Die Erfindung ist im vorstehenden Patentanspruch zusammengefaßt-
Von den Verfahren zur Herstellung von !.-Asparaginsäure
aus Fumarsäure bedienen sich die meisten entweder nicht in reproduzierbarer Weise herstellbarer
und/oder kostspieliger Ausgangsmateriaüen und sind sehr kompliziert.
N.ur diejenigen Verfahren, die auf eine Bioumwandlung
zurückgreifen, sind zur Durchführung in industriellem Maßstäbe anwendbar. Jedoch sind al!e bisher
bekannt gewordenen Verfahren mit dem Nachteil behaftet, ciaß die Reaktionsgeschwindigkeiten gering sind,
wobei ihre Durchführung kostspielig ist, so daß sie nur insoweit durchgeführt wurden, als sie zur Herstellung
von Produkten führten, die in der Pharmazie eingesetzt
werden.
Die Verwendung von Asparaginsäure als Ausgangsverbindung
zur Synthese von verschiedenen Peptiden erschließt dieser Aminosäure sehr interessante Absatzmöglichkeiten.
Dies erfordert jedoch für eine Durchführung in industriellem Maßstabe die Verfügbarkeit einer
sehr reinen Asparaginsäure, die sich unter wirtschaftlichen
Bedingungen herstellen läßt.
Die zur Herstellung von Aminotransferase, weiche für
die Umwandlung von Fumarsäure in L-Asparaginsäure erforderlich ist. geeignetsten Mikroorganismen erfordern
for ihr Wachstum ein komplexes Kulturmedium, das neben einer Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff Quellen
für organischen Stickstoff enthält, gewöhnlich Proteinhydrolysate, welche Ausgangsmaterialien mit einer
nicht-konstanten Zusammensetzung sind, die relativ teuer sind. Aufgrund dieser Tatsache können d'e
bekannten Verfahren, welche diese Mikroorganismen verwenden, als sehr komplex und wenig geeignet für eine
industrielle Herstellung angesehen werden. Ein bekanntes Verfahren, das einen Mikroorganismus dieses Typs
verwendet und die vorstehend geschilderten Nachteile aufweist, wird in der FR-FS 13 94 722 beschrieben. Dabei
erfolgt die Bioumwandlung der Fumarsäure durch Pseudomonas
trifolil. Dieser Mikroorganismus wird in einem aus Glukose and Pepton bestehenden Nährmedium
{»MILKI«) gezüchtet. Die bei 37" C erfolgende Umwandlung
in neutralem Medium verläuft sehr langsam.
Ls wurde nunmehr ein neuer Mikroorganismus der Familie Pseudomonacees gefunden, welchem nicht mehr
die vorstehend geschilderten Nachteile anhaften. Dieser Mikroorganismus vermag unter Einsatz billiger Mittel die
Bioumwandlung von Fumarsäure in L-Asparaginsäure mit beträchtlichen Geschwindigkeiten zn bewirken,
ίο wobei diese Oschwindigkeiten größer sind als die der
vorstehend beschriebenen Verfahren. Die erhaltenen Ausbeuten sind sehr hoch, wobei sich das Produkt mit
einem hohen Reinheitsgrad in einfacher Weise extrahieren Iäß·-
Dieser Mikroorganismus wurde in Frankreich bei Nesle im Departement Somme (80) aus flüssigen Abwässern
einer Anlage isoliert, in der aus Zuckerrüben Zucker hergesieTIt wird. Lr gehört zur Gattung Pseudoraonas.
ττπϊΒ jedoch als neu angesehen werden, da er sich von
den Bakterien dieses Typs durch eine oder mehrere reproduzierbare und stabile Eigenschaften gemäß den
Kriterien unterscheidet, die in der Auflage von 1967 von
»BERGEVS MANUEL« beschrieben sind. Der Stamm wurde zuerst PO 71H genannt und unter der Nummer
ATCC 21973 hinterlegt bei der American Type Culture Collection.
Die Isolation des Mikroorganismus kann unter folgenden
Bedingungen sowie unter Einhaltung, der nachfolgend beschriebenen üblichen Isolaiions- und Reinigungsmethoden durchgeführt werden.
0.1-ml-Proben des Abflusses einer Fabrik, in der Zukker
aus Zuckerrüben hergestellt wird, werden in einer Petri-Sehale ausgebreitet, die ein festes Agar-Agar-Medium
A der folgenden klassischen Zusammensetzung enthält:
Rindfleischextrakt |
20 g/l |
Pepton |
20 g/l |
Glukose |
4 g/i |
NaO |
5 g/I |
Agar-Agar |
15 g/l |
Die Inkubation erfolgt bei ungefähr 30° C. Nach 24- bi~
30stündiger Inkubation stellt man das Auftreten von zahlreichen Kolonien fest.
Jede dieser Kolonien wird entfernt, um durch Ausbreiten auf dem vorstehend geschilderten Medium sowie
unter den angegebenen Bedingungen gerenigt zu werden.
Eine mikroskopische Untersuchung reicht aus, um die so morphologische Homogenität der Bakterien einer jeden
isolierten und gereinigten Pseudomonas-Kolonie zu bestätigen.
Die auf diese Weise erhaltenen Stämme im Zustand einer Reinkultur werden auf dem vorstehend beschriebenen
Α-Medium konserviert, und zwar in einem Reagensglas,
das in schiefer Position abgekühlt worden ist.
Abschließend werden die Stämme auf ihre Fähigkeit untersucht, L-Asparaginsäure zu erzeugen, und zwar
durch Züchten in einem Substrat, das Fumarsäure enthält. Die folgende Vergleichstabelle zeigt die Produkiiorüiäiiigkeii
von 3 Pscüdöinunas-Stärnrnen, die während
des gleichen Abtrennverfahrens Isoliert worden sind.
Züchtungsdauer des Mikro |
36 |
14 |
178 |
36 |
organismus in Stunden |
|
|
|
|
Gehalt an Fumarsäure |
|
115 |
|
|
zur Startzeit, g/l |
|
|
|
|
Ausmaß der Bioumwand |
|
|
|
|
lung nach 5täg!ger Bio |
|
|
|
|
umwandlung (in %) |
O |
|
O |
O |
Stamm: |
I |
|
7 |
3 |
PO 205 |
O |
O |
O |
O |
ATCC 21973 (Erfindung) |
4 |
|
PO 91 |
O |
|
|
|
|
|
18 ' 24
115 178 36 115 Ϊ78
III Ul
5 6 3 6 0
6 0 0 0 0
Im Gegensatz zu den bisher bekannten anderen Mikroorganismen,
die als Aminotransferase-Erzeuger eingesetzt worden sind, kann sich der erfindungsgemäße
Stamm in einem einfachen Medium entwickeln, das sich beispielsweise im wesentlichen aus den Rückständen der
Zuckerextraktion zusammensetzt, d. h. aus Rübenzukker- oder Rohrzucker-Melassen, die mit einem mineralischen
Phosphorzusatz versehen worden sind, beispielsweise in Form eines Phosphats oder in Form von Phosphorsäure,
sowie einen Stickstoffzusatz erhalten haben, beispielsweise in Form von Harnstoff und Ammoniak,
wobei ferner einige Oligoelemente zugeseut worden sind.
Das folgende Beispiel zeigt die Speziizität d^s Stammes
für ein derartiges Medium. Die eingehaltene Methode zu ihrer Ermittlung besteht einesteils in der
Dosierung des spezifischen Enzyms in dem Medium und andererseits in dem Messen der Umwandlungsgeschwindigkeit:
Fumarsäure -
- -> L-AsparagirisäV.re
Versuch Nr. 1
Es werden parallel zwei Kulturmedien hergestellt, welche die folgenden Zusammensetzungen besitzen:
Künstliches Medium (Medium I)
Glukose 60 g/l
25
Macerisierungsflüssigkeit von Mais 40 g/l
MgSO4 - 7H2O 0,5 g/l
Monokaiiumphosphat 5 g/l
Fumarsäure 1 g/l
Melassemedium (Medium 2)
Melasse, ausgedrückt 60 g/I
als Gesamtzucker
Monokaliumohosphat 5 g/l
MgSO4 - 7H2O 0,5 g/l
Harnstoff 8 g/I
Nach einem Sterilisieren des Mediums durch Erhitzen während einer Zeitspanns von 20 Minuten auf 121° C
wird der pH auf 7 bis 7,2 eingestellt. Dazu wird gasförmiges Ammoniak unter sterilen Bedingungen verwendet.
Anschließend wird jedes Medium mit einer Salzsuspension des Stammes ATCC 21973 beimpft. Das Züchten
erfolgt in 6-1-PhioIen, die 1 1 des Mediums enthalten,
wobei ein Drehrührer verwendet wird.
Die Bakterienentwickiung wird durch Messen der optischen
Dichte nach einer Verdünnung auf das 20fache ermittelt. Die Entwicklung der Aminotransieraseaktivität
wird nach der Methode bestimmt, die in »Methods in enzymology« beschrieben wird.
dauer,
Std.
Medium 1
Bakterienpopulation/
ml
Aktivität, ausgedrückt in intern. Aminotransferase-Einheiten/1/Std.
Medium 2 |
Aktivität, ausgedrückt
in intern. Aminotrans-
ferase-Einheiten/1/Std |
Bakterienpopulation/
ml |
|
1 X 10« |
26 |
0,9 x 10' |
24 |
0,9 X 10'° |
32,6 |
1,1 X ΙΟ10 |
31,2 |
1,0 x 10'° |
|
I X 13»
0,8 x 109
1 X 10'°
1,1 X 10'°
1,1 X 10"»
18,8
10
19
18,8
Man kann feststellen, daß, falls die Bakterienerüwick- 6G
lung beinahe in den beiden Medien identisch ist, die
Aminotransferaseaktivitüteri dann um 50 bis 60"» erhöht
sind, wenn der Mikroorganismus In dem Medium 2
gezüchtet wird.
Ganz allgemein kann festgestellt werden, daß das zur a5
Erzeugung von Aminotransferase, welche die Fumarsäure
umwandelt, geeignetste Nährmedium etwa folgender Zusammensetzung entspricht:
15 bis 60 g/! zuckerhaltiger Melassen (ausgedrückt als Gssamlzucker), vorzugsweise 40 g/l, ausgedrückt
als Gesamtzucker
1 bis 4g/l Phosphorsäure oder Mlrieralphosphate
(ausgedrückt als Phosphorsäure), vorzugsweise 2 bis 2,6 g/l
0,1 bis I g/l Mg (ausgedrückt als Magnesiumsulfat),
vorzugsweise 0,4 bis 0,6 g/l Magnesiumsulfat
0,5 bis 10 g/l Fumarsäure, vorzugsweise 0,9 bis
Ug/J
Der pH des auf diese Weise erhaltenen wäßrigen Mediums wird auf 7 bis 8.5, vorzugsweise auf einen
Wert in der Nähe von 7, eingestellt.
Während der Züchtungszcitspanne. die zwischen 9
und 15 Stunden betragen kann und vorzugsweise /wischen 10 uad 12 Stunden schwankt, darf die Temperatur
38° C nicht übersteigen.
Desgleichen verhindert eine Temperatur unterhalb 25° C das Wachsen des Mikroorganismus. Eine optimale
Bakterienpopulalionsdichte wird bei 30° C erhallen.
Spuren an Oligoelementen können in ei .. Menge von
0 bis IO ppm entweder in Form von Salrt^i dem Züchtungsmedium
zugeseiit werden, oder man kann in der
Weise verfahren, daß man übli<-'p--^. n-chl-mineialisiertes
Wassej zusetzt, um das Ve!« ^:** des Mediums auf I 1
einzusteiien.
Die bisher verwendeten Ni.Aroorgan;smen besitzen die
Eigenschaft, daß das von ihnen erzeugte Enzym ihermolabil
und sehr gegenüber physikalisch/chemischen Einflüssen des Bioumwandlungsmediums empfindlich ist,
insbesondere gegenüber dem pH und der Temperatur.
Eine systematische Untersuchung des Stammes ATCC 21973 hat gezeigt, daß dieser Mikroorganismus in einem
Kulturmedium auf der Basis von Melassen ein Enzym anreichern kann, dessen Aktivität innerhalb breiter Verfahrensbedingungen
zur Bioumvandlung von Fumarsäure wirksam ist. Dies gilt insbesondere bezüglich der
Temperatur und des pH-Wertes.
Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, daß sin
Züchten des Stammes ATCC 21973 auf Melassen die Bildung eines Mediums zur Folge hat, weiches ein Enzym
enlhaft, das fur die Aminierung von Fumarsäure in L
Asparaginsäure verantwortlich ist, wobei seine Aktivität mit einer Erhöhung der Umwandlungstemperaiur
zunimmt- Die Aktivität entfallet sich innerhalb eines
Temperaturbereiches von 20 bis öG C. Gleichzeitig wurde festgestellt, daß eine Erhöhung des bei der Bioumwandlung
eingehaltenen pH-Wertes einen günstigen Einfluß auf die Umwandlungsgeschwinc'igkeit innerhalb
eines pH-Bereiches von 6 bis 12 ausübt.
Um den Einfluß dieser zwei Parameter ^uf die Bioumwandlungsgeschwindigkeit
χα untersuchen, wurde der Stamm ATCC 21973 auf einem Meiassenmedium. wie es
vorstehend unter Versuch Nr. 1 beschrieben worden ist. gezüchtet. Es wurden 10 i dieses Mediums zur Durchführung
eines jeden der nachfolgend beschriebenen Versuche hergestellt.
Versuch 2
20 Einfluß der Temperatur auf die Bioumwandlungs^es^hwjndigkeit
Zu 101 der hergestellten Kultur werd >n 2 kg Ammoniumfumarat
zugesetzt, nachdem der pH-Wen auf 8 und
die Temperatur auf den ausgewählten Wert eingestellt worden ist. Während der Umwandlung wird der pH
durch Zugabe von gasförmigem Ammoniak auf 8 gehaf ten.
Die Aktivität wird durch Dosierung nach der Methode gemessen, wie sie in «Methods in enzymology«. Band 13,
beschrieben wird, und zwar nach IiJündiger Reaktion
unter Rühren sowie anschließend alle Stunden während einer Zeitspanne von 4 Stunden. Der in der Tabelle angegebene
Wert entspricht dem Mittel von fünf auf diese Weise durchgeführten Messungen.
Bioumwandlungstemperatur, 0C
Aminotransferaseaktivität
30 37 40 50 57 60
0,01 0,05 0.07 0,08 0,J2 0,14 0,14
Man sieht,' daß die Aktivität beinahe Hnear mit der
Bioumwandlungstemperatur zwischen 20 und 50° C und dann etwas langsamer zwischen 50 und 60° C ansteigt,
wobei sie jedoch auch bei 60° C nicht zerstört ist.
Erfindungsgemäß wira daher die Bioumwandlung zwischen
30 und 60° C durchgeführt, vorzugsweise zwischen 50 und CJ" C und insbesondere zwischen 55 und 57° C,
da die optimale Temperatur bei 55 bis 57° C zu liegen scheint.
Versuch 3
Einfluß des pH au! die Bioumwandlungsgeschwindigkeit
Es werden die gleichen Melassenmedien-Fraktionen
pH des Mediums während 7 7,5
der Bioumwandlung
α M:«A*,— ..r.» 1.«:..:«::» η n-i λ ι ι λ '
wie bei der Durchführung des Versuchs 2 verwendet. Die
Fraktionen von 10 1 werden in ein Gefäß gegeben, das mit einem Rührer versehen ist, und auf 57° C Gehalten.
Nachdem 2 kg Diammoniumfumarat zugesetzt worden sind, wird die Bicumwandlungsgeschwindigkeit in der
gleichen Welse wie bei der Durchführung des Versuchs 2
verfolgt.
Die in der folgenden Tabelle angegebenen Werte steilen das Mittel von fünf aufeinanderfolgend durchgeführten
Messungen dar (vgl. Versuch 2).
S.5
9,5
in mMoI/1/Stunde
Es ist darauf hinzuweisen, daß oberhalb eines pH von
8,75 das Medium dazu neigt. Ammoniak freizusetzen. Urn einen Amrnoniakverlust zu vermeiden, wird das ~
Gefäß unter einem leichten Druck gehalten.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Geschwindigkeit proportional zu dem pH zwischen 7 und 8,75 und dann langsam
zwischen 8,75 und 9,50 ansteigt und sfch dann oberhalb
dieses Werlos stabilisiert. Daher wird erflndungsgemaß
die Bioumwandlung !n vorteilhafter Weise bei
einem pH zwischen 8,5 und 10 und am besten zwischen 9 und 9,5 durchgeführt.
Eine Untersuchung des Einflusses der Konzentration des umzuwandelnden Substrats, d. h. der Fumarsäure,
hai gezeigt, daß die iJmwanrJiüngsgcschwindJgkeii am
günstigsten ist, wenn der Gehalt an Fumarsäure in dem Medium !n der Nähe von !0% liegt; die Geschwindigkeit
wird jedoch nicht durch den Gehalt an gebildeter·
L-Asparaginsütre (innerhalb der Sättigungsgrenzen der Lösung; beeinflußt. Daher empfiehlt es sich, das Verfahren
durch aufeinanderfolgende Zugaben des Substrats in der Weise durchzuführen, daß während einer möglichst
langen Zeltspanne die Konzentration an Fumarsäure In
der Nfihö von Uf:. gehallen wird. Um jedoch In der
LOsung, die zur Extraktion der Aminosäure dient, eine
zu große Menge an nfcht-unigcwandcllcm Ausgangsprodukl
zu vermelden, wird die Zufuhr während der letzten
Stunden des Vcrfahrcs unterbunden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsförm der Erfindung
wird die Erzeugung der Amfnotransferasc. die zur
Bloumwandfung erforderlich ist. In der Welse durchgeführt,
daß der Stamm ATCC 21973 aerob In einem Kulturmedium
inkubieri wird; welches ZuckcrrDbenmelusse
oder Zuckcfrohrrrtebssc als einzige Kohlensioffquelle
sowie eine begrenzte Menge Fumarsäure als Potenlierungsmittel
for die Anreicherung von Aminotransfcrase durch diesen Mikroorganismus enthält.
lit der optimale Gehalt erreicht worden, tiann wird das
Züchten unterbunden, worauf das Substrat zur Umwandlung In Asparaginsäure eingesetzt wird.
Die Aktivität des Enzyms wird nicht durch das Vorliegen
von anderen Mikroorganismen beeinflußt Es ist nicht erforderlich, in einem sterilen Medium während
der Bioumwandlung; der Fumarsäure in !.Asparaginsäure
zu arbeiten.
Man kann daher ein Substrat verwenden, das keiner
speziellen Behandlung unterzogen worden ist. Insbesondere kann man eine reine kristallisierte Fumarsäure einseizin,
wie sie in üblicher Weise im Handel erhältich Ist. Man kann außerdem ein Fumarat verwenden.
Der Fest ν off wird ohne vorherige Sterilisation dem
Bioumwandlungsmedium In einer solchen Menge zugesetzt,
daß eine Konzentration in der Nähe von 10".. aufrecht erhallen wird
Diese Phase der Bioumwandlung erluigs ohne Belüftung,
um die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten /u vermeiden, insbesondere von Oxydationsprodukten
der äthylenischen Säure. Die angegriffene Substanz ist dann das Diammoniumfumaral. wenn man die
Fumarsäure in ein ammoniakafisches Melassenmedium
eingeführt hat
Die Reaktion wird unter Abschirmung mittels eines ncu'raieii Gases, wie Stickstoff, durchgeführt.
Während der Umwandlung wird die Temperatur vorzugsweise hei 55 bis ST t und der pH-Wert bei 9 bis 9.5
durch 7·- jbe von gasförmigem Ammoniak gehalten.
Nach Beendigung der Reaktion, d. h., wenn der Restgehalt
an Fumarsäure auf solche Werte abgefallen ist. daß die Ausbeute optimal ist. wird dis Masse einer
Trennoperation unterzogen, wobei man auf die üblichen
und bekannten Trennmethoden zurückgreifen kann, beispielsweise
auf ein Zentrifugieren. Filtrieren etc.. um die Mikroorganismen sowie alle anderen unlöslichen Verbindungen
zu beseitigen
Man erhall auf diese Weise eine konzentrierte Lösung
von Asparaginsäure, aus welcher die Aminosäure in bekannter Weise entfernt wird, beispielsweise durch
insolubitisieri/ng durch Veränderung des pH-Wertes bis
zum isoslektrischen Punkt.
Das unter den erfindungsgemäßen Bedingungen erhaltene kristallisierte Produkt ist von einer Reinheit, die für
industrielle Zwecke ausreicht, es kann jedoch vorteilhaft sein, weiter bis zur Gewinnung eines Produktes zu reinigen,
das den pharmazeutischen Normen entsprieht, und
zwar durch einfache Lmkristallisalion nach einer Entfärbung
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel I
Die optimalen Bedingungen der angegebenen Bioumwaivilune
des Stammes ATCC 21973 werden in indu-
seriellem Maßstab bei dar Betriebsweise einer PHoIc-Anlagc
eingehalten, welche die Gewinnung von I m'
einer Kultur ermöglicht, die reich an Amfnolran.sferasc
Ist.
Herstellung der Kultur
In einer Gärungselnrächtung, die mit einem Rührer
und einer Heizvorrichtung versehen Ist* werden 10001
eines Mediums hergestellt, das folgende Zusammensetzung
besitzt:
Melasse |
40 g/l. ausgedrückt als |
|
Gesamtzucker |
Phosphorsäure |
2.3 g/l |
Magnesiumsulfat |
0,5 g/l |
Fumarsäure |
1 g/l |
Gewöhnliches Wasser |
] I |
Vor dem Sterilisieren wird der pH auf 7 unter Verwendung
von Ammoniak eingestellt. Das Sterilisieren wird durch Erhitzen auf 1230C während einer Zeitspanne von
30 Minuten durchgeführt.
Das auf diese Weise hergestellte Medium wird mit 201
der VorkuJtur des Pseudomonas-Stammes ATCC 21973 beimpft.
Das Züchte wird In sterilem Medium bei einer gesteuerten Temperatur unter Rühren sowie unter Belüften
durchgeführt.
Die ausgewählten Verfabrensbedingungen wie folgt:
Temperatur 30° C
Rühren: 100 Upm
Belüftungsgeschwindigkeit: 0,8 Volumen/Volumen/MInute
Nach 11 stündigem Züchten hat die Bakterienpopulation
10'° Bakterien/ml erreicht, der pH beträgt 8.95. Die fc.izymatische Aktivität ist daher maximal.
Bioumwandlung
Nach Beendigung des Züchtens wird die GSrungseinrichtung
geöffnet und das Belüften unterbrochen. Die Temperatur wird zunehmend auf 55 bis 57° C unter Rühren
erhöht, worauf kristallisierte Fumarsäure dem Substral
in einer solchen Welse zugefügt wird, daß man eine
Konzentration von 100 g/l erzielt. Der pH des Mediums
wird zwischen 8,9 und 9,1 durch Zugabe von gasförmigem Ammoniak erhalten.
Die Umwandlung wird durch Messen der gebildeten L Asparaginsäure
verfolgt. Die Zugabe von Fumarsäure wird in einer solchen Weise gesteuert, um ihre Konzentration
in der Nähe von 1C% zu halten.
Das Verfahren wird während einer Zeitspanne von 12
Stunden durchgeführt, worauf die Zugabe der Fumarsäure
vermindert wird. Die Temperatur und der pH werden aufrecht erhalten. Auf diese Weise wird der Fumarsäuregehalt
bis zur 15. Stunde vermlrdert. Zu diesem
Zeitpunkt enthält das Medium 180 g L-Asparaginsäure/I und 30 g nicht-umgewandelter Fumarsäure/1. Dann wird
die Zugabe von Fumarsäure unterbunden. Insgesamt werden 160 kg des Substrats verwendet. Das Rühren wird
fortgesetzt, wobei die Temperatur und der pH bis zur 20. Stunde aufrechterhalten werden.
Zu diesem Zeitpunkt beträgt der Gehalt an L-Asparaginsäure
in dem Medium 21,1% und der Gehalt an Restfumarsäure
0,7%. Auf diese Weise sind 155 kg Fumarsäure umgewandelt worden, was einer Gewichtsausbeute
von 109i> oder einer molaren Ausbeute von 95".. entspricht.
Die L-AsparagfnsKure kann nach der Methode von Beispiel 2 oder der Arbeltswelse von Beispiel 3 abgetrennt
werden.
Beispiel 2
Die Lösung des Beispiels I wird zur Gewinnung von
krlstßi'nslerter L-Asparaginsäiure behandelt. Zu diesem
Zweck wird der pH-Wert auf 5,8 Unter Verwendung konzentrierter
Chfofwässerstoffsiiure einges'ellU worauf die '"
Temperatur auf 53 bis 55 C gebracht wird und ein Ausflockungsmittel
aus sulfonierten! Polystyrol in Form einer Lösung mit 10g/l zugesetzt wird. Nach I5minüiigem
Kontakt werden die unlöslichen Bestandteile sowie die ausgefiockten Substanzen durch Filtration auf einem ''
Trommelfilter unter Vakuum entfernt, der mit einer Schicht aus aufgeblähtem Perlit überzogen ist. Der FiHmtionsdurchsatz
beträgt 5001/mVStundc Die filtrierte Lösung ist vollständig klar. Dann wird auf 30"C abgekühlt
und unter Rühren mil konzentrierter Chlorwasser· '" stoffsäure bis zu einem pH von 2.8 bis 3 angesäuert.
Nach Beendigung des Ansäuerns werden sich die Kn stalle während einer Zeitspanne von 8 Stunden entwikkeln
gelassen, worauf sie abzentrifugiert werden.
Die Reinheit der mit Wasser gewaschenen Kristalle "' liegt oberhalb 99°,,. Man erhält auf diese Weise 183 kg L-Asparaginsäure.
Beispiel 3
10 m' der Lösung, die bei der Bioumwandlung von
Fumarsäure in L-Asparaginsäure gemäß Beispiel 1 erhalten wird, wird zur Entfernung der Aminosäure behandelt.
Dazu wird der pH durch Zugabe von Schwefelsäure j5
(60 Gev.-0..) auf 5,8 eingesteSlt.
Gleichzeitig wird die Temperatur auf 55° C gebracht. Dann wird ein aus sulfiniertem Polystyrol bestehendes
Ausflockungsmittel ta Form einer wäßrigen Lösung mit 10 g/l zugesetzt. Es werden davon 0,5 g/I der zu behandelnden
Lösung verwendet.
Nach 15 Minuten dauerndem Kontakt werden die Mikroorganismen, die Zellreste, die ausgefiockten Kolloide
sowie andere unlösliche Verunreinigungen durch Zentrifugieren entfernt, wobei eine Art Milchzentrifuge -n
verwende! wird. Die Abtrennung ist ausgezeichnet, da die Trübung der klaren Phase 25° Kaolin beträft, und
zwar gegenüber 5000° Kaolin vor der Behandlung.
Γ Kaolin ist die Trübung, die einer Suspension von
I mg Kaolin in 11 Wasser entspricht Auf diese Weise so
werden daher 0.5 Gew.-"5>
Schmutz entfernt, dar nur einen sehr geringen Anteil an Asparaginsäure enthält.
Die klare Lösung wird dann einer Rclnlgungsbchandlung
durch Zugabe von Aktivkohle sowie eines Filtration*- hilfsmillcls unterzogen,
10 m' de«1 Lösung mil 200 g Asparaglnsiiurc/I werden
auf diese Weise mit 30 kg Aktivkohle versetzt, sowie mit
50 kg aufgeblähtem I'ertit.
Nach 30minü»gem Kontakt unter müßigem Rühren
sowie unter1 Aul'rediicrhaltung der Temperatur wird die
Suspension mittels einer F'ilterprcsSe oder elriCS 1'rommelfllters
Unter Vakuum filtriert. Die i'lllralion erfolgt
sehr schnell, der Durchsat/ bctriigl ! mVmV.Stundc.
Die erhaltene Lösung lsi vollständig klar und bcsil/t
eine geringe hellgelbe Verfärbung.
Anschließend wird die L-Asparaginsäure durch Zugabe
von konzentrierter 60"..iger Schwefelsäure auskrlstalllsiert.
Diese Maßnahme wird kontinuierlich in ein*/
Reihe von mit Rührern versehenen Gefäßen durchgeführt, die in Reihe geschalte! sind, wobei die Kristallbrühe
von einem Gefäß /um anderen transportiert wird Und kontinuierlich jeweils die Schwefelsäuremengen
zugesetzt werden, die einen linearen pH-Gradienten bis
zum letzten Gefäß bewirken. Auf dicw Weise wird der pH-Wert auf 2.8 bis 3 eingestell«.
Während dei Kristallisation weruen die Gefäße in der
Weise gekühlt, daß die Temperatur bei 42 bis 45' C
gehalten wird.
Das Auskrislallistereniassen <<us der Multcrlösung
erfolgt diskontinuierlich durch Durchmischen bei 20" C während einer Zeitspanne von 8 Stunden in einem speziellen
Gefäß, das mit einer Rühreinrichtung und einem Kühlsystem versehen ist
Die auf diese Weise abschließend erhaltene Masse wird
einer Trennung flüssig/fesi durch eine Korbzentrifuge unterzogen.
Die Kristalle werden mit enthärtetem Wasser vor dem Trocknen gewaschen. Man erhält 180 kg L-Asparaginsäure-Kristalle
mit einer Reinheit von 97,5 bis 98°...
Das Produkt enthält keine Fumarsäure und nur einige Mineralsalze, insbesondere Ammoniumsulfal.
Dieses letztere läßt sich seht leicht durch Suspendieren
in angesäuertem Wasser und Abtrennen der kristallisier
ten Aminosäure entfernen.
D^s auf diese Weise ohne abschließendes Waschen
erhaltene Produkt besitzt eine Reinheit, welche eine Verwendung
für die Synthese von Peptiden und insbesondere Süßstoff-Dipeptiden gestattet.
Vergleichsversuch
Die Wirksamkeit des Stammes ATCC 21973 im Vergleich zu Pseudomonas trifolii ATCC 14537, ATCC
12287 und B-26-9-PY-5 gemäß FR-PS 13 94 722 zeigt folgendes:
Beispiel der Eingesetzte Fumarsäure
FR-PS 13 94 722 Menge
Erhaltene Aspara- Ausbeute
ginsäure — Menge
ATCC |
14537 |
75 |
g/i |
2
ATCC |
14537 |
50 |
g/i |
3
ATCC |
14537 |
100 |
g/l |
24 h
25h
45 h
86 g/I |
100 moI-% |
57,3 g/I |
100 mol-% |
100,25 g/I |
87,5 mol-% |
Beispiel der
FR-PS 13 94 722
Eingesetzte Fumarsäure
Menge
Erhaltene Aspara- Ausbeute
ginsäure— Menge
ATCC 14537
ATCC 12287
Be 26-9-PY-5
Erfindung
ATCC 21973
120 g/l
75 g/l
75 g/1
100* g/l
134,88 g/I
48 g/I
83 g/l
> 211 g/i
98 mol-%
57 friol-%
98,8 mol-%
95 mol-%
*> Die Konzentralion wird im Verlaufe der Bioumwandlung stets auf 100 g/11IO %) gehalten, indem man Fumarsäure zusetzt
Wenn man die Beispiele I, 2, 5 und 6 der FR-PS 13 94 722 mit der Erfind ι« vergleicht, sieht man. dall
bei praktisch gleich lang. <*ioumwan'J!ung und bei einer
Ausbeute von praktisch 100«., gemäß FR-PS 13 94 722 wesentlich verdünntere Lösungen erhalten werden.
In den Beispielen 3 und 4, wo gemäß FR-PS 13 94 722
konzentrierterc Lösungen eingesetzt werden, benötigt
man eine mehr als doppelt so lange Umwandlungszeit, um zu vergleichbaren Ausbeuten zu kommen.
Das Beispiel I der vorliegenden Erfindung zeigt, dall die verbliebene Fumarsäure 0,7t, beträgt, das sind 3,6"«,
bezogen auf eingesetzte Fumarsäure, was mit dem Wert 4»„ gemäß Tabelle 1 der FR-PS 13 94 722 gut vergleichbar
ist.
Schließlich ist es für die industrielle Herstellung wichtiger, daß man relativ hochkonzentrierte Lösungen einsetzt
und solche in verhältnismäßig kurzer Zelt erhalten kann, als daß man auf 100?6 Ausbeute arbeitet und daher
wesentlich längere Zeiten oder verdOrtntere Lösungen
benötigt. Man kann gemäß der Erfindung steis mit einer
!Obigen Lösung arbeiten und erhält in verhältnismäßig
kurzer Zeit eine Ausbeute von 95 mol-'ί, eine über
Lösung von recht reiner Asparaginsäure.