DE3787882T2

DE3787882T2 - Enzym vermittelnde Kupplungsreaktionen.

Info

Publication number: DE3787882T2
Application number: DE87118433T
Authority: DE
Inventors: Akiva Tuvia Gross
Original assignee: Hampshire Chemical Corp
Current assignee: Hampshire Chemical Corp
Priority date: 1986-12-22
Filing date: 1987-12-12
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2007-12-13
Also published as: NZ220958A; EP0272564A3; JPS63169993A; CA1320923C; EP0272564A2; JP2641464B2; DE3787882D1; AU600779B2; AU8292887A; ATE96176T1; ES2059350T3; EP0272564B1

Description

Hintergrund der Erfindung:

Enzym-vermittelte Synthesen von Dipeptiden sind gut bekannt. So beschreiben die US-Patente 4 165 311, 4 436 925 und 4 256 836 die Synthese in wäßrigem Medium zur Bildung unlöslicher Additions-Verbindungen, d. h., die Additions-Verbindung von einem Mol Phenylalaninmethylester mit einem Mol N-geschütztem Aspartylphenylalaninmethylester. US-Patent 4 284 721 lehrt, daß N-geschützte Asparaginsäure und niedere Phenylalanin-Alkylester in Gegenwart eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels, das mit Wasser mischbare Co-Solventien enthalten kann, enzymatisch verknüpft werden kann, daß aber die Menge des mit Wasser mischbaren Lösungsmittels begrenzt sein muß, um eine Inaktivierung oder Inhibierung des Enzyms zu vermeiden. Die US-Patente 4 116 768 und 4 119 493 enthalten ähnliche Ausführungen im Hinblick auf die Verwendung von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln als Co-Solventien in wäßrigem Medium. Ebenso zeigt Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 24 (1985) Nummer 2, Seite 87, daß mit Wasser mischbare Lösungsmittel als Co-Solventien in einer Mischung mit Wasser verwendet werden können, daß die katalytische Aktivität von Protease-Enzymen aber abnimmt, wenn die Konzentration des Co-Solvens zunimmt, wobei bei 50% oder mehr keine Synthese stattfindet, wenn Chymotrypsin als Enzym verwendet wurde. Als mögliche Ausnahme kann in manchen Fällen die Verwendung eines Polyols (z. B. 1,4-Butandiol) das Enzym stabilisieren.
Die Verwendung von wäßrigen oder wäßrig-organischen Medien für die enzymatische Kupplung zur Bildung von N-Formyl-Dipeptiden (z. B. N-Formylaspartam) bzw. von Polypeptiden wird auch in WO 8604924, im Europäischen Patent 0 149 594, in NL-A-8620072 (DMF als mit Wassermischbares Lösungsmittel) und in FR-A-2 328 695 (wäßrige Lösungen ohne organisches Co-Solvens) beschrieben.
In einer Anzahl von Artikeln in verschiedenen wissenschaftlichen Journalen wird auch die Verwendung von Enzymen mit einer Kombination von Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln beschrieben, und es werden Ausbeuten erhalten, die abhängig von der Wahl des Lösungsmittels, der Wasser-Menge, des Enzyms und des Substrats zu variieren scheinen. Es scheint auch ein Faktor zu sein, ob das Enzym immobilisiert ist. Die Verwendung eines 50/50 Acetonitril/Wasser Lösungsmittel-Systems wird von Nilsson und Mosbach in Biotech Bioeng. 26, 1146 (1984) beschrieben. Diese Literaturstelle beschreibt auch die Verwendung von Butandiol/Wasser (90/10). Die Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel wird auch von J.B. Jones und J.F. Beck in Applications of Biochemical Systems in Organic Chemistry, Teil 1 (J.B. Jones, C.J. Sih. und D. Perlman, Herausgeber) Seite 107 ff. New York; J. Wiley, 1976; und J.B. Jones und M.M. Mehes., Can. J. Chem. 57, 2245 (1979) diskutiert. Die Verknüpfung von L-Phenylalaninmethylester (d. h., L-pheoMe) und N-geschützter N-Carbobenzyloxy-asparaginsäure (d. h., Z-asp) unter Verwendung einer Mischung von mit Wasser nicht mischbaren/mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln wird in Biotech. Lett. 7, 789 (1985) beschrieben. Konnecke et al. verweisen in Monatsschriften für Chemie, 112, 469-481 (1981) auf Seite 475 auf die Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel. Andere Artikel von Interesse sind J. Biochem., 89, 385 (1981); J. Ort. Chem., 51, 2728 (1986); Coll. Czechos. Chem. Comm., 49, 231 (1984); und Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 3241 (1983).
Während die Literatur zeigt, daß Enzyme im allgemeinen und Proteasen im besonderen in sowohl mit Wasser mischbaren als auch mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln eingesetzt wurden, scheint es eine allgemeine Vorstellung zu sein, daß die mit Wasser mischbaren Lösungsmittel mehr als unterlegen sind. So wurde ausgeführt, daß "die meisten Enzyme in hydrophilen, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln inaktiv sind, was leicht zu verstehen ist, wenn dem Enzym essentielles Wasser entzogen wird, das ins Lösungsmittel hineingeht". (A.M. Klibanov, Chemtech, Seite 354, Juni 1986).
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Verwendung einer Wasser-enthaltenden Metalloprotease in einem eine Mischung von Acetonitril und Wasser umfassenden Lösungsmittel, wobei das Gewichtsverhältnis von Acetonitril zu Wasser größer als 1 : 1 ist.

Beschreibung der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem eine Wasser-enthaltende Metalloprotease verwendet wird, um die Bildung einer Peptid-Bindung zwischen zwei Substraten zu katalysieren, die aus der Gruppe bestehend aus N-substituierter Asparaginsäure und einem niederen Phenylalanin-Alkylester ausgewählt sind. Das benzylische Kohlenstoffatom des Esters kann durch eine oder mehrere labile Gruppen, die leicht durch Wasserstoff ersetzbar sind, substituiert sein. Das Verfahren der Erfindung umfaßt die Ausführung des obigen Verfahrens in einem eine Mischung von Acetonitril und Wasser umfassenden Lösungsmittel, wobei das Gewichtsverhältnis von Acetonitril zu Wasser größer als 1 : 1 ist.
Die Verwendung von Acetonitril bietet viele Vorteile. Im Gegensatz zu den Erwartungen kann das Lösungsmittel eingesetzt werden, ohne daß dem Enzym essentielles Wasser entzogen wird. Zum Beispiel kann die für die Enzym-Aktivität essentielle Menge Wasser bei Durchführung eines kontinuierlichen Verfahrens zur Verfügung gestellt werden, indem 2-10 Gew.-% Wasser bezogen auf das Lösungsmittel-System beibehalten werden, wobei der Rest Acetonitril ist. In einem geschlossenen System (d. h. im wesentlichen eine Batch-Reaktion im Gegensatz zu einer kontinuierlichen Reaktion) werden das Enzym und dessen Träger genügend Wasser verlieren, um die oben genannten 2-10 Gew.-% zur Verfügung zu stellen. Es sollte jedoch klar sein, daß, wenn das Enzym mit einer ausreichend großen Menge von im wesentlichen wasserfreiem Acetonitril in Kontakt gebracht wird, genügend Wasser extrahiert wird, so daß der Wasser-Gehalt im Lösungsmittel unter etwa 2% fällt und das Enzym denaturiert wird. Wassermengen oberhalb 10%, z. B. mehr als 50%, können eingesetzt werden, die Vorteile bei Verwendung von Acetonitril können dabei aber verringert werden.
In vielen Reaktionen kann die Verwendung eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels als einzigem Lösungsmittel oder als Co-Solvens zu einer einzigen flüssigen Phase führen, wodurch Limitierungen aufgrund von Phasentransfer vermieden werden, die auftreten, wenn das Lösungsmittel mit Wasser nicht mischbar ist. Zum Beispiel erhöht die Verwendung eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels häufig die Reaktionsgeschwindigkeit. Auch die dielektrische Konstante der meisten nützlichen, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel liegt zwischen 5 und 60 (vorzugsweise 30 bis 60), was zur Bildung einer einzigen flüssigen Phase beiträgt, da die meisten Aminosäure-Derivate relativ polar und in solchen Lösungsmitteln löslich sind. Zum Beispiel ist der Methylester von Phenylalanin sehr viel leichter in Acetonitril löslich als in Hexan oder Ethylacetat.
Die Verwendung von einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel kann auch das Reaktionsgleichgewicht verschieben. Zum Beispiel ergibt die Reaktion von N-Formylasparaginsäure mit Phenylalaninmethylester in Ethylacetat eine Ausbeute von etwa 10% während die Ausbeute in Acetonitril etwa 80% beträgt.
Das Enzym, entweder immobilisiert oder in "freier" Form, kann in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel sehr viel stabiler sein als im Vergleich dazu in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel. Zum Beispiel ist auf Silica oder einem Ionenaustauschharz (z. B. Amberlite) immobilisiertes Thermolysin in Acetonitril stabiler als in Ethylacetat. Unter "Stabilität" versteht man, daß das Enzym der Denaturierung, entweder durch Extraktion von Wasser oder aus anderen Gründen, widersteht. Der Begriff "Lösungsmittel-System" wird verwendet, um den Lösungsmittel-Anteil der flüssigen Phase zu bezeichnen und schließt Acetonitril und Wasser ein.
Unter dem Begriff "mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel" werden diejenigen organischen Flüssigkeiten verstanden, die mit Wasser in einem beliebigen Verhältnis mischbar sind, um ein Ein-Phasen-System zu bilden.
Acetonitril ist das in dieser Erfindung verwendete mit Wasser mischbare Lösungsmittel.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann Acetonitril in Verbindung mit einer großen Vielzahl von Aminosäuren und Enzymen verwendet werden, um Dipeptide und Polypeptide durch eine Enzym-vermittelte Verknüpfungsreaktion zu bilden. Beispiele für geeignete Aminosäuren zur Verwendung bei dieser Reaktion schließen aliphatische Aminosäuren wie zum Beispiel Monoaminomonocarbonsäuren, z. B. Glycin (Gly), Alanin (Ala), Valin (Val), Norvalin (nor-Val), Leucin (leu), Isoleucin (iso-Leu), Norleucin (nor-Leu); Oxyaminosäuren, z. B. Serin (Ser), Threonin (Thr), homo-Serin (homo-Ser); Schwefel-enthaltende Aminosäuren, z. B. Methionin (Met) oder Cystin (CysS) und Cystein (CysH); Monoaminodicarbonsäuren, z. B. Asparaginsäure (Asp) und Glutaminsäure (Glu); Diaminomonocarbonsäuren, z. B. Ornithin (Orn) Lysin (Lys), Arginin (Arg); aromatische Aminosäuren, z. B. Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr) und heterocyclische Aminosäuren, z. B. Histidin (His), Tryptophan (Trp), ein. (Die Aminosäuren sind mit den Symbolen bezeichnet, die auf diesem Gebiet gebräuchlich sind.)
Die Aminosäuren, die im allgemeinen als Acyl-Donor wirken, besitzen eine Schutzgruppe an der N-Position. Beispiele geeigneter N-Schutzgruppen sind diejenigen, die normalerweise bei der Peptid-Synthese verwendet werden, wie zum Beispiel tertiäre Alkoxycarbonyl-Gruppen, z. B. t-Butyloxycarbonyl (BOC-), t-Amyloxycarbonyl (t-Aoc); Benzyloxycarbonyl-Gruppen, die mit einem inerten Substituenten substituiert sein können, wie zum Beispiel Benzyloxycarbonyl (Z-), p-Methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ-), 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl (Z(OMe)&sub2;-), 2,4,6-Trimethylbenzyloxycarbonyl (TMZ-), p-Phenylazobenzyloxycarbonyl (PZ-), p-Toluolsulfonyl (tosyl-); o-Nitrophenylsulfenyl (Nps-) und dergleichen. Es kann auch Formyl eingesetzt werden.
Beispiele geeigneter Aminosäuren, die die Amino-Einheit bei der Bildung eines Dipeptids oder Polypeptids abgeben, schließen alle der oben genannten ein. Phenylalanin wird bevorzugt, und insbesondere können am benzylischen Kohlenstoff substituierte Derivate eingesetzt werden, z. B. Derivate, bei denen der benzylische Kohlenstoff mit wenigstens einer Gruppe substituiert ist, die leicht durch Verfahren wie zum Beispiel katalytische Hydrierung oder elektrochemische reduktive Spaltung ersetzbar ist. Beispiele geeigneter, substituierter Phenylalanin-Derivate schließen diejenigen ein, die der folgenden Formel entsprechen:
wobei Ph Phenyl ist (substituiert oder unsubstituiert), während X für -OH, -SH, -Cl, -Br, -I, -OCOCH&sub3;, -OCOOCH&sub3;, -NH&sub2; oder -SCH&sub3; steht und R eine niedere Alkyl-Gruppe ist, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt.
Die Amino-abgebenden Aminosäuren werden durch geeignete C-terminale Schutzgruppen geschützt. Die Schutzgruppen für die Carboxyl-Gruppe (C-terminale Schutzgruppen) der Amin-Komponente schließen Alkoxy-Gruppen wie zum Beispiel Methoxy (-OMe), Ethoxy (-OEt); tertiäre Alkoxy-Gruppen wie zum Beispiel t-Butoxy (-O-t- Bu); und Benzyloxy-Gruppen ein, die substituiert sein können wie zum Beispiel Benzyloxy (-OBzl), p-Nitrobenzyloxy (-OBzl(p-NO&sub2;)), Benzhydryloxy (-OBzh), Benzylamino (-NHBzl), 2,4-Dimethoxyben zylamino (-NHDMB), Benzhydrylamino (-NHBzh) oder unsubstituiertes Amino (-NH&sub2;) usw. Auch Amid- und Hydrazid-Gruppen können als C-terminale Schutzgruppen verwendet werden.
Enzyme, die verwendet werden können, sind diejenigen, von denen bekannt ist, daß sie die Bildung einer Peptid-Bindung vermitteln, und sie schließen Aminopeptidasen (z. B. Leucinaminopeptidase), Carboxypeptidasen (z. B. Carboxypeptidase y), Serinproteinasen (z. B. Chymotrypsin, Subtilisin), Thiolproteinasen (z. B. Papain, Bromelain), saure Proteinasen (z. B. Pepsin) und Wasserenthaltende Metalloproteinasen (z. B. Thermolysin und Metalloendoproteinase aus Vibrio Proteolyticus (siehe Beispiel 6)) ein. Das Enzym muß nicht in gereinigter Form verwendet werden, sondern es kann eine mehr oder weniger rohe Präparation (z. B. eine aufkonzentrierte, teilweise gereinigte Fermentationsbrühe) sein, die ein Enzym oder eine Vielzahl von Enzymen enthält.
Es sollte klar sein, daß Acetonitril entweder in im wesentlichen wasserfreier "reiner" Form oder in Verbindung mit Wasser verwendet werden kann. Wenn Wasser eingesetzt wird, sollte die Menge im allgemeinen weniger als 50 Gew.-% bezogen auf das gesamte Lösungsmittel-System betragen (d. h. Wasser plus Acetonitril).
Wenn das Lösungsmittel in trockener oder reiner Form vorliegt, wird es etwas Wasser enthalten (z. B. bis zu etwa 10 Gew.-% bezogen auf das Lösungsmittel), was durch den zur Immobilisierung des Enzyms verwendeten Träger abgegeben wurde. Beim bevorzugten Lösungsmittel Acetonitril wird die Menge Wasser im allgemeinen auf einem Minimum gehalten, und es wurde herausgefunden, daß "reines" Acetonitril ein gutes Lösungsmittel ist, wobei in diesem Fall das einzig zur Verfügung gestellte Wasser aus dem Träger stammt. Wenn man jedoch auf einer kontinuierlichen Basis arbeitet, sollte der Wasser-Gehalt im Acetonitril-Lösungsmittel auf einem Wert von wenigstens 10 Gew.-% gehalten werden, und er wird im allgemeinen in einen Bereich von 5 bis 50 Gew.-% fallen. Diese Menge Wasser ist ratsam, um ein Dehydratisieren des Enzyms zu vermeiden, und sie kann beim Lösen der Substrate behilflich sein. Wenn es gewünscht ist, kann das Wasser über den Substrat- Strom zugeführt werden, wenn das Verfahren auf einer kontinuierlichen Basis ausgeführt wird. Insbesondere bei der Verknüpfung von N-geschützter Asparaginsäure mit niederen Phenylalanin-Alkylestern und Benzyl-substituierten Derivaten davon (entweder mittels eines Batch- oder kontinuierlichen Prozesses) kann Acetonitril auch mit variierenden Wasser-Mengen verwendet werden, aber es ist bevorzugt, daß die Wasser-Menge weniger als 50 Gew.-% beträgt, d. h. bezogen auf das Gewicht sollte das CH&sub3;CN/H&sub2;O-Verhältnis 1 und vorzugsweise etwa 2,5 übersteigen.
Bei Verwendung der dem Fachmann im Stand der Technik bekannten Verfahren kann das Verhältnis der gewählten Acetonitril/Wasser- Mischung für jede Verknüpfungsreaktion im Hinblick auf eine Zahl von Faktoren optimiert werden, wie zum Beispiel der Löslichkeit der Substrate und des Dipeptid- oder Polypeptid-Produkts im Lösungsmittel, der Wasser-Menge und anderer Faktoren.
Es ist allgemein bekannt, daß viele Protease-Enzyme auch Esterase-Aktivität aufweisen. Diese Aktivität kann gelegentlich durch geeignete Auswahl des organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels vermindert werden. Zum Beispiel hat Acetonitril einen gewissen Effekt bei der Reduzierung der Esterase-Aktivität gezeigt. Es ist auch möglich einen Inhibitor zu verwenden, um die Esterase-Aktivität weiter zu vermindern, wenn die Esterase- Aktivität durch ein separates Protein beigesteuert wird oder wenn der Ort der Esterase-Aktivität von dem Protease-Ort verschieden ist und unter der Annahme, daß beide Orte auf demselben Molekül liegen. Geeignete Inhibitoren können aus Haferflocken, Fava, Gartenbohnen und Tomate extrahiert werden. Das Verfahren der Extraktion ist in Nippon Nogei Kogaku Kaishi, 31, Seite 38 (1957) offenbart. Der Inhibitor muß kein reines Material sein sondern kann ein Roh-Extrakt sein.
Unter dem Begriff "gebunden" versteht man, daß das Enzym auf einem geeigneten unlöslichen Träger immobilisiert ist, um einen Komplex zu bilden, der wiedergewonnen und wiederverwendet werden kann. Geeignete Verfahren zur Immobilisierung schließen physikalische Adsorption, ionisches Binden, kovalentes Binden, auf Adsorption folgende Vernetzung oder andere Verfahren der Aufnahme des Enzyms in oder auf einem Träger-Material ein, das im wesentlichen im Reaktions-Medium unlöslich ist. Geeignete Substrate schließen silicatische Materialien (z. B. poröses Silica), nicht-silicatische Keramiken (z. B. Tonerde) oder natürliche oder synthetische organische polymere Materialien (z. B. Harze wie Amberlite XAD-7, Polyacrylamid-Copolymere, Agarose und Alginate) ein. Im Gegensatz dazu ist ein "freies" Enzym ungebunden und kann im Lösungsmittel-System entweder gelöst oder suspendiert sein.
Eine hohe Konzentration der Aminosäure-Substrate wird bevorzugt, um zu ermöglichen, daß das Verfahren mit einer vernünftigen Geschwindigkeit durchgeführt werden kann. Jedes Substrat für die Verknüpfungsreaktion wird in einer Konzentration verwendet, die im Bereich von dessen Löslichkeit im Lösungsmittel liegt. Da die Materialien aber während des Vorgangs der Reaktion verbraucht werden, ist es jedoch möglich, daß ein Teil irgendeines Substrates in einem suspendiertem Status vorliegt. Die Substrat-Materialien sollten in Lösung jeweils in einer Konzentration im Bereich von 0,001M bis etwa 2M vorliegen, vorzugsweise zwischen etwa 0,1M und etwa 1M.
Im Hinblick auf die Verknüpfungsreaktion von N-substituierter Asparaginsäure/niederen Phenylalanin-Alkylestern, kann das molare Säure/Ester-Verhältnis 1 : 1 sein, wenn beide Substrate in der L-Konfiguration vorliegen. Praktisch können sie in einem Verhältnis zwischen 10 : 1 und 1 : 10 und vorzugsweise zwischen 3 : 1 und 1 : 5 verwendet werden. In den Fällen, in denen die Materialien in einer DL-Konfiguration vorliegen, können sie in Anteilen verwendet werden, die in einem Verhältnis der L-Isomere wie oben beschrieben resultieren.
Die Erfindung kann zum Beispiel ausgeführt werden, indem man eine Wasser-enthaltende immobilisierte Metalloprotease in Acetonitril suspendiert, das außerdem beide Startmaterialien enthält, und die Reaktion dann unter Rühren stattfinden läßt. Nach Beendigung der Reaktion können das immobilisierte Enzym und eine das Reaktionsprodukt enthaltende Suspension oder Lösung von einander getrennt werden, indem man das das Produkt enthaltende Medium einer Filtration oder anderen Trennverfahren unterwirft.
Die Erfindung kann auch in einer mit einem Wasser-enthaltenden iminobilisierten Enzym gefüllten Säule durchgeführt werden, indem man Acetonitril, das die beiden Startmaterialien enthält, durch die Säule fließen läßt. Dieses Verfahren erlaubt die kontinuierliche Durchführung der Reaktion und ist für eine industrielle Anwendung der Erfindung vorteilhaft.
Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich zwischen 10 und etwa 80ºC und vorzugsweise zwischen etwa 20 und etwa 50ºC.
Die Reaktionszeit hängt von den Konzentrationen der beiden Substrate, der Menge des immobilisierten Enzyms, einer vorbestimmten Umsetzungsgeschwindigkeit usw. ab. Gewöhnlich reicht jedoch eine Reaktionszeit von etwa 0,5 bis etwa 200 Stunden und vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 24 Stunden aus.
Wenn das gewünschte Produkt das als Aspartam bekannte Dipeptid ist, kann das Reaktionsprodukt, d. h. N-substituierter L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester durch übliche Mittel isoliert werden, wie zum Beispiel Konzentrieren der Reaktionsmischung gefolgt von Kristallisation, Extraktion oder dergleichen. Die Reaktionsmischung kann auch vom immobilisierten Enzym durch geeignete, in der Technik allgemein bekannte Verfahren abgetrennt werden. Nach der Abtrennung kann das immobilisierte Enzym wieder verwendet werden.
Bei der Durchführung der Erfindung können die Aminosäure-Substrate in der DL- oder der L-Konfiguration vorliegen. Wenn das Enzym für L-Isomere spezifisch ist, präzipitiert beim Einsatz von DL-Isomeren nur das L-Isomer bei der Reaktion, während das D-Isomer unumgesetzt im Reaktionsmedium verbleibt. Wenn das Enzym keine stereospezifische Referenz besitzt, kann das D-Isomer verwendet werden, z. B. kann bei Enzymen wie beispielsweise Serinproteasen, die keine D,L-Spezifität besitzen, der Amino- Donor (z. B. Alanin oder Phenylalanin) D sein.

Beispiel 1. Immobilisierung von Thermoase

Amberlite XAD-7 Harzkörner wurden mit Ethanol und dann mit Wasser gewaschen, um Feinstpartikel zu entfernen. Die gewaschenen Körner wurden in 0,05M Mes-0,02M CaCl&sub2;-Lösung resuspendiert. Nach der Entfernung des Wasser-Überschusses durch Filtrieren von Amberlite XAD-7 im Vakuum wurden die Körner (100 g) in 100 ml 0,05M MES-0,02M CaCl&sub2;-Puffer suspendiert, der 9 g Thermoase bei 4ºC enthielt. Nach Schütteln über Nacht wurde die immobilisierte Thermoase gründlich mit dem Verknüpfungs-Puffer gewaschen und dann vakuumfiltriert.

Beispiel 2. Verknüpfung in "reinen" mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln unter Verwendung eines freien Enzyms

In einem 25 ml-Kolben wurden Z-L-Asparaginsäure (0,192 g, 80 mM) und D,L-erythro-Phenylserinmethylester (0,42 g, 240 mM) in reinem organischem Lösungsmittel (Acetonitril, Dioxan, THF oder DMF) gelöst, um ein Endvolumen von 9 ml zu ergeben. Rohes Thermoase-Pulver (120 mg) wurde zu der oben beschriebenen Reaktionsmischung zugegeben, und der Reaktionskolben wurde bei 40ºC geschüttelt. Nach 10 Stunden wurde die Konzentration des Z-Aspartyl-L-erythro-phenylserinmethylesters (Z-OH-Aspartam) in der Reaktionsmischung durch HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Lösungsmittel THF DMF Dioxan Acetonitril Konzentration an Z-OH-Aspartam

Beispiel 3. Verknüpfung unter Verwendung eines immobilisierten Enzyms

Dasselbe, wie in Beispiel 2 beschriebene Experiment wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 1 g immobilisierter Thermoase (die Immobilisierung von Thermoase wurde in Beispiel 1 beschrieben) anstelle der 120 mg rohen Thermoase-Pulvers verwendet wurde. Nach 20-stündiger Reaktion wurde die Konzentration an Z-OH-Aspartam durch HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Lösungsmittel THF DMF Dioxan Acetonitril Konzentration an Z-OH-Aspartam

Beispiel 4. Verknüpfung in Acetonitril zur Bildung des Dipeptids Z-Phe-PheOMe

In einem 25 ml-Kolben wurden Z-L-Phenylalanin (0,216 g, 80 mM) und L-Phenylalaninmethylester (0,32 g, 200 mM) in reinem Acetonitril gelöst, um ein Endvolumen von 9 ml zu ergeben. Immobilisierte Thermoase (2,5 g) wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben und der Kolben wurde bei 40ºC geschüttelt. Nach 18-stündiger Reaktion wurde eine Konzentration an Z-L-Phenylalanyl-L-phenylalaninmethylester von 70 mM bestimmt.

Beispiel 5. Verknüpfung von D,L-erythro-Phenylserin

In einem 1 Liter-Bioreaktor wurden 30 g Z-asp, 65 g D,L-erythrophenylserinmethylester und 80 g feuchter immobilisierter Thermoase in 650 ml Acetonitril bei 40ºC vermischt. Nach 24 Stunden waren 22 g Z-L-Aspartyl-phenylserinmethylester hergestellt worden.

Beispiel 6. Herstellung von Protease (d. h. "Vibrio") durch Fermentierung von Vibrio Proteolyticus

1. Herstellung einer Impfkultur

A. Herstellung - 100 ml Keim-Medium, die in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben enthalten sind, werden für 20 Minuten bei 121ºC autoklaviert.
B. Impfung - Eine einzige -70ºC Ampulle des Organismus wird unter fließendem Wasser aufgetaut und dann aseptisch in den Keim-Kolben transferiert.
C. Inkubation - Der beimpfte Kolben wird für 18 Stunden bei 250 U/min/27ºC inkubiert.
D. Das bei 640 nm gemessene Wachstum liegt zwischen einer optischen Dichte von 4,0 bis 6,0; der pH-Wert der Brühe beträgt etwa 8,9.

2. Erweiterte Fermentation - 1,0 Liter Volumen in einem 1,5-Liter-Fermenter.

A. Herstellung - Alle Bestandteile des Mediums werden in den Behälter gegeben (Polypepton - 20 g, Meersalze - 20 g, MgSO&sub4;·7H&sub2;O - 0,4 g, P-2000 - 0,2 ml), und der pH-Wert wird vor der Sterilisation nicht eingestellt; er sollte nahe pH 7,0 liegen. Ein 1,0 Liter-Behälter sollte, wenn er in einem Autoklaven sterilisiert wird, für 45 Minuten bei einer Temperatur von 121ºC sterilisiert werden.

B. Beimpfung

(1) Zunächst Einstellen und nochmalige Überprüfung der Betriebs-Parameter:
a. pH-Wert auf 8,6 mit 6N NaOH
b. Temperatur = 27ºC
c. U/min = 1000
d. Anzeige für gelösten Sauerstoff auf 100% bei 1,0-l/min Luft.
(2) Beimpfen mit 10 ml Keim-Brühe.

C. Durchführung

(1) Halten der vorgenannten Parameter.
(2) Der gelöste Sauerstoff wird beim Spitzen-Bedarf auf etwa 75-80% fallen.
(3) Folgendes Überprüfen:
a. Optische Dichte - abgelesen bei 640 nm Absorption. Peaks bei etwa 10-12 O.D. nach etwa 12-14 Stunden.
b. Produktion von Metalloendopeptidase - bis etwa 0,1 Einheiten/sek.

3. Ernten & Konzentrierung des VIBRIO Enzyms

Nach etwa 14-16 Stunden Fermentation erreicht das Enzym-Produkt Titer von annähernd 0,10 Einheiten/sec. Aktivität, gemessen durch FAGLA-Assay. Die Brühe wird geerntet bevor die Zellen zu einem fortgeschrittenem Stadium (etwa 10-25%) lysieren.
Zuerst wird die gesamte Brühe zur Abtrennung des Zell-Anteils zentrifugiert. Dann wird der Überstand 70-100-fach konzentriert unter Verwendung von Amicon SIOYIO und SIYIO Ultrafilter-Patronen. Schließlich wird das Konzentrat dreimal mit 0,01M Hepes plus 0,01M CaCl&sub2; (pH-Wert 7,2) Puffer-Lösung gewaschen.
Eine Vibrio proteolyticus-Kultur unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter der Nr. ATCC 53559 hinterlegt.

Beispiel 7. Verknüpfung von N-Formylasparaginsäure

Die Kulturbrühe des Vibrio proteolyticus, die wie in Beispiel 6 hergestellt wurde, wurde aufkonzentriert und gewaschen. Die neutrale Protease in der Fermentationsbrühe wurde in einer Beispiel 1 entsprechenden Weise auf Amberlite XAD-7 immobilisiert. N-Formylasparaginsäure (1,93 g) und L-Phenylalaninmethylester (6,2 g) wurden in Acetonitril gelöst, um ein Endvolumen von 150 ml zu ergeben. Nach Zugabe von 14,5 g feuchter immobilisierter neutraler Protease wurde die Reaktion 24 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die mittels HPLC bestimmte Endkonzentration des Produkts (N-Formyl-aspartyl-L-phenylalaninmethylester) betrug 11,7 g/l. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft, der Rückstand in Ethylacetat gelöst und zweimal mit 1N HCl gewaschen. Die wäßrige Phase wurde mit Acetat behandelt. Die vereinten organischen Phasen wurden mit Salzwasser gewaschen und über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet. Die Verdampfung des Lösungsmittels lieferte einen farblosen Feststoff, den man aus Dichlorethan kristallisierte und als N-Formyl-aspartam identifizierte.

Beispiel 8. Verwendung von Systemen aus Wasser/mit Wasser mischbares Lösungsmittel

Wasser/mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel wurden als organische Medien für enzymatische Dipeptid-Synthesereaktionen bewertet. Die Substrat-Konzentrationen in jeder Reaktionsmischung betrugen 80 mM Z-Asparaginsäure und 240 mM D,L-erythro- Phenylserinmethylester. Der immobilisierte Katalysator wurde unter Verwendung des Enzyms Thermoase und Silica nach der kovalenten Carbonyl-Alkylamin-Verknüpfungsmethode von Weetall (Weetall, H.H., Methods in Enzymology Bd. 64, 1976, Seiten 134-148) hergestellt.
Die Synthese von Z-Aspartyl-L-erythro-phenylserinmethylester wurde bei Lösungsmittel-Konzentrationen von mehr als 90% Ethanol, Dimethylsulfoxid, N,N-Dimethylformamid oder Aceton nicht beobachtet, wenn ein auf Silica immobilisiertes Enzym verwendet wurde. Die Dipeptid-Ausbeuten in reinem 1,2-Dimethoxyethan und 1,4-Butandiol betrugen beide 25% der theoretischen Ausbeute, wenn ein auf Silica immobilisiertes Enzym verwendet wurde. Dieses Ergebnis sollte mit Beispiel 3 verglichen werden, bei dem Amberlite anstelle von Silica verwendet wurde, was zeigt, daß die Wahl des Trägers die enzymatische Reaktion herbeiführen kann. Die Dipeptid-Ausbeuten in 95%-igem Ethanol und 1,4-Butandiol betrugen 20% bzw. 40%, wenn das Amberlite-immobilisierte Enzym verwendet wurde. Alle Reaktionen wurden bei 40ºC inkubiert.

Beispiel 9. Verwendung von Wasser/Acetonitril Lösungsmittel-Systemen

Acetonitril wurde als Wasser/mit Wasser mischbares organisches Medium für die enzymatische Dipeptid-Synthese unter Verwendung von entweder immobilisiertem oder ungebundenem Thermoase-Enzym bewertet. Die Substrat-Konzentrationen, die bei der Synthesereaktion verwendet wurden, betrugen 80 mM Z-Asparaginsäure und 240 mM entweder des D,L-erythro-Phenylserinmethylesters oder des L- Phenylalaninmethylesters. Das Thermoase-Enzym wurde auf Amberlite-Harz durch die in Beispiel 1 beschriebene Adsorption immobilisiert. Die Synthesereaktionen wurden in 100% Acetonitril, 75% Acetonitril - 25% Wasser, 50% Acetonitril - 50% Wasser und 25% Acetonitril - 75% Wasser bewertet. Die Reaktionen überwachte man über einen Zeitraum von 24 Stunden, um die Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten zu bestimmen. Es wurden geringe Dipeptid-Synthese-Geschwindigkeiten beobachtet, wenn ungebundenes Enzym bei hohen Acetonitril-Konzentrationen verwendet wurde. Keine bedeutende Dipeptid-Synthese wurde in 25 und 50% Acetonitril beobachtet; jedoch waren die Reaktionsgeschwindigkeiten bei Acetonitril-Konzentrationen von 75% und darüber fast gleich, wobei in beiden Fällen 24 Stunden-Ausbeuten von annähernd 70% produziert wurden. Längere Inkubations-Zeiten in mehr als 90% Acetonitril ergaben Dipeptid-Ausbeuten von mehr als 90%. Alle Reaktionen wurden bei 40ºC durchgeführt.

Beispiel 10. Scale-up der Verknüpfungsreaktion

Ein immobilisiertes Protease-Enzym enthaltender 1 Liter Rührreaktor wurde zur Demonstration der kontinuierlichen Herstellung des Dipeptids Z-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester verwendet. 80 g Amberlite-Katalysator wurden zu 700 ml reinem Acetonitril gegeben, welches 160 mM Z-Asparaginsäure und 480 mM L-Phenylalaninmethylester enthielt. Der Katalysator wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Reaktor-Temperatur wurde unter ständigem Rühren auf 40ºC gehalten. Nach 36 Stunden wurden Dipeptid-Ausbeuten von 90% erhalten. Der Reaktor wurde mit frischen Reaktanden und Acetonitril während drei separater Durchführungen beladen, wobei derselbe Enzym-Katalysator ohne Aktivitätsverlust verwendet wurde.

Beispiel 11. Synthese von Z-Asp-L-erythro PhserOMe durch immobilisierte Pronase in Acetonitril

Zu einer Lösung von Z-Asparaginsäure (192 mg) und D,L-erythro- Phenylserin (411 mg) in Acetonitril (9 ml) wurden auf Amberlite (1,5 g Feuchtgewicht) immobilisierte Pronase E (von Sigma Chemicals) zugegeben. Die Mischung wurde bei 23ºC für 19 Stunden geschüttelt. Die HPLC-Analyse zeigte, daß 182 mg Z-Asp-L-erythro-PhserOMe erhalten wurden.

Beispiel 12. Synthese von Z-L-Tyr-D-AlaOMe durch immobilisiertes Chymotrypsin in Acetonitril

Zu einer Lösung von N-Z-L-Tyrosin (102 mg, 0,32 mM) und D-Alaninmethylester (137 mg, 0,66 mM) in Acetonitril (4 ml) wurde auf Amberlite XAD-7 (0,5 g Feuchtgewicht) immobilisiertes Chymotrypsin gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 39 Stunden geschüttelt. Das immobilisierte Enzym wurde filtriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei 85 mg Z-Tyr-D-AlaOMe erhalten wurden.

Claims

1. Enzymatisches Verfahren zum Herbeiführen der Bildung einer Peptid-Bindung zwischen zwei Substraten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-substituierter Asparaginsäure oder einem Salz davon und einem niederen Phenylalanin-Alkylester, wobei das benzylische Kohlenstoffatom durch Wasserstoff oder durch eine oder mehrere labile Gruppen, die leicht durch Wasserstoff ersetzbar sind, substituiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren in einem eine Mischung von Acetonitril und Wasser umfassenden Lösungsmittel ausführt, wobei das Gewichtsverhältnis von Acetonitril zu Wasser größer als 1 : 1 ist und wobei eine Wasser-enthaltende Metalloprotease als Enzym verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Reaktion in Gegenwart einer Wasser-enthaltenden, immobilisierten Metalloproteinase durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Enzym Thermolysin ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Enzym Vibriolysin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die N-Schutzgruppe Formyl oder Benzyloxycarbonyl ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Benzyl-Kohlenstoffatom von Phenylalanin durch Hydroxyl substituiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der niedere Alkyl-Substituent des Esters Methyl ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man das Verfahren in Gegenwart eines Esterase-Inhibitors durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die N-Schutzgruppe tertiär-Alkoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, p-Toluolsulfonyl, o- Nitrophenylsulfenyl oder Formyl ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Dipeptids oder Polypeptids durch Umsetzen einer Säurekomponente einer Aminosäure oder eines Peptids, die eine N-terminale Schutzgruppe besitzen, oder eines Salzes davon mit einer Aminkomponente einer Aminosäure oder eines Peptids, die eine C-terminale Schutzgruppe besitzen, oder einem Salz davon in Gegenwart eines Enzyms, ausgewählt aus Wasser-enthaltenden Metalloproteasen, die dafür bekannt sind, die Bildung von Peptid-Bindungen zu vermitteln und eines eine Mischung von Acetonitril und Wasser umfassenden Lösungsmittels, wobei das Gewichtsverhältnis von Acetonitril zu Wasser größer als 1 : 1 ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Enzym Thermolysin ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Enzym Vibriolysin ist.

13. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die die N-terminale Schutzgruppe tragende Aminosäure Asparaginsäure ist.

14. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die die C-terminale Schutzgruppe tragende Aminosäure ein niederer Alkylester von Phenylalanin ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die geschützte Aminosäure der Methylester von Phenylalanin ist.

16. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die N-Schutzgruppe Formyl oder Benzyloxycarbonyl ist.

17. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem in der Reaktionsmischung ein Esterase-Inhibitor vorhanden ist.

18. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die N-Schutzgruppe tertiär-Alkoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, p-Toluolsulfonyl, o- Nitrophenylsulfenyl oder Formyl ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der niedere Phenylalanin- Alkylester der Formel

entspricht, wobei Ph Phenyl ist, X -OH, -SH, -Cl, -Br, -I, -PCOCH&sub3;, -OCOOCH&sub3;, NH2 oder SCH&sub3; ist und R eine Alkylgruppe ist, die zwischen 1 und 4 Kohlenstoffatomen besitzt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei X -OH und R Methyl sind.

21. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die eine C-terminale Schutzgruppe tragende Aminosäure D-Alanin ist.