DK155613B - Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af peptider - Google Patents

Description

i

DK 155613 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til enzymatisk fremstilling af peptider af den i krav l's indledning anførte art.

5 Det er kendt at gennemføre peptidsynteser ved mere eller mindre raffinerede koblingsreaktioner såvel ved homogen syntese som ved heterogen fastfasesyntese. Alle disse kemiske metoder indebærer imidlertid en risiko for uønskede bireaktioner og racemiseringer, hvorfor man 10 må gennemføre en omhyggelig kontrol af de kemiske reaktioner for at minimere eller eliminere disse problemer. Endvidere må man meget ofte beskytte aminosyreside-kæderne, hvilket kræver en deblokering som det sidste kemiske trin ved opnåelsen af ønskede peptider. Af-15 hængigt af størrelsen af det syntetiserede peptid kan udbytterne endvidere være lave og på grund af bireaktionerne må man ofte foretage besværlige rensningsprocedurer for at opnå det rene peptid. På grund af alle disse iboende problemer ved kemiske peptidsynteser for-20 uden den høje pris for adskillige af koblingsreagenserne og de blokerede aminosyrederivater, så er selv små syntetiske peptider, f.eks. pentapeptider, relativt dyre at fremstille.

25 Eftersom enzymer er meget specifikke katalysatorer, og proteolytiske enzymer således er i stand til at hydrolysere peptidbindinger i proteiner, har man tidligere foretaget studier over mulighederne'for at reversere denne hydrolysereaktion eller med andre ord udnytte 30 enzymer som katalysatorer ved syntese af peptidbindinger.

Dette er nærmere undersøgt af Bergmann og Praenkel-Conrat (Ref. 1) og Bergmann og Eruton (Re. 2), der i 1937 påviste, at papain og chymotrypsin kunne katalysere kobling af visse acylaminosyrer og aminosyreanilider. Disse 35 studier er blevet fortsat og intensiveret ud fra to fundamentalt forskellige indgangsvinkler, nemlig en termodynamisk og en kinetisk.

DK 155613 B

2

Principielle træk ved de termodynamiske fremgangsmåder er anvendelsen af en passende protease til at katalysere tilvejebringelsen af den termodynamiske ligevægt mellem reaktanterne samt en fjernelse af reaktionsproduktet 5 fra reaktionsblandingen. Således har Isowa et al. (Ref.

7-9) og US patentskrift 4.119.493 samt GB patentskrift 1.523.546 og 1.533.129, DE offentliggørelsesskrift 26 47 188 og 26 47 189, Luisi et al. (Ref. 12, 18) og Morihara et al. (Ref. 14) påvist, at adskillige serin-, 10 thiol- og metalloendoproteaser katalyserer syntesen af peptider ud fra beskyttede, men meget letopløselige di-, tri- og tetrapeptider, under forudsætning af, at slutprodukterne fælder ud fra reaktionsblandingen på grund af, at deres opløselighed er lavere end ligevægts-15 koncentrationen. Eksempler på sådanne synteser er illustreret i nedenstående reaktionsskema.

1) Z-Leu-Phe-OH + Phe-ODPM PaPain z-Leu-Phe-Phe-ODPM ODPM = diphenylmethylester 20 2) Z-Arg(NO2)-OH + Phe-Val-OBut Thermoiysin- z_Arg(No2)-

Phe-Val-OBu^

3) BOC-Val-Tyr(Bz)OH + Val-His(Bz)-Pro-Phe-OEt na9arse Boc-Val-Tyr(Bz)-Val-His(Bz)-Pro-Phe-OH

25 (Z = carbobenzoxy, Bz = benzoyl, BOC = tert.butyloxy-carbonyl; alle aminosyrer er på L-form).

For at dette reaktionsprincip skal kunne udnyttes som en generel syntesemetode kræves det imidlertid, ligesom 30 ved den konventionelle kemiske koblingsprocedure, at alle aminosyresidekæderne med potentielt ioniserbare grupper må blokeres inden reaktionen og deblokeres efter reaktionen. Fremgangsmåden er endvidere behæftet med den ulempe, at man på grund af de forskellige enzymers høje 35 specificitet må anvende forskellige enzymer afhængigt af arten af den peptidbinding, der skal syntetiseres eller rettere af de aminosyrer, der danner peptidbindingen. Selv

DK 155613 B

3 om disse komplikationer kunne overvindes, lider metoden også af andre ulemper, idet den kræver en meget høj enzymkoncentration (100 mg/mmol peptid), lange reaktionstider (1-3 dage) og giver stærkt varierende udbytter 5 (typisk 20-80%, jfr. ovennævnte US- og GB-patentskrifter).

Klibanov et al (Ref. 10) har foreslået at arbejde i et system bestående af vand og et organisk opløsningsmiddel, der ikke er blandbart med vand. Denne procedure kræver 10 imidlertid også en høj enzymkoncentration og en lang reaktionstid af størrelsesordenen flere dage.

Ved den anden type enzymatiske reaktioner udnytter man de kinetiske forhold under reaktionen. Por de fleste serin-15 og thiolproteaser er det påvist, at der i et af de katalytiske trin under hydrolysen af peptider eller peptid-estere dannes et acylenzym-mellemprodukt, der i det eller de følgende trin hydrolyseres af vand. Hvis der under hydrolysen er andre nucleophile forbindelser end vand 20 til stede, vil disse også acceptere acylgruppen fra acyl-enzymet3 hvilket resulterer i dannelsen af en amidbinding. Dette er f.eks. undersøgt af Pastrez og Ferscht (Ref. 3), der beskriver chymotrypsin-katalyseret hydrolyse af N-acetyl-L-phenylalanin-ethyl-ester (Ac-Phe-OEt) 25 i nærvær af forskellige aminosyreamider. Reaktionen er vist i skema (4):

Ks ^

Ac-Phe-OEt + CT«=—» *2» Ac-Phe-OH + CT

k2 .

30 (Ac-Phe-OEt) *CT<=^Ac-Phe-CT'ir -2 + EtOH .

^ C^’Ac-Phe-NH-R + CT

35 Skema /47 (CT = chymotrypsin)

DK 155613B

4 Først dannes der et enzym-substratkomplex efterfulgt af dannelsen af acylenzym-mellemproduktet (Ac-Phe-CT).

Dette hydrolyseres af vand til Ac-Phe-OH, men hvis der endvidere er en nucleophilforbindelse (R-N^) til stede, 5 vil acylenzym-mellemproduktet foruden hydrolyse også være udsat for aminolyse. Under forudsætning af, at k^» k_^ °g k_^, vil forholdet mellem aminolyse og hydrolysen klart afhænge af k^/k^ samt af koncentrationen af den nucleophile forbindelse, der konkurrerer med 55 M 10 vand. Fastrez og Ferscht fandt, at f.eks. 1 M alaninamid ved pH 10 er en 44 gange stærkere nucleophilforbindelse end 55 M vand, hvilket resulterede i en overvejende dannelse (større end 95$) af det viste N-aeyldipeptidamid.

Morihara og Oka (Ref. 13-16) har yderligere udnyttet 15 dette princip til enzymatisk peptidsyntese. Under anvendelse af chymotrypsin og trypsin har de syntetiseret et / antal peptider ud fra N-acylaminosyreestere og aminosyre-afledte nucleophile forbindelser, og demonstreret, at reaktionen var rent kinetisk, eftersom man kunne opnå høje 20 udbytter uafhængigt af produktets opløselighed.

Kinetiske fremgangsmåder synes på baggrund af ovennævnte studier at have flere fordele i forhold til de termodynamiske metoder: 25 1. Reaktionen forløber hurtigere (i visse tilfælde på få minutter).

2. Der kan anvendes lave enzymkoncentrationer.

3. Aminosyresidekæder skal ikke nødvendigvis blokeres.

30 4. Immobiliserede og uopløselige enzymer kan anvendes, da peptiderne er i opløsning, hvilket giver mulighed for automatisering.

Eftersom der imidlertid kan være tale om opløselige 35 reaktionsprodukter, må syntesen være hurtigere end den sekundære hydrolyse af produktet, således at disse kan separeres i tide.

DK 155613B

5

De kendte kinetiske metoder har endvidere alle den begrænsning, at der på grund af de undersøgte enzymers specifikke egenskaber må anvendes forskellige enzymer til syntese af de forskellige peptidbindinger. Det har 5 endvidere vist sig, at man ved syntese af større peptidmolekyler uundgåeligt oplever en hydrolyse af de interne peptidbindinger i molekylet, uafhængigt af enzymernes esterolytiske aktivitet, hvilket må tilskrives de hidtil anvendte enzymers endopeptidase-10 karakter.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at angive en enzymatisk peptidsyntese, der ikke er behæftet med ovennævnte ulemper, og nærmere bestemt en syntese, der 15 har generel karakter, således at den ikke er begrænset til bestemte aminosyrekomponenter, og som ikke er behæftet med risiko for efterfølgende hydrolyse af de interne peptidbindinger.

20 Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Opfindelsen hviler på et afgørende brud med kendt teknik, 25 nemlig anvendelsen af exopeptidaser i stedet for de hidtil anvendte enzymer, der alle har udvist overvejende eller i det mindste betydelig endopeptidaseaktivitet.

Foruden at være exopeptidaser, har det vist sig, at de 30 anvendelige enzymer skal udvise en bredspektret peptidase-virkning, for derved at muliggøre en tilsvarende bredspektret syntesevirkning, der ikke er begrænset til en enkelt eller nogle få peptidbindingstyper. Enzymerne skal være i stand til at danne acylenzymmellemprodukter 35 af den ovenfor under de kinetiske metoder beskrevne art, og ikke mindst skal de besidde sådanne karakteristika, at aminolysen af mellemproduktet kan foregå under betin-

DK 155613 B

6 gelser, hvor k_4 << k^, jfr. skema (4) ovenfor, for at undgå at de dannede peptider umiddelbart hydrolyseres. Evnen til at danne acylenzymmellemprodukter kan også udtrykkes som evnen til at fraspalte den C-terminale 5 beskyttelsesgruppe i den anvendte substratkomponent, i det foreliggende tilfælde altså en esterase- eller amidasevirkning. Denne virkning skal for at muliggøre en syntese dominere over enzymets peptidasevirkning ved de anvendte reaktionsbetingelser.

10

Denne mangfoldighed af karakteristika har vist sig at findes hos den gruppe af exopeptidaser, der er L-specifik-ke serin- eller thiolcarboxypeptidaser, og som altså er i stand til at hydrolysere peptider med frie carboxyl-15 grupper. Det har vist sig, at en række sådanne carboxy-peptidaser udviser en enzymatisk aktivitet, der er meget pH-afhængig, således at de f.eks. i basisk milieu ved pH 8 - 10,5 i overvejende grad udviser esterase- og amidaseaktivitet og ved pH 9 - 10,5 ingen eller kun 20 ringe peptidaseaktivitet. Disse egenskaber lader sig på fordelagtig vis udnytte ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, idet de bidrager til opnåelse af gode udbytter.

25 De nævnte L-specifikke serin- eller thiolcarboxypeptidaser kan produceres af gærsvampe, eller de kan være af animalsk, vegetabilsk eller anden mikrobiel oprindelse.

Et særligt hensigtsmæssigt enzym er carboxypeptidase 30 Y fra gærsvampe (CPD-Y). Dette enzym er beskrevet af Hayashi et al. (Ref. 5) og af Johansen et al. (Ref.

6), der anviser en særlig hensigtsmæssig rensningsmetode ved affinitetschromatografi over en affinitetsresin bestående af et polymert resinskelet med et antal til-35

DK 155613 B

7 koblede benzylsuccinylgrupper. CPD-Y, der er et serin-enzym, udmærker sig ved at have de ovennævnte aktivitets-forhold ved pH> 9 og ved at være fri for endopeptidase-aktivitet. Udover sin specificitet for C-terminale 5 aminosyrer eller -estere med frie α-carboxylgrupper,.

kan CPD-Y også hydrolysere peptider, hvor den C-terminale α,-carboxylgruppe er blokeret i form af en estergruppe såsom en alkyl- eller arylester eller som en amidgruppe eller et N-substitueret amid, f.eks. et anilid. Af 10 særlig betydning er det, at enzymet hydrolyserer de fleste substrater uafhængigt af arten af den C-terminale aminosyrerest. En yderligere fordel ved CPD-Y er, at dette enzym er tilgængeligt i store mængder og udviser relativt stor stabilitet.

15

Foruden CPD-Y, der derfor p.t. er det foretrukne, enzym, lader fremgangsmåden ifølge opfindelsen sig også gennemføre med andre L-specifikke serin- eller thiolcarboxy-peptidaser, såsom de i nedenstående oversigt anførte.

20

Enzym Oprindelse

Svampe

Penicillocarboxypeptidase S-l Penicilli.um janthinellum tt S—2 ” ** 25 Carboxypeptidase(r) fra Aspergillus saitoi " Aspergillus oryzae

Planter

Carboxypeptidase(r) C Orange blade 30 Orange skaller

Carboxypept idase Cjj Citrus natsudaidai Hayata

Phaseolin Bønneblade

Carboxypeptidase(r) fra Spirende byg

Spirende bomuldsplanter 35 Tomater

Vandmeloner

Bromelein (ananas) pulver

DK 155613B

8

Derimod har bovint carboxypeptidase A og B (CPD-A og CPD-B) vist sig uegnede, idet disse enzymer er metallo-carboxypeptidaser.

Som det fremgår af krav 1, er reaktionen baseret på en omsætning af en såkaldt substratkomponent, også benævnt syrekomponent eller donor, der indeholder gruppen A, med en såkaldt aminkomponent, også kaldet nucleofil komponent eller acceptor, og som indeholder gruppen B, til dannelse af et peptid A-B-Y. Gruppen A er således en N-terminalbeskyttet aminosyrerest eller en peptidrest, der om ønsket kan være N-terminal aminobeskyttet for at undgå uønskede sidereaktioner.

Behovet for aminobeskyttelse aftager med stigende kædelængde af peptidresten og bortfalder i det væsentlige, når peptidresten består af 3 aminosyrer, dog afhængigt af disses art og sekvens.

Som eksempler på anvendelige aminosyrer kan nævnes alipha-tiske aminosyrer, såsom monoaminomonocarboxyl syrer., f.eks. glycin (Gly), alanin (Ala), valin (Val), norvalin (Nval), leucin (Leu), isoleucin (iso-Leu) og norleucin (Nleu), hydroxyaminosyrer, såsom serin (Ser), threonin (Thr) og homoserin (homo-Ser), svovlholdige aminosyrer, såsom methionin (Met) eller cystin (CysS) og cystein (CysH), monoaminodicarboxylsyrer, såsom asparaginsyre (Asp), glutaminsyre (Glu) og amider deraf, såsom asparagin (Asn) og glutamin (Gin), diaminomonocarboxylsyrer, såsom ornithin (Orn) og lysin (Lys), arginin (Arg), aromatiske aminosyrer, såsom phenylalanin (Phe) og tyrosin (Tyr), samt heterocycliske aminosyrer, såsom histidin (His) og tryptophan (Trp).

Som beskyttende grupper kan anvendes de inden for peptidkemien gængse aminobeskyttende grupper, såsom tert-alkoxy-carbonylgrupper, f.eks. t-butyloxycarbonyl (BOC),

DK 155613 B

9 t-amyloxycarbonyl (t-AOC-), benzyloxycarbonyl (Z-), p-methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ-), 335-dimethoxy-benzyloxycarbonyl (Ζ(ΟΜβ)2“)} 2,4,6-trimethylbenzyloxy-carbonyl (TMZ-), p-phenylazobenzyloxycarbonyl (PZ-), 5 p-toluensulfonyl (Tos-), o-nitrophenylsulfenyl (Nps-), samt benzoyl (Bz), acetyl (Ae) eller lignende.

Foretrukne beskyttelsesgrupper er benzyloxycarbonyl og tert-butyloxycarbonyl, idet disse derivater er lette 10 at fremstille, økonomiske i brug og let kan fraspaltes igen.

Som anført i krav 1 kan substrat-komponenten være valgt blandt 15 (a) aminosyreestere, peptidestere og depsipeptider med formlen A-OR1, hvori A har den i krav 1 anførte betydning, og R betegner alkyl, aryl-, heteroaryl, aralkyl eller 20 et 4-des-amino-fragment af en aminosyrerest, (b) eventuelt N-substituerede aminosyreamider og peptidamider med formlen 2 2 *

A-NR R

hvori A har den i krav 1 anførte betydning og 2 21 25 R og R betegner hydrogen, alkyl, aryl, hetero- aryl eller aralkyl, eller (c) eventuelt N-terminal beskyttede peptider med formlen

A-X-OH

30 hvori A har den i krav 1 anførte betydning, og X

betegner en L-aminosyrerest denne sammenhæng betegner "alkyl" ligekædet eller forgrenet alkyl, fortrinsvis med 1-6 carbonatomer, såsom 35 methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert. butyl, amyl og hexyl.

DK 155613 B

10 "Aryl" betegner f.eks. heterocyclisk aryl og phenyl.

"Aralkyl" betegner f.eks. phenethyl og benzyl. Grupperne og kan være ens eller forskellige.

5 Alle disse grupper kan være substituerede med substi- tuenter, der er inerte over for enzymet, f.eks. halogen (fluor, chlor, brom, iod), nitro, alkoxy (methoxy, ethoxy, ete.), eller alkyl (methyl, ethyl, etc.), forudsat at aminosyreresten eller peptidderivatet er et 10 substrat for carboxypeptidasen.

Ved anvendelse af estere er gruppen OR1 således fortrinsvis valgt blandt alkoxygrupper, såsom methoxy, ethoxy eller tert-butoxy, phenyloxy- eller benzyloxy-15 grupperne. Grupperne kan eventuelt være substitueret med inerte substituenter, såsom nitro-grupper (p-nitro-benzyloxy). Andre grupper kan dog også anvendes, hvis aminosyrederivatet eller peptidderivatet er et substrat for carboxypeptidasen. Som eksempel herpå kan nævnes 20 de såkaldte depsipeptider, hvor den C-terminale aminosyre er bundet via en esterbinding i stedet for en peptidbinding, såsom benzoyl-glycin-phenyl-lactat (Bz-Gly-OPhe).

25 Foretrukne carboxylsyrebeskyttende grupper er alkoxygrupper, navnlig methoxygrupper, eller med andre ord:

Substratkomponenten indeholder eller består fortrinsvis af en aminosyremethylester, eftersom disse derivater er simple at fremstille og samtidig er gode substrater.

30 Man kan dog ligeså vel anvende f.eks. ethylestere, pro-pylestere, isopropylestere, butylestere, tert-butyl-estere, benzylestere eller tert-butyloxyestere.

Det skal nævnes, at eventuelle ioniserbare grupper i de 35 enkelte aminosyrer, der indgår i en peptidrest A, om ønsket kan være blokerede på i og for sig kendt måde af-

DK 155613B

11 hængig af gruppens art. Dette er dog ikke altid påkrævet, hvilket netop som nævnt er en af fordelene ved den omhandlede fremgangsmåde. Ønskes det at beskytte de funktionelle grupper, er egnede beskyttelsesgrupper for 5 tø-aminogruppen (Nw) f.eks. N^-benzyloxycarbonyl (N^-Z), t-butoxycarbonyl (N^-BOC) eller tosyl (N^-Tos). Egnede beskyttelsesgrupper for N-guanidinogruppen (N ) i Arg er Nitro (N^-N0„), N^-benzyloxycarbonyl (NG-Z) og N^, ff ^ fl N -dibenzyloxycarbonyl (N -Z-Z). Egnede beskyttelses-10 grupper for imidazolringen (Nlm) i His er Nim-benzyl (N^m-Bzl) og Tosyl (N^-Tos). Egnede beskyttelsesgrupper for c^-carboxylgrupper er o/-benzyloxy (-OBzl). Egnede beskyttelsesgrupper for hydroxylgruppen i aliphatiske eller aromatiske hydroxyaminosyrer er aralkylgrupper, så-15 som benzyl (Bzl). Egnede S-beskyttelsesgrupper for mer-captogruppen i CysH er f.eks. benzylgruppen (Bzl).

Disse beskyttelsesgrupper skal være stabile under reaktionsbetingelserne for hovedreaktionen og være let fraspaltelige for slutproduktet uden at give anledning 20 til sidereaktioner.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen lader sig principielt gennemføre med alle mulige L-aminosyrer som substratkomponenter. Foretrukne substratkomponenter er L-aminosyre-25 estere eller peptidestere valgt blandt C^-C4 alkyl-eller benzylestere eller p-nitroanilider.

Den anden reaktionsdeltager er den såkaldte aminkompo-nent, der som nævnt kan vælges blandt 30 (a) L-aminosyrer med formlen H-B-OH, (b) eventuelt N-substituerede L-aminosyreamider med 3 3' formlen H-B-NR R , hvori B er en L-aminosyrerest, 3 31 og R og R betegner hydrogen, hydroxy, amino, alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, eller 4 35 (c) L-aminosyreestere med formlen H-B-OR , hvori 4 B er en L-aminosyrerest, og R betegner alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl.

DK 155613 B

12

Alkyl-, aryl-, heteroaryl og aralkylgrupperne kan være substituerede og er defineret ovenfor i forbindelse med substratkomponenten.

3' 3 5 Det ses, at når R er hydrogen, repræsenterer R = 3 hydrogen den fri amid, mens R = OH er en hydroxamsyre, 3 3 R = amino er et hydrazid, og R = phenyl repræsenterer et anilid.

10 Foretrukne aminkomponenter er L-aminosyreamider, hvori 3' 3 R = H og R = H eller C.-C~ alkyl eller -estere, hvori 4 J--3 R er C^-C^ alkyl.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har således den afgø-15 rende fordel i forhold til eksempelvis Isowa et al. og Morihara et al. (op. cit.), at den både lader sig gennemføre med frie (ikke C-terminalbeskyttede) aminosyrer, og med aminosyrer, der er C-terminalbeskyttede, eksempelvis ved omdannelse til de tilsvarende amider, 20 anilider, hydrazider, estere eller andre angivne carboxyl-derivater af aminosyrer.

For aminkomponentens vedkommende gælder det, at reaktionsforløbet, udbytterne, etc. afhænger meget af, om kompo-25 nenten indsættes som fri syre eller som C-beskyttet derivat, eksempelvis som amid. Disse forhold vil blive nærmere belyst nedenfor i forbindelse med eksemplerne, men følgende generelle billede synes at tegne sig: 30 For de frie syrer gælder det, at de hydrophobe aminosyrer, såsom alanin, leucin, valin og phenylalanin, samt syrer med en positivt ladet sidekæde, såsom lysin og arginin, relativt let lader sig inkorporere i substratkomponentens kæde, mens aminosyrer, hvis sidekæder indeholder enten 35 carboxylgrupper (asparaginsyre og glutaminsyre), hydroxyl-grupper (serin og threonin) eller amidgrupper (asparagin og glutamin) vanskelige lader sig inkorporere.

DK 155613 B

13

Heteroeycliske aminosyrer, såsom prolin og histidin lader sig kun særdeles vanskeligt inkorporere som frie syrer.

5 Anderledes tegner forholdet sig, hvis der som aminkompo-nent anvendes aminosyreamider eller N-substituerede amider, såsom hydrazider eller anilider. Dette uddybes nærmere nedenfor, men det kan helt alment siges, at reaktionen i dette tilfælde er vidtgående strukturuafhæn-10 gig og fører til endog meget høje udbytter (op til størrelsesordenen 90%), idet dog heteroeycliske aminosyrer også her vanskeligere lader sig inkorporere end alifatiske.

Som anført ovenfor gennemføres fremgangsmåden ifølge 15 opfindelsen ved pH 5 - 10,5, fortrinsvis ved pH 8,0 - 10.5. Den foretrukne pH-værdi, der ofte ligger inden for et meget snævert interval, afhænger af det anvendte enzyms aktivitetsmæssige pH-optima, respektive pH-minima, idet pH-værdien bør vælges, så aktiviteterne afbalanceres 20 som forklaret ovenfor.

Generelt stiger peptidaseaktiviteten med faldende pH-værdier under ca. 9,0, hvorved processen bliver mindre fordelagtig, hvad udbytterne angår. I visse til-25 fælde, f.eks. med Bz-Ala-Gly eller Bz-Ala-Gly-NH2, er de dannede peptider eller peptidamider imidlertid meget dårlige substrater for carboxypeptidasen, således at esteraseaktiviteten over for amiriosyreesteren eller peptidesteren, der fortrinsvis anvendes som substrat-30 komponent,stadig dominerer, hvorved det bliver muligt at gennemføre syntesen selv ved pH-værdier på 5,0. Generelt afhænger den optimale pH af de konkrete udgangsmaterialer, de dannede peptider og enzymet.

35

Anvendes CPD-Y som enzym, er pH-værdien, som nærmere forklaret nedenfor fortrinsvis 8,0 - 10,5, især 9,0 - 10.5.

DK 155613 B

14

Denne pH-værdi bør opretholdes under hele koblingsreaktionen, hvorefter den kan ændres med henblik på udfældning af reaktionsproduktet, fraspaltning af beskyttelsesgrupper, etc. Denne opretholdelse kan ske 5 ved at reaktionsmediet indeholder en passende puffer for det valgte pH-område, såsom en bicarbonat-puffer.

Den valgte puffer er dog ikke kritisk for reaktionen, når blot den rigtige pH-værdi opretholdes.

10 pH-værdien kan også opretholdes ved tilsætning af en syre, såsom HC1, eller base, såsom NaOH, under reaktionen.

Reaktionen foretages som nævnt i et vandigt reaktions-15 medium, der dog om ønsket kan indeholde indtil 50$ af et organisk opløsningsmiddel, der er blandbart eller ublandbart med vand. Foretrukne organiske opløsningsmidler er alkanoler, f.eks. methanol og ethanol, glycoler, f.eks. ethylenglycol eller polyethylenglycol, 20 dimethylformamid, dimethylsulfoxid, tetrahydrofuran, dioxan og dimethoxyethan.'

Valget af reaktionsmediets sammensætning afhænger især af reaktionskomponenternes og peptidproduktets opløse-25 lighed, temperatur, pH og enzymets stabilitet.

Reaktionsmediet kan endvidere indeholde en komponent, der gør enzymet uopløseligt, men bevarer en væsentlig del af enzymaktiviteten, såsom en ionbytterharpiks.

30 Alternativt kan enzymet på enhver i og for sig kendt måde være immobiliseret ved binding til en matrix, såsom en tværbunden dextran eller agarose, eller til silica, polyamid, cellulose, eller det kan være indkapslet i polyacrylamid, alginater eller i fibre, jfr. Methods 35 of enzymology, Vol. 44, 1976· Endvidere kan enzymet være kemisk modificeret for at forbedre dets stabilitet eller enzymatiske egenskaber.

15

DK 155613 B

Koncentrationen af de to reaktionsdeltagere kan variere inden for vide grænser, som nærmere forklaret nedenfor.

En foretrukken udgangskoncentration for substratkomponenten er 0,01 - 1 molær og for aminkomponenten 0,05 -5 3 molær.

Enzymkoncentrationen kan ligeledes variere, men ligger -6 -4 fortrinsvis på 10 - 10 molær.

10 Reaktionstemperaturen er ifølge opfindelsen fortrinsvis 20 - 50°C. Den ved en given syntese mest hensigtsmæssige reaktionstemperatur lader sig fastlægge ved forsøg, men afhænger især af den anvendte aminkomponent og det anvendte enzym. En hensigtsmæssig temperatur er 15 i reglen ca. 35 - 45°C, fortrinsvis ca. 35°C. Ved lavere temperatur end 20°C er reaktionstiden som regel uhensigtsmæssig lang, mens man ved temperaturer over 50°C ofte har problemer med enzymets og/eller reaktanternes eller reaktionsprodukternes stabilitet.

20

Lignende variationer kan genfindes for reaktionstiden, der afhænger meget af de øvrige reaktionsparametre, som forklaret nærmere nedenfor. Standardreaktionstiden ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ca. 10 minut-25 ter, men kan dog gå op til nogle få timer.

Det skal tilføjes, at når man anvender et amid eller et substitueret amid som aminkomponent, er det ofte fordelagtigt eller endog nødvendigt at fraspalte amidgruppen 30 specifikt fra det dannede peptidamid for at kunne fortsætte syntesen. Også i denne henseende er carboxypepti-dasen, især CPD-Y, særdeles velegnet, eftersom CPD-Y, som anført ovenfor, udviser araidaseaktivitet ved pH>9, mens dets carboxypeptidaseaktivitet er negligerbar.

På samme måde kan carboxypeptidasen generelt anvendes til 3 3'1 4 at fraspalte grupperne -NR R og -OR som defineret ovenfor' 35

DK 155613 B

16 fra det dannede peptid, hvadenten det ønskes at fortsætte syntesen eller blot at opnå et peptid-slutprodukt, der ikke er C-terminalbeskyttet.

5 Som eksempler på velkendte oligopeptider eller polypep-tider, der kan fremstilles således, kan nævnes enkepha-liner, somatostatin, somatostatin-analoge og peptider med lignende biologiske aktiviteter, og det såkaldte "sove-peptid" (Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu).

10 I visse tilfælde, f.eks. når der er tale om peptider bestående af mere end 5 aminosyrer, kan det være fordelagtigt at syntetisere dele af det ønskede peptid i form af oligopeptidfragmenter, f.eks. pentapeptider, med 15 den ønskede aminosyresekvens og underkaste de fremstillede oligopeptider fragmentkondensation på en hvilken som helst i og for sig kendt måde.

Det kan også være fordelagtigt for at forbedre f.eks.

20 de dannede peptiders opløselighedsegenskaber at anvende arginin eller en anden ioniserbar aminosyre som den N-terminale aminosyre under syntesetrinene, og derpå fraspalte argininet fra peptidet med et specifikt enzym, f.eks. trypsin, når man i øvrigt har opnået den ønskede 25 aminosyresekvens.

Inden fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres ved eksempler, angives nogle generelle redegørelser vedrørende udgangsmaterialer, målemetoder, etc.

30

Udgangsmaterialer

Carboxypeptidase Y fra bagerigær isoleredes ved affini-tetschromatografi efter Johansen et al. (Ref. 6) og 35 opnåedes som et lyophiliseret pulver (10% enzym i natriumcitrat). Før anvendelsen afsaltedes enzymet over "Sephadex

DK 155613 B

17 ® G-25 fine" (1,5 x 25 cm) ækvilibreret og elueret med destilleret vand. Koncentrationen af enzymet bestemtes i* spektrophotometrisk ved ^280 nm = (Ref· 6). En lageropløsning på 7 mg/ml (llO^uM) fremstilledes og 5 lagredes i portioner på 250 - 500^ul ved -21°C. Benzoyl-alanin-methylester var fremstillet af Bachem, Liestal,

Schweiz. Bortrifluoridetheratkomplex (til syntese), opløsningsmidler og reagenser (alle analytisk grad) anskaffedes fra Merck, Darmstadt, BRD. Alle aminosyrer 10 og aminosyreamider og derivater deraf var fra Sigma

Chemical Company, St. Louis, USA. Carbobenzyloxy-phenyl-alanin-methylester (Z-Phe-OME) fremstilledes efter Yamada et al. (Ref. 20) og anvendtes i form af en sirup. Phenyl-alaninhydrazid og alaninhydrazid,hydrochlorid fremstille-15 des ud fra estrene som beskrevet af Losse et al. (Ref.

11). De ukorrigerede smeltepunkter var henholdsvis 86-88°C (Lit.: 82-83°C - (11)) og 182-185°C (Lit.: 184-185°C - (21)). Asparaginamid, dihydrochlorid fremstilledes ud fra asparaginsyre via diethylesteren efter Fischer 20 (Ref. 4) ved klassisk aminolyse (smp.: 210-214:C. Lit.: 214-215:C (19)). De øvrige udgangsmaterialer blev fremstillet analogt.

Bestemmelse af produktudbytter 25

Renheden bestemtes kvalitativt ved TLC på "Silica Gel 60 F254" (Merck)· Det anvendte opløsningsmiddelsystem var CHC13/CH3(CH2)30H/CH3C00H/H20 (11:5:2:1) og pletterne blev gjort synlige ved fluorescens-quenching 30 til vurdering af reaktantsammensætningen.

Reaktantsammensætningerne bestemtes kvantitativt ved reverse-phase HPLC på en "RP-8" lO^um (Merck) kolonne og en Hewlett Packard 1084 Chromatograph forsynet med 35 en UV-detektor med variabel bølgelængde (Model 79875 A). Adskillelsen opnåedes med passende specifikke gradien-

DK 155613B

18 ter af elueringssystemer fra 10 mM-NaAc indeholdende 10* CH^N, pH 4 til 100* CH^CN eller fra 10 mM-NaAc, pH 4 til 100* CH^CN. Det sidste system anvendtes ved forbindelser som Bz-Ala-Gly-OH, Bz-Ala-Ala-OH, Bz-Ala-5 Ser-OH og deres respektive amider, jfr. nedenfor. Gennemløbshastigheden var 3 ml/min., kolonnetemperaturen 47 C og elueringen fulgte ved 260 nm. Udbytterne bestemtes på basis af det molære forhold mellem reaktanterne, der opnåedes fra de integrerede arealer under toppene i 10 elueringsprofilen. Det antoges, at alle reaktanter havde identiske extinktionskoefficienter.

Identifikation af produkterne 15 Pletterne identificeredes ved tyndtlagschromatografi med passende standardforbindelser. Flere af produkterne identificeredes ved en kombination af HPLC og aminosyre-analyse. Til dette formål udtoges 1 ml portioner fra reaktionsblandingen efter 10 min., og reaktionen stand-20 sedes ved tilsætning af 250/Ul 6 M-HC1. pH indstilledes til 4 med NaOH, og blandingen separeredes Ted 'HPLC på et Waters apparat omfattende to pumper, en Model 660 Solvent Programmer, en Model U6K Injector, en Model 450 Variable Wavelength Detector kombineret med en Recorder 25 (Radiometer REC 6l) eller en Hewlett Packard Recorder/Integrator Model 3380 A. Elueringen fulgtes ved scanning ved en passende bølgelængde på 255-280 nm. Chromatogra-fien gennemførtes som reverse-phase over en Waters "C-l8 yU-Bondapak" kolonne med elueringssytemet 30 TEAP-20* (v/v) TEAP (triethylammoniumphosphatpuffer) i methanol under passende gradienter og gennemløbshastigheder på 1,5 - 2,0 ml/min. TEAP-pufferen fremstilledes efter Rivier (Ref. 17). I mange tilfælde gav systemet 0,1 M HAc· pH 3 “ 20* (v/v) 0,1 M HAc, pH 3 i methanol 35 også tilstrækkelig adskillelse.

DK 155613 B

19

Effluenten indeholdende N-acyldipeptiderne opsamledes manuelt og tørredes ved lyophilisering eller på en Biichi Rotovap ved 35-45°C. Små prøver af remanenserne hydrolyseredes i 6 M HC1 ved 110°C i vakuum i 36 timer. De 5 inddampede hydrolysater analyseredes derpå på en Durrum D-500 aminosyre analysator.

Fig. 1 viser produktudbytterne ved syntese af Bz-Ala-Val-OH som funktion af pH, temperatur, udgangs-10 materialekoncentration og enzymkoncentration, jfr. eksempel 1,

Fig. 2 viser reaktionsforløbet ved denne syntese som funktion af tiden, jfr. eksempel 1, 15

Fig. 3 viser analogt reaktionsforløbet ved syntese af Bz-Ala-Met-NH2, jfr. eksempel 3

Fig. 4 viser reaktionsforløbets afhængighed af pH og 20 valinamidkoncentration ved syntese af Bz-Ala-Val- NH^, jfr. eksempel 4, og

Fig. 5 viser reaktionsforløbet ved deamidering af Bz-Ala-Leu-NH2 som funktion af tiden, jfr. eksempel 14.

25 SYNTESE MED FRIE AMINOSYRER SOM AMINKOMPONENT EKSEMPEL 1 30 En opløsning af 2 ml 0,6 M valin-0,1 M KCl-lmM EDTA, pH 9,8 blandedes med lOO^ul (0,1 mmol) af en 1M Bz-Ala-OMe opløsning (opløst i 96% ehtanol). Reaktionen udførtes i en pH-stat ved 35°C og pH 9,8, idet pH-værdien holdtes konstant ved automatisk tilsætning af 0,5 M NaOH. Reak-35 tionen startede ved tilsætning af 0,7 mg carboxypeptidase Y (150 U/mg, fremstillet af De Forenede Bryggerier).

DK 155613 B

20

Efter en reaktionstid på 30 minutter blev reaktionen afbrudt ved indstilling af pH til ca. pH = 1 med 6 M HCl. Reaktionsproduktet rensedes og isoleredes ved hjælp af højtrykskromatografi. Bz-Ala-Val-OH-udbyttet var 5 40%. Kvantitativ aminosyreanalyse efter hydrolyse af produktet i 6 M HCl i 24 timer gav relativt 1,0 mol alanin og 1,0 mol valin.

Virkningen af pH, temperatur og koncentration af sub-10 stråtkomponent, aminkomponent og CPD-Y på udbyttet af ovennævnte reaktion: fpn»v. --

Bz-Ala-OMe + H-Val-OH Bz-Ala-Val-OH + CH3OH /5/ 15 studeredes i frem separate eksperimentserier analogt med ovennævnte fremgangsmåde. Det ene af de nedenfor anførte parametre varieredes i hvert forsøg, mens de fire andre holdtes konstant: 0,6 M valin, 55 mM Bz-Ala-OMe, 4,5yuM CPD-Y, pH 9,7, 35°C. Resultaterne er vist 20 i fig. 1. Det fremgår af fig. 1A, at pH-intervallet for optimalt udbytte er temmelig snævert, idet det kun strækker sig over 0,5 pH enheder. Det fremgår af fig.

IB, at en forøgelse af reaktionstemperaturen forårsagede en næsten lineær forøgelse af syntesen på grund af rela-25 tivt mindre hydrolyse. Ved temperaturer over 45°C blev enzyminaktivering og ikke-enzymatisk esterhydrolyse prohibitiv. Ved lavere temperaturer og pH-værdier op til 10,0 blev esterhydrolysen ubetydelig inden for standard-reaktionstiden på 10 minutter. Den blev imidlertid 30 signifikant, når den enzymatiske reaktionshastighed blev hæmmet og krævede reaktionstider på op til 2 -5 timer.

Mens udbytterne af Bz-Ala-Val-OH steg ved højere amin-35 komponentkoncentration (fig. ID), var det modsatte tilfældet for forholdet mellem udbytte og koncentration

DK 155613 B

21 for substratkomponenten Bz-Ala-OMe (fig. 1C). Denne iagttaggelse antyder sammeholdt med afhængigheden mellem udbytte og høj enzymkoncentration (fig. lEj et optimalt forhold mellem substrat- og enzymkoncentrationerne.

5

Tidsforløbet for en typisk reaktion illustreret ved hjælp af ovennævnte reaktion under betingelser, der ligger tæt på at være optimale, er illustreret i fig.

2. I nærværelse af 0,5 M valin blev Bz-Ala-OMe-substra-10 tet hurtigt omdannet (indenfor 20 minutter) til 38% Bz-Ala-Val-OH og 62% Bz-Ala-OH. Figuren viser også, at dipeptidet ikke hydrolyseredes ved pH 9,7 i nærværelse af overskud af valin. Hvis pH imidlertid blev indstillet til 5-8, blev alt Bz-Ala-Val-OH hydrolyseret i løbet 15 af få sekunder. Denne selektive opførsel for CPD-Y ved høj pH er en vigtig egenskab for dens anvendelighed i peptidsynteser.

EKSEMPEL 2 20

En opløsning af 2 ml 3 M lysin - 0,1 M KC1 - 1 mM EDTA, pH 9,8 blandedes med 400^ul 100% methanol og lOO^ul (0,1 mmol) 1 M Z-Phe-OMe (opløst i 100% methanol). Reaktionen udførtes som beskrevet i eksempel 1 og blev star-25 tet ved tilsætning af 0,7 mg carboxypeptidase Y. Efter en reaktionstid på 30 minutter indstilledes pH til 1 med 6 M HC1. Reaktionsproduktet rensedes og isoleredes ved hjælp af højtrykskromatografi. Z-Phe-Lys-OH-udbyttet var 60%. Kvantitativ aminosyreanalyse, som beskrevet 30 i eksempel 1, viste, at produktet relativt indeholdt 1,0 mol lysin og 1,0 mol phenylalanin.

Analogt med eksemplerne 1 og 2 fremstilledes de i tabel I angivne peptider ud fra de angivne udgangsmaterialer.

35 Eksperimenterne udførtes i en Radiometer pH-stat, og udbytterne bestemtes ved HPLC (jfr. ovenfor). Betingelserne var 4,5^uM CPD-Y; pH 9,7 og 35°C.

Tabel I

22

DK 155613 B

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider med frie aminosyrer som aminkomponent.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Ala-OMe Glycin (3,0 M) Bz-Ala-Gly-OH 62 (55 mM) Alanin (1}9 M) Bz-Ala-Ala-OH 65

Valin (0,6 M) Bz-Ala-Val-OH 40 (Eks. 1)

Leucin (0,17 M) Bz-Ala-Leu-OH 24

Phenylalanin (0,16 M) Bz-Ala-Phe-OH 27

Serin (3,2 M) Bz-Ala-Ser-OH 50

Threonin (0,7 M) Bz-Ala-Thr-OH 24

Methionin (0,6 M) Bz-Ala-Met-OH 46

Lysin (1,5 M) Bz-Ala-Lys-OH 56

Arginin (0,8 M) Bz-Ala-Arg-OH 26

Asparaginsyre (1,0 M) Bz-Ala-Asp-OH 0

Asparagin (0,6 M) Bz-Ala-Asn-OH 5

Glutaminsyre (1,2 M) Bz-Ala-Glu-OH 0

Glutaminsyre-1'’’-methyl·· Bz-Ala- ester (1,0 M) Glu(OMe)-OH 30 „ Bz-Ala-OMe Isoleucin (0,15 M) Bz-Ala-Ile-OH 40 (50 mm) Glutamin (0,5 M) Bz-Ala-Glu-OH 20

Asparaginsyre-tert- Bz-Ala-Asp^Bu)-butylester (0,5 M) OH 30

Tryptophan (0,05 M) Bz-Ala-Trp-OH 10

Histidin (1,0 M) Bz-Ala-His-OH 15 Z-Phe-OMe Valin (0,6 M) Z-Phe-Val-OH 6 (55 mM) LySin (^)0 M) Z-Phe-Lys-OH 60 (Eks. 2)

Bz-Phe-Gly- Valin (0,6 M) Bz-Phe-Gly- OMe (30 mM) Val-OH 40 Z-Ala-OMe Glycin (2,0 M) Z-Ala-Gly-OH 30 (10 mM) Alanin (0,7 M) Z-Ala-Ala-OH 60

Leucin (0,15 M) Z-Ala-Leu-OH 21

Lysin (1,5 M) Z-Ala-Lys-OH 60

Tabel I (fortsat) 23

DK 155613 B

Substrat Aminkoraponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Gly-OMe Glycin (2,0 M) Bz-Gly-Gly-OH 63 (20 mM) Leucin (0,15 M) Bz-Gly-Leu-OH 21

Bz-Tyr-OEt Valin (0,6 M) Bz-Tyr-Val-OH 30 (25 mM) Alanin (1,9 M) Bz-Tyr-Ala-OH 46

Arginin (0,8 M) Bz-Tyr-Arg-OH 35

Ac-Phe-OEt Alanin (0,8 M) Ac-Phe-Ala-OH 85 (50 mM) Z-Ala-Ala- Glycin (2,0 M) Z-Ala-Ala- 40

OMe Gly-OH

(10 mM) Leucin (0,15 M) Z-Ala-Ala- 0

Leu-OH

Phenylalanin (0,15 M) Z-Ala-Ala- 0

Phe-OH

Z-Ala-Phe- Glycin (2,0 M) Z-Ala-Phe- 35

OMe Gly-OH

(10 mM) Leucin (0,15 M) Z-Ala-Phe- 0

Leu-OH

Z-Ala-Ser- Leucin (0,15 M) Z-Ala-Ser- 40

OMe Leu-OH

(10 mM)_ Z-Ala-Val- Leucin (0,15 M) Z-Ala-Val- 25

OMe Leu-OH

(10 mM) Lysin (1,5 M) Z-Ala-Val- 60

Lys-OH

Z-Ala-NLeu- Glycin (2,0 M) Z-Ala-NLeu- 60

OMe Gly-OH

(10 mM) Leucin (0,15 M) Z-Ala-NLeu- 16

Leu-OH

Z-Ala-Met- Glycin (2,0 M) Z-Ala-Met- 50

OMe Gly-OH

(10 mM) Leucin (0,15 M) Z-Ala-Met- 15

Leu-OH

Z-Ala-Trp- Glycin (2,0 M) Z-Ala-Trp- 23

OMe Gly-OH

(10 mM) Leucin (0,15 M) Z-Ala-Trp- 3

Leu-OH

Tabel I (fortsat) 24

DK 155613 B

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) % Z-Ala-Trp- Phenylalanin (0,15 M) Z-Ala-Trp- 0

OMe Phe-OH

(10 mM) Lysin (1,5 M) Z-Ala-Trp- 36

Lys-OH

Z-Ala-Ala- Leucin (0,15 M) Z-Ala-Ala- 0

Tyr-OMe Tyr-Leu-OH

(10 mM) Lysin (1,5 M) Z-Ala-Ala- 23

Tyr-Lys-OH

Alanin (1,7 I) ' Z-Ala-Ala- 31

Tyr-Ala-OH

DK 155613 B

25 SYNTESE MED AMINOSYREAMIDER SOM AMINKOMPONENT EKSEMPEL 3 5 En opløsning af 2 ml 0,6 M methioninamid (Met-NH2) - 0,1 M KC1 - 1 mM EDTA, pH 9,8, blandedes med 100/Ul (0,1 mmol) af en 1 M Bz-Ala-OMe-opløsning i 96$ methanol. Reaktionen udførtes som beskrevet i eksempel 1 og startedesved tilsætning af 0,7 mg carboxy-10 peptidase-Y. Efter en reaktionstid på 30 minutter indstilledes pH til 1 med 6 M HC1. Reaktionsproduktet rensedes og isoleredes ved hjælp af højtrykskromatografi. Bz-Ala-Met-NH2“Udbyttet var 95$. Kvantitativ aminosyreanalyse som beskrevet i eksempel 1 15 viste, at produktet relativt indeholdt 1,0 mol Ala, 1,0 mol Met og 1,0 mol NH^.

Reaktionsforløbet er vist i fig. 3, hvoraf det fremgår, at substratet omdannes næsten fuldstændigt i løbet af 20 20 minutter til ca. 95$ dipeptid, mens 5$ hydrolyseres til Bz-Ala-OH.

EKSEMPEL 4 25 En opløsning af 2 ml 0,4 M valinamid (Val-NH2) - 0. 1 M KC1 - 1 mM EDTA, pH 9,5 blandedes med lOO^ul (0,1 mmol) af en 1 M Bz-Ala-OMe-opløsning i 96$ ethanol. Reaktionen udførtes som beskrevet i eksempel 1. Reaktionsproduktet Bz-Ala-Val-NH2 bundfældede i 30 løbet af reaktionen. Efter 20 minutters reaktion indstilledes pH til 1, og bundfaldet isoleredes ved centrifugering. Produktet opløstes i 1 ml 96$ ethanol og rensedes og isoleredes ved højtrykskromatografi.

Udbyttet af Bz-Ala-Val-NH2 var 95$, mens det, som vist 35 i eksempel 1, kun var 40$, når den frie syre anvendtes som aminkomponent. Kvantitativ aminosyreanalyse,

DK 155613 B

26 som beskrevet i eksempel 1, viste at produktet relativt indeholdt 1,0 mol Ala, 1,0 mol Yal og 1,0 mol NH,.

o 5 Reaktionsforløbets afhængighed af pH og valinamid-koncentrationen er vist i fig. 4. Reaktionen udførtes analogt med den ovenfor angivne syntese, idet de konstante parametre var: Valinamid 0,6 M, Bz-Ala-OMe 55 mM, CPD-Y 4,5/uM, pH 9,7, 35°C.

10

Det ses af fig. 4B, at udbyttet er i det væsentlige upåvirket af forandringen i valinamidkoncentratio-nen i modsætning til fig. ID, der viser udbyttet ved varierende valinkoncentration, i det mindste ved en kon-15 centration, der er lig med eller højere end substrat-koncentrationen (55 mM).

Det ses af fig. 4A, at det effektive pH-interval for valinamid strækker sig ned til 9,0, idet der er en 20 skarp øvre grænse ved pH 9,8, over hvilken udbyttet falder kraftigt.

Analogt med eksemplerne 3 og 4 fremstilledes de i tabel II angivne peptider ud fra de angivne udgangsmaterialer.

25 Forsøgene udførtes under følgende betingelser: 4,5/uM CPD-Yj pH 9,6 og 35°C, mens substratkoncentrationen er angivet i tabellen.

Tabel II

27

DK 155613 B

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider med aminosyreamider som aminkomponent.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Ala-OMe Glycin-amid (0,3 M) Bz-Ala-Gly-NH2 90 (55 mM) Serin-amid (0,3 M) Bz-Ala-Ser-NH2 90

Yalin-amid (0,4 M) Bz-Ala-Val-NH9 951 (Eks. 4)

Leucin-amid (0,3 M) Bz-Ala-Leu-NH2 85

Methionin-amid (0,6 M) Bz-Ala-Met-NH? 95 (Eks. 3)

Phenylalanin-amid Bz-Ala-Phe-NHp 90b^ (0,3 M)

Tyrosin-amid (0,6 M) Bz-Ala-Tyr-NH2 90

Asparagin-amid (0,3 M) Bz-Ala-Asn-NH2 80

Prolin-amid (0,3 M) Bz-Ala-Pro-NH2 0

Glutaminsyre-amid Bz-Ala-Glu-NHp 0 (0,25 M)

Histidin-amid (0,2 M) Bz-Ala-His-NH2 89

Threonin-amid (0,2 M) Bz-Ala-Thr-NH2 88 Z-Phe-OMe Valin-amid (0,5 M) Z-Phe-Val-NH2 971 (55 mM) Serin-amid (0,4 M) Z-Phe-Ser-NH2 60

Tyrosin-amid (0,4 M) Z-Phe-Tyr-NH2 64

Bz-Phe-Gly- Valin-amid (0,4 M) Bz-Phe-Gly-Val- 90 OMe (30 mM) NH2 Z-Phe-Ala- Valin-amid (0,4 M) Z-Phe-Ala-Val- 9 0b^ OMe NH2 (20 mM) Glycin-amid (0,4 M) Z-Phe-Ala-Gly 95 nh2

Histidin-amid (0,4 M) Z-Phe-Ala-His- 50 nh2

Produktet udfældedes

Tabel II (fortsat) 28

DK 155613 B

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) % Z-Leu-Gly- Valin-amid (0,4 M) Z-Leu-Gly-Gly- 80

Gly-OEt Val-NHC

_(10. niM)_£_

Bz-Tyr-OEt Valin-amid (0,25 M) Bz-Tyr-Val-NH2 94 (50 mM) Glycin-amid (0,55 M) Bz-Tyr-Gly-NH2 82 Z-Ala-OMe Leucin-amid (0,15 M) Z-Ala-Leu-NH2 90 (10 mM) Glycin-amid (0,15 M) Z-Ala-Gly-NH2 20

Bz-Arg-OEt Tyrosin-amid (0,2 M) Bz-Arg-Tyr-NH2 52 (75 mM)

Bz-Tyr-0Et Valin-amid (0,25 M) Bz-Tyr-Val-NH2 94 (50 mM) Glycin-amid (0,55 M) Bz-Tyr-Gly-NH2 82 Z-Pro-OMe Leucin-amid (0,25 M) Z-Pro-Leu-NHp 0 (50 mM)

Bz-Gly-OMe Histidin-amid (0,2 M) Bz-Gly-His-NH2 20 (100 mM) Glycin-amid (0,55 M) Bz-Gly-Gly-NHp 95

Leucin-amid (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NH2 95 Z-Ala-Phe- Leucin-amid (0,15 M) Z-Ala-Phe-Leu- 95 OMe NH2 (10 mM) Glycin-amid (0,15 M) Z-Ala-Phe-Gly- 84 nh2 Z-Ala-Ala- Glycin-amid (0,15 M) Z-Ala-Ala-Gly- 100 OMe NH2 (10 mM) Leucin-amid (0,15 M) Z-Ala-Ala-Leu- 100 nh2 Z-Ala-Ser- Leucin-amid (0,15 M) Z-Ala-Ser-Leu- 95 OMe NH2 (10 mM) Glycin-amid (0,15 M) Z-Ala-Ser-Gly- 70 nh2 Z-Ala-Val- Leucin-amid (0,15 M) Z-Ala-Val-Leu- 84 OMe NH2 (10 mM) Glycin-amid (0,15 M) Z-Ala-Val-Gly- 100 nh2

Tabel II (fortsat) : 29

DK 155613 B

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) % Z-Ala-NLeu- Leucin-amid (0,15 M) Z-Ala-NLeu- 100 OMe Leu-NH2 (10 mM) Glycin-amid (0,15 M) Z-Ala-NLeu- 100

Gly-NH2 Z-Ala-Met- Glycin-amid (0,15 M) Z-Ala-Met-Gly- 95 OMe NH2 (10 mM)_ Z-Ala-Trp- Glycin-amid (0,15 M) Z-Ala-Trp-Gly- 84 OMe NH2 (10 mM) Leucin-amid (0,15 M) Z-Ala-Trp-Leu- 89 nh2 Z-Thr-Pro- Valin-amid (0,2 M) Z-Thr-Pro-Val- 95 OMe NH2 (25 mM)_ Z-Ala-Ala- Glycin-amid (0,15 M) Z-Ala-Ala-Tyr- 100 '

Tyr-OMe Gly-NH2 (10 mM) Leucin-amid (0,15 M) Z-Ala-Ala-Tyr- 100

Leu-NH2 Z-Tyr-Gly- Phenylalanin-amid Z-Tyr-Gly-Gly- 40

Gly-OMe (0,2 M) Phe-NHp (20 mM)___

DK 155613 B

• 30 SYNTESE MED AMINOSYREHYDRAZIDER SOM AMINKOMPONENT EKSEMPEL 5 5 Analogt med eksempel 3 og 4 fremstilledes de i tabel III angivne peptider ud fra de angivne udgangsmaterialer. Forsøgene udførtes under følgende betingelser: 4,5/UM CPD-Y, pH 9,6 og 35°C.

10 Tabel III

Carboxypeptidase-Y catalyseret syntese af peptider med aminosyrehydrazider som aminkomponent.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte .15 (kone.) (koncentration) %

Bz-Ala-OMe Alanin-hydrazid Bz-Ala-Ala-NH- 37 (55 mM) (0’6 M) **2

Phenylalanin- Bz-Ala-Phe-NH- 80 hydrazid (0,3 M) NH2 20 SYNTESE MED AMINOSYREESTERE SOM AMINKOMPONENT EKSEMPEL 6 ' 25 Forsøgene med aminosyreestere udførtes analogt med eksempel 1, 2, 3 og 4 i en Radiometer pH-stat ved pH 9,0 - 9,7 og 23 - 35°C. Produkter og udbytter bestemtes ved HPLC. CPD-Y koncentrationen var fra 4,5 til 11/UM.

30

Tabel IV angiver peptiderne, der er fremstillet ud fra de angivne udgangsmaterialer.

Det ses, at der i nogle tilfælde opnås en vis oligome-35 risering. Da udbytterne sædvanligvis er meget høje, ser det ud til, at aminosyreesterene er særdeles vel- ' 31

DK 155613B

egnede, hvis oligomeriseringen kan begrænses yderligere .

Tabel IV

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider med aminosyreestere som aminkomponent.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Ala-OMe Glycin-ethylester (Bz-Ala-Gly-OH*^ 100 (50 mM) )Bz-Ala-Gly- f

(Gly-OH J

Glycin-propylester Bz-Ala-Gly-OH 85 (0,5 M)

Glycin-isopropyl- Bz-Ala-Gly-OH 90 ester (0,5 M)

Glycin-butylester Bz-Ala-Gly-OH 80 (0,5 M) rBz-Ala-Leu-OH ^

Bz-Ala-Leu-Leu-Leucin-methylester OH

^0’25 SBz-Ala-Leu-Leu-i 85

Leu-OH

Bz-Ala-Leu-Leu-\Leu-Leu-OH >

Leucin-ethylester fBz-Ala-Leu-OH

(0>25M) |Bz-Ala-Leu-Leu-[

OH J

Leucin-t-butyl- Bz-Ala—Leu-OH 0 ester (0,25 M) rBz-Ala-Phe-OH ^

Phenylalanin-ethyl- Bz-Ala-Phe-Phe- i. 80

ester (0,25 M) OH

Bz-Ala-Phe-Phe-Phe-OH J

Tabel IV (fortsat) 32

DK 155613 B

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Ala-OMe Phenylalanin-ethyl- ^Bz-Ala-Phe-OH*) (50 mM) ester (0,15 M 1B2-Ala-Phe- f 70

jphe-OH J

Glutaminsyre- Bz-Ala-Glu (tf-t-Bu)-methyl- (tf-t-Bu)-OH 35 ester (0,5 M)

Glutaminsyre (tf-t-Bu)- Bz-Ala-Glu 0

t-butylester (0,25 M) ('i-t-Bu)-OH

/Bz-Ala-Met-OH ^

Bz-Ala-Met-Met-OH I

Bz-Ala-Met-

Methionin-methyl- jMet-Met-OH γ 86 ester (0,2 M) jBz-Ala-Met-

/Met-Met-Met-OH

Bz-Ala-Met-Met-Met-Met-, Met-OH J

Methionin-ethyl- Bz-Ala-Met-OH 40 ester (0,2 M)

Methionin-isopropyl- Bz-Ala-Met-OH 8 ester (0,2 M)

Valin-methylester /Bz-Ala-Val-OH") <0·7« ]Bz-Ala-Val- 85

(Val-OH J

Serin-methylester Bz-Ala-Ser-OH 50 (0,5 M)

Tyrosin-methyl- Bz-Ala-Tyr-OH 25 ester (0,5 M)

Arginin-methyl- Bz-Ala-Arg-OH 0 ester (0,5 M)

Arginin (NO?)-methyl- Bz-Ala-Arg(NOp)- 40

ester (0,5 M) OH

Histidin-methyl- Bz-Ala-His-OH 26 ester (0,5 M)

Threonin-methyl- Bz-Ala-Thr-OH 47 ester (0,5 M)

Tabel IV (fortsat) 33

DK 155613 B

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Ac-Phe-OEt Alanin-methylester TAc-Phe-Ala-OH*) (50 mM) (0,5 M) Kc-Phe-Ala- ) 60

Ala-OH J

Bz-Gly-OMe Histidin-methyl- Bz-Gly-His-OH 40 (50 mM) ester (0,5 M) EKSEMPEL 7 L- og D-stereoisomere af amiricompQnentén

Analogt med eksemplerne 1, 2, 3} 4 og 6 fremstilledes de i tabel V angivne peptider ud fra de angivne ud-5 gangsmaterialer.

Det ses, at kun L-isomerene inkorporeredes. Dette er et meget interessant træk set ud fra et procesøkonomisk synspunkt, da det som følge heraf ikke er nødvendigt 10 at rense udgangsaminosyrerne med henblik på at opnå den rene L-isomer.

Tabel V

34

DK 155613 B

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider med L- og D-isomere af aminkomponenten.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte %_ (kone.) (koncentration) L-isomer D-isomer

Bz-Ala-OMe Valin (0,6 M) Bz-Ala-Val- 42 0

(50 mM) OH

A-lanin (1,8 M) Bz-Ala-Ala- 65 0

OH

Bz-Tyr-OEt Valin (0,6 M) Bz-Tyr-Val 30 0

(30 mM) OH

Alanin (1,8 M) Bz-Tyr-Ala- 46 0

OH

Bz-Ala-OMe Val-NH? (0,25 M) Bz-Ala-Val- 78 0 (50 mM) NH2

Bz-Tyr-OEt Val-NHp (0,25 M) Bz-Tyr-Val- 95 0 (30 mM) NH2

Ac-Phe-OEt Ala-OMe (0,5 M) (Ac-Phe-Ala- )

(50 mM) OH I

/Ac-Phe- i 60 0

(Ala)2-OH J

DK 155613B

EKSEMPEL 8 35

Variation af substrat-estergruppen 5 Analogt med eksemplerne 1, 2, 3 og 4 fremstilledes de i tabel VI angivne peptider ud fra de angivne udgangsmaterialer .

Resultaterne beviser fremgangsmådens fleksibilitet 10 med hensyn til anvendelige substrater.

Tabel VI

Udbytte (%) af earboxypeptidase-Y katalyseret syntese 15 af peptider med forskellige estergrupper på substratkomponenten.

.Substrat

Amirr^\^ Bz-Gly-OMe Bz-Gly-OEb Bz-Gly-OiEr Bz-Gly-OBzl komponent"'' (20 iriM) (20 mM) (20 mM) (20 mM)

Glycin 63 56 45 47 (2,0 M)

Glyein-amid 59 95 88 91 (0,15 M)

Leucin 21 59 74 80 (0,15 M)

Leucin-amid 95 100 95 95 (0,15 M) EKSEMPEL 9 -36

DK 155613B

Depsipeptider som substrater

Analogt med eksemplerne 3 og b fremstilledes de i tabel 5 VII anførte peptider ud fra de angivne udgangsmaterialer. Betingelserne var 4,5/UM CPD-Y, pH = 7,6 og 25°C.

Det ses, at der opnås meget høje udbytter.

10 Tabel VII

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider med depsipeptider som substratkomponenter.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Gly-OGly Glycin-amid (0,25 M) Bz-Gly-Gly-NH2 90 (20 mM) Leucin-amid (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NH2 95

Phenylalanin-amid Bz-Gly-Phe-NH2 95 (0,25 M)

Bz-Gly-OPhe Glycin-amid (0,25 M) Bz-Gly-Gly-NH2 95 (20 mM) Leucin-amid (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NH2 95

Phenylalanin-amid Bz-Gly-Phe-NHp 95 (0,25 M)

Bz-Phe-OGly Glycin-amid (0,25 M) Bz-Phe-Gly-NH2 90 (20 mM) Leucin-amid (0,25 M) Bz-Phe-Leu-NH2 80

Phenylalanin-amid Bz-Phe-Phe-NHp 80 _(0,25 m)_:_

Bz-Gly-OAla Glycin-amid (0,25 M) Bz-Gly-Gly-NH2 95 (20 mM) Leucin-amid (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NH2 95 37 EKSEMPEL 10

Peptider som substratkomponenter 5 Analogt med eksemplerne 1, 2, 3 og 4 fremstilledes de i tabel VIII angivne peptider. Eksperimenterne udførtes i en Radiometer pH-stat og udbytterne bestemtes ved HPLC. Betingelserne var 4-25^uM CPD-Y, pH = 1,6 og 25°C.

10

Tabel VIII

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider med peptider som substrater.

15

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Phe-Gly Leucin-amid (0,25 M) Bz-Phe-Leu-NHp 90 (20 mM)

Bz-Gly-Phe Leucin-amid (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NHp 10 (20 mM) Z-Ala-Ala Leucin-amid (0,25 M) Z-Ala-Leu-NHp 7^ (20 mM) Z-Phe-Ala Leucin-amid (0,25 M) Z-Phe-Leu-NHp 60 (20 mM) Z-Phe-Ser Leucin-amid (0,25 M) Z-Phe-Leu-NHp 70 (20 mM) d Z-Ala-Gly Leucin-amid (0,25 M) Z-Ala-Leu-NHp 80 (10 mM) z

Ac-(Ala)^ Leucin-amid (0,25 M) Ac-(Ala)--Leu-NH0 70 (10 mM)J z z

Ac-(Ala). Leucin-amid (0,25 M) Ac-(Ala)--Leu-NH0 70 (10 mM)4 J z Z-Ala-Val Leucin-amid (0,25 M) Z-Ala-Leu-NHP 10 (10 mM) z Z-Phe-Phe Leucin-amid (0,25 M) Z-Phe-Leu-NH, 10 (10 mM) z

DK 155613 B

38

Peptidsyntese som funktion af pH

I tilfælde, hvor det syntetiserede peptid er et dårligt substrat for CPD-Y, kan syntesen gennemføres ved 5 pH-værdier under de foretrukne 9 - 10,5· <> EKSEMPEL 11

Analogt med eksemplerne 1 og 3 fremstilledes de i 10 tabel IX anførte peptider i en pH-stat ved de angivne pH-værdier.

Betingelserne var 15/UM CPD-Y og 25°C.

15 Tabel IX

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider som funktion af pH.

Substrat Aminkomponent Produkt pH Udbytte % (kone.) (koncentration)

Bz-Ala-OMe Glycin (1,3 M) Bz-Ala-Gly 9,5 40 9.0 57 8.0 60 7,0 61 6,0 60 _5,0 51

Glycin-amid Bz-Ala-Gly- 9,5 77 (1,3 M) NH2 9jQ 95 8,0 100 7.0 97 6.0 44 39

DK 155613B

Forskellige andre aminkomponenter EKSEMPEL 12 5 Analogt med eksemplerne 3 og 4 fremstilledes de i tabel X angivne peptider. Eksperimenterne udførtes i en pH-stat, og udbytterne bestemtes ved HPLC.

Betingelserne var 4,5/UM CPD-Y, pH 935 og 25°C.

10 Tabel X

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider med forskellige aminosyrederivater som aminkomponenter .

15

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Ala-OMe β-alanin-amid (0,2 M) Bz-Ala-BAla- 80 (50 mM) NH2

Glycin-hydroxam- Bz-Ala-Gly- syre (0,25M) NH-OH 75 D^L-alanin-hydroxam- Bz-Ala-Ala- syre (0325M) NH-OH 50

Glycin-N-methylamid Bz-Ala-Gly- (0,50 M) NH-CH3 20

DK 155613B

EKSEMPEL 13 40

Syntese af peptider med carboxypeptidaser fra byg 5 Spirende byg, f.eks. i form af malt, indeholder to forskellige peptidaser, der betegnes CP-1-1 og CP-2-1 (se Lee E. Ray, Carlsberg Res. Comm. 4l, 169-182 (1976)).

10 CP-1-1 og CP-2-1 isoleredes som beskrevet af L.E. Ray, og de i tabel XI anførte peptider fremstilledes analogt med eksemplerne 1, 2, 3 og 4 ud fra de angivne udgangsmaterialer. Betingelserne var 6^uM CP-1-1 eller CP-2-1, pH 8,0 og 25°C.

15

Tabel XI

Syntese af peptider under anvendelse af carboxypeptidaser fra spirende byg CP-1-1 og CP-2-1.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte Enzym (kone.) (koncentration) %

Bs-Ala-OMe Yalinamid Bz-Ala-Val- 43 CP-1-1 (50 mM) (0,25 M) NH2

Alaninamid Bz-Ala-Ala- 58 CP-1-1 (0,25 M) NH2

Lysin (1,7 M) Bz-Ala-Lys 11 CP-1-1

Valinamid Bz-Ala-Val- 57 CP-2-1 (0,25 M NH2

Alaninamid Bz-Ala-Ala- 64 CP-2-1 (0,25 M) NH2

Lysin (1,7 M) Bz-Ala-Lys 11 CP-2-1

DK 155613B

41 EKSEMPEL 14

Carboxypeptidase-Y katalyseret deamidering af peptid-amider 5

Til en opløsning af 2 ml 15 mM Bz-Ala-Leu-NH2 i 0,1 M KC1 - 1 mM EDTA, pH 9,1, 25°C og 10% dimethylformamid sattes 2 mg CPD-Y. Reaktionsforløbet som vist i fig. 5 efterfulgtes af HPLC som beskrevet i eksempel 1. Det 10 ses, at Bz-Ala-Leu-NH2 efter 20 minutters forløb var fuldstændig omdannet til ca. 68% Bz-Ala-Leu-OH og 32% Bz-Ala-OH. Aminosyreanalyse udført på reaktionsproduktet viste, at Bz-Ala-OH hovedsagelig blev dannet ved spaltning af Leu-NH2 fra Bz-Ala-Leu-NH2.

15 EKSEMPEL 15

Sammenligning af peptidestersubstrater med og uden N-terminal-beskyttende grupper 20

Analogt med eksemplerne 3 og 4 fremstilledes de i tabel XII angivne peptider under følgende betingelser: 50 mM substrat, 5/UM CPD-Y, pH 9,5 og 25°C.

25 Tabel XII

Sammenligning af carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider under anvendelse af peptidestere med og uden N-terminal-beskyttende grupper som substrat.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Ac-Ala-Ala- Leucinamid (0,15 M) Ac-Ala-Ala- 90

Ala-OMe Ala-Leu-NH? (50 mM)

Ala-Ala- Leucinamid (0,15 M) Ala-Ala-Ala- 75

Ala-OMe Leu-NH? (50 mM) EKSEMPEL 16 42

DK 155613B

Syntese i nærværelse af organiske opløsningsmidler 5 Analogt med eksemplerne 1, 2, 3} ^ og 6 fremstilledes de i tabellerne XIII, XIV og XV nedenfor angivne peptider ud fra de angivne udgangsmaterialer og med de angivne koncentrationer af organiske opløsningsmidler.

10

Betingelserne var: 50 mM substrat, 5/UM CPD-Y, pH

9,6 og 30°C.

Tabel XIII

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider med 50 mM Bz-Ala-OMe som substrat og frie aminosyrer som aminkomponent med og uden 20$ methanol (MeOH) i 0,1 M KC1, 1 mM EDTA.

Aminkomponent Produkt -Udbytte_%-

(koncentration) uden MeOH med MeOH

Valin (0,6 M) Bz-Ala-Val-OH 42 53

Threonin (1,2 M) Bz-Ala-Thr-OH 52 6l

Phenylalanin Bz-Ala-Phe-OH 16 18 (0,16 M)

Leucin (0,l6 M) Bz-Ala-Leu-OH 33 39

Methionin (0,6 M) Bz-Ala-Met-OH 42 64

Glycin (3,0 M) Bz-Ala-Gly-OH 55 50

Serin (3,2 M) Bz-Ala-Ser-OH 50 52

Lysin (1,5 M) Bz-Ala-Lys-OH 53 4l

Glutaminsyre ^-t- Bz-AlarGlu 54 55

butylester (1,0 M) (V-OBu )-0H

Asparagin (0,6 M) Bz-Ala-Asn-OH 18 14

Tabel XIY

43

DK 155613B

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af Bz-Ala-Thr-OH ud fra Bz-Ala-OMe (50 mM) og threonin med varierende koncentrationer af polyethylenglycol-300 (PEG-300). Betingelser: CPD-Y l^uM, pH 9,6 og 25°C.

% PEG-300 i Threonin- % udbytte af

0,1 M KC1 koncentration Bz-Ala-Thr-OH

0 0,7 M 36 10 0,7 M 34 20 0,7 M 31 30 0,7 M 29 40 0,35 M 28

Tabel XV

Carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider ud fra 50 mM Bz-Ala-OMe og de angivne aminosyreestere som aminkomponent i 30$ polyethylenglycol-0,1 M KC1, 1 mM EDTA. De andre betingelser var: CPD-Y = 8^uM, pH 9,6 og 25°C.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Ala-OMe Valin-OMe (0,5 M) Bz-Ala-Val-OH 1 88

Bz-Ala-Val- (

Val-OH D

Serin-OMe (0,5 M) Bz-Ala-Ser-OH 30

Glutaminsyre (^-OBu^) Bz-AlarGlu- 38

-OMe (0,5 M) (V-0Bur)-0H

Phenylalanin-OMe Γβζ-Ala-Phe-OH Ί 82 (0,5 M) ^ 1 Bz-Ala-Phe-

Phe-OH

V ^

Tabel XV (fortsat) 44

DK 155613B

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Ala-OMe /*Bz-Ala-Met-OH Λ (50 mM) L-Methionin-OMe \ _ M . / 0_ (n c μ) Bz-Ala-Met- / 85 AMet-OH y

iBz-Ala-Met-(Met-Met-OH J

D-Methionin-OMe Bz-Ala-D-Met-OH 0 '(0,5 M) EKSEMPEL 17

Uopløselig (immobiliseret) carboxypeptidase-Y

5 CPD-Y blev bundet til Concanavalin A-Sepharose 4B (Pharmacia Pine Chemicals) efterfulgt af tværbinding mellem CPD-Y og Concanavalin A med glutaraldehyd som beskrevet af Hsiao og Royer (Archives og Biochemistry and Biophysics, Vol. 198, 379-385 (1979)) CPD-Y kon-10 centration var 3 mg pr. ml pakket Sepharose.

Analogt med eksemplerne 1 og 3 fremstilledes de i tabel XVI angivne peptider under anvendelse af følgende betingelser: 50 mM substrat, 0,25 ml CPD-Y gel (5/UM 15 CPD-Y), pH 9,7 og 35°C. Efter fjernelse af enzymet ved filtrering bestemtes produkterne og udbytterne ved HPLC.

20 25

Tabel XVI

45

DK 155613B

Uopløselig carboxypeptidase-Y katalyseret syntese af peptider.

Substrat Aminkomponent Produkt Udbytte (kone.) (koncentration) %

Bz-Ala-OMe Phenylalanin (0,15 M) Bz-Ala-Phe 21 (50 mM) Leucinamid (0,2 M) Bz-Ala-Leu-NH^ 91 EKSEMPEL 18

Peptid amider som substrater 5 En opløsning af 5 mm Bz-Ala-Leu-NE^ i 0,1 M KC1 - 1 mm EDTA og 10% dimethylformamid pH 10,0, 25°C blandedes med 0,25 M valinamid.

Reaktionen igangsattes ved tilsætning af 40yUm CPD-Y 10 og gennemførtes analogt med eksempel 3 og 4. Bz-Ala-Leu-Val-NH2 isoleredes ved HPLC i et udbytte på 65%.

Reaktionen gentoges med 5 mm Bz-Ala-Phe-NH2 som substratkomponent. Bz-Ala-Phe-Val-NH2 isoleredes ved HPLC i et 15 udbytte på 44%.

20 25

DK 155613B

EKSEMPEL 19 46

Syntese af met-enkephalin 5 Den trinvise syntese af met-enkephalin startende med 5 g Bz-Arg-OEt og med anvendelse af CPD-Y som katalysator er illustreret i følgende skema (udbytte-% i parentes).

Bz-Arg-OEt II-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (95%) pH 9.6 CPD-Y pH 8.0 Trypsin H-Tyr-NH2

Bz-Arg-Tyr-NH-, (85%) Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH

(75%)

pH 9.6 CPD-Y pH 9.5 CPD-Y

n r H-Met-OH

lo

Bz-Arg-Tyr-OH (90%) Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-OEt (80%)

EtOH/HCl EtOH/HCl

Bz-Arg-Tyr-OEt (80%) Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-OH (95%)

pH 9.0 CPD-Y pH 9.6 CPD-Y

20 H-Gly-OEt

Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-OEt (60%) Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-NH2 (65%) Ν\ν^ CPD-Y, pH 8.0 H-Phe-NH- 25

De CPD-Y katalyserede kondensations- og deamideringstrin udførtes i rent vandig fase og Bz-Arg- valgtes som en solubiliserende beskyttelsesgruppe, der kunne fjernes 30 i sidste trin med trypsin som forklaret ovenfor (p.

16, linie 19-25). Efter forlængelse af peptidet med et aminosyreamid efterfulgt af deamidering, syntetiseredes det næste peptidestersubstrat med absolut ethanol og vandfri HC1. Efter hvert trin isoleredes reaktanterne 35 ved præparativ HPLC. På denne måde kunne overskydende aminkomponent og "hydrolysebiproduktet" også genvindes.

DK 155613 B

47

REFERENCER

1) Bergman Μ. & H. Fraenkel-Conrat: The role of specificity in the enzymatic synthesis of proteins. J.Biol.Chem.

5 119, 707-720 (1937) 2) Bergmann M. & J.S. Fruton: Some synthetic and hydrolytic experiments with chymotrypsin. J.Biol.Chem.

124, 321-329 (1938) - 10 3) Fastrez J. & A.R. Fersht: Demonstration of the acyl-enzyme mechanism for the hydrolysis of peptides and anilides by chymotrypsin. Biochemistry 12, 2025-2034 (1973) 15 4) Fischer E.: Ueber die Ester der Aminosauren. Chem.Ber.

34, 433-454 (1901) 5) Hayashi R., Y. Bai & T. Hata: Kinetic studies of 20 carboxypeptidase Y. I. Kinetic parameters for the hydrolysis of synthetic substrates. J. Biochem. 77, 69-79 (1975) 6) Johansen, J.T., K. Breddam & M. Ottesen: Isolation 25 of carboxypeptidase Y by affinity chromatography.

Carlsberg Res. Commun. 41, 1-14 (1976) 7) Isowa Y., M. Ohmori, T. Ichikawa, H. Kurita, M. Sato & K. Mori: The synthesis of peptides by means of 30 proteolytic enzymes. Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2762-2765 (1977) 8) Isowa Y., M. Ohmori, M. Sato & K. Mori: The enzymatic synthesis of protected valine-5 angiotensin II amide-1.

35 Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2766-2772 (1977) 48

DK 155613B

9) Isowa Y. , T. Ichikawa & M. Ohmori: Peptide synthesis with proteinases. Fragment condensation of ZLeuGln-GlyOH or ZGlnGlyOH with HLeuValNH2 using metallo-proteinases. Bull. Chem. Soc. Japan 51, 271-276 5 (1978) 10) Klibanov A.M., G.P. Samokhin, K. Martinek & J.V.

Berezin: A new approach to preparative enzymatic synthesis. Biotech. Bioeng. 19, 1351-1361 (1977) 10 11) Losse G., H.-J. Hebei & C. Kastner: Racematspaltung von Aminosaureamiden und hydraziden. J.Prak.Chemie, 4. Reihe, Band 8, 345-350 (1959) 15 12) Luisi P.L., R. Saltman, D. Vlach & R. Guarnaccia:

Co-oligopeptides of glycine and aromatic amino acids with variable distance between the aromatic residues. VIII. Enayamatic synthesis of N-protected dipeptide esters. J.Mol.Catalysis 2, 133-138 (1977) 20 13) Morihara K. & T. Oka: tf-chymotrypsin as the catalyst for peptide synthesis. Biochem. J. 163, 531-542 (1977) 25 14) Oka T. & K. Morihara: Peptide bond synthesis catalyzed by d'-chymotrypsin. J.Biochem. 84, 1277-1283 (1978) 15) Oka T. & K. Morihara: Trypsin as a catalyst for peptide synthesis. J.Biochem. 82, 1055-1062 (1977) 30 16) Oka T. & K. Morihara: Protease as a catalyst for peptide synthesis: Synthesis in the absence of product precipitation. Symp. on Peptide Chemistry in Japan,

Osaka, pp. 79-84 (1977) 35

DK 155613 B

49 17) Rivier J.E.: Use of trialkyl ammonium phosphate (TAAP) buffers in reverse phase HPLC for high resolution and high recovery of peptides and proteins. J.Liq.Chrom. 1, 343-366 (1978) 5 18) Saltman R., D. Vlach & P.L. Luisi: Co-oligopeptides of aromatic amino acids and glycine with variable distance between the aromatic residues, vii. Enzymatic synthesis of N-protected peptide amides. Biopolymers • 10 16, 631-638 (1977) 19) Smith E.L. & D.J. Spackman: Leucine aminopeptidase V. Activation specificity and mechanism of action. J.Biol.Chem. 212, 271-299 (1955) 15 20) Yamada T., N. Isono, A. Inui, T. Miyazama, S. Kuwata & H. Watanabe: Esterification of N-(benzyloxycarbonyl)-amino acids and amino acids using BF^-etherate as catalyst. Bull.Chem.Soc. Japan 51, 1897-1898 (1978) 20 21) Zeller E.A., L.A. Blanksma & J.A. Carbon: Ueber die Wirkung von optisch aktiven Hydraziden auf die Diaminoxydase. Helv.Chim.Acta. 40, 257-260 (1957) 25 30 35

Claims (12)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af peptider med den almene formel

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den anvendte carboxy-15 peptidase er carboxypeptidase Y fra gær.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den anvendte carboxypeptidase Y er renset ved affinitetschromatografi over 20 en affinitetsresin bestående af et polymert resinskelet med et antal tilkoblede benzylsuccinylgrupper.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den anvendte carboxy-25 peptidase er penicillocarboxypeptidase S-l eller S-2 fra Penicillium janthinellum, en carboxypeptidase fra Aspergillus saitoi eller Aspergillus oryzae, en carboxypeptidase C fra orangeblade eller orangeskaller, carboxypeptidase CN fra Citrus natsudaidai Hayata, phaseolain 30 fra bønneblade eller en carboxypeptidase fra spirende byg, spirende bomuldsplanter, tomater, vandmeloner eller Bromelein (ananas) pulver.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, 35 kendetegnet ved, at det anvendte carboxypep- tidase-enzym er immobiliseret. DK 155613 B

5 A-B-Y hvori A betegner en N-terminalbeskyttet L-aminosyrerest eller en eventuelt N-terminalbeskyttet peptidrest med en C-terminal L-aminosyre, og B betegner en L-aminosyre-10 rest, og Y er OH eller en C-terminal beskyttelsesgruppe, ved omsætning af en substratkomponent med en aminkompo-nent i nærvær af et enzym, og om ønsket fraspaltning af eventuelle terminalbeskyttelsesgrupper, 15 kendetegnet ved, at man omsætter en substratkomponent valgt blandt aminosyreestere, peptidestere, depsipeptider, eller eventuelt N-substituerede aminosyreamider eller peptid-20 amider, eller eventuelt N-terminalbeskyttede peptider med formlen A-OR1, A-NR2R2' eller A-X-OH 25 hvori A har den ovenfor anførte betydning, R1 betegner alkyl, aryl, heteroaryl, aralkyl eller et o^-des-aminofragment af en aminosyrerest, 2 2' R og R hver betegner hydrogen, alkyl, aryl, hetero-aryl eller aralkyl, og 30 X betegner en L-aminosyrerest, med en aminkomponent valgt blandt eventuelt N-substituerede L-aminosyreamider, L-amino-35 syrer eller L-aminosyreestere, med formlen H-B-NrV eller H-B-OR4 DK 155613 B hvori B har den ovenfor anførte betydning, 3 31 R og R hver betegner hydrogen, hydroxy, amino, alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, og 4 R betegner hydrogen, alkyl, aryl, heteroaryl eller 5 aralkyl, i nærvær af et L-specifikt serin- eller thiolcarboxy-peptidase-enzym stammende fra gær eller af animalsk, vegetabilsk eller anden mikrobiel oprindelse, i en vandig 10 opløsning eller dispersion ved pH 5 - 10,5, fortrinsvis ved en temperatur på 20 - 50°C.

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der anvendes en vandig reaktionsopløsning eller -dispersion indeholdende fra 0 til 50% af et organisk opløsningsmiddel. 5

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det anvendte organiske opløsningsmiddel er valgt blandt alkanoler, dimethyl-sulfoxid, dimethylformamid, dioxan, tetrahydrofuran, 10 dimethoxyethan, ethylenglycol og polyethylenglycoler.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der som substratkomponent anvendes en L-aminosyre eller peptidester valgt 15 blandt benzylestere eller C-^-C^ alkylestere, der eventuelt er substitueret med inerte substituenter.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1-7, kendetegnet ved, at der som substratkompo- 2 2 1 20 nent med formlen A-NR R anvendes et p-nitroanilid.

10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der som aminkomponent anvendes et amid med formlen 25 H-B-NHR3 3 hvori R er hydrogen eller C-^-C^ alkyl og B er en L-amino-syrerest. 30

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som aminkomponent anvendes en ester med formlen

35 H-B-OR4 4 hvori R er Cj-C^ alkyl og B er en L-aminosyrerest. DK 155613 B

12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der findes en eller flere C-terminale beskyttelsesgrupper, og at gruppen eller grupperne fraspaltes enzymatisk, fortrinsvis ved hjælp 5 af det samme carboxypeptidaseenzym, som anvendtes ved den forudgående reaktion. 10 15 20 25 30 35