに高いＲ−ピペラジンカルボキサミド活性を有する好ましい微生物は、ブ ルコルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の微生物、ならびにその機能的に 等価な変異種および突然変異種である。 とりわけ好ましい微生物は、ブルコル デリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する、１９９５年４月２０日にドイ チェ・ザンムルング・フォン・ミクロオーガニスメン・ウント・ツェルクルトウ ーレン（マシェローダ・ヴェク１ｂ，Ｄ−３８１２４，ブラウンシュヴァイク） にブダペスト条約に従って寄託された微生物、ならびにその機能的に等価な変異 種および突然変異種である。 ブルコルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の微生物（ＤＳＭ９９２５） の分類学的特徴 細胞の形状 杆菌 幅 μｍ ０．７−０．８ 長さ μｍ １．５−３．５ グラム反応 − ３％ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ（Cerny） ＋ 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 色素 黄色 成長 嫌気的 − ＰＮＰＧ ＋ ＡＤＨ − ウレアーゼ − ゼラチンの加水分解 − 基質の資化 アジピン酸塩 ＋ クエン酸塩 ごくわずか マレイン酸塩 ＋ グルコース − アドニトール − マンニトール − 基質 ＋ 略 号 アセトアミド ＋ ２，３−ブチレングリコール ＋ ＰＮＰＧ：ｐ−ニトロフェニル ｍ−ヒドロキシベンゾエート ＋ ガラクトシダーゼ α−アミラミン ＋ ＡＤＨ： アルコールデヒドロジェ トリプタミン − ナーゼ 「機能的に等価な変異種および突然変異種」の語は、祖先の微生物と、同じ特 性と機能とを有する微生物を意味する語として理解すべきである。 そのような 変異種および突然変異種は偶発的に、たとえばＵＶ照射によって形成することが できる。 式 の、場合によっては置換されているＲ−α−ピペラジンカルボン酸、および（ま たは）、式 の、場合によっては置換されているＳ−α−ピペラジンカルボキサミドを製造す るための本発明の方法は、式 の、場合によっては置換されている（ＲＳ）−α−ピペラジンカルボキサミドを 、上述した特別の能力を有する微生物またはその細胞を含まない酵素を使用して 、対応する（ＲＳ）−α−ピペラジンカルボン酸に転換し、単離することからな る。 このバイオ転換は、Ｒ−α−ピペラジンカルボン酸を与えるだけでなく、Ｓ− α−ピペラジンカルボン酸をも与えるものであって、所望であれば、それを単離 することによって実施することができる。 出発物質の、式 の、（ＲＳ）−α−ピペラジンカルボキサミドであって、場合によっては置換さ れているものは、対応する芳香族アミドから、当業技術において常用されている 水素化によって得ることができる。 使用する式Ｉのピペラジンカルボキサミドは、置換されているものであっても よいし、置換されていないものであってもよい。 置換されているピペラジンカ ルボキサミドの代表的な例は、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル置換体たとえば４−メチルピペ ラジンカルボキサミド、Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂置換体たとえば４−アミノメチルピペラジ ンカルボキサミド、またはアシル置換体たとえば４−アセチルピペラジンカルボ キサミドである。 ピペラジンカルボキサミドまたは４−メチルピペラジンカル ボキサミが好適に使用される。 細胞を含まないシステムのための酵素は、この技術において常用されている方 法で、微生物をすり潰すことによって得られる。 使用できる技術は、たとえば 、超音波、フレンチプレスまたはリゾチーム法である。 これらの細胞を含まな い酵素は、適当な担持体に固定して使用することもできる。 本発明の方法にとってとくに好適な微生物は、上記したブルコルデリア属に属 する特定の微生物（ＤＳＭ９９２５）、およびその機能的に等価な変異種および 突然変異種である。 常法に従って微生物を成長させたのち、休眠細胞（炭素およびエネルギー源を それ以上要求せず、成長していない細胞）または成長しつつある細胞を用いて、 バイオ転換を行なうことができる。 休眠細胞を用いて行なう方法に使用できる培地は、当業技術において常用され ているもの、たとえば前記したＫｕｒａ ｅｔ ａｌの鉱物塩培地１９８３（前掲 書）、低分子量リン酸塩緩衝溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液、または表１に記載した 培地である。 成長しつつある細胞を用いて行なう方法に使用できる培地は、通 常、炭素および窒素の源を有するもの、たとえば市場で入手できる培地、または 表１に記載の培地である。 本発明の方法は、好ましくは表１の培地を用いて実 施する。 バイオ転換は、（ＲＳ）−α−ピペラジンカルボキサミドを一回だけ添加する か、または（ＲＳ）−α−ピペラジンカルボキサミドの量が２０％。好ましくは １０％を超えないように、連続的に添加をすることによって好都合に行なうこと ができる。 培地のｐＨは、ｐＨ５からｐＨ１１の範囲にあればよいが、ｐＨ６からｐＨ１ ０の範囲にあることが好ましい。 バイオ転換は、１５から５５℃の温度で、好ましくは２０から５０℃の温度で 実施する。 通常の反応時間である１ないし１００時間ののち、式ＩのＲ−α−ピペラジン カルボキサミドのすべてが、Ｒ−α−ピペラジンカルボン酸に転換されており、 この過程で、Ｓ−α−ピペラジンカルボキサミドもまた得られる。 このようにして得られるＲ−α−ピペラジンカルボン酸および（または）Ｓ− α−ピペラジンカルボキサミドは、常用の処理方法で、たとえば酸の添加、電気 透析、クロマトグラフィーまたは抽出によって、単離することができる。 単離 されたＳ−α−ピペラジンカルボキサミドは、化学的に加水分解してＳ−α−ピ ペラジンカルボン酸を得ることができる。 【実施例】 ［実施例１］ ａ）ラセミ体のピペラジンカルボキサミドを唯一の窒素源として資化することが できる微生物の単離 ラセミ体のピペラジンカルボキサミドを唯一の窒素源として資化することがで きる微生物の単離に使用した培地は、組成を表１に示したＡ−Ｎ培地であった。 この培地１００mlを容量３００mlのエルレンマイヤーフラスコに入れ、スイス 国ヴィスプのロンザＡＧの工場の構内から採取した種々の土壌サンプル（２ｇ） で処理した。 フラスコを５日間、３０℃で、動かさずに培養した。 ついで、 １mlのＡ−Ｎ培地を接種のために使用して、新しいフラスコに同じ培地を入れた 。 このフラスコを再び、同じ条件で培養した。 このような富化サイクルを、合 計で５回繰り返した。 その後、富化した培養物を寒天培地（Ａ−Ｎ培地で付加 的に１６gl^-1の寒天を含有する）上に注ぎ、単一のコロニーを形成させた。 単離された微生物を、次のような立体選択的なアミダーゼのための定性的な試 験にかけた。 すなわち、まず３００mlのエルレンマイヤーフラスコ中の１００ mlのＡ−Ｎ培地に、単一のコロニーを接種した。 これらのフラスコを３日間、 シェーカー上、３０℃で培養した。 培養物は、１日あたりは少量であるが、こ の間に十分に成長した。 それから、細胞を含まない培養物上澄みをとり、ピペ ラジンカルボン酸およびピペラジンカルボキサミドに対する挙動を、薄層クロマ トグラフィー（シリカゲル、移動層：１１部のエタノール、６部のＣＨＣｌ₃、 ６部のＮＨ₄ＯＨ（２５％）、ニンヒドリン検出）により試験した。 （ＲＳ） −ピペラジンカルボキサミドの当初の量の約半分と反応した微生物を、生化学的 試験に使用して、どの株がＲ−特異性アミダーゼを含有しているかを確認した。 ｂ）Ｒ−特異性アミダーゼを用いた微生物同定のための生化学的試験 粗製のタンパク質抽出物を調製するため、細胞を１リットルのＡ−Ｎ培地中、 ３０℃で成育させ、ついで収穫し、乾燥した。 ５ｇの細胞（新鮮物の重量）を １０mlの６９mMリン酸塩緩衝溶液、ｐＨ７．０、に再度懸濁させ、フレンチプレ ス(R)を用いて潰した。 粗製の抽出物を２時間、４０，０００ｘＧで遠心分離 にかけ、ついで小分けして−２０℃で凍結させた。 立体選択性を測定するため 、Ｒ−プロリンアミドおよびＳ−プロリンアミドの加水分解速度を比較した。 この目的のために、次の酵素試験を行なった。 すなわち、試験容積１ml、６９ mMリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．０）、１００〜８００μgのタンパク質粗製物お よび２mgのＳ−またはＲ−プロリンアミド塩酸塩を含有、培養時間１〜２４時間 、培養温度３０℃、薄層クロマトグラフィー（上記を参照）後、ニンヒドリン検 出。 ＤＳＭ９９２５の番号を与えた株のアミダーゼが、Ｒ−プロリンアミドの速や かな加水分解を示した。 この株を、光学活性なピペラジンカルボン酸誘導体の 製造に使用した。 溶液の培養温度およびｐＨを変化させることにより、温度３０〜６０℃の間、 かつｐＨ７〜１０の間で、アミダーゼの特定的な活性が最高になることがわかっ た。 ［実施例２］ Ｒ−ピペラジンカルボン酸の製造 ＤＳＭ９９２５の番号を与えた株を使用して行なうＲ−ピペラジンカルボン酸 の製造に、下記に条件が選ばれた。 細胞をＡ−Ｎ培地（表１）で成長させ、生理食塩水で１回洗浄した。 ６９mM リン酸塩緩衝溶液、ｐＨ８．０、に再懸濁させ、細胞密度をＯＤ₆₅₀において１ ０に調整したのち、２０gl^-1の（ＲＳ）−ピペラジンカルボキサミドを、温度４ ７℃で添加した。 このバッチを１８時間培養した（全容積：２００ml、３１mm olの（ＲＳ）−ピペラジンカルボキサミド＝４ｇ）。 細胞を除去した後、細胞 を含まない溶液を減圧下に２０mlに濃縮し、ついで塩酸を加えてｐＨをほぼ０に したところ、生成物が析出した。 単離された塩を０．１Ｍ−ＨＣｌから再結晶 し、乾燥した。 １．３８ｇ（６．８mmol）のＲ−ピペラジンカルボン酸が、ジ 塩酸塩として単離され、これは、（ＲＳ）−ピペラジンカルボキサミド中にあっ た当初のＲ−アミドの量を基準にして４４％の収率に相当する。 ２，３，４， ６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアネートを用 いて誘導体化したのち、ｅｅ値すなわちエナンチオマーの純度を毛細管電気泳動 により測定したところ、９９％を超えていた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハインツマン，クラウス スイス国 ＣＨ−3932 ヴィスパーターミ ネン ウンターシュタルデン（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．場合によっては置換されている、式 の（ＲＳ）−α−ピペラジンカルボキサミド中において、場合によっては置換さ れているＲ−α−ピペラジンカルボキサミドを、対応する、場合によっては置換 されている、式 のＲ−α−ピペラジンカルボン酸に転換する能力を有する微生物。 ２．請求の範囲第１項の微生物であって、ブルコルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄ ｅｒｉａ）属の微生物、とくに寄託番号ＤＳＭ９９２５をもって寄託されている 微生物およびその機能的に等価な変異種および突然変異種である微生物。 ３．場合によっては置換されている、式 のＲ−α−ピペラジンカルボン酸、および（または）場合によっては置換されて いる、式 のＳ−α−ピペラジンカルボン酸を製造する方法であって、場合によっては置換 されている、式 の（ＲＳ）−α−ピペラジンカルボキサミド中で、Ｒ−α−ピペラジンカルボキ サミドを、請求の範囲第１項の微生物またはその微生物からの細胞を含まない酵 素を使用して転換することにより、対応するＲ−α−ピペラジンカルボン酸とし 、それを単離すること、および（または）この生物学的変換においてＲ−α−ピ ペラジンカルボン酸に加えて得られる、Ｓ−α−ピペラジンカルボン酸を単離す ることを特徴とする方法。 ４．請求の範囲第３項の方法であって、ブルコルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅ ｒｉａ）属の微生物、とくに寄託番号ＤＳＭ９９２５をもって寄託されている微 生物またはその機能的に等価な変異種もしくは突然変異種、またはこれらの微生 物から得た細胞を含まない酵素を使用して、バイオ転換を実施することを特徴と する方法。 ５．請求の範囲第３項または第４項のいずれかの方法であって、（ＲＳ）−α −ピペラジンカルボキサミドを１回に、または連続的に添加して、培養培地中の （ＲＳ）−α−ピペラジンカルボキサミドが２０重量％を超えないようにして、 バイオ転換を実施することを特徴とする方法。 ６．請求の範囲第３項ないし第５項のいずれかの方法であって、６〜１０の間 のｐＨと、１５〜５５℃の温度においてバイオ転換を実施することを特徴とする 方法。