DE2345271C2

DE2345271C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure

Info

Publication number: DE2345271C2
Application number: DE19732345271
Authority: DE
Inventors: Nguyen Cong Orsan Duc
Original assignee: LES PRODUITS ORGANIQUES DU SANTERRE ORSAN 75009 PARIS FR
Current assignee: LES PRODUITS ORGANIQUES DU SANTERRE ORSAN 75009 PARIS FR
Priority date: 1972-09-07
Filing date: 1973-09-07
Publication date: 1984-01-26
Also published as: GB1442439A; DE2366505C2; NL184913B; NL184913C; JPS4992281A; NL7312344A; JPS588837B2; DE2345271A1

Description

Die Erfindung ist im vorstehenden Patentanspruch zusammengefaßt-

Von den Verfahren zur Herstellung von !.-Asparaginsäure aus Fumarsäure bedienen sich die meisten entweder nicht in reproduzierbarer Weise herstellbarer und/oder kostspieliger Ausgangsmateriaüen und sind sehr kompliziert.

N.ur diejenigen Verfahren, die auf eine Bioumwandlung zurückgreifen, sind zur Durchführung in industriellem Maßstäbe anwendbar. Jedoch sind al!e bisher bekannt gewordenen Verfahren mit dem Nachteil behaftet, ciaß die Reaktionsgeschwindigkeiten gering sind, wobei ihre Durchführung kostspielig ist, so daß sie nur insoweit durchgeführt wurden, als sie zur Herstellung von Produkten führten, die in der Pharmazie eingesetzt werden.

Die Verwendung von Asparaginsäure als Ausgangsverbindung zur Synthese von verschiedenen Peptiden erschließt dieser Aminosäure sehr interessante Absatzmöglichkeiten. Dies erfordert jedoch für eine Durchführung in industriellem Maßstabe die Verfügbarkeit einer sehr reinen Asparaginsäure, die sich unter wirtschaftlichen Bedingungen herstellen läßt.

Die zur Herstellung von Aminotransferase, weiche für die Umwandlung von Fumarsäure in L-Asparaginsäure erforderlich ist. geeignetsten Mikroorganismen erfordern for ihr Wachstum ein komplexes Kulturmedium, das neben einer Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff Quellen für organischen Stickstoff enthält, gewöhnlich Proteinhydrolysate, welche Ausgangsmaterialien mit einer nicht-konstanten Zusammensetzung sind, die relativ teuer sind. Aufgrund dieser Tatsache können d'e bekannten Verfahren, welche diese Mikroorganismen verwenden, als sehr komplex und wenig geeignet für eine industrielle Herstellung angesehen werden. Ein bekanntes Verfahren, das einen Mikroorganismus dieses Typs verwendet und die vorstehend geschilderten Nachteile aufweist, wird in der FR-FS 13 94 722 beschrieben. Dabei erfolgt die Bioumwandlung der Fumarsäure durch Pseudomonas trifolil. Dieser Mikroorganismus wird in einem aus Glukose and Pepton bestehenden Nährmedium {»MILKI«) gezüchtet. Die bei 37" C erfolgende Umwandlung in neutralem Medium verläuft sehr langsam.

Ls wurde nunmehr ein neuer Mikroorganismus der Familie Pseudomonacees gefunden, welchem nicht mehr die vorstehend geschilderten Nachteile anhaften. Dieser Mikroorganismus vermag unter Einsatz billiger Mittel die Bioumwandlung von Fumarsäure in L-Asparaginsäure mit beträchtlichen Geschwindigkeiten zn bewirken, ίο wobei diese Oschwindigkeiten größer sind als die der vorstehend beschriebenen Verfahren. Die erhaltenen Ausbeuten sind sehr hoch, wobei sich das Produkt mit einem hohen Reinheitsgrad in einfacher Weise extrahieren Iäß·-

Dieser Mikroorganismus wurde in Frankreich bei Nesle im Departement Somme (80) aus flüssigen Abwässern einer Anlage isoliert, in der aus Zuckerrüben Zucker hergesieTIt wird. Lr gehört zur Gattung Pseudoraonas. ττπϊΒ jedoch als neu angesehen werden, da er sich von den Bakterien dieses Typs durch eine oder mehrere reproduzierbare und stabile Eigenschaften gemäß den Kriterien unterscheidet, die in der Auflage von 1967 von »BERGEVS MANUEL« beschrieben sind. Der Stamm wurde zuerst PO 71H genannt und unter der Nummer ATCC 21973 hinterlegt bei der American Type Culture Collection.

Die Isolation des Mikroorganismus kann unter folgenden Bedingungen sowie unter Einhaltung, der nachfolgend beschriebenen üblichen Isolaiions- und Reinigungsmethoden durchgeführt werden.

0.1-ml-Proben des Abflusses einer Fabrik, in der Zukker aus Zuckerrüben hergestellt wird, werden in einer Petri-Sehale ausgebreitet, die ein festes Agar-Agar-Medium A der folgenden klassischen Zusammensetzung enthält:

Rindfleischextrakt	20 g/l
Pepton	20 g/l
Glukose	4 g/i
NaO	5 g/I
Agar-Agar	15 g/l

Die Inkubation erfolgt bei ungefähr 30° C. Nach 24- bi~ 30stündiger Inkubation stellt man das Auftreten von zahlreichen Kolonien fest.

Jede dieser Kolonien wird entfernt, um durch Ausbreiten auf dem vorstehend geschilderten Medium sowie unter den angegebenen Bedingungen gerenigt zu werden.

Eine mikroskopische Untersuchung reicht aus, um die so morphologische Homogenität der Bakterien einer jeden isolierten und gereinigten Pseudomonas-Kolonie zu bestätigen.

Die auf diese Weise erhaltenen Stämme im Zustand einer Reinkultur werden auf dem vorstehend beschriebenen Α-Medium konserviert, und zwar in einem Reagensglas, das in schiefer Position abgekühlt worden ist.

Abschließend werden die Stämme auf ihre Fähigkeit untersucht, L-Asparaginsäure zu erzeugen, und zwar durch Züchten in einem Substrat, das Fumarsäure enthält. Die folgende Vergleichstabelle zeigt die Produkiiorüiäiiigkeii von 3 Pscüdöinunas-Stärnrnen, die während des gleichen Abtrennverfahrens Isoliert worden sind.

Züchtungsdauer des Mikro	36	14	178	36
organismus in Stunden
Gehalt an Fumarsäure		115
zur Startzeit, g/l
Ausmaß der Bioumwand
lung nach 5täg!ger Bio
umwandlung (in %)	O		O	O
Stamm:	I		7	3
PO 205	O	O	O	O
ATCC 21973 (Erfindung)	4
PO 91	O

18 ' 24
115 178 36 115 Ϊ78

III Ul

5 6 3 6 0

6 0 0 0 0

Im Gegensatz zu den bisher bekannten anderen Mikroorganismen, die als Aminotransferase-Erzeuger eingesetzt worden sind, kann sich der erfindungsgemäße Stamm in einem einfachen Medium entwickeln, das sich beispielsweise im wesentlichen aus den Rückständen der Zuckerextraktion zusammensetzt, d. h. aus Rübenzukker- oder Rohrzucker-Melassen, die mit einem mineralischen Phosphorzusatz versehen worden sind, beispielsweise in Form eines Phosphats oder in Form von Phosphorsäure, sowie einen Stickstoffzusatz erhalten haben, beispielsweise in Form von Harnstoff und Ammoniak, wobei ferner einige Oligoelemente zugeseut worden sind.

Das folgende Beispiel zeigt die Speziizität d^s Stammes für ein derartiges Medium. Die eingehaltene Methode zu ihrer Ermittlung besteht einesteils in der Dosierung des spezifischen Enzyms in dem Medium und andererseits in dem Messen der Umwandlungsgeschwindigkeit:

Fumarsäure -

- -> L-AsparagirisäV.re

Versuch Nr. 1

Es werden parallel zwei Kulturmedien hergestellt, welche die folgenden Zusammensetzungen besitzen:

Künstliches Medium (Medium I)
Glukose 60 g/l

25

Macerisierungsflüssigkeit von Mais 40 g/l
MgSO₄ - 7H₂O 0,5 g/l

Monokaiiumphosphat 5 g/l

Fumarsäure 1 g/l

Melassemedium (Medium 2)

Melasse, ausgedrückt 60 g/I

als Gesamtzucker

Monokaliumohosphat 5 g/l

MgSO₄ - 7H₂O 0,5 g/l

Harnstoff 8 g/I

Nach einem Sterilisieren des Mediums durch Erhitzen während einer Zeitspanns von 20 Minuten auf 121° C wird der pH auf 7 bis 7,2 eingestellt. Dazu wird gasförmiges Ammoniak unter sterilen Bedingungen verwendet.
Anschließend wird jedes Medium mit einer Salzsuspension des Stammes ATCC 21973 beimpft. Das Züchten erfolgt in 6-1-PhioIen, die 1 1 des Mediums enthalten, wobei ein Drehrührer verwendet wird.

Die Bakterienentwickiung wird durch Messen der optischen Dichte nach einer Verdünnung auf das 20fache ermittelt. Die Entwicklung der Aminotransieraseaktivität wird nach der Methode bestimmt, die in »Methods in enzymology« beschrieben wird.

dauer,
Std.

Medium 1

Bakterienpopulation/

ml

Aktivität, ausgedrückt in intern. Aminotransferase-Einheiten/1/Std.

Medium 2	Aktivität, ausgedrückt in intern. Aminotrans- ferase-Einheiten/1/Std
Bakterienpopulation/ ml
1 X 10«	26
0,9 x 10'	24
0,9 X 10'°	32,6
1,1 X ΙΟ¹⁰	31,2
1,0 x 10'°

I X 13»
0,8 x 10⁹
1 X 10'°
1,1 X 10'°
1,1 X 10"»

18,8
10
19
18,8

Man kann feststellen, daß, falls die Bakterienerüwick- ^6G lung beinahe in den beiden Medien identisch ist, die Aminotransferaseaktivitüteri dann um 50 bis 60"» erhöht sind, wenn der Mikroorganismus In dem Medium 2 gezüchtet wird.

Ganz allgemein kann festgestellt werden, daß das zur ^a5 Erzeugung von Aminotransferase, welche die Fumarsäure umwandelt, geeignetste Nährmedium etwa folgender Zusammensetzung entspricht:

15 bis 60 g/! zuckerhaltiger Melassen (ausgedrückt als Gssamlzucker), vorzugsweise 40 g/l, ausgedrückt als Gesamtzucker

1 bis 4g/l Phosphorsäure oder Mlrieralphosphate (ausgedrückt als Phosphorsäure), vorzugsweise 2 bis 2,6 g/l

0,1 bis I g/l Mg (ausgedrückt als Magnesiumsulfat), vorzugsweise 0,4 bis 0,6 g/l Magnesiumsulfat

0,5 bis 10 g/l Fumarsäure, vorzugsweise 0,9 bis Ug/J

Der pH des auf diese Weise erhaltenen wäßrigen Mediums wird auf 7 bis 8.5, vorzugsweise auf einen Wert in der Nähe von 7, eingestellt.

Während der Züchtungszcitspanne. die zwischen 9 und 15 Stunden betragen kann und vorzugsweise /wischen 10 uad 12 Stunden schwankt, darf die Temperatur 38° C nicht übersteigen.

Desgleichen verhindert eine Temperatur unterhalb 25° C das Wachsen des Mikroorganismus. Eine optimale Bakterienpopulalionsdichte wird bei 30° C erhallen.

Spuren an Oligoelementen können in ei .. Menge von 0 bis IO ppm entweder in Form von Salrt^i dem Züchtungsmedium zugeseiit werden, oder man kann in der Weise verfahren, daß man übli<-'p--^. n-chl-mineialisiertes Wassej zusetzt, um das Ve!« ^:** des Mediums auf I 1 einzusteiien.

Die bisher verwendeten Ni._Aroorgan;smen besitzen die Eigenschaft, daß das von ihnen erzeugte Enzym ihermolabil und sehr gegenüber physikalisch/chemischen Einflüssen des Bioumwandlungsmediums empfindlich ist, insbesondere gegenüber dem pH und der Temperatur.

Eine systematische Untersuchung des Stammes ATCC 21973 hat gezeigt, daß dieser Mikroorganismus in einem Kulturmedium auf der Basis von Melassen ein Enzym anreichern kann, dessen Aktivität innerhalb breiter Verfahrensbedingungen zur Bioumvandlung von Fumarsäure wirksam ist. Dies gilt insbesondere bezüglich der Temperatur und des pH-Wertes.

Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, daß sin Züchten des Stammes ATCC 21973 auf Melassen die Bildung eines Mediums zur Folge hat, weiches ein Enzym enlhaft, das fur die Aminierung von Fumarsäure in L Asparaginsäure verantwortlich ist, wobei seine Aktivität mit einer Erhöhung der Umwandlungstemperaiur zunimmt- Die Aktivität entfallet sich innerhalb eines

Temperaturbereiches von 20 bis öG C. Gleichzeitig wurde festgestellt, daß eine Erhöhung des bei der Bioumwandlung eingehaltenen pH-Wertes einen günstigen Einfluß auf die Umwandlungsgeschwinc'igkeit innerhalb eines pH-Bereiches von 6 bis 12 ausübt.

Um den Einfluß dieser zwei Parameter ^uf die Bioumwandlungsgeschwindigkeit χα untersuchen, wurde der Stamm ATCC 21973 auf einem Meiassenmedium. wie es vorstehend unter Versuch Nr. 1 beschrieben worden ist. gezüchtet. Es wurden 10 i dieses Mediums zur Durchführung eines jeden der nachfolgend beschriebenen Versuche hergestellt.

Versuch 2

20 Einfluß der Temperatur auf die Bioumwandlungs^es^hwjndigkeit

Zu 101 der hergestellten Kultur werd >n 2 kg Ammoniumfumarat zugesetzt, nachdem der pH-Wen auf 8 und die Temperatur auf den ausgewählten Wert eingestellt worden ist. Während der Umwandlung wird der pH durch Zugabe von gasförmigem Ammoniak auf 8 gehaf ten.

Die Aktivität wird durch Dosierung nach der Methode gemessen, wie sie in «Methods in enzymology«. Band 13, beschrieben wird, und zwar nach IiJündiger Reaktion unter Rühren sowie anschließend alle Stunden während einer Zeitspanne von 4 Stunden. Der in der Tabelle angegebene Wert entspricht dem Mittel von fünf auf diese Weise durchgeführten Messungen.

Bioumwandlungstemperatur, ⁰C
Aminotransferaseaktivität

30 37 40 50 57 60
0,01 0,05 0.07 0,08 0,J2 0,14 0,14

Man sieht,' daß die Aktivität beinahe Hnear mit der Bioumwandlungstemperatur zwischen 20 und 50° C und dann etwas langsamer zwischen 50 und 60° C ansteigt, wobei sie jedoch auch bei 60° C nicht zerstört ist.

Erfindungsgemäß wira daher die Bioumwandlung zwischen 30 und 60° C durchgeführt, vorzugsweise zwischen 50 und CJ" C und insbesondere zwischen 55 und 57° C, da die optimale Temperatur bei 55 bis 57° C zu liegen scheint.

Versuch 3

Einfluß des pH au! die Bioumwandlungsgeschwindigkeit Es werden die gleichen Melassenmedien-Fraktionen

pH des Mediums während 7 7,5

der Bioumwandlung

α _M:«_A*,— ..r.» 1.«:..:«::» η n-i λ ι ι λ '

wie bei der Durchführung des Versuchs 2 verwendet. Die Fraktionen von 10 1 werden in ein Gefäß gegeben, das mit einem Rührer versehen ist, und auf 57° C Gehalten. Nachdem 2 kg Diammoniumfumarat zugesetzt worden sind, wird die Bicumwandlungsgeschwindigkeit in der gleichen Welse wie bei der Durchführung des Versuchs 2 verfolgt.

Die in der folgenden Tabelle angegebenen Werte steilen das Mittel von fünf aufeinanderfolgend durchgeführten Messungen dar (vgl. Versuch 2).

S.5

9,5

in mMoI/1/Stunde

Es ist darauf hinzuweisen, daß oberhalb eines pH von 8,75 das Medium dazu neigt. Ammoniak freizusetzen. Urn einen Amrnoniakverlust zu vermeiden, wird das ~ Gefäß unter einem leichten Druck gehalten.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Geschwindigkeit proportional zu dem pH zwischen 7 und 8,75 und dann langsam zwischen 8,75 und 9,50 ansteigt und sfch dann oberhalb dieses Werlos stabilisiert. Daher wird erflndungsgemaß die Bioumwandlung !n vorteilhafter Weise bei einem pH zwischen 8,5 und 10 und am besten zwischen 9 und 9,5 durchgeführt.

Eine Untersuchung des Einflusses der Konzentration des umzuwandelnden Substrats, d. h. der Fumarsäure, hai gezeigt, daß die iJmwanrJiüngsgcschwindJgkeii am günstigsten ist, wenn der Gehalt an Fumarsäure in dem Medium !n der Nähe von !0% liegt; die Geschwindigkeit wird jedoch nicht durch den Gehalt an gebildeter· L-Asparaginsütre (innerhalb der Sättigungsgrenzen der Lösung; beeinflußt. Daher empfiehlt es sich, das Verfahren durch aufeinanderfolgende Zugaben des Substrats in der Weise durchzuführen, daß während einer möglichst langen Zeltspanne die Konzentration an Fumarsäure In

der Nfihö von Uf:. gehallen wird. Um jedoch In der LOsung, die zur Extraktion der Aminosäure dient, eine zu große Menge an nfcht-unigcwandcllcm Ausgangsprodukl zu vermelden, wird die Zufuhr während der letzten Stunden des Vcrfahrcs unterbunden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsförm der Erfindung wird die Erzeugung der Amfnotransferasc. die zur Bloumwandfung erforderlich ist. In der Welse durchgeführt, daß der Stamm ATCC 21973 aerob In einem Kulturmedium inkubieri wird; welches ZuckcrrDbenmelusse oder Zuckcfrohrrrtebssc als einzige Kohlensioffquelle sowie eine begrenzte Menge Fumarsäure als Potenlierungsmittel for die Anreicherung von Aminotransfcrase durch diesen Mikroorganismus enthält.

lit der optimale Gehalt erreicht worden, tiann wird das Züchten unterbunden, worauf das Substrat zur Umwandlung In Asparaginsäure eingesetzt wird.

Die Aktivität des Enzyms wird nicht durch das Vorliegen von anderen Mikroorganismen beeinflußt Es ist nicht erforderlich, in einem sterilen Medium während der Bioumwandlung; der Fumarsäure in !.Asparaginsäure zu arbeiten.

Man kann daher ein Substrat verwenden, das keiner speziellen Behandlung unterzogen worden ist. Insbesondere kann man eine reine kristallisierte Fumarsäure einseizin, wie sie in üblicher Weise im Handel erhältich Ist. Man kann außerdem ein Fumarat verwenden.

Der Fest ν off wird ohne vorherige Sterilisation dem Bioumwandlungsmedium In einer solchen Menge zugesetzt, daß eine Konzentration in der Nähe von 10".. aufrecht erhallen wird

Diese Phase der Bioumwandlung erluigs ohne Belüftung, um die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten /u vermeiden, insbesondere von Oxydationsprodukten der äthylenischen Säure. Die angegriffene Substanz ist dann das Diammoniumfumaral. wenn man die Fumarsäure in ein ammoniakafisches Melassenmedium eingeführt hat

Die Reaktion wird unter Abschirmung mittels eines ncu'raieii Gases, wie Stickstoff, durchgeführt.

Während der Umwandlung wird die Temperatur vorzugsweise hei 55 bis ST t und der pH-Wert bei 9 bis 9.5 durch 7·- jbe von gasförmigem Ammoniak gehalten.

Nach Beendigung der Reaktion, d. h., wenn der Restgehalt an Fumarsäure auf solche Werte abgefallen ist. daß die Ausbeute optimal ist. wird dis Masse einer Trennoperation unterzogen, wobei man auf die üblichen und bekannten Trennmethoden zurückgreifen kann, beispielsweise auf ein Zentrifugieren. Filtrieren etc.. um die Mikroorganismen sowie alle anderen unlöslichen Verbindungen zu beseitigen

Man erhall auf diese Weise eine konzentrierte Lösung von Asparaginsäure, aus welcher die Aminosäure in bekannter Weise entfernt wird, beispielsweise durch insolubitisieri/ng durch Veränderung des pH-Wertes bis zum isoslektrischen Punkt.

Das unter den erfindungsgemäßen Bedingungen erhaltene kristallisierte Produkt ist von einer Reinheit, die für industrielle Zwecke ausreicht, es kann jedoch vorteilhaft sein, weiter bis zur Gewinnung eines Produktes zu reinigen, das den pharmazeutischen Normen entsprieht, und zwar durch einfache Lmkristallisalion nach einer Entfärbung
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel I

Die optimalen Bedingungen der angegebenen Bioumwaivilune des Stammes ATCC 21973 werden in indu-

seriellem Maßstab bei dar Betriebsweise einer PHoIc-Anlagc eingehalten, welche die Gewinnung von I m' einer Kultur ermöglicht, die reich an Amfnolran.sferasc Ist.

Herstellung der Kultur

In einer Gärungselnrächtung, die mit einem Rührer und einer Heizvorrichtung versehen Ist* werden 10001 eines Mediums hergestellt, das folgende Zusammensetzung besitzt:

Melasse	40 g/l. ausgedrückt als
	Gesamtzucker
Phosphorsäure	2.3 g/l
Magnesiumsulfat	0,5 g/l
Fumarsäure	1 g/l
Gewöhnliches Wasser	] I

Vor dem Sterilisieren wird der pH auf 7 unter Verwendung von Ammoniak eingestellt. Das Sterilisieren wird durch Erhitzen auf 123⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten durchgeführt.

Das auf diese Weise hergestellte Medium wird mit 201 der VorkuJtur des Pseudomonas-Stammes ATCC 21973 beimpft.

Das Züchte wird In sterilem Medium bei einer gesteuerten Temperatur unter Rühren sowie unter Belüften durchgeführt.

Die ausgewählten Verfabrensbedingungen wie folgt:

Temperatur 30° C
Rühren: 100 Upm
Belüftungsgeschwindigkeit: 0,8 Volumen/Volumen/MInute

Nach 11 stündigem Züchten hat die Bakterienpopulation 10'° Bakterien/ml erreicht, der pH beträgt 8.95. Die fc.izymatische Aktivität ist daher maximal.

Bioumwandlung

Nach Beendigung des Züchtens wird die GSrungseinrichtung geöffnet und das Belüften unterbrochen. Die Temperatur wird zunehmend auf 55 bis 57° C unter Rühren erhöht, worauf kristallisierte Fumarsäure dem Substral in einer solchen Welse zugefügt wird, daß man eine Konzentration von 100 g/l erzielt. Der pH des Mediums wird zwischen 8,9 und 9,1 durch Zugabe von gasförmigem Ammoniak erhalten.

Die Umwandlung wird durch Messen der gebildeten L Asparaginsäure verfolgt. Die Zugabe von Fumarsäure wird in einer solchen Weise gesteuert, um ihre Konzentration in der Nähe von 1C% zu halten.

Das Verfahren wird während einer Zeitspanne von 12 Stunden durchgeführt, worauf die Zugabe der Fumarsäure vermindert wird. Die Temperatur und der pH werden aufrecht erhalten. Auf diese Weise wird der Fumarsäuregehalt bis zur 15. Stunde vermlrdert. Zu diesem Zeitpunkt enthält das Medium 180 g L-Asparaginsäure/I und 30 g nicht-umgewandelter Fumarsäure/1. Dann wird die Zugabe von Fumarsäure unterbunden. Insgesamt werden 160 kg des Substrats verwendet. Das Rühren wird fortgesetzt, wobei die Temperatur und der pH bis zur 20. Stunde aufrechterhalten werden.

Zu diesem Zeitpunkt beträgt der Gehalt an L-Asparaginsäure in dem Medium 21,1% und der Gehalt an Restfumarsäure 0,7%. Auf diese Weise sind 155 kg Fumarsäure umgewandelt worden, was einer Gewichtsausbeute

von 109i> oder einer molaren Ausbeute von 95".. entspricht. Die L-AsparagfnsKure kann nach der Methode von Beispiel 2 oder der Arbeltswelse von Beispiel 3 abgetrennt werden.

Beispiel 2

Die Lösung des Beispiels I wird zur Gewinnung von krlstßi'nslerter L-Asparaginsäiure behandelt. Zu diesem Zweck wird der pH-Wert auf 5,8 Unter Verwendung konzentrierter Chfofwässerstoffsiiure einges'ellU worauf die '" Temperatur auf 53 bis 55 C gebracht wird und ein Ausflockungsmittel aus sulfonierten! Polystyrol in Form einer Lösung mit 10g/l zugesetzt wird. Nach I5minüiigem Kontakt werden die unlöslichen Bestandteile sowie die ausgefiockten Substanzen durch Filtration auf einem '' Trommelfilter unter Vakuum entfernt, der mit einer Schicht aus aufgeblähtem Perlit überzogen ist. Der FiHmtionsdurchsatz beträgt 5001/mVStundc Die filtrierte Lösung ist vollständig klar. Dann wird auf 30"C abgekühlt und unter Rühren mil konzentrierter Chlorwasser· '" stoffsäure bis zu einem pH von 2.8 bis 3 angesäuert. Nach Beendigung des Ansäuerns werden sich die Kn stalle während einer Zeitspanne von 8 Stunden entwikkeln gelassen, worauf sie abzentrifugiert werden.

Die Reinheit der mit Wasser gewaschenen Kristalle "' liegt oberhalb 99°,,. Man erhält auf diese Weise 183 kg L-Asparaginsäure.

Beispiel 3

10 m' der Lösung, die bei der Bioumwandlung von Fumarsäure in L-Asparaginsäure gemäß Beispiel 1 erhalten wird, wird zur Entfernung der Aminosäure behandelt.

Dazu wird der pH durch Zugabe von Schwefelsäure j5 (60 Gev.-⁰..) auf 5,8 eingesteSlt.

Gleichzeitig wird die Temperatur auf 55° C gebracht. Dann wird ein aus sulfiniertem Polystyrol bestehendes Ausflockungsmittel ta Form einer wäßrigen Lösung mit 10 g/l zugesetzt. Es werden davon 0,5 g/I der zu behandelnden Lösung verwendet.

Nach 15 Minuten dauerndem Kontakt werden die Mikroorganismen, die Zellreste, die ausgefiockten Kolloide sowie andere unlösliche Verunreinigungen durch Zentrifugieren entfernt, wobei eine Art Milchzentrifuge -n verwende! wird. Die Abtrennung ist ausgezeichnet, da die Trübung der klaren Phase 25° Kaolin beträft, und zwar gegenüber 5000° Kaolin vor der Behandlung.

Γ Kaolin ist die Trübung, die einer Suspension von I mg Kaolin in 11 Wasser entspricht Auf diese Weise so werden daher 0.5 Gew.-"5> Schmutz entfernt, dar nur einen sehr geringen Anteil an Asparaginsäure enthält.

Die klare Lösung wird dann einer Rclnlgungsbchandlung durch Zugabe von Aktivkohle sowie eines Filtration*- hilfsmillcls unterzogen,

10 m' de«¹ Lösung mil 200 g Asparaglnsiiurc/I werden auf diese Weise mit 30 kg Aktivkohle versetzt, sowie mit 50 kg aufgeblähtem I'ertit.

Nach 30minü»gem Kontakt unter müßigem Rühren sowie unter¹ Aul'rediicrhaltung der Temperatur wird die Suspension mittels einer F'ilterprcsSe oder elriCS 1'rommelfllters Unter Vakuum filtriert. Die i'lllralion erfolgt sehr schnell, der Durchsat/ bctriigl ! mVmV.Stundc.

Die erhaltene Lösung lsi vollständig klar und bcsil/t eine geringe hellgelbe Verfärbung.

Anschließend wird die L-Asparaginsäure durch Zugabe von konzentrierter 60"..iger Schwefelsäure auskrlstalllsiert. Diese Maßnahme wird kontinuierlich in ein*/ Reihe von mit Rührern versehenen Gefäßen durchgeführt, die in Reihe geschalte! sind, wobei die Kristallbrühe von einem Gefäß /um anderen transportiert wird Und kontinuierlich jeweils die Schwefelsäuremengen zugesetzt werden, die einen linearen pH-Gradienten bis zum letzten Gefäß bewirken. Auf dicw Weise wird der pH-Wert auf 2.8 bis 3 eingestell«.

Während dei Kristallisation weruen die Gefäße in der Weise gekühlt, daß die Temperatur bei 42 bis 45' C gehalten wird.

Das Auskrislallistereniassen <<us der Multcrlösung erfolgt diskontinuierlich durch Durchmischen bei 20" C während einer Zeitspanne von 8 Stunden in einem speziellen Gefäß, das mit einer Rühreinrichtung und einem Kühlsystem versehen ist

Die auf diese Weise abschließend erhaltene Masse wird einer Trennung flüssig/fesi durch eine Korbzentrifuge unterzogen.

Die Kristalle werden mit enthärtetem Wasser vor dem Trocknen gewaschen. Man erhält 180 kg L-Asparaginsäure-Kristalle mit einer Reinheit von 97,5 bis 98°...

Das Produkt enthält keine Fumarsäure und nur einige Mineralsalze, insbesondere Ammoniumsulfal.

Dieses letztere läßt sich seht leicht durch Suspendieren in angesäuertem Wasser und Abtrennen der kristallisier ten Aminosäure entfernen.

D^s auf diese Weise ohne abschließendes Waschen erhaltene Produkt besitzt eine Reinheit, welche eine Verwendung für die Synthese von Peptiden und insbesondere Süßstoff-Dipeptiden gestattet.

Vergleichsversuch

Die Wirksamkeit des Stammes ATCC 21973 im Vergleich zu Pseudomonas trifolii ATCC 14537, ATCC 12287 und B-26-9-PY-5 gemäß FR-PS 13 94 722 zeigt folgendes:

Beispiel der Eingesetzte Fumarsäure

FR-PS 13 94 722 Menge

Erhaltene Aspara- Ausbeute
ginsäure — Menge

ATCC	14537	75	g/i
2 ATCC	14537	50	g/i
3 ATCC	14537	100	g/l

24 h

25h

45 h

86 g/I	100 moI-%
57,3 g/I	100 mol-%
100,25 g/I	87,5 mol-%

Beispiel der
FR-PS 13 94 722

Eingesetzte Fumarsäure
Menge

Erhaltene Aspara- Ausbeute
ginsäure— Menge

ATCC 14537

ATCC 12287

Be 26-9-PY-5

Erfindung
ATCC 21973

120 g/l
75 g/l

75 g/1
100* g/l

134,88 g/I
48 g/I

83 g/l
> 211 g/i

98 mol-%
57 friol-%

98,8 mol-%
95 mol-%

*> Die Konzentralion wird im Verlaufe der Bioumwandlung stets auf 100 g/¹1IO %) gehalten, indem man Fumarsäure zusetzt

Wenn man die Beispiele I, 2, 5 und 6 der FR-PS 13 94 722 mit der Erfind ι« vergleicht, sieht man. dall bei praktisch gleich lang. <*ioumwan'J!ung und bei einer Ausbeute von praktisch 100«., gemäß FR-PS 13 94 722 wesentlich verdünntere Lösungen erhalten werden.

In den Beispielen 3 und 4, wo gemäß FR-PS 13 94 722 konzentrierterc Lösungen eingesetzt werden, benötigt man eine mehr als doppelt so lange Umwandlungszeit, um zu vergleichbaren Ausbeuten zu kommen.

Das Beispiel I der vorliegenden Erfindung zeigt, dall die verbliebene Fumarsäure 0,7t, beträgt, das sind 3,6"«, bezogen auf eingesetzte Fumarsäure, was mit dem Wert 4»„ gemäß Tabelle 1 der FR-PS 13 94 722 gut vergleichbar ist.

Schließlich ist es für die industrielle Herstellung wichtiger, daß man relativ hochkonzentrierte Lösungen einsetzt und solche in verhältnismäßig kurzer Zelt erhalten kann, als daß man auf 100?6 Ausbeute arbeitet und daher wesentlich längere Zeiten oder verdOrtntere Lösungen benötigt. Man kann gemäß der Erfindung steis mit einer !Obigen Lösung arbeiten und erhält in verhältnismäßig kurzer Zeit eine Ausbeute von 95 mol-'ί, eine über Lösung von recht reiner Asparaginsäure.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zn- Herstellung von L-Asparaginsäure, bei dem man einen Mikroorganismus nnter aeroben Bedingungen auf einem Nähnuedium herstellu das eine KohlenstoifnueHe. eine Phosphorquelle, eine Stickstoffquelle und Oltgoelemente enthält, bis ein iiärungsmedium erhallen worden ist, das reich an Amlnotransferase ist, worauf man eine Biounrwand-Iung durch Einführen von Fumarsäure in das Gärungsmedium ohne Belüftung während der erforderlichen Zeitspanne bei einem pH zwischen 6 und ^l 2 sowie bei einer Temperatur zwischen 30 und 60° C durchführt und anschließend die gebildete !.-Asparaginsäure abtrennt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Pseudomanas ATCC 21973 einsetzt.