DE68913880T2 - Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Dipeptiden. - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Dipeptiden.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die enzymatische Herstellung von Dipeptiden und Derivaten von Dipeptiden der allgemeinen Formel
  • H-A-B-Y
  • in der A einen gegebenenfalls seitenkettengeschützten L- oder D-alpha-Aminosäurerest oder omega-Aminosäurerest und B einen gegebenenfalls seitenkettengeschützten L- oder D-alpha-Aminocarbonsäurerest, der gleich oder verschieden von A sein kann, einen L- oder D-Aminophosphonsäurerest oder einen L- oder D-Aminosulfonsäurerest oder die entsprechenden omega-Aminosäuren oder Salze oder Hydrate derselben und Y OH, H, Alkyl, Aryl, Aralkyl oder eine C-terminale Blockierungsgruppe bedeuten, mit der Maßgabe, daß A nicht Asp oder Glu sein kann, wenn B Phe und Y Alkyl ist, oder BY einen Aminoalkoholrest
  • B¹-CHY¹-OH
  • bedeutet, wobei B¹ ein Decarboxyderivat der Aminocarbonsäuren, wie bezüglich B definiert, und Y¹ H, Alkyl, Aryl oder Aralkyl ist.
  • In den letzten Jahren ist ein zunehmendes Interesse an Dipeptiden und Dipeptidderivaten entstanden, die gegebenenfalls einen Aminosäurerest der D-Konfiguration enthalten, und zwar im Hinblick auf ihre potentiellen pharmakologischen Effekte, z.B. als Antibiotika. Es besteht ebenso ein großes Interesse an Dipeptiden auf Gebieten wie der künstlichen Ernährung - sowohl der menschlichen als auch der tierischen -, der Süßstoffe und innerhalb der Agrochemie, z.B. für Herbizide.
  • Derartige Peptide H-A-B-Y können mittels bekannter chemischer Kopplungsreaktionen hergestellt werden, wobei jedoch sämtliche dieser Verfahren das gemeinsame Merkmal aufweisen, daß es im allgemeinen erforderlich ist, die eingeschlossenen Aminosäuren - A und B - jeweils an der Aminogruppe und an der Carboxylgruppe zu schützen, und zudem häufig auch die Seitenketten, wenn diese funktionelle Gruppen aufweisen. Weiterhin besteht ein inhärentes Risiko von Nebenreaktionen während des chemischen Kopplungsschrittes, und zwar wegen der Reagentien und der eingesetzten Bedingungen, wobei eine häufige Nebenreaktion die Racemisierung, insbesondere der A-Komponente, ist. Durch Austausch des chemischen Kopplungsschrittes gegen einen enzymatischen Kopplungsschritt, der unter milden Bedingungen verläuft, können derartige Nebenreaktionen und Racemisierungen vermieden werden, wobei man ein stereochemisch reines Produkt erhält.
  • Die Anwesenheit von Amino- und Carboxyl-Schutzgruppen bei der chemischen Kopplung ist zwingend vorgeschrieben und wurde im allgemeinen auch bei der enzymatischen Kopplung gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung von Endoproteasen als zwingend angesehen.
  • Hierdurch werden verschiedene unerwünschte Merkmale diesen Verfahren zugesellt, die die Verfahrensökonomie in industriellem Maßstab betreffen; dies wird besonders deutlich bei der Dipeptidsynthese.
  • Die Nachteile stehen in Zusammenhang mit der Einführung dieser Gruppen sowie mit ihrer Entfernung und Anwesenheit während der Verfahrensdurchführung, wodurch die Gesamtkosten des Verfahrens und die Zeit vergrößert und die Gesamtausbeute beeinträchtigt wird.
  • Typische Beispiele für Aminoschutzgruppen, die üblicherweise eingesetzt werden, sind diejenigen vom Carbobenzoxy-(Z-) und tert.-Butoxycarbonyl-(Boc-)-Typ, die ein Molekulargewicht aufweisen, das mit demjenigen der Aminosäurereste vergleichbar ist. Zunächst müssen die Schutzgruppen in die Ausgangsmaterialien mittels geeigneter, teurer Agentien in einem getrennten Reaktionsschritt eingeführt werden, woran sich ein Isolierungsschritt anschließt. Während ihrer Anwesenheit haben diese hydrophoben Gruppen häufig einen drastischen Effekt auf die Löslichkeit der Zwischenprodukte und Reaktionsprodukte und können sowohl die Natur und die Menge der erforderlichen Lösemittel bei ihrer Weiterverarbeitung als auch die Leichtigkeit der Reinigung und der Entschützung beeinflussen. Die Entschützung erfolgt ebenfalls in einem getrennten Schritt mit einem anschließenden Reinigungsschritt.
  • Für diesen Zweck steht eine Reihe von Reaktionen zur Verfügung. Mit der Ausnahme der katalytischen Hydrierung, die industrielle Probleme eigener Art aufwirft, laufen diese Verfahren unter drastischen, häufig stark sauren oder basischen Bedingungen ab, welche oft eine Reihe von Nebenreaktionen veranlassen, die ihrerseits zu einem unreinen Produkt oder aufwendigen Reinigungen führen.
  • Die letzten Schritte in dieser relativ langen Reihe von Synthesestufen können daher eine ziemlich vollständige Entschützung zum Erhalt der gewünschten Peptide sein, und es werden infolge der fast unvermeidlichen Sekundärreaktionen häufig ziemlich mühevolle Reinigungsverfahren benötigt, um ein Produkt mit der gewünschten hohen Reinheit zu erhalten.
  • Ein Dipeptid, das in den letzten Jahren ein großes Interesse hervorgerufen hat, ist L-Asp-L-Phe-methylester, das auch als Aspartam bekannt ist, und Derivate desselben, die in breitem Umfang als Süßstoff verwendet werden. Die chemische Synthese des Aspartam ist mit den oben genannten Nachteilen behaftet.
  • Versuche zur Vermeidung des aminoterminalen Schutzes bei der Herstellung von Aspartam und Derivaten desselben haben zu mikrobiellen Fermentationslösungen geführt, z.B. die Fermentationsverfahren, die in EP-A1-074095, EP-A2-102529 und EP-A2-154472 beschrieben worden sind. Diese Methodik unterscheidet sich fundamental von synthetischen Lösungsansätzen und erfordert spezifische Organismen für Aspartam; sie ist daher nicht allgemein in Verbindung mit anderen Dipeptiden anwendbar. Die Ausbeuten sind außerdem niedrig, und die Wiedergewinnung aus der Fermentationsbrühe ist mühevoll.
  • Die oben genannten Nachteile der Verfahren für die Herstellung von Aspartam werden in der EP-A2-269390 bestätigt. In dieser Anmeldung wird ein Verfahren für die Herstellung von L-Asp-L- Phe-alkylestern beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in einem Lösemittelmedium L-Asparaginsäure-alpha-ester oder L-Asparaginsäure-alpha-amid mit L-Phenylalanin-alkylester in Gegenwart eines Enzyms, von das Enzym enthaltenden Mikroorganismen, von das Enzym enthaltenden Fraktionen eines Mikroorganismus oder von einem auf einem festen Träger immobilisierten Enzym umsetzt, wobei das Enzym L-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylester bilden kann, und zwar durch Kondensation des L-Asparaginsäure-alpha-esters oder L-Asparaginsäure-alpha- amids und L-Phenylalanin-alkylester
  • Man erkennt, daß man ein Enzym verwenden muß, das eine spezifische Esterase- oder Amidaseaktivität gegen Asp, nicht jedoch gegen Phe, aufweist. Das einzige erwähnte Enzym ist die extrazelluläre Protease mit einer esterolytischen Aktivität des Staphylococcus aureus V8.
  • Während dabei die Anwendbarkeit von N-alpha-ungeschützten Asp-estern oder -amiden vorgeschlagen wird - zusammen mit N-geschützten oder beta-Estern oder -Amiden - wobei die Offenbarung eines spezifischen Enzyms für die Verwendung bei der Herstellung eines spezifischen Peptids lediglich durch ein Beispiel gestützt ist, bei dem ziemlich spezielle Reaktionsbedingungen verwendet werden, z.B. ein fünffacher Überschuß an Substratkomponenten, liefert diese Veröffentlichung bei weitem nicht eine allgemeine Lehre für die Anwendbarkeit von N-ungeschützten Substratkomponenten bei der Dipeptidsynthese, die durch Amidase- oder Esteraseenzyme katalysiert wird.
  • Es ist daher im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit des Gesamtverfahrens ein offensichtlicher Vorteil, wenn man auch an dem Amino- und Carboxyende Schutzgruppen vermeiden kann. In einigen Fällen kann es von Interesse sein, wenn man ein Dipeptid mit Seitenkettenschutz, jedoch ohne terminalen Schutz herstellen kann, und es wird gezeigt werden, daß es in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung möglich ist, von seitenkettengeschützten, jedoch aminoungeschützten Ausgangsmaterialien auszugehen. In diesem Falle können die gleichen Vorteile der milden Reaktionsbedingungen und der Wirtschaftlichkeit des Gesamtverfahrens erhalten werden. Falls erwünscht können die Seitenkettenschutzgruppen mittels chemischer oder enzymatischer Mittel entfernt werden, und zwar im allgemeinen unter milderen Bedingungen als Aminoschutzgruppen.
  • Die enzymkatalysierten Kopplungsreaktionen, die die Verwendung von gegebenenfalls seitenketten-ungeschützten Aminosäurederivaten und einer gegebenenfalls C-terminal ungeschützten B-Komponente (Nucleophil) gestatten, sind bekannt. Vgl. z.B. die DK-Patentbeschreibung Nr. 155613 sowie die entsprechende EP-Patentbeschreibung Nr. 17485 (EP-B1-17485), auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird.
  • Kurz gesagt beschreibt die EP-B1-17485 ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Reaktion einer Substratkomponente, ausgewählt u.a. aus Aminosäureestern und Aminosäureamiden, mit einer Aminkomponente (Nucleophil), ausgewählt u.a. aus L-Aminosäureamiden, L-Aminosäuren oder L-Aminosäurestern, in Gegenwart eines L-spezifischen Serin- oder Thiolcarboxypeptidase-Enzyms.
  • Wenn ein Dipeptid mittels des Verfahrens der EP-B1-17485 hergestellt werden soll, ist die Substratkomponente obligatorisch ein N-terminal geschütztes Aminosäurederivat, und die enthaltene Aminosäure ist obligatorisch eine L-Aminosäure.
  • Wie in EP-A1-278787 beschrieben wurde (auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird), sowie in anderen Anmeldungen, die die Priorität aus der dänischen Patentanmeldung 725/87, eingereicht am 13. Februar 1987, beanspruchen, wurde überraschenderweise gefunden, daß die gemäß EP-B1-17485 verwendeten Serin- und Thiolcarboxypeptidasen N-ungeschützte Aminosäureester oder -amide verwenden können, und zwar als Substratkomponente in kontrollierten Reaktionen für die Synthese von Dipeptiden und Dipeptidderivaten, und daß es möglich ist, eine mögliche Oligomerisierung des Substrats zu unterbinden.
  • Zugegebenermaßen ist es seit langem bekannt, daß einige Endoproteasen die Oligomerisierung von bestimmten N-ungeschützten Aminosäureestern mit L-Konfiguration katalysieren können (Fruton, J.S., Advances in Enzymology, 53: 239-306, 1982), es ist jedoch niemals der Versuch unternommen worden, dies für die Herstellung von Dipeptiden, die keine einfachen Dimeren darstellen, auszunutzen. Allgemein war das Ergebnis derartiger Oligomerisierungen ein Gemisch einer Reihe von manchmal langen Oligomeren. Das Ausmaß der Oligomerisierung und die Komplexität des Gemisches hängen von der Löslichkeit der gebildeten Produkte ab. Es sollte auch erwähnt werden, daß die simple Tatsache, daß ein gegebenes Enzym ein bestimmtes N-alpha-ungeschütztes Aminosäurederivat hydrolysieren kann, nicht automatisch auf eine ähnliche Fähigkeit zur Katalysierung von Kopplungsreaktionen unter Einschluß des gleichen Derivats schließen läßt. Vgl. die von Andersen, A.J. in "Peptides, Structure and Function", Proc. of the Ninth Ann. Peptide Symposium, Hg. Deber, C.M. et al., Pierce (1985), S. 355, zitierten Veröffentlichungen.
  • Aus diesem Grunde ist der Einsatz von Serin- und Thiolendoproteasen für die Peptidsynthese auf die Verwendung von amino- und carboxyterminal geschützten Ausgangsmaterialien begrenzt worden, z.B. gemäß US-A-4 086 136, in der z.B. Papain, Stembromelein, Ficin, Chymopapain und Chymotrypsin genannt werden.
  • Weiterhin sind für diese Enzyme freie Aminosäuren bisher im allgemeinen als ungeeignet als Aminokomponenten angesehen worden, wie dies von Y.W. Mitin et al., Int. J. Peptide Protein Res., Bd. 23 (1984), S. 528-534, festgestellt wurde.
  • Die oben genannten amino- und carboxyterminal geschützten Ausgangsmaterialien sind ebenfalls zwingend vorgeschrieben, wenn Aspartat-Endoproteasen, z.B. Pepsin, eingesetzt werden, wie dies z.B. aus der US-A-3 972 773 hervorgeht, und wenn Metallo-Endoproteasen verwendet werden, wie dies z.B. aus der Synthese von Z-AspPheOMe.PheOMe-Salz gemäß EP-A1-009585 hervorgeht. Bei diesen Reaktionen vom Kondensationstyp ist es weiterhin zwingend, daß die Substratkomponente von der freien alpha-Carbonsäureform ist, z.B. gemäß EP-A2-220923.
  • Die enzymatische Kondensation von L-Aminosäuren mit alpha- Aminophosphonsäuren, wie in EP-A2-209430 ausgeführt, verwendet ebenfalls eine N-alpha-geschützte Aminosäure, z.B. BOC-Ala, BOC-Leu oder BOC-Phe, in der freien Carbonsäureform als Substratkomponente.
  • Die Verwendung von amino- und carboxyterminal geschützten Ausgangsmaterialien ist auch als zwingend für Nichtproteasen angesehen worden, z.B. Esterasen mit Amidaseaktivität, Blair West et al., Tetrahedron Letters, Bd. 28, Nr. 15, S. 1629-32 (1987), die Schweinepankreas-Lipase, Candida cylindracea-Lipase und Schweineleber-Esterase in organischen Medien, gegebenenfalls einen wäßrigen Puffer enthaltend, verwendeten.
  • Andererseits sind Cellulasen bisher lediglich synthesemäßig für Polymerisationsreaktionen vom Kondensationstyp von vollständig freien beta-Aminosäuren verwendet worden, wie dies von Kitazume, T. et al., J. Flourine Chem. 36 (1987), S. 225-236, beschrieben wurde.
  • Die Synthese der diastereomeren Dipeptide mit DL-, LD- und DD-Konfiguration sowie von Peptiden, die beta-Aminosäurereste enthalten, aus aminoungeschützten Substratkomponenten war bisher mit Carboxypeptidasen nicht möglich, mit der Ausnahme wie oben in bezug auf EP-A1-278787 beschrieben, und auch nicht allgemein mit beliebigen proteolytischen Enzymen (Klasse EC 3.4). Es hat einige Bemühungen mit einer anderen Klasse von Enzymen gegeben, Aminoacyl-t-RNA-Synthetase (Klasse EC 6.1), z.B. gemäß EP-A1-086053. In diesem Falle muß für jede Art des Aminosäurerestes ein spezifisches Enzym verwendet werden, und weiterhin werden teure Cofaktoren wie ATP benötigt. Gleichzeitig sind die Ausbeuten sehr schlecht, so daß, selbst wenn einiges an Produkt isoliert und identifiziert wurde, üblicherweise ein zehnfacher Überschuß an dem Cofaktor und ein hundertfacher Überschuß des Nucleophils sowie ein bis zu tausendfacher Überschuß des Enzyms pro Gewicht benötigt wurden.
  • Eine kürzlich veröffentlichte Studie von Gaertner et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 3: 130-137 (1988), bestätigt indirekt das Vorurteil gegen die Verwendung von N-alpha-ungeschützten Aminosäuren als Substratkomponente in enzymatischen Peptidsynthesen. Da ein größeres Problem, das früher aufgetreten ist, die sekundäre Hydrolyse der neu synthetisierten Produkte ist, wurde ein Versuch unternommen, die Wasseraktivität in dem Reaktionsmedium herabzusetzen, indem man organische Lösemittel verwendete. Gaertner et al. berichten über eine Dipeptidsynthese unter Verwendung von Chymotrypsin, das chemisch modifiziert wurde, um seine Löslichkeit in organischen Medien zu verbessern. Unter Verwendung einer Anzahl von N-alpha-geschützten Aminosäureestern als Substrate und Aminosäureamiden als Nucleophile wurden N- alpha-geschützte Dipeptidamide in guten Ausbeuten in einem Benzolmedium erhalten. So erhielt man alpha-Bz-Lys-Phe-NH&sub2; in einer Ausbeute von mehr als 98% durch Umsetzung von alpha-Bz- Lys-OMe mit Phe-NH&sub2;. Bei der Verwendung von epsilon-Z-LysOEt, d.h. einem seitenkettengeschützten, jedoch N-alpha-ungeschützten Lysinester, wurde jedoch kein epsilon-Z-Lys-Phe-NH&sub2; gebildet. Gaertner et al. nehmen zu diesem Ergebnis nicht Stellung; dies zeigt, daß sie offenbar annahmen, daß ein Aminosäureschutz der Substratkomponente zwingend sei.
  • Die vorliegende Erfindung, die eine weitere Entwicklung der Erfindung gemäß EP-A1-278787 darstellt, beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß die Fähigkeit zur Verwendung von N-alpha-ungeschützten Aminosäureestern und Amiden als Substratkomponente in kontrollierten Reaktionen für die Synthese von Dipeptiden und Dipeptidderivaten nicht auf Serin- oder Thiolcarboxypeptidasen beschränkt ist, sondern auch mit Amidase- oder Esteraseenzymen allgemein möglich ist, insbesondere mit Serinproteasen, Thiolendoproteasen, Lipasen und Esterasen.
  • Es wurde wiederum überraschend gefunden, daß auch N-alpha-ungeschützte Aminosäurederivate mit D-Konfiguration als Substrate in diesen Reaktionen verwendet werden können, so daß zusätzlich zu LL-Dipeptiden es auch möglich ist, DL-Dipeptide zu synthetisieren. Die Reaktionsgeschwindigkeit für D-Substrate ist jedoch im allgemeinen etwas niedriger als diejenige für L-Substrate unter einheitlichen Bedingungen. Der Unterschied in der Geschwindigkeit ist jedoch wesentlich geringer als für die entsprechenden N-geschützten Aminosäureester, wobei das D-Substrat mit einer Geschwindigkeit umgesetzt wird, die wesentlich kleiner als die Geschwindigkeit für das L- Substrat ist; Purdie et al., Biochem. Biophys. Acta, 268 (1972), 523. Es gibt jedoch große individuelle Unterschiede in dieser Beziehung zwischen den Enzymen. Die Syntheseausbeuten sind häufig ebenso hoch mit den ungeschützten D-Substraten, bezogen auf die ungeschützten L-Substrate.
  • Es ist bekannt, daß verschiedene Endoproteasen in der Lage sind, eine nucleophile Komponente mit D-Konfiguration in Reaktionen mit N-geschützten Substratkomponenten zu verwenden. Somit ist es in Abhängigkeit von der tatsächlichen Sequenz möglich, die Peptide mit LL-, DL-, LD- oder DD-Konfiguration mit dem Verfahren der Erfindung zu synthetisieren.
  • Das Verfahren der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratkomponente, die ein Aminosäurederivat der Formel
  • H-A-OR¹ oder H-A-NR²R³
  • ist, wobei A wie oben definiert ist, sowie R¹ Alkyl, Aryl oder Arakyl, gegebenenfalls substituiert mit inerten Substituenten, oder ein alpha-Desaminofragment einer Aminosäure und R² und R³, die gleich oder verschieden sind, jeweils Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit inerten Substituenten, bedeuten,
  • mit einer nucleophilen Komponente, ausgewählt aus
  • (a) Aminosäuren der Formel
  • H-B-OH
  • in der B ein wie oben definierter Amonocarbonsäurerest,
  • (b) Aminosäureamiden der Formel
  • H-B-NR²-R³
  • in der B ein wie oben definierter Aminocarbonsäurerest ist und R² und R³ wie oben definiert sind, mit der Ausnahme, daß wenn R² Wasserstoff ist, R³ auch Hydroxy oder Amino sein kann,
  • (c) Aminosäureestern der Formel
  • H-B-OR&sup4;
  • in der B ein wie oben definierter Aminocarbonsäurerest ist und R&sup4; Alkyl, Aryl oder Aralkyl bedeutet,
  • (d) gegebenenfalls säuregruppengeschützten, geradkettigen oder verzweigten Aminophosphonsäuren oder Aminosulfonsäuren der Formel
  • NH²(CH&sub2;)xPO&sub3;R&sup5;R&sup6; oder NH&sub2;(CH&sub2;)xSO&sub3;R&sup7;
  • in der R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Aralkyl und x 1 - 6 bedeuten,
  • (e) Aminosäurealdehyden oder Ketonen oder Derivaten derselben der Formel
  • H-B¹-CY²-R&sup8;
  • in der B¹ wie oben definiert, Y² O oder ein funktionelles Derivat desselben, vorzugsweise ein Ketal und R&sup8; H, Alkyl, Aryl oder Aralkyl bedeuten, und
  • (f) Aminoalkoholen der Formel
  • H-B¹-CHY¹-OH
  • in der B¹ und Y¹ wie oben definiert sind,
  • in Gegenwart eines Amidase- oder Esterassenzyms, das von Serin- oder Thiocarboxypeptidasen verschieden ist, in Lösung oder Disperion umsetzt und anschließend, falls erwünscht, eine vorhandene Seitenkettenschutzgruppe oder Schutzgruppe Y abspaltet und/oder, falls erwünscht, das erhaltene Dipeptidderivat in ein Salz oder Hydrat überführt.
  • Beispiele für einsetzbare Aminosäuren schließen aliphatische Aminosäuren wie Monoaminomonocarbonsäuren, z.B. Glycin (Gly), Alanin (Ala), Valin (Val), Norvalin (Nval), Leucin (Leu), Isoleucin (iso-Leu) und Norleucin (Nleu), Hydroxyaminosäuren wie Serin (Ser), Threonin (Thr) und Homoserin (homo-Ser), schwefelhaltige Aminosäuren wie Methionin (Met) oder Cystin (CysS) und Cystein (CysH), Monoaminodicarbonsäuren wie Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (Glu) und Amide derselben wie Asparagin (Asn) und Glutamin (Gln), Diaminomonocarbonsäuren wie Ornitin (Orn) und Lysin (Lys), Arginin (Arg), aromatische Aminosäuren wie Phenylalanin (Phe) und Tyrosin (Tyr), ebenso heterocyclische Aminosäuren wie Histidin (His), Prolin (Pro) und Tryptophan (Trp) ein. Als Beispiele für einsetzbare Aminoverbindungen einer ungewöhnlicheren Struktur können Penicillamin (Pen), Aminophosphonsäuren wie Alaninphosphonsäure (AlaP), Aminosulfonsäuren wie Taurin (Tau), omega-Aminosäuren wie beta-Alanin (BAla), Isoaminosäuren wie alpha- Methylalanin (Aib), Aminosäuren, die mit inerten Substituenten substituiert sind, z.B. Halogen oder Nitro, oder die Aldehyde, Ketone, Ketale oder Alkohole, die z.B. von Alanin abgeleitet sind, genannt werden. Wie erwähnt können sie in der D-Form in der Substratkomponente eingeschlossen sein; sie können auch in D-Form in der nucleophilen Komponente vorliegen.
  • Es ist zu beachten, daß die für die Gruppe Y in dem Peptidderivat der Formel H-A-B-Y gegebenen Definitionen sich in den verschiedenen nucleophilen Komponenten gemäß Anspruch 1 widerspiegeln. Somit enthalten sowohl (b) als auch (c) C- terminale blockierende Gruppen, während Y = H einem Aminosäurealdehyd und Y = Alkyl, Aryl oder Aralkyl einem Aminoketon entspricht. Falls erwünscht kann ein funktionelles Derivat eines Aminoketons als Nucleophil verwendet werden, z.B. ein Ketal, Oxim oder Sulfit.
  • Wie in dem Verfahren gemäß EP-A1-278787 sind die Vorteile des Verfahrens der Erfindung gegenüber den bekannten, erwähnten Verfahren ein minimaler oder überhaupt kein Seitenkettenschutz, kein N-Schutz der Substratkomponente, die sowohl in der D- als auch in der L-Konfiguration sein kann, keine Gefahr einer Racemisierung, wenige Synthesestufen und ein erwartetes, relativ reines Endprodukt, was in der Kombination eine außerordentlich einfache und wirtschaftliche Herstellungsmethode ergibt.
  • Bevorzugte Substratkomponenten sind Ester, in denen R ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, Amyl, Hexyl, Heptyl und Octyl, oder die Aralkylgruppe Benzyl. Besonders vorteilhafte nucleophile Komponenten sind Aminosäureamide, in denen R² H und R³ H oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyl ist, oder Aminosäureester, in denen R&sup4; ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, z.B. wie die oben genannten. Wie erwähnt kann R¹ Alkyl, Aryl oder Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit inerten Substituenten, z.B. mit Hydroxy oder Nitro, sein.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren, die die intermediäre Bildung eines Peptids einschließen, das die Gruppe
  • -NR²R³ oder -OR&sup4;
  • enthält, worauf diese Gruppe abgespalten werden kann, um eine Carbonsäuregruppe zu bilden. Diese Abspaltung kann durch ein anderes Enzym oder durch das gleiche Enzym, das zur Ausbildung des Peptids verwendet wurde, jedoch unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen, katalysiert werden. Es können auch C-terminale Modifizierungen der Gruppe Y vorgenommen werden.
  • Enzyme können weiterhin verwendet werden, um Seitenketten- Schutzgruppen abzuspalten, wobei anwendbare Enzyme proteolytische Enzyme, Lipasen und Esterasen sind, gemäß der Natur der Schutzgruppe, vgl. "The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 9, Special Methods in Peptide Synthesis Part C., J.A. Glass, Enzymatic Manipulation of Protecting Groups in Peptide Synthesis, Academic Press 1987.
  • Als Beispiele für Esterase- und/oder Amidaseaktivität aufweisende Enzyme, von denen daher erwartet wird, daß sie als Katalysatoren in dem Verfahren der Erfindung wirksam sind, können die in der weiter unten folgenden Tabelle aufgeführten genannt werden.
  • Für eine genauere Beschreibung dieser Enzyme wird Bezug genommen unter anderem auf: Perlmann, G.E. et al., in Clowick, S.P. & Kaplan, N.O. (Hg.) Methods of Enzym. 8 (1966) 19 (1970), 28 (1972), 35 (1975) und 45 (1976), Fruton, S., Adv. Enzymol. 53, S. 239, Wiley (1982), Abassi, A. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 367, s. 441-45 (1986), Dixon, M. und Webb, E.C., "Enzymes", 3. Aufl. Longman Group (1979), Torrey, S. (Hg.) in "Enzyme Technology, Recent Advances", Biotech. Rev. 2, Noyes Data Corporation (1983), und schließlich Laane, C., Tramper, S., Lilly, M.D. (Hg.) "Biocatalysis in Organic Media", Elsevier (1987), Asano, Y. et al., Angew. Chem. 101 (1989), S. 511-512, Kitazume, T. et al., J. Flourine Chem. 36 (1987), S. 225-236, auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird. TABELLE I I. Proteasen, die sich von Carboxypeptidasen unterscheiden Enzyme (Abkürzung) normale Quelle Thiolendoproteasen Serinendoproteasen Papain (P) Chymopapain (CP) Bromelain (B) Ficin (F) Clostripain (CL) Trypsin (T) Chymotrypsin (CT) Papaya Ananas Feige (Ficus) Clostridium histolyticum Pankreas C) Exopeptidasen Elastase (E) Subtilisin (S) Thermitase (TV) Proteinase K (K) Valylproteinase (VP) Post-Prolinspezifische Endopeptidase (PPSE) Achromobacter lyticus Protease I (AL-I) ArgC (AC) Lysc (LC) Thrombin (TB) Aminopeptidase (EC3.411), insbesondere aus Achromobacter sp. Pankreas Bacillus licheniformis oder subtilis Thermoactinomyces vulgaris Tritrachium album Candida tropicalis Flavobacterium meningosepticum Achromobacter lyticus Endoproteinase Submaxillaris-Drüsen Endoproteinase Lysobacter-Enzymogene Blutplasma tierisch, pflanzlich oder mikrobiell II. Andere Hydrolasen, die auf Esterbindungen wirken Carboxylesterase (EC.3.1.1.1) Arylhydrolase (EC.3.1.1.2) Triacylglycerollipase (EC.3.1.1.3), insbesondere von Schweinepankreas oder Candida cylindracea oder Lipolase (NOVO); (Aspergillus sp.) Essigesteracetylesterase (EC.3.1.1.6) Arylglycerinlipase (EC.3.1.1.23) Leber Plasma tierisch, pflanzlich oder mikrobiell tierisches Gewebe pflanzlich oder tierisch II. Glycosidasen Cellulase (EC 3.2.1.4), insbesondere von Trichoderma viride oder Aspergillus niger tierisch, pflanzlich oder mikrobiell
  • Gegenwärtig bevorzugte Enzyme sind Trypsin, Chymotrypsin, Subtilisin, Elastase, Papain, Chymopapain, Clostripain, Schweinepankreaslipase und Candida-cylindracea-Lipase
  • Das verwendete Enzym kann auch chemisch modifiziert oder ein biosynthetischer Mutant einer natürlichen Form sein.
  • Wie im folgenden eingehend erläutert wird, ist das Verfahren der Erfindung ziemlich einfach.
  • Die Reaktion kann in einem wäßrigen Reaktionsmedium durchgeführt werden, das, falls erwünscht, bis zu 90%, vorzugsweise bis zu 60% eines polaren organischen Lösemittels, das mit Wasser mischbar ist, enthält, und mit dem Enzym unter den angegebenen Bedingungen verträglich ist. Bevorzugte Lösemittel sind niedere Alkohole, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dimethoxyethan und Ethylenglykol.
  • Es ist wichtig, daß man einen ziemlich konstanten pH-Wert in dem Reaktionsgemisch aufrechterhält. Dieser pH-Wert liegt zwischen 3 und 11, vorzugsweise zwischen 5 und 10,5, insbesondere zwischen 6 und 10 und besonders vorteilhaft zwischen 7 und 9,5; er hängt auch von den konkreten Ausgangsmaterialien, dem gebildeten Peptid und dem Enzym ab.
  • Alternativ kann die Reaktion in einem nicht-wäßrigen, unpolaren Medium durchgeführt werden, das aus mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösemitteln zusammengesetzt ist, z.B. Benzol, Toluol, Hexane, Heptane, Octane, Dialkylether, Ethylacetat, Ethylpropionat und Methylenchlorid und dergleichen, die mit Enzymen mit Esterase- und/oder Amidaseaktivität, insbesondere Lipasen, verträglich sind.
  • Diese im wesentlichen apolaren Reaktionsmedien können bis zu 10% Wasser in gelöster Form enthalten, um eine optimale Enzymleistung oder Reaktionsstabilität zu gewährleisten.
  • Die Reaktionstemperatur ist vorzugsweise die Umgebungstemperatur und darüber, 20 bis 50ºC, es können jedoch Temperaturen im Bereich von 0 bis 80ºC verwendet werden, vorzugsweise unter den sonst gegebenen Bedingungen. Bei hohen Lösemittelbedingungen können Temperaturen unter 0 oder Temperaturen von mehr als 80ºC verwendet werden.
  • Die Konzentration der zwei Reaktionskomponenten kann innerhalb breiter Bereiche schwanken, wobei die nucleophile Komponente jedoch häufig im Überschuß vorhanden ist, und zur Vermeidung von Oligomerisation der Substratkomponente wird diese Komponente häufig in kleineren Anteilen in Abständen während der gesamten Reaktionsfolge zugesetzt. Wenn ein gutes Nucleophil für das Enzym in hohem Überschuß verwendet wird, wird überraschenderweise keine Oligomerisation beobachtet, und es können hohe Substratkonzentrationen ohne Nebenreaktionen verwendet werden. Falls ein homo-Dipeptid, in dem A = B ist, hergestellt werden soll, kann die Oligomerisation eines einzelnen Nucleophils vermieden werden, wenn man unterschiedliche Carboxyschutzgruppen auf dem Substrat und der nucleophilen Komponente verwendet.
  • Somit kann die Anfangskonzentration der Substratkomponente typischerweise 0,005 bis 2 molar sein, und für die nucleophile Komponente in Fällen, in denen sie separat zugesetzt wird, 0,005 bis 3 molar. In den meisten Situationen ist es möglich, einen Überschuß der nucleophilen Komponente und das Hydrolyse produkt von der Substratkomponente für eine eventuelle erneute Veresterung und Verwendung wiederzugewinnen. Das Recycling der Komponenten ist besonders leicht infolge ihrer einfachen Struktur und des Fehlens von Nebenreaktionen sowie von Entschützungsverlusten.
  • Die Enzymkonzentration kann ebenfalls variieren, sie ist jedoch im allgemeinen etwas höher (5 bis 50 um oder noch höher, bis zu etwa 500 um) als die Konzentrationen, die für die Verwendung von N-geschützten Aminosäureestersubstraten geeignet sind. Die für synthetische Zwecke erforderliche Menge kann jedoch um mehr als das Zehnfache verringert werden, indem man eine stabile, immobilisierte Enzymzubereitung verwendet, wodurch das zu verwendende Enzym in einem kontinuierlichen Verfahren eingesetzt werden kann.
  • Das Reaktionsmedium kann weiterhin Salze enthalten, z.B. NaCl und CaCl&sub2;; dies beeinflußt die Bindung des Enzyms an das Substrat und kann das Enzym stabilisieren; weiterhin auch ein Komplexbindungsmittel für vorhandene Metallionen, z.B. EDTA, und mercaptostabilisierende Mittel wie DTT, BME oder Cystein können z.B. mit Thiolendoproteasen verwendet werden.
  • Diese überraschende Hydrolysesequenz spiegelt sich in den folgenden Beispielen wider, die die Herstellung von verschiedenen Dipeptiden mit dem Verfahren der Erfindung unter Verwendung verschiedener Enzyme veranschaulichen.
    • Allgemeines Verfahren für die Beispiele 1 bis 13 und 20 ff.
  • Die Reaktionen, die in einem analytischen Maßstab mit einem Reaktionsvolumen von 1 ml erfolgten, wurden in einem pH-Staten durchgeführt, und der gewählte pH-Wert wurde mittels automatischer Zugabe von 1 N NaOH konstant gehalten, ausgenommen bei denjenigen Beispielen mit hohen Gehalten an organischen Lösemitteln und immobilisierten Enzymen, wo die Bedingungen in den einzelnen Beispielen angegeben werden. Die Reaktionstemperatur war die Umgebungstemperatur, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Tabelle schließt auch Reaktionskonzentrationen, den Gehalt an organischen Lösemitteln, das Produkt und die Ausbeute ein. Die Reaktionszeiten betrugen typischerweise zwischen 0,5 und 5 Stunden und die Enzymkonzen tration typischerweise 5 bis 20 um, wenn nicht anderes angegeben ist.
  • Die Produktidentifikation und die Bestimmung der Produktausbeute wurden mittels Umkehrphasen-HPLC durchgeführt (Waters 6000 A Pumpen, 660 Gradientmischer, UK 6-Injektor), und zwar an einer C&sub1;&sub8;NOVA-PAK-Kolonne (Waters, RCM) unter Verwendung geeigneter Gradienten von Elutionssystemen, enthaltend 50 mM Triethylammoniumphosphat, pH 3,0, von 0% bis 80% Acetonitril mit einem Fluß von 2 ml/min. Die Elution wurde mittels eines UV-Detektors (Waters 480) bei 230 nm, 254 nm, 278 nm oder 290 nm verfolgt.
  • Die Produkte wurden durch Aminosäureanalyse von Fraktionen aus der HPLC-Analyse identifiziert, welche dem vermuteten Produktpeak entsprachen, und/oder durch HPLC-Vergleich mit einem chemisch synthetisierten Vergleichsprodukt. Dieses wurde gemäß bekannter Prinzipien hergestellt, gewöhnlich über eine Reaktion zwischen BOC-A-OSu - das tertiär-Butyloxycarbonyl-succinimid-ester-Derivat der Aminosäure als Substrat - und der verwendeten nucleophilen Komponente, gefolgt von einer Deblockierung des N-terminalen Aminosäurerests. In allen Fällen war es möglich, LL- und DD-Dipeptide aus den diastereomeren DL- und LD-Dipeptidprodukten abzutrennen.
  • Für diejenigen Produkte, die nur bei 230 nm bestimmt werden können, wurden die Produktausbeuten mittels der Absorption/Konzentration-Kurve der chemisch synthetisierten Vergleichsverbindung bestimmt. Für die anderen Produkte wurden die Ausbeuten auf der Basis des Verhältnisses zwischen den integrierten Flächen unterhalb der Peaks in dem Elutionschromatogramm, entsprechend dem Produkt, bzw. dem bei der betreffenden Wellenlänge absorbierenden Reaktanten bestimmt.
  • Die Reaktionsbedingungen in den präparativen Beispielen 14-17 werden in jeweiligen Beispielen erläutert. Die Reaktionen wurden in der beschriebenen Weise durch analytische HPLC verfolgt. Die Enzymkonzentrationen waren allgemein niedriger und die Reaktionszeiten länger als in den entsprechenden analytischen Beispielen; es wurde jedoch kein Versuch unternommen, die Reaktionsbedingungen zu optimieren. Beispiel 1 Trypsin a)-katalysierte Synthese von L,L-Dipeptidamiden mit L-Arginin-ethylester (50 mM) als Substrat und L-Aminosäureamiden als Nucleophile bei verschiedenen Konzentrationen in Wasser bei pH 8,5. Nucleophil (Konz.) Produkt Ausbeute Leucinamid Methioninamid Serinamid Tyrosinamid a) 10 um Beispiel 2 Trypsin a)-katalysierte Synthese von diastereomeren L,D- und D,L-Dipeptidamiden mit L- oder D-Argininethylester (50 mM) als Substrat und L- oder D-Leucin und -Methioninamiden als Nucleophile in Wasser bei pH 8,5. Substrat Nucleophil (Konz.) Produkt Ausb. L-Leucinamid L-Methioninamid D-methioninamid a) 10 uM Beispiel 3 Trypsin a)-katalysierte Synthese von L,L-Dipeptidamiden unter Verwendung von L-Aminosäureamiden (0,5 M) als Nucleophile und L-Lysin oder -Histidinethylester (50 mM) als Substrat in Wasser bei pH 8,5. Substrat Nucleophil Produkt Ausb. Methioninamid Tryptophanamid Alaninamid Methioninamid a) 10 uM Beispiel 4 Alpha-Chmotrypsin a)-katalysierte Synthese von L,L-Dipeptidamiden unter Verwendung von L-Tyrosinethylester (50 mM) als Substrat und L-Aminosäureamid als Nucleophil in Wasser. Nucleophil (Konz.) Produkt Ausb. Leucinamid Argininamid Serinamid a) 5 um Beispiel 5 Alpha-Chymotrypsin a)-katalysierte Synthese von L,D-Dipeptidamiden unter Verwendung von L-Tyrosinethylester (5 oder 50 mM) als Substrat und D-Aminosäureamid als Nucleophil in Wasser. Nucleophil (Konz.) Produkt Ausb. D-Leucinamid D-Isoleucinamid D-Serinamid Substrat a) 5 uM b) 5 mM Substrat Beispiel 6 Alpha-Chymotrypsin-katalysierte Synthese von D,L-Dipeptidamiden unter Verwendung von D-Tyrosinethylester (50 mM) als Substrat und L-Leucinamid als Nucleophil in Wasser bei pH 9,0. Nucleophil (Konz.) Produkt Ausbeute c) L-Leucinamid a) 50 uM Enzym b) 100 uM Enzym c) längere Reaktionszeit - Tage Beispiel 7 Alpha-Chymotrypsin a)-katalysierte Synthese von L,L- und L,D-Dipeptidamiden und -estern unter Verwendung verschiedener L-Aminosäureester (50 mM) als Substrate und L- oder D-Aminosäureestern (0,8 M) oder -amiden als Nucleophile bei pH 8,5. Substrat Nucleophil Lösemittel Produkt Ausb.d) Wasser a) 5 uM b) 0,4 M Nucleophil c) bei 90% Konversion d) Hydrolyse/Diketopiperazin, gebildet durch chemische Instabilität des Produktes, wurde unter diesen Bedingungen in Mengen von 15 bis 35% beobachtet und ist in den Ausbeuteangaben nicht eingeschlossen. Beispiel 8 Subtilisin-A a)-katalysierte Synthese von seitenkettengeschütztem L-Aspartyl-D-alanylamid unter Verwendung von L-Aspartyldiestern (0,1 M) als Substraten und D-Alaninamiden als Nucleophile bei pH 8,5. Substrat Nucleophil (Konz.) Lösemittel Produkt Ausb. L-Asp(OBzl)&sub2; b) a) 5 uM b) 50 mM Substrat, 20 uM Enzym Beispiel 9 Elastase a)-katalysierte Synthese von L,L-Amiden unter Verwendung von Aminosäure-benzylester (50 mM) als Substrat und Aminosäureamiden (0,5 M) als Nucleophil in Wasser bei pH 8,5. Substrat Nucleophil Produkt Ausbeute L-Argininamid a) 40 uM Beispiel 10 Synthese von L,L-Dipeptdiamiden, katalysiert durch Papaya- Thiolendoproteasen a) unter Verwendung von Aminosäureestern (50 mM) als Substrate und L-Aminosäureamiden (0,8 M) als Nucleophile in Wasser bei pH 8,5. Enzym Substrat Nucleophil Produkt Ausb. Papain Chymopapain a) 100 uM, 2 mM, EDTA, 10 mM Cystein Beispiel 11 Clostripain a)-katalysierte Synthese von L-L-Dipeptidamiden und -estern mit L-Argininethylester als Substrat (50 mM) und L-Aminosäureamiden als Nucleophile bei pH 8,5. Nucleophil (Konz.) Lösemittel Produkt Ausb. L-Methioninamid L-Phenylalaninamid Wasser a) 5 uM Enzym, 50 mM CaCl&sub2;, 10 mM DTT, pH eingestellt mit TEA Beispiel 12 Schweinepankreas-Lipase a)-katalysierte Synthese von L,L-Dipeptidamiden unter Verwendung von L-Aminosäureethylestern (50 mM) als Substrate und L-Aminosäureamiden als Nucleophile in 30% EtOH bei pH 8,5. Substrat Nucleophil (Konz.) Produkt Ausb. L-MetNH&sub2; b) a) 500 uM b) Reaktion in Reinwasser c) bei unvollständiger Konversion Beispiel 13 Candida-cylindracea-Lipase a)-katalysierte Synthese von L,L-Dipeptidamiden unter Verwendung von L-Aminosäureethylestern (50 mM) als Substrate und L-Aminosäureamiden als Nucleophile in 30% EtOH bei pH 8,5. Substrat Nucleophil (Konz.) Produkt Ausb. a) 1000 uM, verlängerte Reaktionszeit b) Gegen Hydrolyse bei weniger als 50% Konversion.
    • Beispiel 14 Präparative Synthese von L,L-Tryptophanyl-methioninamid, TrpMetNH&sub2;. Verfahren.
  • L-Tryptophan-ethylester-hydrochlorid (4,0 g, 15 mmol) und L-Methionin-amid-hydrochlorid (55,7 g, 300 mmol) wurden in 195 ml H&sub2;O und 90 ml Ethanol gelöst; der pH wurde mit Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,8 g roher Schweinepankreas-Lipase initiiert und bei einem pH von 8,5 für die Dauer der Reaktion gehalten. Der Rest des Substrats (4,0 g, 15 mmol) wurde nach fünf Stunden zugesetzt, und man ließ die Reaktion über Nacht weiterlaufen. Sie wurde anschließend durch Einstellung des pH auf 3 mittels HCl-Lösung gestopt.
  • Das Gemisch wurde anschließend verdünnt; Ethanol wurde durch Verdampfung unter verringertem Druck entfernt, und das Gemisch wurde filtriert. Das Filtrat wurde durch RP-präparative HPLC (Waters Prep LC/System 500A) unter Verwendung von zwei Kolonnen (5,7 x 30 cm), gepackt mit 60 um C-18-Teilchen, und 5 mM HCl/Ethanol-Gemischen als Eluent gereinigt.
  • Die gesammelten Fraktionen, die das reine Produkt enthielten, wurden unter verringertem Druck konzentriert und schließlich gefriergetrocknet.
  • Dieses Verfahren ergab 4,78 g, L,L-Tryptophanylmethioninamid-hydrochlorid (12,9 mmol, 43 %) als amorphes Pulver.
    • Identifizierung.
  • Das Produkt wurde als Hydrochlorid mit einem Gehalt von 10,3 % (w/w) an Chlorid identifiziert.
  • Die Aminosäureanalyse zeigte das Fehlen von freien Aminosäuren und ergab die folgenden Ergebnisse nach der Säurehydrolyse:
  • Met (1,00)
  • Trp (1,00).
  • Die spezifische optische Rotation in 50 % MeOH, c=0,2, unter Verwendung der Natrium-D-Linie ergab sich als +40,0º bei 20ºC.
    • Reinheit.
  • HPLC-Reinheit: 92,4% (Novapak 4 um C-18, 0,1 M Ammoniumphosphat, pH 3,0/Acetonitril, 220 nm).
  • Wassergehalt nach Karl Fischer: 5,3 % (w/w).
  • Quantifizierung der alpha-Aminogruppen durch Reaktion mit Trinitrobenzol-sulfonsäure und UV-Messung: 75,8 % (w/w).
  • Peptidgehalt durch UV-Quantifizierung: 88,3 % (w/w) (281 nm, Trp-absorbtion in MeOH: 0,1 N KOH (1:1)).
    • Beispiel 15 Präparative Synthese von L,D,-Tyrosylserinamid, TyrSerNH&sub2; Verfahren.
  • L-Tyrosinethylesterhydrochlorid (2,5 g, 10 mmol) und D-Serinamid-Hydrochlorid (17,5 g, 100 mmol) wurden in 200 ml Wasser gelöst, und der pH wurde mittels Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 mg alpha- Chymotrypsin initiiert und während der Dauer der Reaktion bei einem pH von 8,5 gehalten. Nach 30 Minuten begann das Ausfallen des freien Tyrosins. Der Rest des Substrats (5,0 g, 20 mmol) wurde in zwei Portionen von 2,5 g innerhalb einer Stunde zugesetzt. Die Reaktion wurde zwei Stunden gerührt, und sie wurde anschließend durch Einstellung des pH auf 3 mittels HCl-Lösung gestopt.
  • Das gebildete Tyrosin wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde mittels RP-präparativer HPLC gereinigt (Waters Prep LC/System 500A), und zwar unter Verwendung von zwei Kolonnen (5,7 x 30 cm), gepackt mit 20 uM C-18 Teilchen und 50 uM Essigsäure als Eluent.
  • Die gesammelten Fraktionen, die das reine Produkt enthielten, wurden unter verringertem Druck konzentriert und schließlich unter Zugabe von wässriger HCl gefriergetrocknet.
  • Dieses Verfahren ergab 2,8 g L,D-Tyrosylserinamid-Hydrochlorid (9,2 mmol, 31 %) als amorphes Pulver.
    • Identifizierung.
  • Das Produkt wurde als das Hydrochlorid mit einem Gehalt von 16,0 % (w/w) von Chlorid identifiziert.
  • Die Aminosäureanalyse zeigte die Abwesenheit von freien Aminosäuren, ergab jedoch nach der Säurehydrolyse die folgenden Ergebnisse:
  • Ser (1,10)
  • Tyr (0,90).
  • Die spezifische optische Rotation in 50 % MeOH, c=0,3, unter Verwendung der Natrium-D-Linie, ergab sich zu +58,0º bei 20ºC.
    • Reinheit.
  • HPLC-Reinheit: 97,4 % (Novapak 4 um C-18, 0,1 M Ammoniumphosphat, pH 3,0/Acetonitril, 220 nm).
  • Wassergehalt nach Karl Fischer: 1,8 % (w/w).
  • Quantifizierung der alpha-Aminogruppe durch Reaktion mit Trinitrobenzolsulfonsäure und UV-Messung: 81 % (w/w).
    • Beispiel 16 Präparative Synthese von D,L-TyrosylLeucinamid, tyrLeuNH&sub2; Verfahren.
  • D-Tyrosinethylester-Hydrochlorid (3,5 g, 14 mmol) und L- Leucinamid-hydrochlorid (14 g, 84 mmol) wurden in 246 ml 0,1 M KCl gelöst, und der pH wurde mittels Natriumhydroxid auf 9,0 eingestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,7 g alpha- Chymotrypsin initiiert und zwei Tage bei Umgebungstemperatur gerührt. Der pH wurde während der Dauer der Reaktion bei 9,0 gehalten. Die Reaktion wurde durch Einstellung des pH auf 3 unter Verwendung von HCl-Lösung gestopt.
  • Das gebildete Tyrosin wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde mittels RP-präparativer HPLC gereinigt (Waters Prep LC/System 500A), unter Verwendung von zwei Kolonnen (5,7 x 30 cm), gepackt mit 20 uM C-18-Teilchen, und 5 mM HCl als Eluent.
  • Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen wurden durch Verdampfen unter verringertem Druck konzentriert und schließlich gefriergetrocknet.
  • Dieses Verfahren ergab 2,50 g D,L-Tyrosyleucinamid-hydrochlorid (7,6 mmol, 54 %) als amorphes Pulver.
    • Identifizierung.
  • Das Produkt wurde als das Hydrochlorid mit einem Gehalt an 9,8 % (w/w) Chlorid identifiziert.
  • Die Aminosäureanalyse zeigte das Fehlen von freien Aminosäuren; nach der Säurehydrolyse ergaben sich jedoch die folgenden Ergebnisse:
  • Tyr (0,98)
  • Leu (1,03).
  • Die spezifische optische Rotation in Wasser, c=0,1, unter Verwendung der Natrium-D-Linie, ergab sich als -129,4º bei 20ºC.
    • Reinheit
  • HPLC-Reinheit: 92,9 % (Novapak 4 um C-18, 0,1 M Ammoniumphosphat, pH 3,0/Acetonitril, 220 nm).
  • Wassergehalt nach Karl Fischer: 6,8 % (w/w).
  • Quantifizierung der alpha-Aminogruppe durch Reaktion mit Trinitrobenzolsulfonsäure und UV-Bestimmung: 74,9 %.
  • UV-Quantifizierung: 74,9 % (Tyrosinphenolat-Absorption bei 293 nm, in 0,1 M KOH).
    • Beispiel 17 Präparative Synthese von L,L-Arginylmethioninamid, ArgMetNH&sub2; Verfahren
  • L-Argininethylester-hydrochlorid (4,1 g, 15 mmol) und L- Methioninamid-hydrochlorid (55,4 g, 300 mmol) wurden in 300 ml Wasser gelöst, und der pH wurde mit Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 mg Trypsin initiiert. Der pH wurde für die Dauer der Reaktion bei 8,5 gehalten. Der Rest des Substrats (8,2 g, 30 mmol) wurde innerhalb einer Stunde zugesetzt. Die Reaktion wurde anschließend durch Einstellung des pH auf 3 unter Verwendung von HCl-Lösung gestopt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde anschließend verdünnt und durch successiven Kationenaustausch gereinigt, und zwar an einer DOWEX-A650 Wx4 und einer CM-Sepharose 6B-Kolonne unter Verwendung von Ammoniumacetat bzw. NaCl/HCl-Salzgradienten, und es wurde schließlich entsalzt.
  • Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter verringertem Druck konzentriert sowie schließlich gefriergetrocknet.
  • Dieses Verfahren ergab 10,7 g L,L-Arginylmethioninamid-dihydrochlorid (28,3 mmol, 63 %) als weißes, amorphes Pulver.
    • Identifizierung.
  • Weniger als 0,2 % (w/w) an Acetat und 22,9 % (w/w) Chlorid wurden gemessen, so daß das Produkt als ein Dihydrochlorid vorlag.
  • Die Aminosäureanalyse zeigte die Abwesenheit von freien Aminosäuren, wobei jedoch nach der Säurehydrolyse die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:
  • Arg (1,00)
  • Met (0,80).
  • Die spezifische optische Rotation in 50 % MeOH, c=0,2, unter Verwendung der Natrium-D-Linie ergab sich zu +19,5º bei 20ºC.
    • Reinheit.
  • HPLC-Reinheit: 95,1 % (Novapak C-18, 0,1 M Ammoniumphosphat enthaltend Alkylsulfonat, pH 4,5/Acetonitril, 220 nm).
  • Wassergehalt nach Karl Fischer: 9,1 % (w/w).
  • Peptidgehalt durch Aminosäureanalyse: 72 % (w/w), bezogen auf Arginin. Beispiel 18 Synthese von L,L-Methionyl-methioninamid, katalysiert durch Eupergit C-immobilisierte Schweinepankreas-Lipase a) unter Verwendung von L-Methioninethylester als Substrat und L- Methioninamid als Nucleophil bei pH 8,5 in Wasser und wässrig/organisch-homogenen Gemischen. Konz. an Substrat Nucleophil Organisches Lösemittel Ausb.b) Isopropanol
  • a) Schweinepankreas-Lipase wurde auf Eupergit C immobilisiert, und zwar unter Verwendung des von dem Hersteller empfohlenen Verfahrens bis auf eine Endkonzentration, die etwa 400 uM auf dem Gel durch Aktivitätsassay entsprach.
  • b) Die Reaktionsgemische mit Volumina von 1 - 3 Reaktionsbettvolumina wurden über die mit Enzymgel gepackte Kolonne rezirkuliert, und zwar bis zur vollständigen Konversion des Substrats, bestimmt durch HPLC (0,5 - 2 Tage), wobei der pH durch pH-Statkontrolle konstant gehalten wurde. Beispiel 19 Schweinepankreas-Lipase a) und alpha-Chymtrypsin a)- katalysierte Synthese von L,L-Tryptrophanyl-alanin tert-butylester in reinen organischen Lösemitteln mit L- Tryptophanethylester (50 mM) als Substrat und L-Alanin-tert- butylester (0,3 M) als Nucleophil, beide in salzfreier Form. Enzym a) Lösemittel Konversion c) Ausb. c) CH&sub2;Cl&sub2;/n-Hexan CH&sub2;Cl&sub2;/Isooctan
  • a) 500-2000 uM gefriergetrocknetes Enzym, enthaltend Wasser, wurde direkt dem Gemisch zugesetzt, welches 24 Stunden gerührt wurde.
  • b) In diesem Falle wurden 500 uM Enzym und 3 Tage Reaktionszeit verwendet.
  • c) Die Konversion des Ausgangsmaterials und die Ausbeute gegen die Hydrolyse wurde durch HPLC bestimmt, und zwar an mit DMF gequenchten Proben, eingedampft und erneut gelöst in DMF/Säure-Wasser. Kontrollgruppen zeigten weder einer Konversion noch eine Ausbeute. Beispiel 20 Alpha-Chymotrypsin a)-katalysierte Synthese von seitenkettengeschützten L,L-Dipeptidamiden mit L-Tyrosin oder L-Phenylalanin-ethylestern (50 mM) als Substrate und L-S-Acetamidomethylcysteinamid (0,6 M) als Nucleophile in Wasser bei pH 8,5. Substrat Produkt Ausb. L-Tyrosinethylester L-Phenylalaninethylester a) 5 um Beispiel 21 Alpha-Chymotrypsin a)-katalysierte Synthese von L,L-Dipeptidalkoholen unter Verwendung von L-Tyrosin und L-Phenylalanin-ethylestern (50 mM) als Substrate und L-Aminosäurealkoholen (0,5 M) als Nucleophile in Wasser bei pH 8,5. Substrat Nucleophil Produkt Ausb. a) 10 um Beispiel 22 Synthese von L,L-Dipeptiden, katalysiert durch Thiolendoproteasen a), unter Verwendung von Aminosäureethylestern (50 mM) als Substrat und freien L-Aminosäuren als Nucleophile in Wasser bei pH 8,5. Enzym Substrat Nucleophil (Konz.) Produkt Ausb.b)c) Ficin Papain a) 100 uM, 2 mM EDTA, 0,1 M KCl, 5 mM DTT oder 10 mM Cystein. b) Bestimmt gegen Hydrolyse über einen Standard bei weniger als 50 % Konversion. c) Kontrollen ohne Enzyme zeigten keine meßbare Aminolyse unter den beschriebenen Bedingungen. Beispiel 23 Trypsin a) katalysierte Synthese von L,L-Dipeptidamiden mit Arginin-Aparanitroanilid (10 mM) als Substrat und L-Aminosäureamid (0,3 M) als Nucleophile in 40 % DMF bei pH 8,5. Nucleophil Produkt Ausb. b) Methioninamid Leucinamid Tyrosinamid a) 5 uM b) Bestimmt gegen die Hydrolyse über einen Standard bei weniger als 80 % Konversion. Beispiel 24 Papain a)b)-katalysierte Synthese von L,L-Lysylalaninamid unter Verwendung von L-Lysinethylester (50 mM) als Substrat und L-Alaninamid (0,8 M) als Nucleophil in Wasser bei verschiedenen pH-Werten. pH Ausb. c) a) 50 uM, 2 mM EDTA, 10 mM Cystein. b) Bei verlängerter Reaktionszeit; weniger als 50 % Konversion. c) Bestimmt gegen eine Hydrolyse unter Verwendung eines Standards und korrigiert bezüglich unvollständiger Konversion. Beispiel 25 Alpha-Chymotrypsin a) und Clostripain b)-katalysierte Synthese von L,L-Dipeptidestern unter Verwendung von L-Aminosäureethylestern (50 mM) als Substrat und L-Aminosäureethyl- oder tert-butylestern als Nucleophile in Wasser bei pH 7,5 und 8,5. Enzym Substrat Nucleophil (Konz.) Produkt Ausb. a) 5 uM, 0,1 M KCl, pH 7,5. b) 10 uM, 50 mM CaCl&sub2;, 10 mM DTT, pH 8,5 eingestellt mit TEA. C) Bestimmt bei weniger als 50 % Konversion. Beispiel 26 Schweinepankreas-Lipase a) und Lipolase (Novo)(LIP) a) und Rhizopus arrhizus-Lipase (RA) b)-katalysierte Synthese von L,L-Methionylmethioninamid unter Verwendung verschiedener L-Methioninester als Substrate und L-Methioninamiden als Nucleophil in verschiedenen Wasser/organische Lösemittel-homogenen Gemischen bei pH 8,5 und 1,0 M Nucleophil, wenn nichts anderes angegeben ist. Enzym Ester Substrat (Konz.) Organisches Lösemittel Ausb. e) PPL c) PPL d) Ethyl n-Propyl n-Hexyl Dimethoxyethan Isopropanol 36 % Ethylenglykol a) 1000 uM - 2000 uM b) 50 uM c) pH 9,0 d) Bei 0,25 M Nucleophil e) Verschiedene kleinere Mengen von Deamidationen des Produktes wurden unter diesen Bedingungen festgestellt und sind in den angegebenen Ausbeuten nicht eingeschlossen. Beispiel 27 Trichoderma viridae-Cellulase-katalysierte Synthese von L,L-TyrGlyNH&sub2; unter Verwendung von L-Tyrosinethylester als Substrat und Glycinamid als Nucleophil in Wasser. Substrat (Konz.) Nucleophil Produkt Ausb. TyrOEt a) TyrOEt b) TyrOiPr b/b a) 1000 uM rohes Enzym, pH 8,5 b) 500 uM rohes Enzym, pH 8,0 c) Bestimmt gegen eine Hydrolyse von weniger als 30 % Umwandlung und korrigiert für Hydrolyse und Aminolyse, die unter ähnlichen Bedingungen bei Vergleichen gefunden wurden. d) Es wurde eine vollständige enzymatische und keine spontane Konversion unter den verwendeten Bedingungen beobachtet.

Claims (14)

1. Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden oder strukturell verwandter Verbindungen der allgemeinen Formel
H-A-B-Y
in der A einen gegebenenfalls seitenkettengeschützten L- oder D-alpha-Aminosäurerest oder omega-Aminosäurerest und B einen gegebenenfalls seitenkettengeschützten L- oder D-alpha-Aminocarbonsäurerest, der gleich oder verschieden von A sein kann, einen L- oder D-Aminophosphonsäurerest oder einen L- oder D-Aminosulfonsäurerest oder die entsprechenden omega-Aminosäuren oder Salze oder Hydrate derselben und Y OH, H, Alky, Aryl, Aralkyl oder eine C-terminale Blockierungsgruppe bedeuten, mit der Maßgabe, daß A nicht Asp oder Glu sein kann, wenn B Phe und Y Alkyl ist, oder BY einen Aminoalkoholrest
B¹-CHY¹-OH
bedeuted, wobei B¹ ein Decarboxyderivat der Aminocarbonsäure, wie bezüglich B definiert, und Y¹ H, Alkyl, Aryl oder Aralkyl ist, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratkomponente, die ein Aminosäurederivat der Formel
H-A-OR¹ oder H-A-NR²R³
ist, wobei A wie oben definiert ist, sowie R¹ Alkyl, Aryl oder Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit inerten Substituenten, oder ein alpha-Desaminofragment einer Aminosäure und R² und R³, die gleich oder verschieden sind, jeweils Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit inerten Substituenten, bedeuten,
mit einer nucleophilen Komponente, ausgewählt aus
(a) Aminosäuren der Formel
H-B-OH
in der B ein wie oben definierter Aminocarbonsäurerest,
(b) Aminosäureamiden der Formel
H-B-NR²R³
in der B ein wie oben definierter Aminocarbonsäurerest ist und R² und R³ wie oben definiert sind, mit der Ausnahme, daß wenn R² Wasserstoff ist, R³ auch Hydroxy oder Amino sein kann,
(c) Aminosäureestern der Formel
H-B-OR&sup4;
in der B ein wie oben definierter Aminocarbonsäurerest ist und R&sup4; Alkyl, Aryl oder Aralkyl bedeutet,
(d) gegebenenfalls säuregruppengeschützten, geradkettigen oder verzweigten Aminophosphonsäuren oder Aminosulfonsäuren der Formel
NH²(CH&sub2;)xPO&sub3;R&sup5;R&sup6; oder NH&sub2;(CH&sub2;)xSO&sub3;R&sup7;
in der R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Aralkyl und x 1 - 6 bedeuten,
(e) Aminosäurealdehyden oder Ketonen oder Derivaten derselben der Formel
H-B¹-CY²-R&sup8;
in der B¹ wie oben definiert, Y² O oder ein funktionelles Derivat desselben, vorzugsweise ein Ketal und R&sup8; H, Alkyl, Aryl oder Aralkyl bedeuten, und
(f) Aminoalkoholen der Formel
H-B¹-CHY¹-OH
in der B¹ und Y¹ wie oben definiert sind,
in Gegenwart eines Amidase- oder Esteraseenzyms, das von Serin- oder Thiolcarboxypeptidasen verschieden ist, in Lösung oder Dispersion umsetzt und anschließend, falls erwünscht, eine vorhandene Seitenkettenschutzgruppe oder Schutzgruppe Y abspaltet und/oder, falls erwünscht, das erhaltene Dipeptidderivat in ein Salz oder Hydrat überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzym mit Esterase- oder Amidase-Aktivität verwendet, das von Serin- oder Thiolendoprotheasen, Lipasen, Esterasen und Glycosidasen ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Enzym chemisch modifiziert oder ein biosynthetischer Mutant einer natürlichen Form ist.
4. Verfahren nach einem jeden der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein immobilisiertes Enzym verwendet.
5. Verfahren nach einem jeden der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Reaktionslösung oder -dispersion verwendet, die 0 - 90 %, vorzugsweise 0 - 60 %, eines polaren, wassermischbaren organischen Lösemittels enthält und einen pH-Wert von 3 - 11, vorzugsweise 5 - 10,5, besonders bevorzugt 6 - 10 und insbesondere 7 - 9,5, aufweist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösemittel aus Alkanolen, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dimethoxyethan und Ethylenglykol ausgewählt ist.
7. Verfahren nach einem jeden der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine organische Reaktionslösung oder -dispersion verwendet, die 0 - 10 % Wasser enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein unpolares organisches Lösemittel verwendet, vorzugsweise ausgewählt aus Dialkylethern, Ethylacetat, Ethylpropionat, Octanen, Heptanen, Hexanen, Petrolethern und Methylenchlorid.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein flüssiges Substrat oder eine nucleophile Komponent verwendet, die ebenfalls als organisches Lösemittel dienen kann.
10. Verfahren nach einem jeden der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substratkomponente einen D- oder L-Aminosäureester verwendet, der aus Benzylestern oder geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub8;-Alkylestern, gegebenenfalls mit inerten Substituenten substituiert, ausgewählt ist.
11. Verfahren nach einem jeden der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als nucleophile Komponente ein Aminosäureamid der Formel
H-B-NHR³
verwendet, in der R³ Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl und B einen L- oder D-Aminocarbonsäurerest bedeuten.
12. Verfahren nach einem jeden der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als nucleophile Komponente einen Ester der Formel
H-B-OR&sup4;
verwendet, in der B ein L- oder D-Aminocarbonsäurerest und R&sup4; C&sub1;-C&sub3;-Alkyl bedeutet.
13. Verfahren nach einem jeden der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das erhaltene Dipeptid eine C-terminale Schutzgruppe Y oder mehrere einschließt und daß die Gruppe bzw. Gruppen enzymatisch abgespalten wird/werden, und zwar entweder mittels des gleichen Enzyms, das in der vorherigen Reaktion verwendet wurde, oder mittels eines Enzyms, das eine unterschiedliche Ester- oder Amidspezifität aufweist.
14. Verfahren nach einem jeden der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das erhaltende Dipeptid eine Seitenkettenschutzgruppe oder mehrere einschließt und daß die Gruppe bzw. Gruppen enzymatisch abgespalten wird/werden, vorzugsweise mittels einer Esterase oder Lipase oder eines proteolytischen Enzyms.
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