JPH04501056A - ジペプチドまたは構造関連化合物の酵素的製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ジペプチドまたは構造関連化合物の酵素的製造方法本発明は、一般式 ％式％ 〔式中、Ａは側鎖が保護されていてもよいＩ７−もしくはＤ−α−アミノ酸残基 またはω−アミノ酸残基であり、ＢはＡと同種もしくは異種の側鎖か保護されて いてもよいし−もしくはＤ−α−アミ、！カルボン酸残基、およびＬ−もしくは Ｄ−アミノリン酸残基またはＬ−もしくはＤ−アミノスルホン酸残基、または相 当するω−アミノ酸、またはそれらの塩もしくは水和物であり、ＹはＯＨ。

Ｈ１アルキル、アリール、アラールキルまたはＣ−末端保護基であり、あるいは ＢＹは Ｂ’　−ＣＨＹ’　−０Ｈ （式中、Ｂ’はＢに関連して定義されたアミノカルボン酸のデカルボキシ誘導体 であり、ＹｌはＨ、アルキル、了り−ルまたはアラールキルである）で示される アミノアルコール残基を表す〕を存するジペプチドおよびジペプチド誘導体の酵 素的製造方法に関する。

最近、Ｄ−コンフィギユレーションのアミノ酸残基を含有していてもよいジペプ チドおよびジペプチド誘導体６二対する興味か、それらの薬理学的効果たとえば 抗生物質作用の可能性に関連して高まってきている。同様に、ヒトならびに動物 の人工栄養、甘味剤の分野で、また農薬たとえば除草剤の分野でも、ジペプチド は著しい興味をもたれている。

このようなジペプチドＨ−Ａ−Ｂ−Ｙは公知の化学的カップリング反応によって 製造できるが、これらの方法はすべて、一般に、ＡおよびＢに含まれるアミノ酸 のアミノ基およびカルボン酸基をそれぞれ、また多くの場合、これらが側鎖に官 能基ももつ場合には側鎖も、保護する必要があるという特徴をもっている。さら に、使用する試薬のために、化学的カップリング反応に際して副反応が起こる危 険がついてまわり、主な副反応にはとくにＡ成分のラセミ化がある。化学的カッ プリング工程を、緩和な条件下に進行する酵素的カップリング工程に置換えるこ とによって、このような副反応およびラセミ化は回避することができて、立体化 学的に純粋な生成物が生成する。

アミノおよびカルボキシル保護基の存在は化学的カップリングにおいては必須で あり、またエンドプロテアーゼを使用する従来技術での酵素的カップリングにお いても一般的に必須と考えられてきた。

これは、これらの方法の工業的規模での経済性に大きな悪影響を与えるいくつか の望ましくない特徴を付与し、これはジペプチド合成の場合と（に明白である。

この欠点は、これらの基の導入ならびにそれらの除去および処理操作時における 存在によるもので、全過程の費用および時間を増大させ、総収量に悪影響を与え る。

共通して用いられるアミノ保護基の代表的な例には、カルボベンゾキシ（Ｚ−） および三級ブトキシカルボニル（Ｂ　ｏ　ｃ−）型の保護基があり、これらの分 子量はアミノ酸残基のそれに匹敵する。まず、保護基は、別個の反応工程で適当 な高価な試薬により出発原料に導入し、ついで単離工程を行わねばならない。そ の存在時には、これらの疎水性の基が中間生成物および反応生成物の溶解度に著 しく影響する場合が多く、それらの処理に必要な溶媒の性質および量の両者に、 また精製および脱保護の容易さに問題を生じる。脱保護にも別個の工程を要し、 ついで精製工程が必要になる。

この目的では一連の反応が利用できるが、接触水素化の場合を除いて、それ自身 がまた工業的な問題を生じる。

これらの方法は、激烈な、多くの場合強酸性または塩基性条件下に行われ、一連 の副反応を生じ、不純な生成物を生成し、また繁雑な精製が必要になることが多 い。

この比較的長い一連の合成工程の最終工程は所望のペプチドを得るためのかなり 複雑な脱保護であり、はとんど不可避な二次反応によって、所望の高純度を有す る生成物を提供するためにはかなりの労力を要する精製操作をしばしば必要とす る。

最近とくに興味をひいているジペプチドには、甘味剤として広く使用されアスパ ルテームとも呼ばれるＬ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅメチルエステルおよびその誘導体 がある。アスパルテームの化学的合成にも上述の欠点がある。

アスパルテームおよびその誘導体の製造に際してのアミノ末端の保護を回避する 試みから、ＥＰ−ＡＩ−０７４０９５、ＥＰ−Ａ２−１０２５２９およびＥＰ− Ａ２−１５４４７２に記載されている発酵法のような、微生物発酵によるアプロ ーチが生まれている。この方法は、合成的アプローチとは基本的に異なり、アス パルテームに特異的な生物体によるものである。したがって、一般的に他のジペ プチドに関連して適用できるものではない。

さらに、収率は低く、発酵培地からの回収には労力を要する。

アスパルテームの既知の製造方法における上述の短所はＥＰ−Ａ２−２６９３９ ０に述べられている。この出願には、溶媒中でＬ−アスパラギン酸α−エステル またはＬ−アスパラギン酸α−アミドをＬ−フェニルアラニンアルキルエステル と、酵素、その酵素を含有する微生物、微生物の酵素含有分画、または固体支持 体上に固定化された酵素の存在下に反応させるＬ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−アルキ ルエステルが請求されている。この酵素は、Ｌ−アスパリン酸α−エステルまた はＬ−アスパラギン酸α−アミドとＬ−フェニルアラニンアルキルエステルの縮 合によりＬ−アスパルチル−し−フェニルアラニンアルキルエステルを生成でき るものである。

Ａｓｐに対して特異的なエステラーゼまたはアミダーゼ活性を有するがＰｈｅに 対しては活性を示さない酵素を使用しなければならないことが認められる。挙げ られている唯一の酵素は５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　Ｖ　８ のエステル分解活性をもつ細胞外プロテアーゼである。

したがって、Ｎ−保護もしくはβ−エステルまたはアミドとともに、Ｎ−α−非 保護Ａｓｐ−エステルまたはアミドの適用可能なことが示唆されてはいるが、特 定のペプチドの製造に使用される１種の特異的酵素の開示は、かなり独特な反応 条件、すなわち５倍過剰の基質成分が用いられた１つの実施例によって支持され ているのみで、この言及は、アミダーゼまたはエステラーゼ酵素によって触媒さ れるジペプチド合成におけるＮ−非保護基質成分の適用可能性の一般的教示を提 供するものとは到底いうことができない。

すなわち、アミノおよびカルボキシ末端両者の保護基の回避を可能にすることは 、全過程の経済性という意味で明らかに有利である。側鎖に保護基をもつが末端 には保護基をもたないジペプチドを製造できることに興味がもたれる場合もあり 、それは、側鎖は保護されているがアミノ基は保護されていない出発原料に出発 する本発明の方法において示される。この場合、緩和な反応条件と全過程の経済 性の同じ利点が得られる。所望により、側鎖保護基は、一般的に、アミノ保護基 の場合よりも緩和な条件下に、化学的または酵素的手段で除去できる。

側鎖が保護されていなくてもよいアミノ酸誘導体とＣ−末端が保護されていなく てもよいＢ−成分（求核試薬）の使用が可能な酵素触媒カップリング反応も知ら れている。たとえば、ＤＫ特許明細書第１５５６１３号ならびに相当するＥＰ特 許明細書第１７４８５号（ＥＰ−Ｂｌ−１７４８５）に記載されている。この記 載は参考として本明細書に導入する。

略述すれば、ＥＰ−Ｂ！−１７４８５には、一般にアミノ酸エステルおよびアミ ノ酸アミドから選ばれる基質成分を、一般にＬ−アミノ酸アミド、Ｌ−アミノ酸 またはＬ−アミノ酸エステルから選ばれるアミン成分（求核試薬）と、Ｌ−特異 的セリンまたはチオールカルボキシペプチダーゼ酵素の存在下に反応させること によりペプチドを製造する方法が記載されている。

ＥＰ−Ｂｌ−１７４８５の方法によってジペプチドを製造しようとする場合には 、基質成分はＮ−末端保護アミノ酸誘導体であることが必須であり、構成成分ア ミノ酸はＬ−アミノ酸であることか必須である。

ＥＰ−ＡＩ−２７８７８７（参考として導入）および１９８７年２月１３日出願 のＤＫ出願７２５　／　８７から優先権を主張されている他の出願に記載されて いるように、ＥＰ−Ｂｌ−１７４８５に用いられるセリンおよびチオールカルポ ギシペブチダーゼはジペ′ブチドおよびジペプチド誘導体の合成のための制御さ れた反応において、驚くべきことに、基質成分としてＮ−非保護アミノ酸二のオ リゴマー化を抑制できたことが見出された。

ある種のエンドプロテアーゼがＬ−コンフィギユレーションのある種のＮ−非保 護アミノ酸エステルのオリゴマー化を触媒できることは以前から知られていた通 りで−ではないジペプチドの製造に使用する試みはごれまでにはなか、った。一 般に、このようなオリゴマー化の結果は一連のオリゴマー、場合によっては長い オリゴマーの混合物であった。オリゴマーの程度および混合物の複雑さは形成さ れる生成物の溶解度に依存する。また、与えられた酵素が特定のＮ−α−非保護 アミノ酸誘導体を加水分解できれば、それが直ちに同じ誘導体が関与するカップ リング反応を常に触媒できるというものではないことも留意すべきである（Ａｎ ｄｅｒｓｏｎ、　Ａ、　Ｊ、　二　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ。

５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ″　、Ｐｒｏｅ、ｏｆ　ｔｈｅ 　ｎ１ｎｔｈ　ａｎｎ。

ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙ＋ｙ＋ｐｏｓｉ＋＋ｍ、Ｄｅｂｅｒ、Ｃ，Ｍ、ら編、Ｐｉ ｅｒｃｅ、１９８５年、３５５頁によって引用された文献参照）。

この理由から、ペプチド合成に対するセリンおよびチオールエンドプロテアーゼ の使用は、たとえばハバイン、ステムブロメレン、フィシン、キモパパインおよ びキモトリプシンが挙げられているＵＳ−Ａ−４，０８６，１３６に例示されて いるように、アミノおよびカルボキシ末端保護出発原料に限られていた。

さらに、これらの酵素に対しては、Ｙ、　Ｗ、　ＡＨｔｉｎら（ｆｎｔ、Ｊ、Ｐ ｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、２３　：　５２８〜５３４．１９８ ４）も述べているように、これまで一般的に、遊離アミノ酸はアミノ成分として 不適当と考えられてきた。

上述のアミノおよびカルボキシ末端保護出発原料はまた、ＵＳ−Ａ−３，９７２ ，７７３に例示されているようにアスパラギン酸エンドプロテアーゼたとえばペ プシンを使用する場合、ＥＰ−ＡＩ−００９５８５にＺ−Ａｓｐ−ＰｈｅＯＭｅ 、Ｐｈｅ　ＯＭｅ−塩の合成によって例示されているようにメタロエンドプロテ アーゼを使用する場合にも必須である。

アミノおよびカルボキシ末端保護出発原料の使用は、非プロテアーゼたとえばア ミダーゼ活性をもつエステラーゼについても必須と考えられていた。Ｂｌａｉｒ 　Ｗｅｓｔら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２８　（１５）　： 　ｌ　６２９〜３２゜１９８７）による、水性緩衝液を含んでいてもよい有機媒 体中でのブタ膵リパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａリパーゼお よびブタ肝エステラーゼの使用例かある。

一方、セルラーゼは、にｉｔａｚｕｍｅ、　Ｔ、ら（Ｊ、　ｐｌｏｕｒｉｎｅＣ ｈｅｍ、３６　：　２２５〜２３６．１９８７）によって記載されているように 、これまで、完全に遊離のβ−アミノ酸の重合縮合型反応に合成的に使用された ことがあるにすぎない。

アミノ非保護基質成分からのＤＬ、ＬＤおよびＤＤ−コンフィギユレーションの ジアステレオ−マージペプチドならびにβ−アミノ酸残基を含むペプチド゛の合 成は、これまで、ＥＰ−ＡＩ−２７８７８７１Ｓ！ｉ連の記載を除くカルボキシ ペプチダーゼまたは一般に蛋白分解酵素（ＥＣ３，４群）では不可能であった。

ＥＰ−ＡＩ−０８６０５３に示されているように、別の群の酵素、アミノアシル −ｔ−ＲＮＡシンテターゼ（ＥＣ６，１群）用いる試みも行われてきたが、この 場合には各種類のアミノ酸残基について特異的な酵素を使用せねばならず、しか もＡＴＰのような高価な補因子を必要とする。同時に、収率もきわめて低く、あ る程度の生成物は単離、同定されるものの、通常１０倍過剰の補因子および１０ ０倍過剰の核試薬、また重量で！０００倍過剰までの酵素を必要とした。

ｃａｅｒｔｎｅｒらの最近の研究（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ。

ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＧｅｎｅｔｉｅｓ、３　：　１３０〜１３７．　１９８ ８）では、酵素的ペプチド合成における基質成分としてＮ−α−非保護アミノ酸 を使用することに対する偏見を間接的に確認している。初期に遭遇した大きな問 題は新たに合成された生成物の二次的加水分解であることから、有機溶媒の使用 により反応媒体中の水の活性を低下させる試みが行われた。Ｇａｅｒｔｎｅｒら は、有機媒体中への溶解度を上昇させるために化学的に修飾されたキモトリプシ ンを用いてジペプチド合成法を報告しているのである。

多数の基質としてのＮ−α−保護アミノ酸エステルと核試薬としてのアミノ酸ア ミドを用い、ベンゼン媒体中で、Ｎ−α−保護ジペプチドが好収率で得られた。

すなわち、ａ−Ｂｚ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２は、α−Ｂｚ−Ｌｙｓ−ＯＭｅを Ｐ　ｈ　ｅ　−Ｎ　Ｈ＊と反応させることにより、９８％以上の収率で得られた 。しかしながらε−Ｚ−ＬｙｓＯＥｔ、すなわち側鎖は保護されているがＮ−α −非保護リジンエステルを用いた場合には、ε−Ｚ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ！は 生成しなかった。この結果についてＧａｅｒｔｎｅｒらは意見を述べていないが 、基質成分のアミノ基保護が必須と考えていることは明白である。

ＥＰ−ＡＩ−２７８７８７の発明をさらに発展させた本発明は、ジペプチドおよ びジペプチド誘導体の合成のための制御された反応における基質成分のＮ−α− 非保護アミノ酸エステルおよびアミドの利用可能性がセリンまたはチオールカル ボキシペプチダーゼに限られるものではなく、一般にアミダーゼまたはエステラ ーゼ、とくにセリンエンドプロテアーゼ、チオールエンドプロテアーゼ、リパー ゼおよびエステラーゼによっても可能であるという驚くべき所見に基づくもので ある。

さらに、驚くべきことに、これらの反応における基質としてはＤ−コンフィギユ レーションのＮ−α−非保護アミノ酸誘導体も使用でき、したがってＬＬ−ジペ プチドのほかにＤＬ−ジペプチドも合成できることが見出された。しかしながら 、Ｄ−基質についての反応速度は一般に、均一条件下では、Ｌ−基質についての 反応速度よりも若干低いが、Ｄ−基質がＬ−基質についての速度よりはるかに低 い速度で反応する相当するＮ−保護アミノ酸エステルの場合（Ｐｕｒｄｉｅら： 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ。

２６８：５２３，１９７２）よりも速度差ははるかに小さい。しかしまた、この 点に関しては酵素間には大きな個体差がある。合成収率は非保護し一基質の場合 と同様に非保護り一基質でも高いことが多い。

ある種のエンドプロテアーゼが、Ｎ−保護基質成分との反応においてＤ−コンフ ィギユレーションを育する核試薬成分を利用できることは知られている。すなわ ち、本発明の方法によれば、実際の配列に応じて、ＬＬ−１ＤＬ−１ＬＤ−また はＤＤ−コンフィギユレーションを有するジペプチドを合成することが可能であ る。

すなわち、本発明の方法は、式 （式中、Ａは先に定義した通りで、Ｒ１は不活性置換基で置換されていてもよい アルキル、アリールもしくはアラール基、またはアミノ酸のα−ｄｅｓ−アミノ フラグメントであり、Ｒ２およびＲ１は互いに同種または異種であってそれぞれ 水素または不活性置換基で置換されていてもよいアルキル、アリールもしくはア ラールキル基である）を有するアミノ酸誘導体である基質成分を、（ａ）式 ％式％ （式中、Ｂは先に定義したようにアミノカルボン酸残基である）を有するアミノ 酸、（ｂ）式 （式中、Ｂは先に定義したようにアミノカルボン酸残基であり、Ｒ２およびＲ３ は上述の意味を存するが、Ｒ１が水素である場合にはＲ３はヒドロキシまたはア ミノであってもよい）を有するアミノ酸アミド、（Ｃ）式％式％ （式中、Ｂは先に定義したようにアミノカルボン酸残基であり、Ｒ４はアルキル 、アリールまたはアラールキルである）を有するアミノ酸エステル、（ｄ）式％ 式％ （式中、Ｒ″、Ｒ１およびＲ７はそれぞれ独立に水素、アルキルまたはアラール キルを表し、又は１〜６、Ｚは２〜１２である）を有する酸基が保護されていて もよい直鎖状または分岐状アミノホスホン酸またはアミノスルホン酸、（ｅ）式 ％式％ （式中、Ｂ１は先に定義した通りであり、Ｙｌは０またはその官能性誘導体、好 ましくはケタールであり、Ｒ８はＨ１アルキル、アリールまたはアラールキルで ある）を有するアミノ酸アルデヒドもしくはケトンまたはその誘導体、およびＣ ｆ’）式 ％式％ （式中、Ｂ１およびＹｌは上述の意味を有する）を有するアミノアルコールから 選ばれる核試薬成分と、セリンまたはチオールカルボキンペプチダーゼとは異な るアミダーゼまたはエステラーゼの溶液または分散液としての存在下に反応させ 、ついで所望により存在する側鎖保護基もしくは保護基Ｙを切断し、および／ま たは、得られたジペプチド誘導体を所望により塩または水和物に変換することを 特徴とする。

有用なアミノ酸の例には、脂肪族アミノ酸、たとえばグリシン（Ｇ　１　ｙ）　 、アラニン（Ａ　１　ａ）　、バリン（Ｖａ　１）　、ノルバリン（Ｎｖａ　１ ）　、ロイシン（ｌｅｕ）、イソロイシン（ｉｓｏ−Ｌｅｕ）およびノルロイシ ン（Ｎｌｅｕ）のようなモノアミノモノカルボン酸、セリン（Ｓｅｔ）、スレオ ニン（Ｔｈｒ）およびホモセリン（ｈｏｍｏ−３ｅｔ）のようなヒドロキシアミ ノ酸、メチオニン（Ｍｅｔ）またはシスチン（ＣｙｓＳ）およびシスティン（Ｃ ｙＳＨ）のような含硫アミノ酸、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇ 　１　ｕ）ならびにそれらのアミドたとえばアスパラギン（Ａｓｎ）およびグル タミン（Ｇ　Ｉ　ｎ）のようなモノアミノジカルボン酸、オルニチン（Ｏｒｎ） 、リジン（Ｌｙｓ）およびアルギニン（Ａｒｇ）のようなジアミノモノカルボン 酸、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびチロシン（Ｔｙｒ）のような芳香族アミ ノ酸、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、プロリン（Ｐ　ｒ　ｏ）およびトリプトファン（ Ｔｒｐ）のような異項環アミノ酸が包含される。もっと異例の構造をもつ有用な アミノ化合物の例としては、。

ペニシラミン（Ｐｅｎ、）、アラニンホスホン酸（Ａ　Ｌ　ａ　Ｐ＞のようンー アミノホスホン酸、タウリン（Ｔａｕ）のような了ミノスルホン酸、β−アラニ ン（ＢＡ　１　ａ）のようなω−アミノ酸、α−メチルアラニン（Ａ　ｉ　ｂ） のようなイソアミノ酸、不活性置換基たとえばハロゲンもしくはニトロで置換さ れたアミノ酸、またはたとえばアラニンから誘導されるアルデヒド、ケトン、ケ タールもしくはアルツー／しを挙げることができる。

すでに述べたように１、：れらは基質成分中にＤ−型として包含されてもよく、 また核試薬成分中にＤ−型で存与えられた定義は、「請求項１」に記載された様 々な核試薬成分に反映している。すなわち、（ｂ）および（ｅ）両者はＣ−末端 保護基を含存し、一方、Ｙ＝Ｈはアミノ酸アルデヒドに、Ｙ；アルキル、アリー ルまたはアラールキルはアミノケトンに相当する。所望により、アミ、ノケトン の誘導体たとえばケタール、オキシムまたはサルファイドを核試薬として用いる こともできる。

ＥＰ−Ａ　ｌ−２７８７８７の方法の場合のように、上述の公知方法に対する本 発明の方法の利点は、側鎖の保護が最小限または不要なこと、Ｄ−およびＬ−コ ンフィギユレーションのいずれでもよい基質成分のＮ−保護が不要なこと、ラセ ミ化の危険がないこと、合成工程が少なくてよいこと、および期待される比較的 純粋な最終生成物が得らイ］ることであり、これらの組合せにより著しく簡単か ・つ経済的な製造方法が提供される。

好ましい基質成分は、Ｒ１が１〜８個の炭素原子を存する直鎖状または分岐状の アルキルであるエステル、たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、 ブチル、イソブチル、三級ブチル、アミル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチル 、またはアラールキル基９６ベンジルである。とくに適当な核試薬成分は、Ｒ２ がＨでＲ８がＨもしくは０１〜Ｃ６アルギルであるアミノ酸アミド、またはＲ４ が上述し７たような炭素原子１〜６個を存する直鎖状もしくは分岐状のアルキル であるアミノ酸エステルである。上述のように、Ｒ１は不活性な置換基たとえば ヒドロキシまたは二ｌ・口で置換されていてもよいアルキル、アリールまたはア ラールキル基であってもよい。

本発明はまた、基 を含有するペプチドを中間体を形成し、ついでこの基を切断してカルボン酸基を 形成させる方法をも包含する。

二の切断は、他の酵素、または反応条件は違っ°Ｃもペプチドの生成に使用した のと同じ酵素によって触媒させることができる。基ＹのＣ−末端の修飾も可能で ある。

酵素はまた、側鎖保護基の切断にも使用できる。適用可能な酵素はその保護基の 性質に応じて、蛋白分解酵素、リパーゼおよびエステラーゼである（”Ｔｈｅ　 Ｐｅｐｔｉｄｅｓ。

Ａｎａｌｙｓｉｓ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ”　、第９巻、　 ＳｐｅｃｉａｌＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　 Ｐａｒｔ　Ｃ，Ｊ、　Ａ、　Ｇｌａｓｓ。

Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ 　Ｇｒｏｕｐｓ　１ｎＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８７参照）。

エステラーゼおよび、／またはアミダーゼ活性をもち、したがって本発明の方法 における触媒としての活性が期待できる酵素の例としては、以下の表に掲げた酵 素がある。

これらの酵素の詳細については、とくに、Ｐｅｒｌｍａｎｎ。

Ｇ、　Ｅ、ら：　Ｃｏｌｏｗｉｃｋ、　Ｓ、　Ｐ、　＆　Ｋａｐｌａｎ、　Ｎ、 　Ｏ，編、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍ、８　（１９６６）　、上９（１ ９７０）。

２８　（１９７２）、３５　（１９７５）および４５（１９７６）　、　Ｆｒｕ ｔｏｎ、　Ｓ、　：　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５３　：　２３９頁。

Ｗｉｌｅｙ　（＋　９８２　）　、　Ａｂａｓｓｉ、　Ａ、ら：　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ。

ｔ（ｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ、　３６７　：　４４１〜４５頁（１９８６）。

Ｄｉｘｏｎ、　Ｍ、　＆　Ｗｅｂｂ、　Ｅ、　Ｃ，：　”Ｅｎｚｙｍｅｓ　”　 、第３版。

Ｌｏｎｇｍａｎ　Ｇｒｏｕｐ　（１９７９）　、　Ｔｏｒｒｅｙ、　Ｓ、纒：　 “ＥｎｚｙｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ″、 　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｒｅｖ、２　：Ｎｏｙｅｓ　Ｄａｔａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ　（１９８３）　、さらにり、ａａｎｅ。

Ｃ，、Ｔｒａｍｐｅｒ、Ｓ、、Ｌｉ１ｌｙ、Ｍ、Ｄ、編：　”Ｂｉｏｅａｔａｌ ｙｓｉｓｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄｉａ”　、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　（１９ ８７）　、　Ａｓａｎｏ、　Ｙ。

２５〜２３６頁（１９８７）の記載が参考になる。これらの記載はすべて参考と して本明細書に導入する。

酵素（略号）　通常の起源 フィシン（Ｆ）　イチジク（Ｆｉｃｕｓ）クロストリパイン　Ｃｌｏｓｔｒｉｄ ｉｕｍ（ＣＬ　）　ｈｊｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍエラスターゼ（Ｅ）　膵臓 ズブチリシン（Ｓ）　Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ または５ｕｂｔｉｌｉｓ テルミターゼ（ＴＶ）　Ｔｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｖｕｌｇａｒｉｓ プロテナーゼＫ　Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ（Ｋ　）　ａｌｂｕｍ パリループロチ　Ｃａｎｄｉｄａ ナーゼ（Ｖ　Ｐ　）　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓポストプロリン　Ｆ１ａＶＯｂａＣ ｔｅｒｉｕｍ特異的 エンドペブチダ　ｍｅｎｌｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ−ゼ（ＰＰＳＥ） Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｌｙｔｉｃｕｓブロ テ　１ｙｔｉｃｕｓアーゼＩ（ＡＬ−Ｉ） エンドブロテナ　Ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｉｓ−ゼＡｒｇＣ（ＡＣ）　ｇｌａｎ ｄｓ エンドブロテナ　Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ−ゼＬｙｓＣ（ＬＣ）　ｅｎｚｙｍｏｇ ｅｎｅｓトロンビン（ＴＢ）　血漿 Ｃ）エキソペブ　アミノペブチダ　動物、野菜また（まとくにＡｃｈｒｏｍｏ− ｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、起源 １−ｚ五二止膨魚臣正亘工ゑ亘且互上ユニ０１アリールヒドロラーゼ （ＥＣ，３，１，１，２）　血漿 トリアジルグリセロリパーゼ　動物、野菜（ＥＣ，３，１，１，３）とくに　ま たは微生物ブタ膵臓またはＣａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａまたはＬｉ ｐｏｌａｓｅ”　（ＮＯＶＯ）；（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ、） 酢酸エステルアセチルエステラーゼ （ＥＣ，３，１，１，６）　動物組織 アリールグリセロールリパーゼ （ＥＣ，３，１，１，２３）　動物または野菜■、グリコシダーゼ セルラーゼ（ＥＣ，３，２，１，４）動物、野菜またはとくにＴｒｉｃｈｏｄｅ ｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅまたは　微生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ起源 現時点で好ましい酵素はトリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、エラスタ ーゼ、パパイン、キモパパイン、クロストリパイン、ブタ膵臓リパーゼおよびＣ ａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａリパーゼである。

使用される酵素は、化学的に修飾されてもよく、また天然型の生合成的変異体で あってもよい。

以下にさらに詳細に説明するように、本発明の方法はかなり単純である。

反応は水性反応媒体中、所望により、水混和性で特定の条件下に酵素と適合性を 存する極性有機溶媒９０％まで好ましくは６０％までを含有してもよい媒体中で 行われる。好ましい溶媒は、低級アルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチル スルホキシド、ジメトキシエタンおよびエチレングリコールである。

反応混合物中のｐＨはかなり一定の値に維持することが重要である。このｐＨ値 は３〜１１、好ましくは５〜１０゜５、さらに好ましくは６〜１０、最も好まし くは７〜９゜５であり、また具体的な出発原料、生成するペプチドおよび酵素に 依存する。

反応は別法として、水非混和性有機溶媒、たとえばベンゼン、トルエン、ヘキサ ン、ヘプタン、オクタン、ジアルキルエーテル、酢酸エチル、プロピオン酸エチ ルおよびメチレンクロリド等からなる非水、非極性媒体中でも実施できる。これ らの溶媒はエステラーゼおよび／またはアミダーゼ活性を存する酵素とくにリパ ーゼと適合性を有する。

これらの本質的に非極性の反応媒体には、至適な酵素の働きまたは反応安定性を 促進するために、１０％までの水を溶解型で含有させることができる。

反応温度は室温およびそれ以上、２０〜５０°Ｃが好ましいが、０〜８０°Ｃの 範囲の温度もその条件下に他の利点があれば使用できる。高溶媒条件では、氷点 下または８０°Ｃ以上の温度も使用できる。

２種類の反応成分の濃度は広範囲に変動させることができるが請求核試薬成分が しばしば過剰に用いられ、また基質成分のオリゴマー化を回避するために上記成 分は全反応連鎖時にわたり間隔をおいて少量ずつ添加されることが多い。酵素に 対して良好な核試薬を大過剰に使用すれば、驚くべきことにすりゴマ−化は全く 認められず、高基質濃度を副反応を生じることなく使用できる。

Ａ＝Ｂのホモジペプチドを所望の場合には、基質および核試薬成分に別のカルボ キシ保護基を用いることによって単一の核試薬のオリゴマー化を回避できる。

したがって、基質成分の開始濃度は通常０．００５〜２モルであり請求核試薬成 分については、別個に添加される場合、０．００５〜３モルである。大抵の場合 、過剰の核試薬成分および基質成分からの加水分解生成物は回収可能で、所望に より再エステル化および再使用ができる。同成分の再循環は、それらの構造が簡 単で、また副反応および脱保護による損失がないので、とくに容易である。

酵素濃度も同様に変動させることができるが、Ｎ−保護アミノ酸基質を用いる場 合に適当な濃度よりも若干高く（５〜５０μｍ、またはさらに高濃度、約５００ μｍまで）することが多い。しかし、合成の目的での所要量は、安定な固定化酵 素プレバレージョンを用い、したがって連続過程で酵素を使用できる場合には、 １０倍以上減少させることができる。

反応媒体には、酵素の基質への結合に影響しまた酵素を安定化する塩たとえばＮ ａＣｌ！およびＣａＣｌ！＊　、ならびに存在する金属イオンに対する錯体結合 剤を含有させることもでき、また、たとえばチオールエンドペプチダーゼにはメ ルカプト安定化剤たとえばＤＴＴ、ＢＭＥまたはシスティンを使用できる。

、二の驚くべき加水分解連鎖の結果は、様々な酵素を用（・１だ本発明の方法に よる様々なジペプチドの製造を例示する以下の実施例トニ示）゛通りＣある。

例１・〜１３および２０以下の一般的方法反応は、反応容量１−の分析的規模に より、ｐＨスタッ１〜中で実施し、個々の例に一ついて条件を指示した仔機溶媒 の高含量または固体化酵素の使用例を除き、選択された１）ｌ（値はＩＮ　Ｎａ ＯＨの自動添加によって一定に保持さ第１た。反応温度はとくに指示のない限り 室温である。

表には、反応濃度、４１機溶媒含量、生成物および収率も包含する。反応時間は 通常０５〜５時間、どくに指示のない限り、酵素濃度は通常５〜２０μｎ’ｌで ある。

生成物の確認および生成物の収率の決定は（１：＋ＩＮＱＶＡＩ）ＡＫカラム（ Ｗａｔｅｒｓ、　ＲＣ％ｌ　）　、Ｌ、５０ｍＭ）リエヂルアニノモニウムリン 酸、ｐｌ（３，０，０％−８０％アセト＝トリル含有の速当な勾配溶出系を用い 、流速２ｒｒＪ！／分の逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ　６０００Ａポンプ、６６ ０勾配ブ［／ンダー、ＵＫ６インジｙ、フタ−）によって実施し５た。溶出は２ ３０ｎｍ、２５４％ｍ、　２７８％ｍまたは２９０ｎｍてＵＫ検出器（Ｗａｔｅ ｒｓ４８０　）　ｉ：よってモニタリングした。

生成物は、ＨＰＬＣ分析からの推定される生成物ピークに相当する分画のアミノ 酸分析および／または化学的に合成した標品どのＨＰ　Ｌ　Ｃ比較（こよって同 定した。これらの標品は既知の原理に従い、油筒は、Ｂ　ＯＣ−ｐ、　−０Ｓｕ 、基質アミノ酸の三級ブ升ルオギシ力ルポニルースクシニックイミドエステル誘 導体と使用される核試薬成分どの間の反応を用い、ついＣ末端アミノ酸残基の脱 保護によって製造された。いずれの場合ｔ２、ジアステレオ−マーＤ　Ｌ−およ びＬＤ−ジベブチドノＪ、Ｅ放物からＬ５Ｌ−およびＤＤ−ジペプチドを分離喋 ることか可能であった。。

２３０　ｒｌ、ｒｎでのみ検出できる生成物−）いては、生成物の収率は、化学 的に合成された標品化合物の吸収７．／濃度曲線によって決定した。他の生成物 については、収率は５゜（Ｓｇ連波長での％放物および反応原料の吸収に相当す る演出クロマトグラムのビークＦ積分面積間の比に基づいで決定された。

製造例１４〜１７の反応条件は個々の例に記哉多゛る。

反応は記載したように分析ＨＰＬＣで追跡した。、酵素濃度は、相当する分析例 の場合よりも一般ζこ低く、反応時間は長くしであるが、反応条件の至適化の試 みは行われ基質どしてＬ−アルギニンエチルエステル（５０ｍＭ）と核試薬とし てＬ−アミノ酸アミドをｐＨ８，５の水中様々な濃度で用いるり、Ｌ−ジペプチ ドのトリプシン−触媒合成 求核試薬　１窮Ｏ生成物　収率 ロイシンアミド　（０，２Ｍ）　ＡｒｇＬｅｕＮ８．　２０％ロイシンアミド　 （０，７Ｍ）　ＡｒｇＬｅｕＮＨ＊　３２％メチすニンアミド　（０，２５Ｍ） 　ＡｒｇＭｅｔＮＴ４ｓ　３１％メチオニンアミド　（０，５Ｍ）　ΔｒｇＭｅ ｔＮＨｔ　５２！１１ｉメ升才ニンアミド　（１，０Ｍ）　ＡｒｇＭｅｔＮＨ， ９０％セリンアミド　（０，ｓｈｏ　ＡｒｇＳｅｒＮＨ＊　４５％ヂロシンアミ Ｆ　（（１，５Ｍ）　ＡｒｇＴｙｒＮＨｙ　４６％ａ）　ＩＯｌｚＭ 例２ 基質としてＬ−またはＤ−アルギニンエチルエステル（５０ｍＭ）ど請求核試薬 として１．−またはＤ−ロイシンおよびメチオニンアミドを用いるｐＨ８，５の 水中でのり。

Ｄ−−およびり、Ｉ、−ジペプチドアミドジアステレオ−マーのトリプシン“ゝ 触媒合成 基ｖｔ　請求核試薬　（濃［生成物　収率Ｄ−ａｒｇＯＥｔ　Ｌ−ａイシ〉アミ ド　（０，２Ｍ）　ａｒｇＬｅｕＮＨ，２０％Ｄ−ａｒｇＯＥｔ　Ｌ−ｏイソン アミド　（１，０Ｍ）　ａｒｇＬｅｕＮＨ＊　３０％Ｄ−ａｒｇＯＥｔＬ−メチ オニンアミド　（０，５Ｍ）　ａｒｇＭｅｔＮＨ＊　６８％Ｌ−ＡｒｇＯＥｔ　 Ｄ−メチオニンアミド　０．ＯＮθ　ΔｒＨｍｅｔＮｆ（驚　５％ａ）　ＩＯｕ Ｍ 例３ 求核試薬としてＬ−アミノ酸アミド（０，５Ｍ）および基質としてＬ−リジンま たはヒスチジンエヂルエズデル（５０ｍＭ）を用いるｐＨ８，５の水中での１１ ．Ｌ−ジペプチドのトリプシン１触媒合成 基質　請求核試薬　生成物　収率 ＬｙｓＯＥｔ　メチオニンアミド　ＬｙｓＭｅｔＮＨｖ　８１％ＬｙｓＯＥｔ　 ｈリブトファンｒミド　ＬｙｓＴｒｐＮＨ，３２％ＬｙｓＯＥｔ　アラニンアミ ド　ＬｙｓΔ１ａＮＨｆ　５％ＨｉｓＯＥｔ　メチオニンアミド　ＨｉｓＭｅｔ ＮＨ＊　６２％ａ）　＊ＯｔｔＭ 例４ 基質としてＬ−チロシンエチルエスデノｌ、（５０ｄ）および核試薬とｌｌ、で Ｌ−アミノ酸アミドを用いる水中でのり、Ｌ−ジペプチドアミドのα−ギをトリ プシン１触媒合成 求核試薬　（４リ　団　生成物　収率 ロイシンアミド　（０，２Ｎυ　９．ＯＴｙｒｌ、ｅｕＮＨｆｉ　６８％アルギ ニンアミド　（０，４Ｍ）　８．５　ＴｙｒＡｒｇＮＨ＊　９０％セリンアミド 　（０，４Ｍ）　８．５　ＴｙｒＳｅｒＮＨｔ　７５％ａ）　５μＭ 例５ 基質としてＬ−チロシンエチルエステル（５または５０　ｍＭ）と核試薬として Ｄ−アミノ酸アミドを用いる水中でのり、　Ｄ−ジペプチドのα−キモトリプシ ン１触媒合成 求核試薬　（測り　州　生成物　収率 り一ロイシンアミド　（０，２Ｍ）　９．ＯＴｙｒ１ｅｕＮＨ禦　１７％ＩＤ− イソロイシンアミド　（０，３Ｍ）　９．ＯＴｙｒｉｌｅＮＨ禦　２３％１１Ｄ −セリンアミド　（０，４Ｍ）　８．５　ＴｙｒｓｅｒＮＨ茸　３５％ｍ）　５ ＭＭ ｂ）　５ｄｌ基質 例６ 基質としてＤ−チロシンエチルエステル（５０ｍＭ）と核試薬としてＬ−ロイシ ンアミドを用いる水中ｐｔｔ９．０でのり、Ｌ−ジペプチドのα−キモトリプシ ン触媒合成 求核試薬　（Ｎｏ　生成物　収率Ｏ Ｌ−ロイシンアミド　（ｏ、２Ｍ）　Ｄ、ｌ、−ｔｙｒＬｅｕＮＨ＝　４０％Ｉ Ｌ−ロイシンアミド　（０，３Ｍ）　Ｄ、Ｌ−ｔｙｒＬｅｕＮＨ，６８％１ａ） ５０μＭ酵素 ｂ）１００μＭ酵素 Ｃ）長い反応時間−Ｆｆ単位 例７ 様々なＬ−アミノ酸エステル（５０ＩｎＭ）を基質として、Ｌ−またはＤ−アミ ノ酸エステル（０，８Ｍ）またはアミドを核試薬として用いるｐＨ８，５でのり 、Ｌ−およびり、Ｄ−ジペプチドアミドおよびエステルのα−キモトリプシン畠 ）触媒合成 基質　請求核試薬　溶媒　生成物　収率−〉Ｌ−ＰｈｅＯＥｔ　Ｌ　ＡｒｇＮＨ ｘ”　水　ＰｈｅＡｒｇＮＨｔ　８２％Ｌ−ＴｙｒＯＥｔ　Ｌ−５ｅｒＯＥｔ　 水　ＴｙｒＳｅｒＯＥｔ　４８９６”Ｌ−ＴｙｒＯＢｚｌ　Ｌ−３ｅｒＯＥｔ　 ３０％ＤＭＦ　ＴｙｒＳｅｒＯＥｔ　４０％ｅｌＬ−ＴｙｒＯＢｚｌ　Ｌ−５ｅ ｒＯＭｅ　３０％ＤＭＦ　ＴｙｒＳｅｒＯＭｅ　３９９６”Ｌ−ＴｙｒＯＢｚｌ 　Ｄ−３ｅｒＯＭｅ　３０％ＤＭＦ　Ｔｙｒｓｅ、ｒＯＭｅ　２１％０ａ）５　 μＭ ｂ）　０．請求核試薬 Ｃ）９０％変換において ｄ）生成物の化学的不安定性により、これらの条件下１５〜３５％量の加水分解 ／ジケトピペラジン生成が認められたが、これは記録された収率には含まれてい ない。

例８ Ｌ−アスパルチルジエステル（０，１Ｍ）を基質として、Ｄ−アラニンアミドを 核試薬として用いるｐＨ８，５での側鎖保護し一アスパルチルーＤ−アラニルア ミドのズブチリシンＡ”触媒合成 求核試薬 基質　ＵＭＤ　溶媒　生成物　収率 Ｌ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）ｇ　（１，０Ｍ）　水　Ａｓｐ（ＯＥｔ）ａｌａＮＨｍ　 ９％Ｌ　ＡＳｐ（ＯＥｔ）＊　（２，ＯＭ）　水　Ａｓｐ（ＯＥｔ）ａｌａＦ＆ 　２４％１、−ＡＳＰωＢｚｌ）＊”　（０，５Ｍ）　３０％ｌ［ｌ　Ａｓｐ（ ＯＢｚｌ）ａ層札８％Ｌ　−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）＊”　（ｔ、ＯＭ）　３０９６ ｒＭＪＡＳＰ（ＯＢＺＩ）ａｌａｌｌｌｍ　２０％ｍ）　５ＭＭ ｂ）　５〇−基質、２０μＭ酵素 例９ 基質としてアミノ酸ベンジルエステル（５０ｍｌ）および核試薬としてアミノ酸 アミド（０，５Ｍ）を用いるｐＨ８，５における水中でのり、Ｌ−アミドのエラ スターゼ０触媒合成 基質　請求核試薬　生成物　収率 Ｌ−ＶａｌＯＢｚｌ　Ｌ−アルギニンアミド　ＶａｌＡｒｇＮＨ，５９＄ａ１４ ０μＭ 例１０ 基質としてアミノ酸エステル（５０ｍＭ）および核試薬としてＬ−アミノ酸アミ ド（０，８Ｍ）を用いるｐＨ８，５における水中での、パパイヤチオールエンド プロテアーゼ６）触媒り、Ｌ−ジペプチドアミドの合成酵素　基質　請求核試薬 　生成物　収率ノ０（イン　ＬｙｓＯＥｔ　ＡｌａＮＨｔ　ＬｙｓＡＩａＮＨｘ 　６０％パパイン　ＬｙｓＯＭｅ　ＡｌａＮＨｔ　ＬｙｓＡＩａＮＨｘ　５５％ キモパパイン　ＬｙｓＯＥｔ　ＡｌａＮＨｔ　ＬｙｓＡＩａＮＨｘ　２３％キモ パパイン　ＬｙｓＯＭｅ　ＡｌａＮＨｔ　ＬｙｓＡＩａＮＨｘ　３４％ｉ）　１ ００８Ｍ、　２ｍＥＩＴ＾、１０−システィン例１１ 基質としてＬ−アルギニンエチルエステル（５０ｍＭ）および核試薬としてＬ− アミノ酸アミドを用いるｐＨ８，５でのクロストリパイン１′触媒り、Ｌ−ジペ プチドアミドの合成 求核試薬　Ｃ駐り　溶媒　生成物　収率Ｌ−メチオニンアミド　（（Ｌ５！ｉＤ 　水　ＡｒｇＭｅｔＮＨｔ　３８％Ｌ−フェニルアラニンアミド（０，２Ｍ）　 ３０％ＩｊＯＨＡｒｇＰｈｅＮＨ，６％Ｌ−フェニルアラニンアミド（８，６Ｍ ）３０％ＤＭＦ　ＡｒｇＰｈｅＮＨ，８５％６ａ）　５μＭ酵素、５０ｄｌ　Ｃ ａＣ１ｍ、Ｉ　（ｎＭ　ＤＴＴ、　ｐＨはＴＥＡで請贅例１２ 基質としてＬ−アミノ酸エチルエステル（５０［ＤＭ）および核試薬としてＬ− アミノ酸アミドを用いる３０％ＥｔＯＨ中ｐＨ８，５でのブタ膵臓リパーゼａ′ 触媒り、　Ｌ−ジペプチドアミドの合成 基質　請求核試薬　ｌ駄わ　生成物　収率Ｌ−ＴｒｐＯＥｔ　Ｌ−ＭｅｔＮＨｚ 　（１，５Ｍ）　ＴｒｐＭｅｔＮＨｔ　７１％Ｌ−ＴｒｐＯＥｔ　Ｌ−ＭｅｔＮ Ｈｓ　（１，０Ｍ）　ＴｒｐＭｅｔＮＨｔ　５４％Ｌ−ＴｙｒＯＥｔ　Ｌ−Ｓｅ ｒＮＨ＊　（１，５Ｍ）　ＴｙｒＳｅｒＮＨｔ　６９９６Ｌ−ＭｅｔＯＥｔ　Ｌ −ＭｅｔＮＨｓ”（１，０Ｍ＞　ＭｅｔＭｅｔＮＨｔ　３１％０ａ）５００μＭ ｂ）純粋な水中での反応 Ｃ）不完全な変換において 例１３ 基質としてＬ−アミノ酸エチルエステル（５０ｍＭ）および核試薬としてＬ−ア ミノ酸アミドを用いる３ｏ％ＥｔＯＨ中ｐＨ８，５でのＣａｎｄｉｄａ　Ｃｙｌ ｉｎｄｒａｃｅａリパーゼ０触媒り、Ｌ−ジペプチドアミドの合成基質　請求搗 試薬　Ｉしり　生成物　収率Ｌ−ＴｒｐＯＥｔ　Ｌ−ＭｅｔＮＨｔ　（１，５Ｍ ）　ＴｒｐＭｅｊＮＨｔ　ｙｓ％−）Ｌ−ＴｒｐＯＥｔ　Ｌ−５ｅｒＮＨｔ　（ １，５ｈＯＴｙｒＳｅｒＮＨｔ　５０％峠ａ）１００μＭ、長時間反応 ｂ）　５０％未満の変換での付加水分解操作 り一トリブトファンエチルエステル塩酸塩（４，０ｇ、１５ミリモル）とＬ−メ チオニンアミド塩酸塩（５５，７ｇ、３００ミリモル）を水１９５ｙｄとエタノ ール９０ｒｎｌに溶解し、ｐＨを水酸化ナトリウムで８．５に調整した。反応は ０．８ｇの粗製ブタ膵臓リパーゼを加えて開始させ、反応期間中ｐＨを８．５に 保持した。５時間後に基質の残部（４，０ｇ、１５ミリモル）を加え、反応を一 夜継続させた。ついでＨＣＩ溶液でｐＨを３に調整して反応を停止させた。

混合物を次に希釈し、エタノールを減圧下に蒸発させて除去し、混合物を濾過し た。濾液を、６０μｍＣ−１８粒子を充填した２本のカラム（５，７Ｘ３０ａｎ ）と溶出液として５　ｍＭ　ＨＣｌ　／エタノール混合物を用いたＲＰ−製造Ｈ Ｐ　Ｌ　Ｃ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｅｐ　ＬＣ／Ｓｙｓｔｅｍ　５００　Ａ）によ って精製した。

純粋な生成物を含む分画を集め、減圧下に濃縮し、最後に凍結乾燥した。

この操作でり、Ｌ−１−リブトファニルメチオニンアミド塩酸塩４．７８ｇ（１ ２，９ミリモル、４３％）が無生成物は、塩素１Ｏ８３％（Ｗ　／　Ｗ　）を含 有する塩酸塩として同定された。

アミノ酸分析では遊離のアミノ酸は存在せず、酸加水分解後次のような結果が得 られた。

Ｍｅｔ　（１，００） Ｔｒｐ　（１，００） ナトリウムＤ線を用いた５０％ＭｅＯＨ，ｃ＝０．２における比旋光度は２０° Ｃで＋４０．０’であった。

純度 ＨＰＬＣ−純度：９２．４％（Ｎｏｖａｐａｋ　４　μｍ　Ｃ−１８、Ｏ，１Ｍ リン酸アンモニウム、ｐＨ３，０／アセトニトリル、２２０　ｎｍ） カールフィッシャーによる水含量：５．３％（ｗ　／　ｗ　） トリニトロベンゼンスルホン酸との反応およびＵＶ−検出によるα−アミン基の 定量ニア５．８％（Ｗ　／　Ｗ　）ＵＶ一定量によるペプチド含量：８８．３％ （Ｗ／ｗ）（２８１ｎｍ、ＭｅＯＨ：Ｏ，ＩＮ　ＫＯＨ（１：１）中Ｔｒｐ吸収 ） Ｌ−千ロシンエチルエステル塩酸塩（２，５ｇ、１０ミリモル）とＤ−セリンア ミド塩酸塩（１７，５ｇ、１００ミリモル）を水２００ｍ１に溶解し、ｐＨを水 酸化ナトリウムで８．５に調整した。反応は５０■のα−キモトリプシンを添加 して開始させ、反応期間中ｐＨを８．５に維持した。３０分後に遊離チロシンの 沈殿が始まった。

基質の残部（５，０ｇ、２０ミリモル）を１時間内に２．５ｇずつ２部に分けて 加えた。反応液を２時間攪拌したのち、ＨＣＩ！溶液でｐＨを３に調整して反応 を停止させた。

生成したチロシンを濾過し、濾液を２０℃ｍＣ−１８粒子を充填した２本のカラ ム（５，７Ｘ３０ａｎ）と溶出液として５０℃Ｍ酢酸を用いたＲＰ−製造ＨＰＬ Ｃ＜Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｅｐ　ＬＣ／Ｓｙｓｔｅｍ　５００　Ａ）によって精製 した。

純粋な生成物を含有する分画を集め、減圧下に濃縮し、最後にＨＣＩ！水溶液を 加えて凍結乾燥した。

この操作により、Ｌ、Ｄ−チロシルセリンアミド塩酸塩２．８ｇ　（９，２ミリ モル、３１％）が無定形の粉末として得られた。

同定 この生成物は、塩素１６．０％（Ｗ／Ｗ）を含む塩酸塩として同定された。　− アミノ酸分析では、遊離のアミノ酸は存在しないことが示され、酸加水分解後に は次の結果を与えた。

Ｓｅｔ　（１，１０） Ｔｙｒ　（０，９０） ナトリウムＤ線を用い、５０％ＭｅＯＨ中Ｃ＝Ｏ３３での比旋光度は２０℃で＋ ５８．０°であった。

純度 ＨＰＬＣ−純度：９７．４％（Ｎｏｖａｐａｋ　４　μｍ　Ｃ−１８、Ｏ，１Ｍ リン酸アンモニウム、ｐＨ３，０／アセトニトリル、２２０　ｎｍ） カールフィッシャーによる水含量：１．８％（ｗ　／　ｗ　） トリニトロベンゼンスルホン酸との反応およびＵＶ−検出によるα−アミノ基の 定量二８１％（Ｗ／Ｗ）Ｄ−チロシンエチルエステル塩酸塩（３，５ｇＳ　１４ ミリモル）およびＬ−ロイシンアミド塩酸塩（１４ｇ。

８４ミリモル）をＯ，ＩＭ　ＫＣＩ！２４６−に溶解し、水酸化ナトリウムでｐ Ｈを９．０に調整した。反応はα−キモトリプシン０．７ｇを添加して開始させ 、室温で２日間攪拌した。反応期間中ｐＨは９．０に維持した。

ＨＣｊ！溶液を用いてｐＨを３に調整して反応を停止させた。

生成したチロシンを濾過し、濾液を、２０℃Ｍ　Ｃ−１８粒子を充填した２本の カラム（５，７ｘ３０ａｎ）および溶出液として５ｍＭＨＣｆを用いるＲＰ−製 造ＨＰＬ　Ｃ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｅｐ　ＬＣ／Ｓｙｓｔｅｍ　５００　Ａ）に よって精製した。

純粋な生成物を含有する分画を集めて減圧下に蒸発させて濃縮し、最後に凍結乾 燥した。

この操作により、Ｄ、Ｌ−チロシルロイシンアミド塩酸塩２．５０ｇ（７，６ミ リモル、５４％）が無定形粉末として得られた。

同定 生成物は、塩素９．８％（Ｗ　／　Ｗ　）を含有する塩酸塩として同定された。

アミノ酸分析では遊離アミノ酸の存在は認められなかったが、酸加水分解後には 以下の結果を与えた。

Ｔｙｒ　（０，９８） Ｌｅｕ（１，０３） ナトリウムＤ線を用いた水中、ｃ＝０．１での比旋光度は２０°Ｃで−１２９， ４°であっに。

純度 ＨＰＬＣ−純度：９２．９％（Ｎｏｖａｐａｋ　４　μｍ　Ｃ−１８，０，１Ｍ リン酸アンモニウム、ｐ）１３．０／アセトニトリル、２２０　ｎｍ） カールフィッシャーによる水含量・６．８％（Ｗ／Ｗ） トリニトロベンゼンスルホン酸との反応およびＵＶ−検出によるα−アミノ基の 定量ニア４．９％ＵＶ一定量：７４．９％（０，ＩＭ　ＫＯＨ中２９３ｎｍにお けるチロシンフェルレートの吸収）ＡｒｇＭｅｔＮＨｔの調製的合成 Ｌ−アルギニンエチルエテルニ塩酸塩（４，１ｇ、１５ミリモル）およびＬ−メ チオニンアミド塩酸塩（５５，４ｇ、３００ミリモル）を水３００ｄに溶解し、 水酸化ナトリウムでｐＨを８．５に調整した。反応はトリプシン５０■の添加に より開始した。反応期間中ｐＨは８゜５に維持した。ついでｐＨをＨＣ１溶液に よって３に調整して反応を停止させた。

反応混合物を次に希釈し、ＤＯＷＥＸ　Ａ６５０ＷＸ４およびＣＭ　−５ｅｐｈ ａｒｏｓｅ　６　Ｂカラム上、それぞれ酢酸アンモニウムおよびＮ　ａ　Ｃ１２ ／　ＨＣｌ塩勾配を用いる連続陽イオン交換によって精製し、最終的に脱塩した 。

純粋な生成物を含む分画を集め、減圧下に濃縮し、最後に凍結乾燥した。

この操作により、Ｌ、Ｌ−アルギニルメチオニンニ塩酸塩１０．７ｇ　（２８， ３ミリモル、６３％）が、白色の無定形粉末として得られた。

同定 ０．２％（ｗ　／　ｗ　）未満の酢酸および２２．９％（Ｗ／Ｗ）の塩素が測定 され、生成物は二塩酸塩として存在した。

アミノ酸分析では、遊離アミノ酸の存在は認められなかったが、加水分解後には 以下の結果が得られた。

Ａｒｇ　（１，００） Ｍｅｔ　（０，８０） ナトリウムＤ線を用いた５０％ＭｅＯＨ中ｃ＝０．２での比旋光度は２０°Ｃに おいて＋１９．５６であった。

純度 ＨＰ　Ｌ　Ｃ−純度：９５．１％（Ｎｏｖａｐａｋ　Ｃ−１８。

０．１Ｍリン酸アンモニウム、アルキルスルホネート含有、ｐＨ４，５／アセト ニトリル、２２０　ｒ＋ｍ）カールフィッシャーによる水含量：９，１％（Ｗ／ Ｗ） アミノ酸分析によるペプチド含量：アルギニンに基づいて７２％（ｗ　／　ｗ　 ） 例１８ 基質として請求 としてＬ−メチオニンアミドを用いる水中および水／存機溶媒均−混合物中ｐＨ ８，５での、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ　Ｃ固定化ブタ膵臓リパーゼ”ゝ触媒り、Ｌ−メ チオニルメチニジアミドの合成 濃度 基質　請求核試薬　％　有機溶媒　収率ｂ）５０ｍＭ　１．ＯＭ　Ｏ−６８％ １００ｍＭ　Ｏ，５Ｍ　３０　イソプロパ　２６％ノール ａ）ブタ膵臓リパーゼをＥｕｐｅｒｇｉｔ　Ｃ上に、製造業者の推薦する操作に 従い、活性アッセイでゲル上約４００μＭに相当する最終濃度になるように固定 化した。

ｂ）酵素ゲルを充填したカラム上に１〜３反応ベッド容量の容量で反応混合物を 、ＨＰＬＣで測定して基質が完全に変換するまで（０，５〜２日間）再循環させ 、この間ｐｌはｐＨ−スタット制御によって一定に維持した。

例１９ 純粋な有機溶媒中、基質としてＬ−１−リブトファンエチルエステル（５０ｍＭ ）および核試薬としてＬ−アラニン−三級ブチルエステル（０，３Ｍ）をいずれ も塩を含まない形で用いるブタ膵臓リパーゼ魯）およびα−キモトリプシン１触 媒、Ｌ、Ｌ−トリプトファニル−アラニン−三級ブチルエステルの合成 酵素゛１　溶媒　変換゛１　収率ｅ′ ＰＰＬ　ＣＨ，ＣＬ　／ｎ−ヘキサン（１：　３）　３（１％　１３％ＣＴ　Ｃ Ｈ，ＣＩ！ｔ　／ｎ−ヘキサ：／（１：３）　５６％　１７％ＰＰＬ　ＣＨｔＣ ｅｔ　７％　１０％ ＣＴ　（Ｊ（、Ｃ６５０％　３％ ＰＰＬ”　ＣＨｔ　Ｃ１！？／イソオクタン（１：　Ｉ）　８２％″　２６％ａ ）５００〜２０００μＭの水分含有、凍結乾燥酵素を混合物に直接加え、これを ２４時間攪拌した。

ｂ）この場合は、酵素５００μ藺、反応時間３日を適用した。

Ｃ）出発原料の変換率と生成対加水分解は、ＤＭＦで反応を停止Ｉニジ、蒸発さ せ、ＤＭＦ／酸性水中に再溶解したサンプルのＨＰＬＣで測定した。対照は変換 も生成も示さなかった。

例２０ 基質としてＬ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンエチルエステル（５０ｍＭ ）および核試薬としてＬ−Ｓ−アセトアミドメチルシスティンアミド（０，６Ｍ ）を用いるｐＨ８，５における水中での、α−キモトリプシン”）触媒、側鎖保 護り、Ｌ−ジペプチドの合成基質　生成物　収率 Ｌ−チロシンエチルエステル　ＴｙｒＣｙｓ（−ＳＡｅｍ）ＮＬ　６２％Ｌ−フ ェニルアラニンエ千ル　ＰｈｅＣ）’Ｓ（−ＳＡｃｍ）ＮＨｔ　７８％基質とし てＬ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンエチルエステル（５０ｍＭ）および 核試薬としてＬ−アミノ酸アルコール（０，５Ｍ）を用いるｐＨ８，５における 水中での、α−キモトリプシン１′触媒り、Ｌ−ジペプチドアルコールの合成 左−質　請求核試薬　生成物　収率 １、−ＴｙｒＯＥｔ　Ｌ−ＭｅｔＣＨｔＯＨＴｙｒＭｅｔＣＨｘＯＨ４２％Ｌ− ＴｙｒＯＥｔ　Ｌ−ＬｅｕＣＨｚＯＨＴｙｒＬｅｕＣＨ＊ＯＨ４６％１、、Ｐｈ ｅＯＥｔ　Ｌ　ＭｅｔＣＨｙＯＨ、ＰｈｅＭｅｔＣＨｓＯＨ６０％ａ）１０μＭ 例２２ 基質としてアミノ゛酸エチルエステル（５０ｍＭ）および核試薬として遊＃Ｌ− アミノ酸を用いる、Ｉ）８８．５における水中での、千オールエンドプロテアー ゼ・ゝ触媒、Ｉｌ、Ｌ−ジペプチドの合成 酵素　基質　請求核試薬　ＣＭｊＤ　生成物　収率１″１）フィシン　ＡｒｇＯ Ｅｔ　ＡｒｇＯＨ（１，０Ｍ）　ＡｒｇＡｒｇＯＨ６％パパイン　ＡｒｇＯＥｔ 　ＡｒｇＯＨ（１，０Ｍ）　ＡｒｇＡｒｇＯＨ７％フィシン　ＬｙｓＯＥｔ　Ａ ＩａＯＨ（１，５Ｍ）　ＬｙｓＡＩａＯＨ５％／　（／　（イン　ＬｙｓＯＥｔ 　八ＩａＯＨ（１，５Ｍ）　ＬｙｓＡＩａＯ）１　６％ａ）１００　μｍ　、２ ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１Ｍ　ＫＣＩ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭシスティン ｂ）変換率５０％未満で、標品によって加水分解に対して測定 Ｃ）酵素のない対照は、上述の条件下では加アミノ分解は検出できなかった。

例２３ 基質としてアルギニン−パラニトロアニリド（１０ｍＭ）および核試薬としてＬ −アミノ酸アミド（０，３Ｍ）を用いる、ｐＨ８，５における４０％ＤＭＦ中で の、トリプシン１触媒、Ｌ、Ｌ−ジペプチドアミドの合成求核試薬　生成物　収 率ｂ′ ロイシンアミド　ＡｒｇＬｅｕＮＨ＊　３１％チロシンアミド　ＡｒｇＴＹｒＮ Ｈｔ　１４％ｂ）変換率８０％未満で、標準により加水分解に対して測定 例２４ 基質としてＬ−リジンエチルエステル（５０ｍＭ）および核試薬としてＬ−アラ ニンアミド（０，８Ｍ）を用いる、様々なｐＨの水中での、パパイン・″′触媒 、Ｌ、　Ｌ−リジルアラニンの合成 ｐＨ収率０ ６．５　２１％ ４．５　４７％ ａ）５０μＭ　、　２ｍＭ　ＥＤＴＡＳ１０ｍＭシスティンｂ）長時間反応；変 換率５０％未満 Ｃ）標準を用いて加水分解に対して測定し、不完全な変換について補正した。

例２５ 基質としてＬ−アミノ酸エチルエステル（５０ｍＭ）および核試薬としてＬ−ア ミノ酸エチルまたは三級ブチルエステルを用いる、ｐＨ７，５および８．５にお ける水中での、α−キモトリプシン１）およびクロストリバインゝ）触媒り、Ｌ −ジペプチドエステルの合成猷　基質　請求核試薬　Ｃ１υ　生成物　収率ＣＴ 　ＴｒｐＯＥｔ　ＡＩａＯｔＢｕ　（０，８Ｍ）　ＴｒｐＡｌａＯｔＢｕ　１２ ％ＣＴ　ＴｒｐＯＥｔ　ＶａｌＯＥｔ　（０，８Ｍ）　ＴｒｐＶａｌＯＥｔ　１ ８％ＣＬ　ＡｒｇＯＥｔ　ＭｅｔＯＥｔ　（ｔ、ＯＭ）　ＡｒｇＭｅｔＯＥｔ　 ３３％１１ａ）５μＭ　、０．１Ｍ　ＫＣＩ、　ｐＨ７，５ｂ）　１０　μＭ　 、　５０ｍＭ　ＣａＣ１＊　、１０ｍＭ　ＤＴＴｌＴＥＡでｐＨ８，５に調整 Ｃ）変換率５０％未満で測定 例２６ 基質として様々なし一メチオニンエステルおよび核試薬としてＬ−メチオニンア ミドを用いる、様々な水／存機溶媒均−混合物中、ｐＨ８，５、とくに指示のな い限り核試薬１．０Ｍにおける、ブタ膵臓リパーゼ１）およびＬｉｐｏｌａｓｅ 　（Ｎｏｖａ）（ＬＩＰ）”およびＲｈ１ｚｏｐｕｓ　Ａｒｒｈｉｚｕｓ　リパ ーゼ（ＲＡ）”触媒、Ｌ、　Ｌ−メチオニル−メチオニンアミドの合成 基質 酵素　エステル　ｍ　％　有機溶媒　収率°１ＰＰＬ”　エチル　（奮　〇　− 式 ＰＰＬ”　エチル　６伽り　〇　−式 ＰＰＬ　エチｔｋ　（１５０ｎｉＪ）　Ｏ−４３ＰＰＬ　エチル　（加伽メ１５ 　ジメトキシエタン　２０％ＰＰＬ　エチル　（１５１ｋＭ）　３０　イソプロ パツール　式ＰＰＬ　エチル　（奮轄　エチレングリコール　ｄＰＰＬ　ｎ−プ ロピル　（５０１１Ｍ）０−　５５％ＰＰＬ　ｎ−＼キシル　（鷲　０　−　ま 戊ＬＩＰ　エチル　６伽め　Ｏ−４） ＬＩＰ　エチル　（５０ｎｆｆｉ　１５　ジメトキシエタン　ｇＬＩＰ　ｎ−＼ キシル　（鷲　０　−　！ｊＲＡ　エチル　（５０＋、ｌ　（９）　エタノール 　２３％ａ）　１０００μＭ　〜２０００μＭ ｂ）　５０μＭ ｃ）　ｐＨ９，０ ｄ）　０．請求核試薬 ｅ）　これらの条件下では、量的に変動する少量の脱アミド生成物が認められた が、記載した収率には包含されて基質としてＬ−チロシンエチルエステルおよび 核試薬としてグリシンアミドを用いる、水中での、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　Ｖ ｉｒｉｄａｅセルラーゼ触媒、Ｌ、Ｌ−ＴｙｒＧ　１　ｙ　Ｎ　Ｈｘの合成 基質　Ｃａ＋ｔ＋　＊核試薬　Ｃ＠ｔａ　生成物　収率１ゝＴｙｒＯＥｔ”　（ ２０ｄＤ　ＧＩｙＮＨｙ　（０゜６ｈＯＴｙｒＧｌｙＮＨｔ　２３％ＴｙｒＯＥ ｔ″　（１０ｍ　ＧＩｙＮＨｙ　（０，８Ｍ）ＴｙｒＧＩｙＮＨ，３４％ａ）　 １０００μＭ　＄１１酵素、ｐＨ８，５ｂ）　５００μＭ粗酵素、ｐＨ８，０ Ｃ）変換率３０％未満で加水分解に対して測定し、同一条件下における対照に認 められた加水分解および加アミノ分解に対して補正した。

補正書の翻訳文提出書　（曲舖１８４ｉ０８　）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式 Ｈ−Ａ−Ｂ−Ｙ 〔式中、Ａは側鎖が保護されていてもよいＬ−もしくはＤ−α−アミノ酸残基ま たはω−アミノ酸残基であり、ＢはＡと同種もしくは異種の側鎖が保護されてい てもよいＬ−もしくはＤ−α−アミノカルボン酸残基、およびＬ−もしくはＤ− アミノリン酸残基またはＬ−もしくはＤ−アミノスルホン酸残基、または相当す るω−アミノ酸、またはそれらの塩もしくは水和物であり、ＹはＯＨ、Ｈ、アル キル、アリール、アラールキルまたはＣ−末端保護基であるか、あるいはＢＹは Ｂ１−ＣＨＹ１−ＯＨ （式中、Ｂ１はＢに関連して定義されたアミノカルボン酸のデカルボキシ誘導体 であり、Ｙ１はＨ、アルキル、アリールまたはアラールキルである）で示される アミノアルコール残基を表す〕を有するジペプチドまたは構造的に類縁の化合物 を製造するにあたり、式Ｈ−Ａ−ＯＲ１または▲数式、化学式、表等があります ▼（式中、Ａは上に定義したとおりであり、Ｒ１は不活性置換基で置換されてい てもよいアルキル、アリールもしくはアラール基であるかまたはアミノ酸のα− ｄｅｓ−アミノフラグメントであり、Ｒ２およびＲ３は互いに同種または異種で ありそれぞれ水素または不活性置換基で置換されていてもよいアルキル、アリー ルもしくはアラールキル基である）を有するアミノ酸誘導体である基質成分を、 （ａ）式 Ｈ−Ｂ−ＯＨ （式中、Ｂは上に定義したようにアミノカルボン酸残基である）を有するアミノ 酸、 （ｂ）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｂは上に定義したようにアミノカルボン酸残基であり、Ｒ２およびＲ３ は、Ｒ２が水素である場合にはＲ３はヒドロキシまたはアミノでもよいことを除 いて、上記の意味を有する）を有するアミノ酸アミド、（ｃ）式 Ｈ−Ｂ−ＯＲ４ （式中、Ｂは上に定義したようにアミノカルボン酸残基であり、Ｒ４はアルキル 、アリールまたはアラールキルである）を有するアミノ酸エステル、 （ｄ）式 ＮＨ２ＣｘＨｚＰＯ３Ｒ６Ｒ６または ＮＨ２ＣｘＨｚＳＯ３Ｒ７ （式中、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に水素、アルキル、アリールまた はアラールキルであり、ｘは１〜６、ｚは２〜１２である）を有する、酸基が保 護されていてもよい直鎖状または分岐状アミノホスホン酸またはアミノスルホン 酸、 （ｅ）式 Ｈ−Ｂ１−ＣＹ２−Ｒ３ （式中、Ｂ１は上に定義した通りであり、Ｙ２はＯまたはその官能性誘導体、好 ましくはケタールであり、Ｒ■はＨ、アルキル、アリールまたはアラールキルで ある）を有するアミノ酸アルデヒドもしくはケトンまたはそれらの誘導体、およ び式 Ｈ−Ｂ１−ＣＨＹ１−ＯＨ （式中、Ｂ１およびＹ１は上記の意味を有する）を有するアミノアルコールから 選ばれる求核試薬成分と、セリンまたはチオールカルボキシペプチダーゼとは異 なるアミダーゼまたはエステラーゼの溶液または分散液としての存在下に反応さ せ、ついで所望により存在する側鎖保護基もしくは保護基Ｙの切断および／また は、所望により得られたジペプチドの塩もしくは水和物への変換を行う方法 ２．セリンまたはチオールプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼおよびグリコ シダーゼから選ばれるエステラーゼまたはアミダーゼ活性を有する酵素を使用す る請求項１記載の方法 ３．使用する酵素は化学的に修飾されているかまたは天然型の生合成的変異体で ある請求項１または２記載の方法 ４．固定化を使用する請求項１〜３のいずれかに記載の方法 ５．０〜９０％好ましくは０〜６０％の極性水混和性有機溶媒を含有し、ｐＨ値 ３〜１１、好ましくは５〜１０．５、さらに好ましくは６〜１０、とくに７〜９ ．５を有する水性反応溶液を用いる請求項１〜４のいずれかに記載の方法 ６．有機溶媒はアルカノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、 ジメトキシエタンおよびエチレングリコールから選ばれる請求項５記載の方法７ ．０〜１０％の水を含有する有機反応溶液または分散液を使用する請求項１〜４ のいずれかに記載の方法８．好ましくはジアルキルエーテル、酢酸エチル、プロ ピオン酸エチル、オクタン、ヘプタン、ヘキサン、石油エーテルおよびメチレン クロリドから選ばれる非極性春機溶媒を用いる請求項７記載の方法 ９．有機溶媒としても働く液体基質または求核試薬成分を使用する請求項７記載 の方法 １０．基質成分として、不活性置換基で置換されていてもよいベンジルエステル または直鎖状もしくは分岐状Ｃ１〜Ｃ■アルキルエステルから選ばれるＤ−また はＬ−アミノ酸エステルを使用する請求項１〜９のいずれかに記載の方法 １１．求核試薬成分として、式 Ｈ−Ｂ−ＮＨ尺２ （式中、Ｒ３は水素またはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、ＢはＬ−またはＤ−アミ ノカルボン酸残基である）を存するアミノ酸アミドを使用する請求項１〜１０の いずれかに記載の方法 １２．求核試薬成分として、式 Ｈ−Ｂ−ＯＲ４ （式中、ＢはＬ−またはＤ−アミノカルボン酸残基であり、Ｒ４はＣ１〜Ｃ３ア ルキルである）を有するエステルを使用する請求項１〜１０のいずれかに記載の 方法１３．生成したジペプチドは１個または２個以上のＣ−末端保護基Ｙを包含 し、これらの基の１個または２個以上を、それに先立つ反応に使用されたのと同 一の酵素によりまたは異なるエステルもしくはアミド特異性を有する酵素により 、酵素的に切断する請求項１〜１２のいずれかに記載の方法 １４．生成したジペプチドは１個または２個以上の側鎖保護基を包含し、これら の基の１個または２個以上を、好ましくはエステラーゼもしくはリパーゼまたは 蛋白分解酵素により、酵素的に切断する請求項１〜１３のいずれかに記載の方法 発明の詳細な説明