DE3203292C2

DE3203292C2 -

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Publication number: DE3203292C2
Application number: DE3203292A
Authority: DE
Inventors: Arthur A. Skokie Ill. Us Davino; Marilyn J. Wauconda Ill. Us Kvetkas; Robert D. Glenview Ill. Us Muir
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1981-02-02
Filing date: 1982-02-01
Publication date: 1990-01-11
Also published as: GB2092161B; DE3203292A1; IE52242B1; FR2499098A1; JPS57146595A; IE820220L; GB2092161A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das mikrobiologische enzymatische Kupplungsverfahren (MEC-Verfahren) zur Herstellung von aminogeschützten L-Aspartyl-L-phenylalaninalkylestern gemäß Anspruch 1. Der Anspruch 2 nennt eine Ausgestaltung der Erfindung.

Zu den üblichen Verfahren zur Herstellung von Peptiden gehören das Azid-Verfahren, das Verfahren mit gemischten Säureanhydriden, das Carbodiamid-Verfahren, das Verfahren mit aktiven Estern, das Säurechlorid-Verfahren u. dgl. Mit den üblichen Verfahren sind jedoch verschiedene technische Schwierigkeiten verbunden, so daß beispielsweise eine Racemisierung der Carboxylkomponente an dem mit der endständigen Aminogruppe verbundenen C-Atom auftritt. Zu weiteren Schwierigkeiten gehören Nebenreaktionen, die Temperaturkontrolle, die Auswahl des Lösungsmittels, andere Eigenschaften der Aminoschutzgruppen und der Carboxylgruppen produzierenden Gruppen, die Wirkungen der funktionellen Gruppen in den Seitenketten der Aminosäuren, geringe Ausbeuten und Schwierigkeiten bei der Entfernung der gewünschten Endprodukte. Das Fragmentkondensations-Verfahren kann mit Vorteil auf Verbindungen angewendet werden, die Glycin (die einzige Aminosäure, die nicht racemisiert werden kann) an der endständigen Carboxylgruppe enthalten. Für Verbindungen, die irgendeine andere Aminosäure an der endständigen Carboxylgruppe enthalten, kann jedoch eine Racemisierung nicht verhindert werden. Tatsächlich stellt in jeder Peptidsynthese die Racemisierung eine ernste Schwierigkeit dar. Wenn eine Racemisierung auftritt, wird die Reinheit des Produktes verringert, und es wird erforderlich, das unerwüschte Isomere von dem Produkt abzutrennen. Diese Abtrennung ist für jedes technische Verfahren sehr nachteilig.

Unter den üblichen Verfahren zur Bildung von Peptidbindungen ist das Azid-Verfahren das einzige Verfahren, bei dem eine Racemisierung keine große Schwierigkeit darstellt, und aus diesem Grunde stellt dieses Verfahren ein erwünschtes Verfahren dar. Da jedoch das Azid-Verfahren komplizierte Verfahrensmaßnahmen umfaßt, und da in einer Nebenreaktion ein Harnstoffderivat poduziert wird und dadurch die Produktausbeute verringert wird, ist das Azid-Verfahren ebenfalls unbefriedigend. Neben den verschiedenen organisch-chemischen Verfahren zur Herstellung von Peptiden wurde auch eine besondere Peptidsynthese unter Anwendung der Enzyme Pepain oder Chymotrypsin beschrieben (vgl. z. B. J. S. Fruton "Advances in Protein Chemistry", Bd. 5, Academic Press Inc., New York, N.Y. 1949). Die Umsetzungen dieses Verfahrens sind in dem nachstehenden Schema A zusammengefaßt.

Schema A

Die Schwierigkeit, die die Umsetzungen (1) bis (3) gemäß Schema A alle gemeinsam aufweisen, besteht darin, daß es erforderlich ist, aus dem Peptid (III) die Phenylaminogruppe unter scharfen Bedingungen zu entfernen, da die Phenylaminogruppe, die an das Kohlenstoffatom der endständigen Gruppe der Aminkomponente (II) gebunden ist, nicht leicht von dem Peptid abgetrennt werden kann, und daher eine Spaltung der Peptidkette möglich ist, die nachteilig ist. Wegen dieses Nachteils kann diese Art der Peptidsynthese praktisch nicht für eine Peptidsynthese eingesetzt werden. Auf der anderen Seite wird die Umsetzung (4) von einer Transaminierung und Transpeptidation als Nebenreaktionen begleitet und ist daher praktisch nicht geeignet (vgl. z. B. R. B. Johnston u. a., J. Biol. Chem., Bd. 185 (1950), S. 629 und J. S. Fruton u. a., J. Biol. Chem., Bd. 204 (1953), Seite 891). In der Umsetzung (4) begünstigt die primäre Aminogruppe des Säureamids, die an die endständige Gruppe der Aminkomponente gebunden ist, die durch Papain katalysierte Amidasereaktion. Daher haben diese Verfahren nur eine theoretische Bedeutung, da sie zeigen, daß Papain und Chymotrypsin als Katalysatoren der Synthese von Peptidbindungen wirken, wobei die Phenylaminogruppe oder die primäre Aminogruppe als Schutzgruppe für die endständige Carboxylgruppe der Aminkomponente verwendet wird. Diese Verfahren geben keinen Hinweis auf die Möglichkeit einer Synthese von gewünschten Oligopeptiden oder Polypeptiden.

Es ist bekannt, daß Peptidderivate verschiedene physiologische Wirkungen haben, und diese Peptidderivate können nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Die Peptide mit sauren Aminosäureresten, wie z. B. α-Aspartyl-L-phenylalaninniederalkylester, die als Süßstoffe brauchbar sind, können aus einer Vorstufe mit einer Carbobenzoxygruppe als endständiger Schutzgruppe am Ende durch Entfernung der Schutzgruppe der Aminogruppe erhalten werden. So sind in den US- PS 41 16 768 und 41 19 493 Verfahren zur Synthese von Oligopeptiden oder Polypeptiden nach einem einfachen Verfahren beschrieben. Das Verfahren ist ein diskontinuierliches Verfahren, wobei eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer endständigen Schutzgruppe am Ende oder ein Salz einer solchen Verbindung mit der Formel X-A-OH mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer Schutzgruppe am endständigen Kohlenstoffatom oder einem Salz einer derartigen Verbindung mit der Formel H-B-Y umgesetzt wird, worin A und B gleich oder verschieden sind und einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeuten, X eine Schutzgruppe für eine Aminosäure darstellt und Y eine Schutzgruppe für eine Carboxylgruppe darstellt. Diese Reaktionsteilnehmer werden in Gegenwart einer Metalloproteinase in einer wäßrigen Lösung mit einem pH- Wert, der die Enzymaktivität der Metalloproteinase aufrechterhält, umgesetzt. Wenn die Umsetzung auch ein wirksmes Verfahren darstellt, so ist sie doch mit fortschreitender Umsetzung begrenzt, und darüber hinaus ist die Filtration des Endproduktes schwierig. Ein anderes Verfahren ist in der US-PS 41 65 311 beschrieben. Diese US-PS beschreibt neue Additionsverbindungen von Dipeptiden, die aus N-substituierten Monoaminodicarbonsäureesterresten und Aminocarbonsäureestern zusammengesetzt sind, sowie Verfahren zur Herstellung der Additionsverbindung unter Verwendung einer enzymatischen Reaktion und Zersetzung des Additionsproduktes.

Einschlägige Verfahren zur Gewinnung von Proteasen sind in den US-PS 42 12 945 und 42 12 946 beschrieben, wonach die Protease nach einer Peptidsynthese von an ein Peptid gebundenen Aminosäurederivaten in Gegenwart der Protease durch Isolierung der Protease aus einer Additionsverbindung gewonnen wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von aminogeschützten L-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylestern gemäß dem folgenden Schema B

Schema B

worin die L-Asparaginsäure eine Schutzgruppe R₁ für die Aminogruppe aufweist, die Enzymquelle ein eine Protease produzierender Mikroorganismus oder ein von einem Mikroorganismus erhaltenes Enzympräparat mit Proteaseaktivität ist und R₂ eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die aminogeschützte L-Asparaginsäure in Gegenwart einer der genannten Enzymquellen unter Bedingungen, die die mikrobilogische enzymatische Kupplung in Gegenwart eines Enzyms begünstigen, bei einem pH-Wert, der die Enzymaktivität aufrechterhält, mit einem carboxylgeschützten L-Phenylalanin umgesetzt, kontinuierlich das Produkt entfernt, wie es gebildet wird, und werden kontinuierlich weitere Mengen der Reaktionsteilnehmer zugesetzt, wie das Produkt entfernt wird (vgl. Anspruch 1).

Die Aminogruppe der L-Asparaginsäure kann durch üblicherweise eingesetzte Schutzgruppen geschützt sein, wozu beispielsweise die folgenden Schutzgruppen gehören: aliphatische Oxycarbonylgruppen, wie z. B. die Carbobenzoxygruppe, tert.-Butyloxycarbonylgruppe ((CH₃)₃C-O-CO-) und tert.-Amyloxycarbonylgruppe ((CH₃)₂C(C₂H₅)-O-CO-); im Kern substituierte Carbobenzoxygruppen, wie z. B. die p-Methoxy-carbobenzoxygruppe (p-CH₃O-Φ-CH₂-O-CO-), die 3,5-Dimethoxycarbobenzoxygruppe (3,5-(CH₃O)₂-Φ-CH₂-O-CO-), und die 2,4,6-Trimethoxycarbobenzoxygruppe (2,4,6-(CH₃O)₃-Φ-CH₂-O-CO-); die Benzoylgruppe (Φ-CO-); die p-Toluolsulfonylgruppe (p-CH₃-Φ-SO₂-); Schutzgruppen vom Urethantyp sowie aromatische Sulfinylgruppen, wie z. B. die Φ-Nitrosulfinylgruppe. Eine bevorzugte Schutzgruppe für die Aminogruppe ist die Carbobenzoxygruppe.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Enzyme sind Proteasen und vorzugsweise Metalloproteasen, die ein Metallion im aktiven Zentrum aufweisen. Geeignete Metallproteasen sind Enzyme, die von Mikroorganismen stammen, beispielsweise solche, die durch eine Anzahl von Bacillen, Streptomyceten, Pseudomonaden, Meeresbakterien und verschiedenen anderen Bakterien sowie bestimmten Pilzen, insbesondere Aspergillusarten, produziert werden. Wenn anwendbar, kann der die Protease produzierende Mikroorganismus direkt verwendt werden. Verschiedene Metalloproteasen von mikrobiologischem Ursprung, wie z. B. Thermolysin oder Thermoase (Bacillus thermoproteolyticus), Mikroprotease (B.cereus), Dispase (B.polymyxa), Pronase (Streptomyces griseus), rohe Pilzprotease (Aspergillus oryzae) sind im Handel erhältlich. Eine bevorzugte Enzymquelle für das erfindungsgemäße Verfahren ist der Hyperprotease produzierende Stamm von B.cereus NRRL B-12 315. Bacillus cereus NRRL B-12 315 ist von der A. R. S. Culture Collection Investigations Fermentation Laboratory, 1815 N. University Avenue, Peoria, Illinois, 61604 erhältlich. Wenn der Organismus direkt verwendet wird, können die mit der Isolierung und Gewinnung des Enzyms verbundenen Kosten eingespart werden. Es kann aber auch ein von einem eine Protease produzierenden Mikroorganismus stammendes Enzympräparat eingesetzt werden. Ein solches Enzympräparat kann aus verschiedenen Arten von Präparaten bestehen. Zu den Beispielen derartiger Präparate gehören zellfreie Kulturlösungen, die durch Entfernung der Zellen aus dem Kulturmedium unter Anwendung von Zentrifugenfiltration oder anderen technischen Trennungsverfahren hergestellt wurden, rohe Enzympräparate, bei denen zusätzliche Stufen, z. B. eine Ausflockung (die Kolloide entfernen kann) oder eine bakteriologische Filtration, angewendet wurden, und teilweise gereinigte Enzympräparate, zu denen solche Präparate gehören, bei denen eine Ausfällung des Enzyms mit organischen Lösungsmitteln oder Salzen durchgeführt wurde. Die Menge der Protease, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist nicht kritisch, wenn auch eine bestimmte Mindestmenge an Ezymaktivität erwünscht ist, um hohe Geschwindigkeiten der Produktbildung aufrechtzuerhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist Vorteile in verschiedenen Richtungen auf. Erstens verfestigte sich das Reaktionsgemisch in den bekannten Verfahren, die diskontinuierliche Verfahren waren, mit der Zeit, so daß die Schwierigkeit bei der Gewinnung des Produktes erhöht und die Geschwindigkeit, mit der die Umsetzung abläuft, gehemmt wurden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein kontinuierliches Verfahren, bei dem die Verfestigung verhindert und ein kristallines Produkt erhalten wird, das überraschenderweise und unerwartet im Hinblick auf die Handhabung des Materials, die Reaktionsdauer und die Ausnutzung des Enzyms wirksamer ist. Zweitens können geringere Mengen der Enzyme angewendet werden, wodurch weiterhin die Handhabung der Umsetzung vereinfacht und die Kosten verringert werden. Drittens werden durch die direkte Verwendung des das Enzym produzierenden Mikroorganismus die Dauer des Verfahrens, die Aufwendungen und die Kosten im Vergleich mit der Verwendung des isolierten Enzyms wesentlich verringert. Schließlich hat das erfindungsgemäße mikrobiologische enzymatische Kupplungsverfahren den Vorteil der Spezifität. Es sind zwei Carboxylgruppen verfügbar, und daher sind theoretisch zwei Isomere (α und b) möglich. Das α- Isomer wird leicht gebildet, so daß eine Trennungsstufe nicht unbedingt erforderlich ist. Das erfindungsgemäß erhaltene Produkt kann zur Herstellung von L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, einem künstlichen Süßstoff, dessen Süße etwa 200mal so groß wie die von Tafelzucker ist, verwendet werden. Dies kann erreicht werden, indem man die Schutzgruppe der Aminogruppe nach bekannter Weise, z. B. durch eine katalytische Hydrierung, entfernt.

Die in den Beispielen eingesetzten Enzymlösungen von B.cereus können auf folgende Weise und aus folgenden Materialien hergestellt und bestimmt werden:

A. Herstellung des Inokulums

Eine gefrorene Vorratskultur von B.cereus NRRL B-12 315 wird aufgetaut, und 2 ml dieser Kultur werden zur Beimpfung von 200 ml einer Trypticase-Soja-Nährlösung verwendet, die in einem mit Prallflächen versehenen Kolben mit einem Fassungsvermögen von 1 l enthalten waren. Die Kultur wurde 16 bis 24 Stunden bei 30±1°C auf einem Rotationsschüttelapparat mit einer Umlaufban von 5,1 cm bei 200 UpM bebrütet.

B. Herstellung der Enzymlösung

Ein Medium, bestehend aus 10,0 g löslicher Stärke; 10,0 g Sojamehl; 2,0 g Hefeextrakt; 7,5 g dibasischem Kaliumphosphat; 1,0 g Sorbimacrogololeat; 1,0 g Calciumchlorid; 0,001 g Magnesiumsulfat-monohydrat; 0,001 g Eisen(II)sulfat; und 0,001 g Zinksulfat gelöst in 1 l destilliertem Wasser wird mit 45%igem (Gew./Vol.) Kaliumhydroxid auf einen pH- Wert von 7,3 eingestellt, bevor es 15 Minuten bei 1,03 bar im Autoklaven behandelt wird. Anteile von 100 ml diess Mediums werden jeweils in mit Prallflächen versehenen Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml mit 5 ml der Inokulumkultur beimpft. Nach 24stündiger Bebrütung werden die Kulturen 10 Minuten in einer Kühlzentrifuge bei 12 000×g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und bei 4°C aufbewahrt, bis sie benötigt wird. Gegebenfalls wird das zellfreie Enzym unter Verwendung von Filtern CX konzentriert.

C. Prüfung der Enzymlösung

Die zellfreie Kulturlösung wird in einem kontinuierlichen spektrofotometrischen Versuch, der im wesentlichen dem von Feder in Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 32 (1968), S. 326 beschriebenen Versuch entspricht, mit der Abweichung, daß die Konzentration des Substrates, nämlich von Furylarcyloyl-L-glycyl-L-leucinamid (FAGLA), auf 5 · 10^-4 Mol verringert wird, auf ihre Enzymaktivität geprüft. Die Enzymaktivität wird ausgedrückt als FAGLA-Einheiten (A₃₄₅/min/ml).

Die bei der Dünnschichtchromatographie-Analyse von α-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester (αAPM) verwendeten Stoffe und Verfahrensmaßnahmen sind die folgenden:

A. Platte

Kieselgelplatte mit Fluoreszenz-indikator, aktiviert bei 254 nm.

B. Lösungsmittelsystem
Chloroform
60% (Vol./Vol.)
Methanol	30% (Vol./Vol.)
Wasser	4% (Vol./Vol.)
Ameisensäure	2% (Vol./Vol.)

C. Nachweisverfahren

Nach dem Auftropfen und der Entwicklung in dem vorstehenden Lösungsmittelsystem wird die Platte 30 Minuten an der Luft getrocknet und wie folgt untersucht:

1. man setzt sie kurzwelligem UV-Licht aus, und
2. man setzt sie überschüssigem tert.-Butyl-hypochlorit aus, dampft anschließend überschüssiges Reagens ab, besprüht mit 0,5% (Gew./Vol.) Kaliumjodid und 0,5% (Gew./Vol.) Stärke in Wasser und untersucht visuell unter weißem Licht.

Die bei den Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC)- analysen der Reaktionsteilnehmer und Produkte des mikrobiologischen enzymatischen Kupplungsverfahrens angewendeten Materialien und Verfahrensmaßnahmen sind die folgenden:

A. Säule

Partisil PXS 10/25 ODS (250 mm × 4,6 Innendurchmesser (i. d.)).

B. Mobile Phase

33% Tetrahydrofuran (in Glas destilliert): 67% destilliertes Wasser mit einem Gehalt von 0,005 Mol Pentansulfonsäure.

C. Apparat

Flüssigkeitschromatograph, ausgestattet mit einer Pumpe, Modell M-600A, einem Detektor, Modell 440 (UV, 254 nm mit einem Sicherheitsfaktor von 0,1 Einheiten (0,1 AUFS) und einem Autoinjektor, Modell WISP 710A, der mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wird.

D. Verfahren

Abgewogene Mengen der festen Stoffe und abgemessene Volumina der flüssigen Stoffe werden zweckmäßig in der mobilen Phase verdünnt und chromatographiert. Die Peaks werden im Vergleich zu bekannten Standards identifiziert und quantifiziert.

In den folgenden Beispielen werden alle Ausbeuten als Prozent der Theorie, bezogen auf die Ausgangsmenge an Carbobenzoxy- L-asparaginsäure (Z-Asp) im Reaktionsgemisch, angegeben. Die bekannten IR- und NMR-Spektren von a-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester sind die folgenden:
IR-Spektrum (Methode mit KBr-Scheibe):
3350 cm^-1 (N-H-Valenzschwingung); 3070, 3036 und 2960 cm^-1 (NH₃⁺ Valenzschwingung, breit und überlappend mit C-H-Valenzschwingungen), 1742 cm^-1 (C=O-Ester, Valenzschwingung), 1672 cm^-1 (C=O, Amid); 1553 (NH₃⁺, symmetrische Deformationsschwingung, C-N-H, Amid); 1500 und 1450 cm^-1 (aromatischer Ring, Valenzschwingung); 1381 cm^-1 (G-O₂^- symmetrische Valenzschwingung), 1235 cm^-1 (G-O-Ester, asymmetrische Valenzschwingung; NH₃⁺ Pendelschwingung (rock)), 1037 cm^-1 (G-O-Ester, symmetrische Valenzschwingung); 923 cm^-1 (G-C-N, Aminosäure, Valenzschwingung); 751 cm^-1 (5 benachbart H, Schwingung (wag vibration), monosubstituierte Phenylgruppe), und 702 cm^-1 (Ringdeformationsschwingung, monosubstituierte Phenylgruppe).
NMR-Spektrum: δ

Die Herstellung der aminogeschützten L-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylester wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von Carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester (Z-APM): (Schema B, worin R₁ der Carbobenzoxyrest und R₂ der Methylrest sind)

38 g (284 mMol) Carbobenzoxy-L-asparaginsäure (Z-Asp), 77 g (714 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid (PM · HCl) und 1,68 g Calciumacetat wurden in destilliertem Wasser gelöst, der pH-Wert wurde mit 21 g Natriumcarbonat auf 6,8 eingestellt, und das Volumen wurde mit Wasser auf 250 ml aufgefüllt. Die erhaltene Lösung wurde zu einem gleichen Volumen einer zellfreien Kulturlösung von B. cereus mit einer FAGLA-Aktivität von 4,0 Einheiten gegeben. Dieses Gemisch wurde dann in ein geeignetes Glasgefäß gegeben und 6 Stunden bei 40°C gerührt. Das Produkt wurde kontinuierlich durch Filtration gesammelt, wie es sich bildete, und das Filtrat wurde in das Reaktionsgefäß zurückgepumpt. Die Reaktion wurde abgebrochen, und der verbliebene feste Rückstand wurde mit dem gesammelten Niederschlag vereinigt und mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen und Umkristallisieren aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Wasser (1 : 2) wurden insgesamt 64,52 g einer Additionsverbindung von Carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanin- methylester und L-Phenylalanin-methylester (1 : 1) erhalten. Dies entspricht einer Ausbeute von 74,7%.

Das Salz Z-APM · PM wurde in einem Mörser zu einem feinen Pulver gemahlen, in 350 ml Wasser und 127 ml 1N Salzsäure suspendiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur heftig geschüttelt. Die erhaltene Suspension wurde filtriert, und der Niederschlag wurde mehrmals mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurden 44,8 g Carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester (Gesamtausbeute von 73,6%) und 22,63 g L-Phenylalanin- methylester (29%ige Rückgewinnung) erhalten.

Die gesamte Menge von 44,8 g Z-APM wurde zu 746 ml Wasser und 2240 ml Methanol gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde in Gegenwart von 4,48 g 5%igen Palladiums auf Kohle als Katalysator bei einem Druck von 3,45 bar hydriert. Nach 2 Stunden wurde der Katalysator durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei einer Temperatur, die 50°C nicht überstieg, auf ein Volumen von 500 ml konzentriert. Der α-Aspartyl-L-phenylalanin- methylester (αAPM) wurde kristallisiert, indem man die Lösung 2 Stunden auf 0°C kühlte. Durch Filtration wurden 25,14 g des Produktes erhalten, das durch Dünnschichtchromatographie-analyse als αAPM identifiziert wurde. Eine zweite Menge von 3,60 g wurde durch weitere Konzentration der Flüssigkeiten erhalten. Die Gesamtausbeute an αAPM betrug 96,5%, wovon 82% gemäß Dünnschichtchromatographie-analyse eine hohe Qualität aufwiesen.

Der als Produkt erhaltene α-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester hatte die folgenden physikalischen Eigenschaften und Ergebnisse der Elementaranalyse:

Schmelzpunkt: 247 bis 248°C.
Elementaranalyse für C₁₄H₁₈N₂O₅ · ½ H₂O:
berechnet:
C 55,44%; H 6,31%; N 9,24%;
gefunden:
C 55,56%; H 6,15%; N 9,24%.

Die IR- und NMR-Spektren des Produktes wiesen die vorstehend beschriebenen charakteristischen Parameter auf.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde mit einer zellfreien Kulturlösung von B.cereus mit einem Gehalt von 3 Einheiten/ml an FAGLA-Aktivität wiederholt, mit der Abweichung, daß das erhaltene Gemisch von Reaktionsteilnehmern und Enzym in zwei gleiche Teile geteilt wurde. Nach 6 Stunden wurden insgesamt 34,60 g der Additionsverbindung aus Z-APM und PM (1 : 1) aus dem Reaktionsgemisch erhalten, wobei das Produkt kontinuierlich entfernt wurde, wie es gebildet wurde. Das Salz Z-APM · PM wurde in 125 ml Wasser und 51 ml 1N Salzsäure suspendiert und 1,5 Stunden heftig gerührt, wobei 16,82 g Z-APM erhalten wurden. Die Gesamtausbeute betrug 55,2% der Theorie. Der erhaltene feine Niederschlag war gemäß Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-analye zu 100% rein.

Der zweite Teil des Gemisches aus Enzym und Reaktionsteilnehmern wurde identisch behandelt mit der Abweichung, daß das Produkt während der Reaktionsdauer von 6 Stunden nicht kontinuierlich entfernt wurde, d. h. das Verfahren wurde diskontinuierlich durchgeführt. Es wurden insgesamt 17,34 g der Additionsverbindung erhalten, die sodann in 85 ml Wasser und 35 ml 1N Salzsäure suspendiert wurden. Nachdem die Suspension 1,5 Stunden heftig gerührt worden war, wurden 11,65 g Z-APM (100% rein gemäß Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) erhalten, was einer Gesamtausbeute von 38,2% entsprach.

Beispiel 3

Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Die kontinuierliche Reaktion ergab insgesamt 30,57 g der Additionsverbindung, die in 150 ml Wasser und 60,4 ml 1N Salzsäure suspendiert und 1 Stunde heftig gerührt wurde. Es wurden 20,08 g Z-APM (90,6% rein gemäß Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) erhalten, was einer Gesamtausbeute von 59,7% der Theorie entsprach.

Die entsprechende diskontinuierliche Arbeitsweise ergab 21,94 g der Additionsverbindung, die in 110 ml Wasser und 43,3 ml 1N Salzsäure suspendiert wurden. Nachdem die Suspension 1 Stunde heftig gerührt worden war, wurden 14,3 g Z-APM (98,7% rein gemäß Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) erhalten, was einer Gesamtausbeute von 46,2% der Theorie entsprach.

Beispiel 4

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde mit einer zellfreien Kulturlösung von B.cereus mit einem Gehalt von 4,7 Einheiten FAGLA-Aktivität wiederholt, mit der Abweichung, daß die Umsetzung bei Raumtemperatur durchgeführt wurde und daß weiterhin eine zweite Menge von 500 ml des Gemisches aus Enzym und Reaktionsteilnehmern hergestellt wurde. Das Reaktionsgefäß, das die ursprünglichen 500 ml des Gemisches aus Enzym und Reaktionsteilnehmern enthielt, wurde beginnend 3 Stunden nach Reaktionsbeginn nach und nach in Anteilen von jeweils 15 ml und in Abständen von etwa 10 Minuten mit dem zweiten Gemisch versetzt. Nach 11,5 Stunden wurde der im Reaktionsgefäß verbliebene Rückstand mit dem gesammelten Niederschlag vereinigt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden insgesamt 115,4 g der Additionsverbindung erhalten, die aus 75,6% (87,3 g) Carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylanalin-methylester und 30,9% (35,7 g) L-Phenylalanin-methylester bestanden, wie durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie für eine Gesamtausbeute von 71,56% an Carbobenzoxy-L-aspartyl-L- phenylalanin-methylester bestimmt wurde.

Beispiel 5

Die Arbeitsweise von Beispiel 4 wurde mit einer anderen zellfreien Kulturlösung von B.cereus mit einem Gehalt von 4,7 Einheiten FAGLA-Aktivität wiederholt, mit der Abweichung, daß weitere 750 ml eines Gemisches aus Enzym und Reaktionsteilnehmern hergestellt wurden. Das erhaltene Gemisch wurde beginnend 4 Stunden nach Reaktionsbeginn in Anteilen von 25 bis 50 ml zugesetzt. Der pH-Wert wurde während der Umsetzung periodisch nachgestellt, und weitere Anteile von 5 bis 10 ml des Reaktionsgemisches, dessen pH-Wert nicht eingestellt war, wurden je nach Bedarf zugesetzt, um den pH-Wert unter 7 zu halten (insgesamt 125 ml des Reaktionsgemisches, dessen pH-Wert nicht eingestellt war, wurden zugesetzt). Nach 17 Stunden wurde die Umsetzung beendet, indem man den verbliebenen Rückstand des Reaktionsgemisches mit dem gesammelten Niederschlag vereinigte, und das erhaltene Gemisch anschließend wusch und trocknete. Es wurden insgesamt 203,05 g der Additionsverbindung erhalten, die aus 66,2% (134,42 g) Carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und 28,4% (57,66 g) L-Phenylalanin-methylester bestanden, wie durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie für eine Gesamtausbeute an Carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanin- methylester von 73,4% bestimmt wurde.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von aminogeschützten L- Aspartyl-L-phenylalanin-alkylestern der allgemeinen Formel worin R¹ eine Schutzgruppe für die Aminogruppe und R² eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine aminogeschützte L-Asparaginsäure der allgemeinen Formel worin R¹ die vorstehende Bedeutung aufweist, in Gegenwart eines eine Protease produzierenden Mikroorganismus oder eines von einem Mikroorganismus erhaltenen Enzympräparates mit Proteaseaktivität als Enzymquelle unter Bedingungen, die die mikrobiologische enzymatische Kupplung in Gegenwart eines Enzyms begünstigen, bei einem pH-Wert, der die Enzymaktivität aufrechterhält, mit einem carboxylgeschützten L-Phenylalanin-alkylester-hydrochlorid der allgemeinen Formel worin R² die vorstehende Bedeutung aufweist, umsetzt, kontinuierlich die als Produkt erhaltene Additionsverbindung eines aminogeschützten L-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylesters mit dem L-Phenylalanin-alkylester mit der allgemeinen Formel worin R¹ und R² die vorstehenden Bedeutungen aufweisen und PA den L-Phenylalanin-alkylester bedeutet, entfernt, wie sie gebildet wird, kontinuierlich weitere Mengen der Reaktionsteilnehmer zusetzt, wie das Produkt entfernt wird, und sodann aus der Additionsverbindung in Gegenwart von Wasserstoffionen den aminogeschützten L- Aspartyl-L-phenylalanin-alkylester gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als den eine Protease produzierenden Mikroorganismus Bacillus cereus NRRL B-12 315 verwendet.