CH645341A5

CH645341A5 - Verfahren zur herstellung von dipeptiden.

Info

Publication number: CH645341A5
Application number: CH263880A
Authority: CH
Inventors: Kiyotaka Oyama; Shigeaki Nishimura; Yuji Nonaka; Tsutomu Hashimoto; Keiichi Kihara
Original assignee: Sagami Chem Res; Ajinomoto Kk; Toyo Soda Mfg Co Ltd
Priority date: 1979-04-03
Filing date: 1980-04-03
Publication date: 1984-09-28
Also published as: BE882603A; NL8001902A; FR2453137B1; IT1147338B; IT8021154A0; JPS615399B2; DE3012693C2; DE3012693A1; US4284721A; FR2453137A1; CA1133841A; GB2049703A; GB2049703B; JPS55135595A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden durch Umsetzen einer N-substituierten Asparaginsäure mit einem Phenylalaninniedrigalkylester.

Enzyme sind proteinartige Verbindungen, die in extrem starkem Ausmass Vitalreaktionen katalysieren. Im allgemeinen sind die Enzyme jedoch nicht nur kostspielig sondern auch instabil und haben daher im industriellen Bereich nur in sehr begrenztem Ausmass Anwendung gefunden. Aufgrund der ausgezeichneten katalytischen Wirksamkeit der Enzyme wurden in jüngster Zeit erhebliche Anstrengungen im Hinblick auf ihre industrielle Anwendung unternommen. Als Ergebnis solcher Forschungen ist es mögüch geworden, die Enzymstabilität durch Immobilisieren des Enzyms zu verbessern. Weiterhin werden hierdurch ihre wiederholte Verwendung und eine kontinuierliche Durchführung der Reaktion ermöglicht, wodurch es gelingt, sie auch für industrielle Zwecke einzusetzen. Jedoch ist die Aktivität der Enzyme in organischen Lösungsmitteln sehr gering. Weiterhin werden sie in dem organischen Lösungsmittel leicht denaturiert und desaktiviert. Demzufolge ist die Anwendung der Enzyme auf wässrige Medien beschränkt, was einen erheblichen Nachteil darstellt.

Im Hinblick auf eine in einem organischen Lösungsmittel ablaufende enzymatische Reaktion ist auf die Herstellung von Acetyl-L-tryptophanäthylester aus Acetyl-L-tryptophan und Äthylalkohol hinzuweisen.

Es ist weiterhin seit langem bekannt, dass proteolytische Enzyme die Peptidbindungen ergebende Reaktion in einem wässrigen Medium katalysieren. Es findet sich jedoch kein Hinweis auf die Durchführung einer solchen Reaktion in einem organischen Lösungsmittel.

Von den Patentinhaberinnen wurde bereits ein Verfahren vorgeschlagen, gemäss dem eine N-substituierte Monoaminodicarbonsäure in einem wässrigen Lösungsmittel und in Gegenwart eines proteolytischen Enzyms mit einem Aminocarbonsäureester umgesetzt wird, worauf der in dieser Weise gebildete Dipeptidester mit dem Aminocarbonsäureester eine Additionsverbindung liefert, die dann abgetrennt wird. Diese Methode ist in der JP-OS 92729/ 1978 beschrieben.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt, eine Peptidbindungen erzeugende Reaktion in wirksamer Weise in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel durchzuführen, um in dieser Weise aus einer N-substituierten Asparaginsäure und einem Phenylalaninniedrigalkylester ein Dipeptid zu bilden.

Diese Aufgabe wird nun durch das erfindungsgemässe Verfahren gelöst.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden aus einer N-substituierten Asparaginsäure und einem Phenylalaninniedrigalkylester, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die N-substituierte Asparaginsäure und den Phenylalaninniedrigalkylester in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Wasser enthaltenden bzw. wasserhaltigen, immobilisierten Metallo-proteinase umsetzt bzw. zur Reaktion bringt.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren werden somit die N-substituierte Asparaginsäure und der Phenylalaninniedrigalkylester in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel mit einer wasserhaltigen immobilisierten Metallo-proteinase in Kontakt gebracht und in dieser Weise unter Bildung des Dipeptids miteinander gekuppelt bzw. umgesetzt.

Der N-Substituent der bei dem erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten N-substituierten Asparaginsäure ist z.B. eine in der Peptidsynthese üblicherweise verwendete Schutzgruppe für Aminogruppen. Beispiele für bevorzugte Schutzgruppen sind Schutzgruppen des Urethan-Typs, wie die Benzyloxycarbonylgruppe, die p-Methoxybenzyloxycarbo-nylgruppe, die tert.-Butoxycarbonylgruppe usw.

Die niedrigmolekulare Alkylgruppe des als zweites Ausgangsmaterial bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Phenylalaninniedrigalkylesters ist eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und insbesondere eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren können beide Materialien in der L- und/oder DL-Konfiguration vorliegen. Wenn man die DL-Isomeren verwendet, nimmt lediglich das L-Isomere an der Reaktion teil, während das D-Isomere nicht umgesetzt wird und in der Lösung verbleibt.

Das bei dem erfindungsgemässen Verfahren in immobilisierter Form eingesetzte Enzym ist ein proteolytisches Enzym, das ein Metallion in seinem aktiven Zentrum aufweist, das heisst mit anderen Worten eine Metallo-proteinase. Beispiele für solche Enzyme sind die aus Mikroorganismen gewonnenen, wie eine natürliche Protease, die aus Actino-mycetes gewonnen worden ist, Prolysin, Thermolysin, Collagenase, Crotulus atrox-Protease usw. Man kann auch ein rohes Enzym, wie Thermoase, verwenden. Bei der Anwendung eines solchen rohen Enzyms kann man einen Kar5

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toffel-Inhibitor oder einen ähnlichen Inhibitor verwenden, um die Wirkung einer verunreinigenden Esterase oder dergleichen zu inhibieren. Es ist jedoch am bevorzugtesten, Thermolysin oder Theormoase einzusetzen.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren werden diese Enzyme in immobilisierter Form eingesetzt, in die man sie z.B. mit Hilfe herkömmlicher Immobilisierungsverfahren überführt. Diese Immobilisierungsverfahren schliessen Methoden ein, die auf der physikalischen Adsorption, der Ausbildung von Ionenbindungen, der Ausbildung von kovalen-ten Bindungen, einer Einschlussreaktion und/oder einer Vernetzungsreaktion beruhen. Die Methode der Immobilisierung ist jedoch nicht auf diese Verfahrensweisen beschränkt, so dass man auch Enzyme, die lediglich auf einem porösen Trägermaterial vorliegen, das eine sehr schwache Wechselwirkung mit den Enzymen eingeht, verwenden kann.

Der hierin verwendete Ausdruck «immobilisiertes Enzym» steht somit z.B. für einen Komplex, der das Enzym und ein Trägermaterial umfasst.

Die Menge, in der das Enzym auf dem Trägermaterial vorliegt, kann nicht ohne weiteres vorausgesagt werden, da die Fähigkeit des Trägermaterials zur Aufnahme des Enzyms von der Intensität der Wechselwirkung zwischen dem Trägermaterial und dem Enzym abhängt. Jedoch kann die Menge etwa 1 bis etwa 2000 mg und normalerweise etwa 50 bis etwa 1000 mg pro Gramm des Trägermaterials, auf das Trockengewicht bezogen, betragen. Die oben angegebenen Mengen sollen jedoch die Erfindung nicht einschränken, insbesondere im Hinblick auf die Obergrenzen, wobei ein Trägermaterial, das dazu geeignet ist, das Enzym in einer Menge zu immobilisieren, die oberhalb der oben angegebenen Werte liegt, bevorzugt ist, da es hierdurch möglich wird, den Trägermaterialverbrauch zu vermindern. Da das erfindungsgemäss in immobilisierter Form verwendete Enzym eine sehr geringe Aktivität in einem trockenen organischen Lösungsmittel aufweist und instabil ist, ist es erforderlich, die Poren des immobilisierten Enzyms mit Wasser zu füllen, wenn dieses in dem organischen Lösungsmittel verwendet wird. Das in den Poren enthaltene Wasser sollte zweckmässig einen pH-Wert besitzen, der für die Aktivität der Metallo-proteinase geeignet ist. Da der optimale pH-Wert der Metallo-proteinase im neutralen Bereich liegt, kann das Wasser einen Puffer enthalten, der dazu geeignet ist, den gewünschten pH-Wert aufrechtzuerhalten (ein pH-Wert von etwa 5 bis etwa 9).

Wenngleich im Hinblick auf den Wassergehalt des immobilisierten Enzyms keine besonderen Beschränkungen bestehen, liegt der Wassergehalt üblicherweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 500 Gew.-% und vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 200 Gew.-%, bezogen auf das Trägermaterial auf Trockenbasis. Weiterhin ist es für diesen Zweck möglich, Wasser zu verwenden, das in natürlicher Weise von dem Trägermaterial zurückgehalten wird, wenn man das Enzym bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms aus einer wässrigen Lösung auf das Trägermaterial aufbringt.

Das bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendete Lösungsmittel ist ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel. Die Anwendung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels ist nicht erwünscht, es sei denn, dass man es als Zusatz zu dem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel verwendet, wie es nachstehend erläutert wird, da bei Anwendung eines solchen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels das in den Poren des immobilisierten Enzyms zurückgehaltene Wasser sich in dem organischen Lösungsmittel lösen und durch dieses ersetzt werden würde, wodurch die Reaktion gehindert würde. Bei der Verwendung des mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels ist es weiterhin bevorzugt, dieses in mit Wasser gesättigter Form einzusetzen, um sicherzustellen, dass es das in den Poren des Trägermaterials enthaltene Wasser nicht löst und in seiner Menge verringert. In diesem Sinne steht der Ausdruck «mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel», wie er hierin verwendet wird, mit anderen Worten für ein organisches Lösungsmittel oder eine homogene Mischung aus dem organischen Lösungsmittel und Wasser, das bzw. die sehr wenig Wasser löst, wenn es bzw. sie mit einer geringen Menge Wasser in Kontakt kommt. Demzufolge ist es, solange die Reaktionsbedingungen nicht gestört werden, möglich, das mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zu versetzen. Weiterhin ist es vorteilhaft wenn das mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel sowohl die Ausgangsmaterialien als auch das Reaktionsprodukt löst. Beispiele für bevorzugte organische Lösungsmittel sind niedrigmolekulare Alkylhalogenide, wie Chloroform und Äthylendi-chlorid Carbonsäureester, wie Äthylacetat und Isopropyl-acetat; Ketone, wie Methylisobutylketon; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol; und Mischungen aus solchen organischen Lösungsmitteln. Wie oben angegeben kann man diese Lösungsmittel mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Äthanol, versetzen, vorausgesetzt, dass der Zustand der Unmischbarkeit des organischen Lösungsmittels mit Wasser aufrechterhalten wird.

Vorzugsweise verwendet man beide Ausgangsmaterialien bei dem erfindungsgemässen Verfahren in hohen Konzentrationen, da die Reaktionsgeschwindigkeit um so grösser ist, je höher die Konzentrationen sind. Man verwendet die Ausgangsmaterialien normalerweise in einer Konzentration, in der sie sich in dem Lösungsmittel lösen. Da die Materialien jedoch mit fortschreitender Reaktion verbraucht werden, ist es möglich, einen Teil der Ausgangsmaterialien in suspendierter Form in dem Lösungsmittel vorliegen zu haben.. Vorzugsweise verwendet man die beiden Ausgangsmaterialien in Konzentrationen von etwa 0,001 m bis etwa 2 m und noch bevorzugter in Konzentrationen von etwa 0,01 m bis etwa 0,5 m.

Die Menge, in der die N-substituierte Asparaginsäure und der Phenylalaninniedrigalkylester bei dem erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden, entsprechen im allgemeinen einem stöchiometrischen Molverhältnis von 1:1, wenn beide Verbindungen in der L-Konfiguration verwendet werden. In der Praxis kann man sie in einem Verhältnis von 10:1 bis 1:10 und vorzugsweise von 3:1 bis 1:5 einsetzen. Wenn man die Materialien in der DL-Konfigu-ration verwendet, kann man sie in Mengen einsetzen, die so gehalten sind, dass die Verhältnisse der L-Isomeren innerhalb der oben angegebenen Bereiche liegen.

Bezüglich der Menge, in der das wasserhaltige immobilisierte Enzym bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendet wird, bestehen keine besonderen Beschränkungen. Bei Anwendung einer höheren Konzentration dieses immobilisierten Enzyms lässt sich die Reaktion in kürzerer Zeit vollständig durchführen, während bei niedriger Konzentration längere Reaktionszeiten erforderlich sind. Die verwendete Menge hängt auch von der Menge des auf dem Trägermaterial vorliegenden Enzyms und seiner Aktivität ab. Wenn man zum Beispiel das immobilisierte Enzym aus dem Enzym und dem Trägermaterial bildet, das keine besonders starke Wechselwirkung gegenüber dem Enzym aufweist, und diesen Fall mit dem vergleicht, bei dem das immobilisierte Enzym aus dem Enzym und einem Trägermaterial gebildet worden ist, das das Enzym stark adsorbiert, indem man beispielsweise eine Matrix aus einem Acrylsäureester

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verwendet, so enthält das zuletzt genannte Material eine grössere Menge des Enzyms als das erstgenannte. Demzufolge kann man im Vergleich zu dem ersteren Material mit dem letzteren Material bei Anwendung einer geringeren Menge einen vergleichbaren Effekt erzielen. Im allgemeinen genügt jedoch pro jeweils 1 Millimol der Ausgangsmaterialien die Anwendung von etwa 0,01 bis etwa 20 g und vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 5 g des wasserhaltigen immobilisierten Enzyms.

Zum Beispiel kann man das erfindungsgemässe Verfahren in der Weise durchführen, dass man das wasserhaltige, immobilisierte Enzym in dem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel suspendiert, das beide Ausgangsmaterialien enthält, und die Reaktion unter Rühren ablaufen lässt. Nach Beendigung der Reaktion kann man das immobilisierte Enzym und die das Reaktionsprodukt enthaltende Reaktionsmischung voneinander trennen, indem man die in Form einer Suspension vorliegende Reaktionsmischung filtriert usw.

Man kann das erfindungsgemässe Verfahren auch in einer mit dem wasserhaltigen, immobilisierten Enzym gefüllten Säule durchführen, indem man das mit Wasser nicht -mischbare organische Lösungsmittel, das die beiden Ausgangsmaterialien enthält, durch die Füllschicht der Säule fliessen lässt. Diese Methode ermöglicht die kontinuierliche Durchführung der Reaktion und ist für die industrielle Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens von Vorteil.

Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis etwa 80°C und vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 50°C.

Die Reaktionszeit hängt von den Konzentrationen der beiden Substrate, der Menge des immobilisierten Enzyms, der Menge, in der das Enzym auf dem Trägermaterial vorliegt, einer vorbestimmten Umwandlungsgeschwindigkeit usw. ab. Im allgemeinen genügt eine Reaktionszeit von etwa 0,5 bis etwa 200 Stunden und vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 100 Stunden.

Man kann das Reaktionsprodukt, den N-substituierten L-Aspartyl-L-phenylalaninniedrigalkylester, nach der Durchführung der erfindungsgemässen Reaktion aus der von dem immobilisierten Enzym abgetrennten Reaktionsmischung in üblicher Weise isolieren, beispielsweise durch Aufkonzentrieren bis zur Kristallisation, durch Extraktion oder dergleichen. Da das immobilisierte Enzym, das von der in Form einer Suspension vorliegenden Reaktionsmischung abgetrennt worden ist, eine ausreichend hohe Aktivität aufweist, kann es erneut verwendet werden.

Die mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens erhaltenen Dipeptide sind nützliche Produkte. Beispielsweise kann man durch Abspalten des N-Substituenten mit Hilfe einer geeigneten Verfahrensweise von dem Dipeptid, das als niedrigmolekulare Alkylgruppe eine Methylgruppe aufweist, den L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester bilden, ein Süs-sungsmittel, das im Vergleich zu Saccharose die zweihundertfache Süsskraft besitzt.

Wie aus den obigen Ausführungen hervorgeht, kann man mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens die Peptidbindungen bei einer in einem organischen Lösungsmittel durchgeführten Reaktion bilden, so dass es möglich wird, das Enzym ohne Schwierigkeit zurückzugewinnen und wiederzuverwenden. Da die Hydrolyse des Phenylalanin-niedrigalkylesters unterdrückt wird, da die Reaktion in dem organischen Läsungsmittel durchgeführt wird, ergeben sich geringere Verluste der Ausgangsmaterialien im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden, bei denen die Reaktion in einem wässrigen Medium durchgeführt wird. Wenn beide Ausgangsmaterialien in der L-Konfiguration eingesetzt werden, beträgt im Fall der Reaktion in einem wässrigen Medium, die in der JP-OS 92729/1978 beschrieben ist, das stöchiometrische Molverhältnis von N-substituierter Asparaginsäure zu dem Phenylalaninniedrigalkylester 1:2, während dieses Molverhältnis bei dem erfindungsgemässen Verfahren 1:1 beträgt Demzufolge kann man bei dem erfindungsgemässen Verfahren den Phenylalaninniedrigalkylester in geringerer Menge einsetzen, was einen erheblichen Vorteil für die industrielle Durchführung des Verfahrens darstellt.

Weiterhin kann man dann, wenn bei dem erfindungsgemässen Verfahren die Ausgangsmaterialien in der DL-Konfiguration verwendet werden, eine Anreicherung des oder der D-Isomeren eines oder beider Ausgangsmaterialien bei gleichzeitiger Bildung des Peptids erreichen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Man versetzt zunächst 25 ml einer 0,05 mNatrium-acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 mit 3,0 g Thermoase (Titer: 1,6 Millionen PU/g) und 0,15 g Calcium-acetat-monohydrat und vermischt die Bestandteile. Dann zentrifugiert man, um die überstehende Flüssigkeit von dem unlöslichen Material zu trennen. Die in dieser Weise erhaltene überstehende Flüssigkeit versetzt man mit 30 ml (20 g) eines feuchten Acrylsäureester-Matrix-Trägermate-rials (Amberlite XAD-7, das einen Wassergehalt von etwa 230 Gew.-% auf Trockenbasis aufweist) und rührt die erhaltene Mischung über Nacht unter Bildung einer wässrigen Suspension des immobilisierten Enzyms. Man trennt das Wasser enthaltende immobilisierte Enzym durch Filtration ab, indem man das Material über ein Glasfilter absaugt. Ausgehend von der anfänglich eingesetzten Enzymmenge und der enzymatischen Aktivität des Filtrats, die man mit Hilfe eines Digestionsverfahrens ermittelt, beträgt die auf dem Trägermaterial vorliegende Enzymmenge des immobilisierten Enzyms etwa 3 g. Der Wassergehalt des in dieser Weise gebildeten immobilisierten Enzyms entspricht im wesentlichen dem anfänglichen Wassergehalt des Trägermaterials. Auch in den nachstehenden anderen Beispielen verwendet man die gleiche Methode zur Bestimmung der Menge des auf dem Trägermaterial vorliegenden Enzyms.

Man gibt das in dieser Weise gebildete immobilisierte Enzym zu 37 ml einer Äthylacetatlösung, die zuvor mit Wasser gesättigt worden ist und die 3,21 g (12 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 4,14 g (23 mMol) L-Phenylalaninmethylester enthält. Dann führt man die Reaktion unter mässigem Rühren während 23 Stunden bei 40°C durch. Nach Beendigung der Reaktion trennt man das immobilisierte Enzym durch Absaugen unter Verwendung eines Glasfilters ab und wäscht mit 50 ml Äthylacetat.

Man vermischt das Filtrat und die Waschflüssigkeit, wäscht zweimal mit 20 ml In Chlorwasserstoffsäure und einmal mit 20 ml Wasser. Man trocknet die in dieser Weise erhaltene Äthylacetatschicht mit trockenem Natriumsulfat und engt ein. Dann gibt man n-Hexan zu, bis die Flüssigkeit weiss und trüb wird. Dann lässt man die Äthylacetatschicht über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Man isoliert die gebildeten Kristalle des n-Benzyloxycarbonyl-L--aspartyl-L-phenylalaninmethylesters durch Filtration und kristallisiert die Verbindung aus einer Äthylacetat/n-Hexan-Mischung als Lösungsmittel um. Man erhält die Verbindung mit einer Ausbeute von 3,71 g (72,3%). Die physikalischen Kenndaten des in dieser Weise erhaltenen N-Ben-zyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylesters sind nachstehend angegeben:

Schmelzpunkt: 118 bis 124°C Drehwert [a]D25: —14,6 (C = 1, Methanol)

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Elementaranalyse:

berechnet: C 61,67 H 5,65 N 6,54 %

gefunden: C 61,53 H 5,72 N 6,48 %

Man trennt zunächst einen aliquoten Anteil der Äthyl-acetatschicht ab und löst das Material nach dem Eindampfen bis zur Trockne in einer wässrigen Natriumacetatlösung (0,8 Gew.-%). Die in dieser Weise erhaltene Lösung unterwirft man einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromato-graphieanalyse, wobei sich zeigt, dass die Ausbeute an dem N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester bei der Reaktion 84,7 % beträgt.

Die für die Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatogra-phieanalyse eingesetzte Vorrichtung und die angewandten Bedingungen sind nachstehend angegeben:

Vorrichtung: Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromato-graph der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. (TSK HLC 802).

Säule: 300 mm Länge, 7,5 mm Innendurchmesser.

Füllung: Stärkegel mit einer Teilchengrösse von 5 (im der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. (TSK GEL, LS-170, P5).

Elutionsmittel: Wässrige Natriumacetatlösung (0,8 Gew.-%).

Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min.

Druckabfall: 20 kg/cm.

Detektor: UV 254 nm.

Wenn nicht anders angegeben, werden diese Vorrichtung und die angegebenen Bedingungen auch bei den folgenden Beispielen zur Untersuchung der Reaktionsprodukte und der Bestimmung ihrer Ausbeuten verwendet.

Beispiel 2

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Reaktion in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durch mit dem Unterschied, dass man die Thermoase in einer Menge von 9,0 g, Calciumacetat-monohydrat in einer Menge von 0,45 g, die 0,05 mNatriumacetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 in einer Menge von 90 ml verwendet; das Acrylsäureester-Matrix-Trägermaterial (Amber-lite XAD-7) durch 16,6 g eines anderen Trägermaterials der gleichen Klasse ersetzt (Amberlite XAD-8, das etwa 150 Gew.-% Wasser, auf Trockenbasis, enthält); 2,14 g (8 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 2,87 g (16 mMol) L-Phenylalaninmethylester anstelle des DL-Phe-nylalaninmethylesters verwendet; 26 ml der mit Wasser gesättigten Äthylacetatlösung einsetzt und die Reaktion während 5 Stunden durchführt. Man erhält den N-Benzyloxy-carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 79,8%.

Die Enzymmenge, die auf dem nach der Verfahrensweise dieses Beispiels hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegt, beträgt etwa 6 g. Der Wassergehalt dieses immobilisierten Enzyms ist annähernd der gleiche wie der anfängliche Wassergehalt des Trägermaterials.

Beispiel 3

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise mit den folgenden Unterschieden durch:

Man verwendet anstelle der in Beispiel 2 eingesetzten Äthylacetatlösung 50 ml mit Wasser gesättigten Methyl-isobutylketons; arbeitet bei einer Reaktionszeit von 3 Stunden; und bewirkt das Waschen des immobilisierten Enzyms nach Beendigung der Reaktion mit Methylisobutylketon. Man erhält N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester in einer Ausbeute von 41,0%.

Die Menge, in der das Enzym auf dem gemäss diesem Beispiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegt, und der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms entsprechen im wesentlichen den Werten des im-5 mobilisierten Enzyms von Beispiel 2.

Beispiel 4

Man führt die Herstellung des imlobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der in Beispiel 2 beschriebenen io Weise unter Einhaltung der folgenden Unterschiede durch: Man verwendet die Thermoase bzw. das Calciumacetat-monohydrat in einer Menge von 7,0 g bzw. 0,31 g; anstelle der N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure verwendet man 3,56 g (12 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-aspara-15 ginsäure; und man ersetzt den DL-Phenylalaninmethylester durch 4,30 g (24 mMol) L-Phenylalaninmethylester; man benützt 39 ml der mit Wasser gesättigten Äthylacetatlösung und hält die Reaktionstemperatur bei 25°C. Nach Beendigung der Reaktion trennt man das immobilisierte Enzym 20 durch Absaugen unter Verwendung eines Glasfilters ab und wäscht das immobilisierte Enzym mit 50 ml Äthylacetat. Man behandelt das Filtrat und die Waschflüssigkeit nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise und erhält bei der Isolierung des N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-25 -aspartyl-L-phenylalaninmethylesters 3,93 g Kristalle (Ausbeute = 71,5%).

Die Menge des auf dem nach der Verfahrensweise dieses Beispiels hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzyms vorliegenden Enzyms und der Wassergehalt des 30 immobilisierten Enzyms entsprechen den Werten des immobilisierten Enzyms von Beispiel 2.

Die physikalischen Kenndaten des in dieser Weise erhaltenen N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phe-nylalaninmethylesters sind nachstehend angegeben: 35 Schmelzpunkt: 125 bis 129°C

Drehwert: [a]D25: —11,5 (C = 1, Methanol) Elementaranalyse: C^H^N^

berechnet: C 60,25 H 5,72 N 6,11 % gefunden: C 60,43 H 5,80 N 5,90 %

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Man bestimmt die Ausbeute der Bildung des N-p-Meth-oxybenzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethyl-esters durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie nach der Verfahrensweise von Beispiel 1. Bei dieser Mes-45 sung ergibt sich eine Ausbeute von 81,3%.

Beispiel 5

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der Verfahrensweise von Beispiel so 4 mit den folgenden Unterschieden durch: Man ersetzt die in Beispiel 4 verwendete Natriumacetatpufferlösung durch 70 ml destilliertes Wasser; man ersetzt die N-p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure durch 3,21 g (12 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure; verwendet 2,15 g 55 (12 mMol) L-Phenylalaninmethylester; und arbeitet während einer Reaktionszeit von 24 Stunden. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 74,8%.

Die Menge, in der das Enzym auf dem gemäss diesem 60 Beispiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegt, und der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms entsprechen den Werten des immobilisierten Enzyms von Beispiel 2.

65 Beispiel 6

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise mit den folgenden Unterschieden durch:

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Man ersetzt das Äthylacetat durch eine mit Wasser gesättigte Isopropylacetatlösung; arbeitet bei einer Reaktionsdauer von 21,5 Stunden; und verwendet als Waschflüssigkeit für das Waschen des immobilisierten Enzyms nach Beendigung der Reaktion Isopropylacetat. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenyllaninmethylester in einer Ausbeute von 82,0%.

Die Menge des auf dem nach der Verfahrensweise dieses Beispiels hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzyms vorliegenden Enzyms und der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms entsprechen den Werten des immobilisierten Enzyms von Beispiel 1.

Beispiel 7

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise mit den folgenden Unterschieden durch:

Man setzt die Thermoase in einer Menge von 2 g und Calciumacetat-monohydrat in einer Menge von 0,1 g ein; man ersetzt die Natriumacetatpufferlösung durch 20 ml einer 0,05m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 man ersetzt das Acrylsäureester-Matrix-Trägermaterial durch 3 g trockene, poröse Glas-kügelchen mit einem Porendurchmesser von 500 Â (CPG-10 der Firma Electro-Nucleonix Company) und bewirkt die Herstellung des immobilisierten Enzyms bei einer Reaktionsdauer von 1 Stunde. Man verwendet 0,08 g (0,3 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 0,109 g (0,61 mMol) L-Phenylalaninmethylester; ersetzt das Äthylacetat durch 30 ml mit Wasser gesättigten Chloroforms; arbeitet bei einer Reaktionsdauer von 21 Stunden und verwendet als Waschflüssigkeit für das Waschen des immobilisierten Enzyms nach Beendigung der Reaktion Chloroform. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester in einer Ausbeute von 20,1%.

Die Enzymmenge, die auf dem immobilisierten Enzym vorliegt, beträgt etwa 0,7 g, während der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms etwa 150 Gew.-%, auf Trockenbasis, beträgt.

Beispiel 8

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Reaktion nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 mit den folgenden Unterschieden durch:

Man verwendet 1,0 g Thermoase und 0,05 g Calciumacetat-monohydrat; ersetzt die Natriumacetatpufferlösung durch 10 ml einer 0,05m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer-lösung mit einem pH-Wert von 8,0; ersetzt das Acrylsäure-ester-Matrix-Trägermaterial durch 3 g trockene poröse Glaskügelchen mit einem Porendurchmesser von 500 Â (CPG-10 der Firma Electro-Nucleonix Co.); arbeitet bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms bei einer Reaktionsdauer von 1 Stunde; verwendet 3,94 g (22 mMol) L-Phe-nylalaninmethylester und 43 ml der mit Wasser gesättigten Äthylacetatlösung; und bewirkt die Reaktion innerhalb von 65 Stunden. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspar-tyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 74,2%.

Die Menge des auf dem nach der Verfahrensweise dieses Beispiels hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzyms vorliegenden Enzyms und sein Wassergehalt entsprechen den Werten des immobilisierten Enzyms von Beispiel 7.

Beispiel 9

Man führt die Reaktion nach der in Beispiel 8 beschriebenen Verfahrensweise mit dem Unterschied durch, dass man das nach der Verfahrensweise von Beispiel 8 nach Beendigung der Reaktion abgetrennte und zurückgewonnene immobilisierte Enzym für die Reaktion verwendet und die Reaktion während 93 Stunden durchführt. Man erhält den N -B enzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 88,0%.

Beispiel 10

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Durchführung der Reaktion nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise mit den folgenden Unterschieden durch:

Man verwendet die Thermoase in einer Menge von 4 g und Calciumacetat-monohydrat in einer Menge von 0,2 g; man setzt die 0,05m Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 g in einer Menge von 40 ml ein; ersetzt das Acrylsäureester-Matrix-Trägermaterial durch 15 ml (11,7 g) eines feuchten hydrophilen Gels (Toyopearl 5 der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., das etwa 230 Gew.-% Wasser, auf Trockenbasis, enthält und Carboxy-methylgruppen aufweist); man bewirkt die Herstellung des immobilisierten Enzyms während 1 Stunde; ersetzt das L-Isomere der N-Benzyloxycarbonyl-asparaginsäure durch die DL-Isomeren und arbeitet bei einer Reaktionsdauer von 22 Stunden. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl-L--aspartyl-L-yhenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 41,0%.

Die auf dem gemäss diesem Beispiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegende Enzymmenge beträgt etwa 0,9 g, während der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms annähernd dem anfänglichen Wassergehalt des Trägermaterials entspricht.

Beispiel 11

Anstelle des in Beispiel 1 verwendeten Acrylsäureester-Matrix-Trägermaterials verwendet man 15 ml (11,7 g) eines feuchten hydrophilen Gels (Toyopearl 5 der Firma Toyo Soda Manufacturing'Co., Ltd.), das etwa 230 Gew.-% Wasser, auf Trockenbasis, und Diäthylaminoäthylgruppen aufweist; die Herstellungsdauer des immobilisierten Enzyms beträgt 5 Stunden; man ersetzt die L-Isomeren der N-Ben-zyloxycarbonylasparaginsäure und des Phenylalaninmethyl-esters, die bei Beispiel 1 verwendet wurden, durch die entsprechenden DL-Isomeren; und führt die Umsetzung während 22,5 Stunden durch. Man erhält den N-Benzyloxy-carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 25,5%.

Die auf dem gemäss dem vorliegenden Beispiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegende Enzymmenge beträgt etwa 1,0 g, während der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms annähernd dem Wassergehalt des anfänglich eingesetzten Trägermaterials entspricht.

Beispiel 12

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 mit den folgenden Unterschieden durch:

Man verwendet anstelle der in Beispiel 1 verwendeten 0,05m Natriumacetat Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 25 ml einer 0,1m Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0; man ersetzt das in Beispiel 1 verwendete Acrylsäureester-Matrix-Trägermaterial durch 15 ml (11,7 g) eines feuchten hydrophilen Trägermaterials, das eine schwache Wechselwirkung mit dem Enzym zeigt (Toyopearl 5 der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), das etwa 230 Gew.-% Wasser, auf Trockenbasis, enthält; und gibt •

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bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms 0,6 g Kar-toffel-Inhibitor zu. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl--L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester in einer Ausbeute von 55i5%.

Die auf dem gemäss diesem Beispiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegende Enzymmenge beträgt etwa 0,8 g, während der Wassergehalt dieses immobilisierten Enzyms annähernd dem Wassergehalt des ursprünglich eingesetzten Trägermaterials entspricht.

Beispiel 13

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 mit den folgenden Unterschieden durch:

Man verwendet die Thermoase in einer Menge von 2,0 g und das Calziumacetat-monohydrat in einer Menge von 0,1 g; man ersetzt die Natriumacetat-Pufferlösung durch 20 ml destilliertes Wasser; man ersetzt das Acrylsäureester-Matrix-Trägermaterial durch 11,7 g eines feuchten hydrophilen Gels (TOYOPEARL-5 der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.) das etwa 230 Gew.-% Wasser auf Trockenbasis enthält und Epoxidgruppen aufweist; und man versetzt die Suspension mit einer wässrigen Natriumhydroxidlösung, um ihren pH-Wert auf 8,0 einzustellen. Die Menge und der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms entsprechen den in Beispiel 12 verwendeten Mengen.

Weiterhin führt man die Reaktion nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 durch, mit dem Unterschied, dass man 2,14 g (8 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 2,87 g (16 mMol) L-Phenylalaninmethylester einsetzt, 26 ml mit Wasser gesättigtes Äthylacetat verwendet und bei einer Reaktionszeit von 28,5 Stunden arbeitet. Mit Hilfe dieser Reaktionsweise erhält man den N-Benzyloxy-carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 82,9%.

Beispiel 14

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Durchführung der Reaktion nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 unter Anwendung der folgenden Unterschiede durch:

Man ersetzt die Thermoase durch 0,45 g Thermolysin mit einem Titer von 8 080 PU/mg (ein Produkt der Daiwa Kasei K.K.); man ersetzt das Acrylsäureester-Matrix-Trä-germaterial durch 15,6 g eines feuchten hydrophilen Gels (TOYOPEARL-7 der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.) mit einem Wassergehalt von etwa 230 Gew.-%, auf Trockenbasis. Man erhält N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl--L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 59,8%.

Die Menge des auf dem gemäss dem vorliegenden Beispiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzyms-des vorliegenden Enzyms beträgt etwa 0,15 g, während der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms annähernd dem des eingesetzten Trägermaterials entspricht.

Beispiel 15

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Reaktion nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise mit den folgenden Unterschieden durch:

Man ersetzt die in Beispiel 4 verwendete Natriumace-tat-Pufferlösung durch 70 ml destilliertes Wasser; ersetzt die N-p-methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure durch 2,80 g (12 mMol)N-tert.-Butoxycarbonyl-L-asparaginsäure; und arbeitet bei einer Reaktionstemperatur von 40°C und einer Reaktionszeit von 23 Stunden. Das in dieser Weise hergestellte und verwendete immobilisierte Enzym besitzt den gleichen Enzymgehalt und den gleichen Wassergehalt wie das immobilisierte Enzym von Beispiel 4. 5 Man vermischt das Filtrat, aus dem das immobilisierte Enzym entfernt wurde mit der Waschflüssigkeit. Dann isoliert man nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 den N-tert.-Butoxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethyl-ester, der in einer Ausbeute von 1,4 g (29,6%) erhalten wird, io Die physikalischen Kenndaten des erhaltenen N-tert.--Butoxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester sind nachstehend angegeben:

Schmelzpunkt: 149-150°C Drehwert [a]D25: —15,3 (c = 1, Methanol) 15 Elementaranalyse: ClgH26N207

berechnete Werte: C 57,85 H 6,65 N 7,10 %

gefundene Werte: C 58,03 H 6,56 N 7,05 %

Man entnimmt einen aliquoten Anteil der Äthylacetat-20 schicht, löst das Material nach dem Trocknen in einer Natriumacetatlösung (0,8 Gew.-%) und unterwirft es der in Beispiel 1 beschriebenen Analyse. Es zeigt sich, dass man den N-tert.-Butoxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninme-thylester in einer Ausbeute von 62,6% erhält.

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Beispiel 16

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Durchführung der Reaktion nach der Verfahrensweise von Beispiel 7 mit dem Unterschied durch, dass man 30 anstelle des Chloroforms als Lösungsmittel für die Peptidbindungen Bildungsreaktion Toluol verwendet. In diesem Beispiel erhält man den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl--L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 10,5%.

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Beispiel 17

Man bereitet das immobilisierte Enzym nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, mit dem folgenden Unterschied:

40 Man verwendet Thermoase in einer Menge von 21,0 und Calziumacetat-monohydrat in einer Menge von 1,05 g; man ersetzt die Natriumacetat-Pufferlösung durch 210 ml destilliertes Wasser; man verwendet 100 g des Acrylsäure-ester-Matrix-Trägermaterials (Amberlite XAD-7, das 230% 45 Wasser auf Trockenbasis enthält); und bewirkt das Rühren der das Trägermaterial enthaltenden Enzymlösung während 4 Stunden.

Die auf dem in dieser Weise gebildeten immobilisierten Enzym vorliegende Enzymmenge beträgt etwa 20 g. Der 50 Wassergehalt des immobilisierten Enzyms entspricht annähernd dem anfänglichen Wassergehalt des Trägermaterials.

Man beschickt eine Glassäule des Strömungstyps mit einem Innendurchmesser von 24 mm und einer Höhe von 300 mm, die an ihrer Aussenseite mit einem Wärmeisola-55 tionsmantel ausgerüstet ist, mit dem in dieser Weise erhaltenen immobilisierten Enzym. Dann führt man 700 g einer mit Wasser gesättigten und bei 35°C gehaltenen Äthylacetatlösung, die 74 g L-Phenylalaninmethylester und 55 g N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure enthält, mit einer 60 Strömungsgeschwindigkeit von etwa 0,3 ml pro Minute durch die Säule, währenddem man die Temperatur des Mantels für die Reaktion bei 40°C hält. 17 Stunden nach Beginn der Reaktion enthält der Abstrom der Säule N-Ben-zyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in 65 einer Ausbeute von 54,3%.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden aus einer N-substituierten Asparaginsäure und einem Phenylalanin-niedrigalkylester, dadurch gekennzeichnet, dass man die N-substituierte Asparaginsäure und den Phenylalaninnied-rigalkylester in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Wasser enthaltenden, immobilisierten Metallo-proteinase umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die N-substituierte Asparaginsäure als Substituent einen Substituenten des Urethan-Typs aufweist.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die N-substituierte Asparaginsäure als Substituent eine Benzyloxycarbonylgruppe, eine p-Methoxy-benzyloxycarbonylgruppe oder eine tert.-Butoxycarbonyl-gruppe aufweist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die N-substituierte Asparaginsäure in der L-Konfiguration und/oder in der DL-Kon-figuration verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man den Phenylalaninniedrig-alkylester in der L-Konfiguration und/oder in der DL-Kon-figuration verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Phenylalaninniedrigalkyl-ester als niedrigmolekulare Alkylgruppe eine Methylgruppe aufweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Metallo-proteinase Thermolysin verwendet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Metallo-proteinase Thermoase verwendet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel ein niedrigmolekulares Alkylhalogenid, einen Carbonsäureester, ein Keton, einen aromatischen Kohlenwasserstoff oder eine Mischung aus solchen Lösungsmitteln verwendet.